JP2835902B2 - 耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、熱に不安定なラクトフ
ェリンに耐熱性を賦与した耐熱性ラクトフェリン−鉄結
合体に関する。また、本発明は、ラクトフェリン溶液に
鉄塩と重炭酸イオンを含むアルカリ塩とを添加すること
による耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体の製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来、ラクトフェリン（以下、Ｌｆと略
記する）には、鉄吸収促進、過酸化脂質生成抑制、抗
菌、抗ウィルス、細胞増殖、免疫系の制御など様々な生
理活性を有することが知られており、これらの生理活性
を付加したＬｆ含有食品、医薬品、飼料、化粧品などを
製造する試みがなされている。そして、このような製品
は、製造中に加熱殺菌されたり、使用時に熱湯と接触す
る機会が多い。しかしながら、Ｌｆは熱に不安定な物質
であり、熱変性すると沈澱したり鉄結合能を失い、その
生理活性も失われてしまうという致命的な欠点があっ
た。

【０００３】そこで、Ｌｆの熱安定化についての検討が
行われ、ｐＨ４にして加熱したＬｆは生のＬｆと同等の
鉄結合能を有することが報告されている〔Ｄａｖｉｄｓ
ｏｎａｎｄ Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．、第２５７巻、Ｇ９３０〜Ｇ９３４、１９８９
年〕。しかし、このようにして調製されたＬｆは保存中
に次第に変性し、その生理活性が失われてしまうことも
判明している。また、イオン強度の低い条件でＬｆを加
熱すると生理活性を維持し得ることが開示されている
〔特開平４−１０８６２９号公報〕。しかし、実際の製
品を製造する系では、必ずしもイオン強度が低くないの
で実用的ではない。そこで、本発明者らは、ｐＨと電気
伝導度Ωの関係が、Ｌｆの熱安定化に及ぼす影響につい
て検討し、 ｌｏｇΩ ≦（２．９６／ｐＨ）＋０．６４ （ｐＨ＜５） ｌｏｇΩ ≦（２９．３７／ｐＨ）−４．６２ （５≦ｐＨ≦７．９） ｌｏｇΩ ≦−０．９１７ （ｐＨ＞７．９） となるようにＬｆ含有溶液を調整するとＬｆの熱安定化
を図ることができることを見出した〔特開平４−８２６
９号公報〕。しかし、この条件を満たさない製品の場
合、この条件を満たすように調整したＬｆ溶液と他の原
料溶液を別々に殺菌し、無菌的に両者を混合するという
手段を取らざるを得ない。ところが、乳等省令では、全
ての原料を混合した後に加熱殺菌を行うことが定められ
ており、Ｌｆ溶液と他の原料溶液を別々に殺菌して混合
する方法は、実際的ではないという問題があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
問題を解決するべく、さらにＬｆの熱安定化について検
討を重ねた結果、Ｌｆの鉄結合能を維持した状態で耐熱
性を賦与するためには基本的にＬｆそのものを改質する
ことが必要だという結論に達した。そして、水に溶解し
た時のｐＨが４以下である鉄塩と重炭酸イオンを含むア
ルカリ塩とをＬｆ溶液に、それぞれ特定量の範囲で添加
することにより、Ｌｆに特定量の範囲の鉄及び重炭酸イ
オンが結合し、かつＬｆのアミノ基に重炭酸イオンを介
して鉄が結合したＬｆ−鉄結合体が生成され、このＬｆ
−鉄結合体が耐熱性を有することを見出し、本発明をな
すに至った。したがって、本発明は、耐熱性Ｌｆ−鉄結
合体を提供することを課題とする。また、本発明は、こ
のような耐熱性Ｌｆ−鉄結合体を製造する方法を提供す
ることを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ラ
クトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介して鉄が結
合した耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体に関する。本発
明におけるラクトフェリンに対する重炭酸イオン及び鉄
の結合範囲は、ラクトフェリン１ｇ当り重炭酸イオン３
５〜４００ｍｇ及び鉄４０〜５００ｍｇである。また、
本発明は、水に溶解した時のｐＨが４以下である鉄塩を
Ｌｆ溶液に添加して溶解するか、あるいは、水に溶解し
た時のｐＨが４以下である鉄塩とＬｆとを一緒に溶解す
るかして得られる溶液に、重炭酸イオンを含むアルカリ
塩を添加し、溶液のｐＨを７以下に調整することによっ
て、ラクトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介して
鉄を結合させる耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体の製造
法に関する。そして、この場合、鉄塩の添加量はラクト
フェリン１ｇ当り４０〜５００ｍｇ、重炭酸イオンを含
むアルカリ塩の添加量を０．３５〜５ｇとすると前記ラ
クトフェリンに対する鉄及び重炭酸イオンが特定の比率
で結合した耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体を得ること
ができる。

【０００６】本発明で用いるＬｆは、哺乳類の乳などの
ような分泌液から分離して得ることができる。この分離
方法は、どのような方法であっても構わない。このよう
なＬｆを大量に分離、精製する方法は、既に種々の提案
がなされている。また、本発明で用いるＬｆは、遺伝子
操作によって微生物、動物細胞、あるいはトランスジェ
ニック動物などに生産させたものであっても構わない。

【０００７】本発明で用いる鉄塩は、水に溶解した時の
ｐＨが４以下を示すものであって、例えば、塩化第２
鉄、硝酸第２鉄、硫酸第２鉄などがある。なお、水に溶
解したときのｐＨが４以下を示すこれらの鉄塩以外の鉄
塩を用いても、Ｌｆに耐熱性を付与することはできな
い。また、水に溶解したときのｐＨが４を越える鉄塩の
ｐＨを酸で４以下として用いても、本発明の目的を達成
することはできない。本発明で用いる鉄塩の量は、Ｌｆ
１ｇに対し、鉄イオンとして４０〜５００ｍｇ、好まし
くは５０〜２００ｍｇである。鉄塩の量が、４０ｍｇよ
り少ないと加熱時にＬｆの一部が沈澱するし、５００ｍ
ｇを超えると鉄の一部がＬｆと共に沈澱する。

【０００８】次に、本発明で用いるアルカリ塩は、重炭
酸イオンが含まれているものである。この重炭酸イオン
を含むアルカリ塩としては、重炭酸アンモニウム、重炭
酸ナトリウム、重炭酸カリウムなどを例示することがで
きる。なお、これらのアルカリ塩と通常用いられる水酸
化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウムなどのアル
カリとを併用して用いることもできる。また、ｐＨを調
整する際に途中から重炭酸イオンを含むアルカリ塩を用
いることもできる。ただし、ここで重要なことは、Ｌｆ
１ｇ当たり３５〜４００ｍｇの重炭酸イオンを結合させ
なければならず、そのためには、Ｌｆ１ｇ当たり重炭酸
イオンとして３５０ｍｇ〜５ｇのアルカリ塩をＬｆ／鉄
塩混合溶液に添加する必要がある。重炭酸イオンの量
が、３５０ｍｇより少ないと重炭酸イオンを介してＬｆ
に結合する鉄量が少なくなるので、Ｌｆに耐熱性を十分
で賦与できないし、５ｇより多いと過剰の重炭酸イオン
が鉄と反応して沈澱を形成する。なお、本発明におい
て、最終的な耐熱性Ｌｆ−鉄塩溶液のｐＨは７以下でな
ければならない。耐熱性Ｌｆ−鉄塩溶液のｐＨが７以上
となると沈澱が生成する。

【０００９】本発明者らは、先に、Ｌｆ、鉄及び重炭酸
ナトリウムを混合し、電気伝導度を調整してＬｆの殺菌
を行い、その後、殺菌済の他の原料と無菌的に混合し、
ｐＨ５．５でＦｅ（ｍｇ）／Ｌｆ（ｇ）＝９．６の鉄強
化飲料を製造する方法を提案した〔特開平４−８２６９
号公報〕。しかし、その際にＬｆ溶液に加える鉄量が少
なかったため、本発明のような耐熱性が賦与されたＬｆ
−鉄結合体は形成されておらず、別々に殺菌を行う方法
を採用せざるを得なかった。

【００１０】本発明の耐熱性が賦与されたＬｆ−鉄結合
体は、その表面構造が天然Ｌｆと異なる。Ｌｆは、リジ
ンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多く含有してお
り、これに鉄化合物を加えてｐＨを酸性にすると正に帯
電する。このＬｆの正電荷に重炭酸イオンが結合し、さ
らに鉄が結合して、本発明の耐熱性Ｌｆ−鉄結合体が生
成する。この耐熱性Ｌｆ−鉄結合体は、９０℃で加熱し
ても安定である。

【００１１】一般に、Ｌｆ、鉄塩及び重炭酸塩を混合す
ると鉄飽和型Ｌｆが生成することは古くから知られてい
る事実であり、Ｌｆを構成するＮローブと呼ばれる領域
とＣローブと呼ばれる類似した二つの領域に、鉄イオン
がそれぞれ１分子づつ結合したものである。すなわち、
Ｎローブでは、Ａｓｐ６０、Ｔｙｒ９２、Ｔｙｒ１９２
及びＨｉｓ２５３（数字はＮ末端からのアミノ酸の順番
を示す、以下同様）の４個のアミノ酸残基に１分子の鉄
イオンが結合しており、さらに、この鉄に重炭酸イオン
が１個結合したものである。同様に、Ｃローブでは、Ａ
ｓｐ３９５、Ｔｙｒ４３５、Ｔｙｒ５２８及びＨｉｓ５
９７に鉄イオンが結合している〔Ｂ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２０
９巻、７１１〜７３４頁、１９８９年〕。したがって、
通常鉄飽和型Ｌｆは、Ｌｆ１ｇ当たり、鉄１．４ｍｇ、
重炭酸イオン１．５ｍｇそれぞれ結合したものとなる。
また、鉄飽和型Ｌｆは、鉄が結合していないＬｆに比べ
ると若干安定性は増すが、６５℃以上で加熱すると沈澱
してしまう。

【００１２】さらに、Ｌｆに多量の鉄を添加すると鉄が
Ｌｆに結合して非遊離状態となり、安定化された鉄剤を
得ることができることが示されている〔特開平４─１４
１０６７号公報〕。しかし、その明細書には、鉄を多量
に添加することによってＬｆに耐熱性が賦与されるとい
うことは何ら示されていないし、重炭酸塩を用いるとい
うことも何ら示されておらず、したがって、本発明の重
炭酸イオンを介して鉄が結合した耐熱性Ｌｆ−鉄結合体
とは全く異なるものと言える。

【００１３】本発明の耐熱性Ｌｆ−鉄結合体は、鉄の結
合量及び重炭酸イオンの結合量が、いわゆる鉄飽和型Ｌ
ｆより遙に多く、Ｌｆがまるで鉄の鎧を着ているようで
ある。そして、この鉄の鎧のために、本発明の耐熱性Ｌ
ｆ−鉄結合体は、抗体で認識され難くなる。次に、本発
明の耐熱性Ｌｆ−鉄結合体の抗体認識試験について示
す。

【００１４】

【試験例１】２ｍｇ／ｍｌのウシＬｆ溶液に塩化第２鉄
を所定量加え、さらに、Ｌｆ１ｇ当たり０．１２〜０．
５ｇの重炭酸ナトリウムを添加して、ウシＬｆ溶液のｐ
Ｈを６．５に調整した。そして、このウシＬｆ溶液とｐ
Ｈ６．６の０．１モルイミダゾール緩衝液／０．３モル
食塩とを等量混合した。一方、ＥＬＩＳＡ用プレートに
抗ウシＬｆ抗体をコートした後、ブロックエース（大日
本製薬（株）販売）でブロッキングしておき、先に調製
したウシＬｆ溶液を添加して、室温で１時間反応させた
後、パーオキシダーゼを標識した抗ウシＬｆ抗体を反応
させた。反応後、プレートをよく洗浄した後、ＡＢＴＳ
基質を加えて、４０５ｎｍの吸光度を測定した。各鉄塩
濃度における抗体認識結果について表１に示す。

【表１】 ──────────────────────────────────── 鉄塩添加量（ｍｇ／ｇＬｆ） 抗体で認識されたＬｆ（ｍｇ／ｍｌ） ──────────────────────────────────── ０ １．０２ ２０ ０．９５ ４０ ０．８２ ５０ ０．５７ ６０ ０．５０ ７０ ０．３６ ８０ ０．２０ １００ ０．０９ ──────────────────────────────────── このように、重炭酸イオンを介してＬｆのアミノ基に結
合する鉄塩の量が増えるに従い、抗体で認識されるＬｆ
の濃度は減少した。なお、対照として、重炭酸ナトリウ
ムの代わりに水酸化ナトリウムを用いてｐＨを６．５に
調整したＬｆ／鉄溶液を作製しようと試みたが、沈澱が
生じてＥＬＩＳＡに供することができなかった。

【００１５】次に、種々の鉄塩を用いて行ったＬｆの熱
安定化試験について示す。

【試験例２】表に示される種々の鉄塩をＬｆ１ｇ当たり
鉄イオンとして１２０ｍｇとなるようにＬｆ溶液に添加
し、１モル重炭酸ナトリウム溶液でｐＨを６．３に調整
した。そして、この溶液を、最終濃度が０．０５モルイ
ミダゾール／０．１５モル食塩（ｐＨ６．６）となるよ
うに加え、９０℃で１０分間加熱してＬｆの沈澱生成を
観察した。その結果を表２に示す。

【表２】 ──────────────────────────────────── 鉄 剤 水に溶解した時のｐＨ 沈澱の有無 ──────────────────────────────────── Fe(NO₃)₃ ２．７３ 無し、透明 FeSO₄ ４．８１ 有 り FeCl₃ ２．６９ 無し、透明 FeCl₂ ４．５６ 有 り FeCl₂ ４．５６→２．６６（塩酸で調整） 有 り Fe(SO₄)NH₄ ４．８３ 有 り Fe₂(SO₄)₃ ２．６０ 極わずかに濁り ピロリン酸鉄 ６．８０ 有 り クエン酸鉄 ６．５３ 有 り フマル酸鉄 ４．５０ 有 り フマル酸鉄 ４．５０→２．７５（塩酸で調整） 有 り ──────────────────────────────────── この表から、先に述べたように、（１）水に溶解したと
きのｐＨが４以下を示す鉄塩を用いるとＬｆに耐熱性を
付与することができるが、それ以外の鉄塩を用いても耐
熱性を付与することができないこと、（２）水に溶解し
たときのｐＨが４を越える鉄塩を酸でｐＨ４以下として
も耐熱性を付与することができないこと、及び（３）鉄
塩の使用量には一定の範囲があることが分る。

【００１６】

【試験例３】Ｌｆ２．７ｍｇ／ｍｌの水溶液１５ｍｌに
塩化第２鉄を鉄イオン濃度として最終濃度２０〜１，０
００μｇ／ｍｌとなるように添加し、重炭酸ナトリウム
を４ｍｇ〜２１０ｍｇ加えｐＨを６．２に調整した。こ
の溶液を水で２０ｍｌにメスアップし、次いで、この溶
液８ｍｌずつを０．１モルイミダゾール／塩酸／０．３
モル食塩（ｐＨ６．６又はｐＨ７．３）の緩衝液各８ｍ
ｌと等量混合した。混合した後の溶液のｐＨは各々６．
５又は７．２であった。この混合溶液を９０℃で１０分
間加熱し、室温まで自然冷却した後、３，０００ｒｐ
ｍ、１０分間遠心分離して、上清中のＬｆ含量をＢｉｏ
Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙで測定した。上清
中に残存しているＬｆの割合を表３に示す。

【表３】 ──────────────────────────────────── 上清中に残存のＬｆ割合（％） 鉄塩添加量（ｍｇ／ｇＬｆ） ───────────────── ｐＨ６．５ ｐＨ７．３ ──────────────────────────────────── ２０ ７３ ４６ ３０ ８１ ４０ ４０ ９６ ３８ ５０ １００ ３４ １００ １００ ５０ ５００ ９４ ２１ １，０００ ２８ １１ ──────────────────────────────────── このように、最終的な溶液のｐＨが７以下で、Ｌｆ１ｇ
当たりの鉄量が４０〜５００ｍｇの範囲において、本発
明の耐熱性Ｌｆ−鉄結合体は、９０％以上の熱安定性を
示した。

【００１７】本発明の耐熱性Ｌｆ−鉄結合体を配合した
製品を製造するに際し、特に制限はないが、製品の最終
ｐＨと電気伝導度Ωの関係が、 ｌｏｇΩ ＞（２．９６／ｐＨ）＋０．６４ （４≦ｐＨ＜５） ｌｏｇΩ ＞（２９．３７／ｐＨ）−４．６２ （５≦ｐＨ≦７） であるような場合に本発明の耐熱性Ｌｆを用いるとよ
い。なぜならば、ｐＨと電気伝導度Ωの関係が、上記の
関係を示さない場合、既に開示されたＬｆの殺菌方法
（特開平４−８２６９号公報）を用いることで十分であ
り、また、ｐＨが７を越える場合、上述したように本発
明の耐熱性Ｌｆを用いることができないからである。な
お、ｐＨが７を越える場合、ｐＨを７以下とするため
に、若干量の酸を添加しても構わない。その後、通常実
施されている工程に従い、加熱殺菌あるいは滅菌を行
う。加熱処理方法としては、６５℃、３０分間の低温殺
菌処理、１２０℃、２〜３秒間、あるいは１４０〜１５
０℃、３〜５秒間の処理、さらにはレトルト処理を用い
ることも可能である。また、乾燥を行えば耐熱性Ｌｆ−
鉄結合体を含有する粉末製品を得ることもできる。な
お、乾燥方法としては、凍結乾燥法を用いてもよいが、
大量に処理する場合、乾燥コストの安い噴霧乾燥法を用
いることが好ましい。

【００１８】このようにして得られる耐熱性Ｌｆ−鉄結
合体含有製品は、鉄を含んでいるので、貧血の予防ある
いは治療を目的とした食品、飼料、医薬品などとして特
に適している。また、病原菌の付着阻止効果〔特開平３
─２２０１３０号公報〕を賦与した医薬品、飼料、食
品、化粧品などとしても適している。なお、本発明の耐
熱性Ｌｆ−鉄結合体は、鉄を含んでいるが殆ど鉄臭が感
じられないので、鉄強化飲料の素材として利用するのに
も適している。

【００１９】次に本発明を実施例を挙げて具体的に説明
する。

【実施例１】Ｌｆ１００ｇと硝酸鉄（９水和物）７２．
４ｇとを水８ｌに溶解し、攪拌機で激しく攪拌しながら
重炭酸ナトリウム５ｇを添加してｐＨを６．４に調整し
た。そして、全体の容積が１０ｌとなるまで加水し、Ｌ
ｆ１０ｇ／ｌ、鉄イオン１００ｍｇ／ｇＬｆ及び重炭酸
イオン１０７ｍｇ／ｇＬｆを含む耐熱性Ｌｆ−鉄結合体
溶液を調製した。本溶液の半量５ｌを凍結乾燥した結
果、５．３ｇの粉末を得た。次にＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−２５（ファルマシア社製）を水で平衡化したもの１０
０ｍｌを内径２ｃｍ、高さ５０ｃｍのカラムに充填し、
得られた溶液のうち１ｍｌを負荷した。水で溶出し、ボ
イドボリューム画分を集め、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＰｒｏ
ｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔでＬｆを定量し、さらに
ＩＣＰによって鉄含量を測定した。その結果、Ｌｆ９．
７ｍｇ、鉄イオン１．０３ｍｇであった。すなわちＬｆ
１ｇ当り１０６ｍｇの鉄が結合していることが確かめら
れた。尚、当然のことながら他の画分にはＬｆも鉄も溶
出されていなかった。

【００２０】

【実施例２】Ｌｆ０．５ｇと塩化第２鉄（６水和物）
０．４ｇとを水１００ｍｌに溶解し、スターラーでよく
攪拌しながら１モル重炭酸ナトリウム溶液を添加して、
ｐＨを３．５に調整し、さらに、１Ｎ水酸化ナトリウム
を添加してｐＨを６．２に調整して耐熱性Ｌｆ−鉄結合
体溶液を得た。次に、脱脂粉乳２ｋｇを水２０ｌに還元
し、乳酸をごく少量加えてｐＨを６．５に調整した。こ
のようにして調製した還元脱脂乳と先に調製した耐熱性
Ｌｆ−鉄結合体溶液１００ｍｌとを混合した後、均質化
を行った。そして、プレート型殺菌機で１２０℃、２秒
間殺菌した後、直ちに５℃に冷却した。このようにして
得られた耐熱性Ｌｆ−鉄結合体を含む製品は、電気伝導
度が６．５ｍｓ／ｃｍ、ｐＨが６．５で、耐熱性Ｌｆ−
鉄結合体含量２５ｍｇ／ｌ、鉄含量１６４ｍｇ／ｇ、Ｌ
ｆ及び重炭酸イオン含量０．１７ｇ／ｇＬｆであった。
この耐熱性Ｌｆ−鉄結合体を含む製品を２週間冷蔵庫に
保存した後、その一部を１，２００×ｇ、１０分間遠心
分離したが、沈澱は認められず、鉄臭も殆ど感じられな
かったので、耐熱性Ｌｆ−鉄結合体が安定して存在して
いると判断された。

【００２１】

【実施例３】実施例１で調製した耐熱性Ｌｆ−鉄結合体
溶液１．３ｌを脱脂乳１００ｌに溶解し、均質化した
後、１５０℃で４秒間滅菌を行った。滅菌後、直ちに４
℃まで冷却して、２５０ｍｌずつ紙容器に無菌充填し
た。この耐熱性Ｌｆ−鉄結合体を含む製品を３７℃で３
ヶ月保存した後、１，２００×ｇ、１０分間遠心分離し
て沈澱物の有無を調べたが、沈澱は全く認められなかっ
た。また、製品中の大腸菌数及び一般細菌数は、共に０
であった。さらに、製品中に鉄が存在しているので、保
存中に褐変が進行する恐れがあったが、極わずかに茶褐
色を帯びているだけで、実用的には殆ど問題にはならな
い程度の変化であった。

【００２２】

【発明の効果】本発明の耐熱性Ｌｆ−鉄結合体は、耐熱
性を有し、しかも従来知られているＬｆと同様の鉄結合
能を維持している。したがって、従来の方法で加熱殺菌
あるいは滅菌するとＬｆの鉄結合能が失なわれていた製
品に本発明の耐熱性Ｌｆ−鉄結合体を加え生体にとって
有用なＬｆを供給することができる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 103:00 (56)参考文献 特開 平４−8269（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−141067（ＪＰ，Ａ) Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，19 （10）（1987）ｐ．1001−1008 Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（1992）31（18) ｐ．4451−4458 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（1990) 265（13）ｐ．7138−7141 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（1989) 264（９）ｐ．4776−4781 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/79 A23L 1/304 A23L 2/38 A61K 33/26 ACC A61K 38/16 C07K 103:00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトフェリン１ｇ当たり、重炭酸イオ
   ンが３５〜４００ｍｇ、鉄が４０〜５００ｍｇ結合し、
   かつラクトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介して
   鉄が結合した耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体。
2. 【請求項２】 水に溶解したときのｐＨが４以下である
   鉄塩をラクトフェリン１ｇ当たり鉄として４０〜５００
   ｍｇの割合でラクトフェリン溶液に添加し、重炭酸イオ
   ンを含むアルカリ塩をラクトフェリン１ｇ当たり重炭酸
   イオン濃度にして０．３５〜５ｇ加えてｐＨを７以下に
   調整することを特徴とする、ラクトフェリン１ｇ当り重
   炭酸イオンが３５〜４００ｍｇ、鉄が４０〜５００ｍｇ
   結合し、ラクトフェリンのアミノ基に重炭酸イオンを介
   して鉄が結合した耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体の製
   造法。