JP2000511424A

JP2000511424A - ラクトフェリン変異体およびその使用

Info

Publication number: JP2000511424A
Application number: JP09543045A
Authority: JP
Inventors: コネリー，オーラ・エム; ウォード，ポーリーン・ピー
Original assignee: Baylor College of Medicine
Current assignee: Baylor College of Medicine
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-06-02
Publication date: 2000-09-05
Also published as: DE959898T1; NZ333215A; AU3227197A; KR20000016159A; US6111081A; EP0959898A1; WO1997045136A1; IL127319A; EP0959898A4; ES2140362T1; GR990300043T1; CA2256453A1; IL127319A0; AU707476B2

Abstract

(57)【要約】本発明はラクトフェリン変異体およびその部分をコードし、修飾した鉄結合能を有する組換え核酸および同組換え核酸を含むベクターに関する。本発明はさらにそのようなベクターを製造する方法および同ベクターを有するトランスフェクションした細胞に関する。多様な真核生物細胞または原核生物細胞でのラクトフェリン変異体およびその部分の製造方法をも提供する。最終的に、本発明は本発明の核酸によってコードされ、本発明のプロセスによって製造されるラクトフェリンおよびその部分に関する。従って、本発明は、組換えラクトフェリン変異体およびその部分の有効かつ経済的な製造手段を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ラクトフェリン変異体およびその使用Ｉ．発明の分野本発明は一般的にラクトフェリン関連糖タンパク質に関する。より詳しくは、本発明はラクトフェリン変異体およびその部位、その産物および使用に関する。 II.本発明の背景ラクトフェリンは非ヘム鉄結合糖タンパク質のトランスフェリンファミリーの一員であり（アイセン（Aisen）ら、１９８０、Ann.Rev.Biochem．４９：３５７ −３９３）、このファミリーは血液中の主要な鉄輸送タンパク質であるトランシフェリン（マクギリブレイ（MacGilliveay）ら、１９８３、J.Biol．Chem．２５８ :３５４３−３５５３）、鳥類卵白タンパク質であるオボトランスフェリン（J eltsch）ら、１９８２、Eur.J.Biochem．１２２：２９１−２９５）およびヒトメラノサイトで見出されたこのファミリーの膜結合形態であるメラノトランスフェリン（ローズ（Rose）ら、１９８６、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ８３：１２６１−１２６５）を含む。ラクトフェリンは広範に分布し、体表面を覆う外分泌（マッソン（Masson）ら、１９７１、Camp．Biochem．Physiol．３９：１１９ −１２９；ヘンナルト(Hennart)ら、１９９１、Am．J．Clin．Nurr．５３：３２ −３９；マッソンら、１９６６、Clln．Chlm．ACta．１４：７３５−７３９；ペンテコスト（Pentecost）ら、１９８７、J．Biol．Chem．２６２：１０１３４− １０１３９；ユ（Yu）ら、１９９３、Biochem.J. ２９６：１０７−１１１）および好中球の活性化に関する血流に放出されることができる多形核好中球の二次的顆粒（マッソンら、１９６９、J．Exp．Med．１３０：６４３−６５８）の両者に存在する。ラクトフェリンに提起される機能は、鉄結合および小腸への運搬（フランソン（Fransson）ら、１９８０、J．Pediarics ９６：３８０−３８4）；アイアー（lyer）ら、１９９３、Eur.J.Clin．Nutr．４７：２３２−２４１；コックス（Cox）ら、１９７９、Biochem．Biophys．Acta．５５８：１２９−１４１；フ（Hu）ら、１９８８、Biochem.J．２４９：４３５−４４１；ギスラソン（Gislason）ら、１９９５、J．Pediatr．Gastroent．Nutr.２１：３７−４３）；ミコガミ（Mikogami）ら、１９９４、Am．J．Physiol．２６７：Ｇ１−Ｇ８；ウォード（Ward）ら、１９９５、Biotechnology １３：４９８ −５０３）、グラム陰性およびグラム陽性細菌の広範囲に対する抗活性（オラム（Oram）ら、１９６８、Biochem.Biopyhs.Acta．１７０：３５１−３６５；アーノルド（Arnold）ら、１９７７、Science １９７：２６３−２６５；エリソン（ Ellison）ら、１９８８、Infect.Immn．５６：２７７４−２７８１；ベラミー（ Bellamy）ら１９９２、Biochem.Biophys.Acta.１２２１：１３０−１３６；ヤマウチ（Yamauchi）ら、１９９３、Infect．Immn.６１：７１９−７２８、細胞増殖促進（ハシズメ（Hashizuma）ら、１９８３、Infect．Immn．７６３：３７７ −３８２；ニコラス（Nchols）ら、１９８９、Blood １９８７、Pediatt.Res．２１：５６３−５６７）、骨髄造血の調節（サワツキー（Sawatzki）ら、１９８９、Blood Cells １５：３７１−３７５；ブロキシメイヤー（Broxmeyer）ら、１９８６、Blood Cells １３：３１−４８；ズカリ（Zucali）ら、１９７９、Bl ood ５４：９５１−９５４）、および免疫調節特性（マッキニッキ（Machnlckl ）ら、１９９３、Int．J．Exp．Path．７４：４３３−４３９；クラウチ（Crouc h）ら、１９９２、Blood ８０：２３５−２４０；ザグルスキー（Zagulskl）ら、１９８９、Br．J．Exp．Parhol．７０：６９７−７０４）を含む。ラクトフェリンはトランスフェリンファミリーの他の成員と高度の構造ホモロジーを共有する。これらのタンパク質のすべては８０kDaより低い分子量を有するモノマー糖タンパク質である。アイセンら、１９８０、Ann．Rev．Biochem.４９：３５７−３９３；メッツ−ブティック（Nletz-Boutique）ら、１９８４、Eu r．J．Biochem．１４５：６５９−６７６。ラクトフェリン（アンダーソン（And erson）ら、１９８９、J．Mol．Biol．２０９：７１１−７３４）およびトランスフェリン（リンドレー（Llndley）ら、１９８８、Biochem．２７：５８０４− ５８１２）の三次元構造はＸ線結晶構造解析によって正確に定義されている。該タンパク質は該タンパク質のアミノ末端およびカルボキシ末端の半分に対応する２つの小球葉（globular lobes）に折り畳まれている。この２葉構造はアミノ末端半分とカルボキシ末端半分の間で４０％より低く保存されているが、共通の祖先遺伝子からの遺伝子間の複製により進化したと考えられる。ウィリアムズ（ Williams）ら、１９８２、Trends．Biochem．Sci．７：３９４−３９７。この各葉はそれぞれ可逆的に高親和性で、かつ通常、炭酸イオンである陰イオンの結合と同時に鉄に結合することができる。アイセンら、１９８０、Ann．Rev．Bioche m．４９：３５７−３９３。ラクトフェリンによる鉄結合に必要とされるアミノ酸はトランスフェリンファミリーの成員間で高度に保存されている。ベーカー（ Baker）ら、１９９２、J．Inorg．Biochem.４７：１４７−１６０。ラクトフェリンにおいて、鉄原子は、アミノ末端葉においてAsp ３９６、Tyr ９３、Tyr １９３およびHis ２５４に、カルボキシ末端葉において対応するAsp ３９６、Tyr ４３６、およびTyr ５３９およびHis ５９８にそれぞれ結合する。アンダーソンら、１９８９、J．Mol．Biol．２０９：７１１−７３４。その構造類似性に逆らわずにラクトフェリンは、その血清部分であるトランスフェリンよりも鉄結合性が一層高いことを示す。特に、ラクトフェリンからの鉄の放出は、トランスフェリンよりも一層高度のｐＨ安定性を示し、後者は約６〜約４のｐＨの範囲で鉄を放出するが、前者は約４〜約２の範囲のｐＨで鉄を放出ずる。マズイエー（Mazuler）ら、１９８９、Biochem．Biophys．Acta．６２９：３９９−４０８。ラクトフェリン独特の鉄結合性は、このタンパク質に提起される多様な機能的活性のいくつかに貢献しているということが示唆されている。ラクトフェリン独特の鉄結合特性に関する構造および機能的な特性は、以下に限るものではないが、修飾された抗微生物活性のための高度な親和性を有するラクトフェリン変異体、修飾された鉄放出特性を有する鉄への低度親和性を有するラクトフェリン変異体、または修飾された鉄放出へのｐＨ依存性を有するラクトフェリン変異体などを含む修飾された特性を有するラクトフェリン変異体の形成および産生を可能にするであろう。本発明の出願人は以前、アスペルギルス（Aspergillus）を含む腸内細菌における組換えヒトラクトフェリンの高レベルの産生および特徴付けを報告した。ウォードら、１９９５、Biotechnology１３：４９８−５０３；米国特許第５,５７１,８９６号、第５,５７１,６１９号、第５,５７１,６９７号、参照のためその全体を引用する。顕著かつ独特な炭素組成物に逆らわずに、組換えタンパク質は、鉄および受容体結合性および抗微生物活性を含んでおり、生理学的活性に関してヒト乳汁ラクトフェリンから区別がつかない。従って、この発現系の利用性は、現在、修飾された特性を有する変異体を産生するために、このタンパク質の構造および／機能的役割を推定するために十分な量でラクトフェリン変異体の産生を提供する。 III．発明の要約本発明は、ラクトフェリン変異体またはその一部分（該部位はラクトフェリンの少なくとも１つの鉄結合部位に対応する配列である）をコードする核酸配列に関する。該ラクトフェリン変異体またはその一部は野生型ラクトフェリンに比較される場合に修飾した鉄結合能を有することによってさらに定義される。部位特異的突然変異誘発を用いて、本発明はラクトフェリンの独特の鉄結合特性への２葉（lobe）構造の貢献を明らかにしている。ヒトラクトフェリンｃＤＮＡは選択的に該タンパク質の片方の半分かあるいは、両方における鉄結合に関する２つのチロシン残基で突然変異する。得られた３つの鉄結合欠如変異体をアスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori)中で発現させ、かつアスペルギルス・アワモリから精製した。⁵⁹FeCl₃を用いての鉄結合分析は、いずれか一方の葉での鉄結合に関与する２つのチロシン残基の突然変異が、突然変異した葉への選択的な鉄結合の喪失という結果となることを確実にした。さらに、ｐＨ依存性鉄放出実験は、カルボキシ末端葉よりもアミノ末端葉が酸性安定性であるというラクトフェリンの２つの半分の異なった鉄結合安定性を示した。一層重要なことには、本発明は機能的な鉄結合カルボキシ末端葉が、野生型ラクトフェリンの特徴であるアミノ末端葉に対する鉄結合のｐＨ安定性に必要であることを示している。これらの結果は、ラクトフェリンの２葉間での共同相互作用がこのタンパク質の独特の鉄結合特性に貢献するという結果を支持している。従って、本発明は例えば鉄に対する増大した親和性または減少した親和性などの修飾した鉄結合特性、または鉄結合のための修飾したｐＨまたは温度条件または範囲などの修飾した鉄結合特性などの重要な特性を有するラクトフェリン変異体の産生のためのガイダンスを提供する。さらに本発明は、鉄結合活性を保有する一方、例えば治療耐性などの改良された特徴を有するラクトフェリン変異体の形成に関するガイダンスを提供する。第２局面において、本発明はさらに、真核生物細胞におけるラクトフェリン変異体またはその一部の発現に適していて、ラクトフェリン変異体またはその一部をコードする核酸を含むベクターに関する。好ましくは、該プラスミドはアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）、アスペルギルス・ニードランス（Aspergillus nidulans）およびアスペルギルス・アワモリを含む細菌細胞における発現に適している。第三の局面において、本発明はさらにそのようなベクターの製造方法および同ベクターを含むトランスフェクションした細胞に関する。多様な真核生物細胞または原核生物細胞におけるラクトフェリンおよびその変異体の製造方法もまた提供する。最終的に、本発明は本発明の工程によって製造されたラクトフェリンおよびその変異体に関する。従って、本発明は組換えラクトフェリンタンパク質およびその変異体およびラクトフェリン関連ポリペプチドの製造に有効かつ経済的である手段を提供する。 IV．図面の簡単な説明図１Ａおよび１Ｂは、精製した鉄結合欠損ラクトフェリン変異体ウエスタンイムノブロットおよび銀染色分析を示す。図１Ａは、それぞれ２００ngの精製した組換えヒトラクトフェリン(Rec hLF) 、アミノ末端(MN-2Y)、カルボキシ末端(MC-2Y)およびアミノ末端およびカルボキシ末端(MNC-4Y)鉄結合欠損ラクトフェリン変異体サンプルのウエスタンイムノブロット分析を示す。図１Ｂは、精製Rec hLF、MN-2Y、MC-2YおよびMNC-4Y（各１μｇ）の銀染色ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析を示す。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは、鉄結合欠損ラクトフェリン変異体によるヒト腸内細胞に結合するビオチン化した組換えラクトフェリンの競合を示す。図２Ａ。鉄飽和ビオチン化組換えヒトラクトフェリン（０.４μＭ）を、未標識鉄飽和組換えラクトフェリン（Fe-RechLF）またはアポ組換えラクトフェリン( Apo-RechLF)の増大濃度の存在下または不在下で、カコ−２膜（３００ng）と共にインキュベートした。ビオチン化ラクトフェリンのカコ−２膜への結合の阻害をビオチン／アビジンマイクロタイターアッセイを用いて決定した（ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８−５０３）。図２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄ。アポビオチン化組換えヒトラクトフェリン（０.４ μＭ）を未標識Apo-RechLFまたはMN-2Y（図２Ｂ）、MC-2Y（図２Ｃ）またはMNC- 4Y（図２Ｄ）の増大濃度の存在下または不在下で、カコ−２膜（３００ng）と共にインキュベートした。ビオチン化ラクトフェリンのカコ−２膜への結合の阻害をビオチン／アビジンマイクロタイターアッセイを用いて決定した。該データを平均＋／−S.E.M.として示す。図３はラクトフェリンアミノ末端（MN-2Y）、カルボキシ末端(MC-2Y)およびアミノ末端およびカルボキシ末端（MNC-4Y）鉄結合欠損変異体の鉄飽和分析を示す。無鉄組換えヒトラクトフェリン（RechLF）、MN-2Y、MC-2YおよびMNC-4Yを実験手法に記載するようにして鉄と飽和させた。該サンプルに結合した⁵⁹Feを液体シンチレーションカウンティングを用いて定量し、ついでFe／タンパク質モル比を決定した。該データを平均＋／−S.E.M.として示す。図４はラクトフェリンアミノ末端（MN-2Y）およびカルボキシ末端（MC-2Y）鉄結合欠損変異体からのｐＨ−依存⁵⁹Pe放出を示す。⁵⁹Fe飽和組換えヒトラクトフェリン（Rec hLF）、MN-2YおよびMC-2YをｐＨ７〜２範囲のバッファーに対して透析した。透析後のラクトフェリンサンプルに結合した残存⁵⁹Feを液体シンチレーションカウンティングによって定量し、ついでFe／タンパク質モル比を決定した。該データを平均＋／−S.E.M.として示す。Ｖ．定義本明細書で一般的に使用される語句は典型的に当業界において使用されている。以下の語句は本明細書で使用される以下の一般的な意味を有すると意図されている：「ラクトフェリン変異体」なる語句は少なくとも１つのアミノ酸位で天然に存在するラクトフェリンの変異によって産み出されるポリペプチドをいう。「ベクター」なる語句は、ラクトフェリン変異体またはその一部分をコードする核酸の挿入、増殖および／または発現を可能にするプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、レトロウイルスまたは他のビヒクルを意味する。「宿主細胞」なる語句はラクト・フェリン発現を可能にする任意の細胞である。「プロモーター」なる語句はラクトフェリンｃＤＮＡの転写をコントロールする調節ＤＮＡ配列を意味する。「形質転換」なる語句は細胞によって異種核酸配列の発現を可能にする取り込みを意味する。「鉄結合能」はFeに結合する能力を意味する。完全に機能的なヒトラクトフェリンは、ラクトフェリンの分子当たり２つの鉄原子と結合することができる。「生物学的な活性／生物学的に活性である」なる語句は、鉄を結合する能力、または微生物を殺す能力または微生物の増殖の阻害または鉄輸送タンパク質として機能する能力によって測定されるラクトフェリンの生物学的活性を意味する。ＶI．発明の詳細な説明Ａ．概要本発明は部分的には、タンパク質の鉄結合能力／特性に貢献するラクトフェリンポリペプチドにおける領域、配列および構造の同定に基づく。このように、本発明は、例えば増大した鉄結合能力または減少した鉄結合能力、または修飾されたｐＨまたは温度条件またえは鉄の結合範囲など、修飾した鉄結合特徴などの改善された特徴を有するラクトフェリン変異体産生に関するガイダンスを提供する。さらに、本発明はその他の改良された特徴、例えば治療上の耐性、分解に対する安定性または免疫応答などラクトフェリン変異体形成のためのガイダンスを提供する一方でその鉄結合活性を保有している。従って、本発明はラクトフェリン変異体およびその一部をコードする組換え核酸および同組換え核酸を含むベクターに関する。本発明はさらにそのようなベクターの製造方法および同ベクターを有するトランスフェクションした細胞に関する。多様な真核生物細胞または原核生物細胞におけるラクトフェリン変異体およびその一部分の製造方法もまた提供する。最終的に、本発明は本発明の核酸によってコードされるラクトフェリン変異体およびその一部および／または本発笑みの工程によって製造されるラクトフェリン変異体およびその一部に関する。従って、本発明は改良された特徴を有するラクトフェリン変異体またはその一部の設計のためのガイダンスおよびそのようなラクトフェリン変異体およびその一部の有効かつ経済的な製造手段を提供するＢ．ラクトフェリンの２葉性構造の独特の鉄結合特性に対する貢献本発明において、部位関連突然変異誘発法を使用してラクトフェリンの２葉性構造のこのタンパク質の独特の鉄結合特性に対する貢献を調査した。とりわけ、ラクトフェリンのいずれか一方の葉または両葉における鉄結合に関する２つのチロシンを対応するアラニン残基に突然変異させて、３つの鉄結合欠損変異体を製造した。これらのラクトフェリン変異体を、野生型タンパク質に関して以前に記載したようにアスペルギルス・アワモリから発現させ、かつ精製した。米国特許第５,５７１,８９６号；ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８−５０３。銀染色、ウエスタンイムノブロットおよび腸内受容体結合分析によつて決定されたように、これらのラクトフェリン変異体の大きさ、免疫応答性および機能的活性は野生型組換えヒトラクトフェリンに類似であり、アミノ酸置換体が全く該タンパク質に逆の効果を及ぼさないことを示す。⁵⁹FeCl₃を用いた鉄飽和分析は、そのままのカルボキシ末端鉄結合葉を有するラクトフェリン変異体が、鉄とタンパク質の期待された１：１の比率で飽和するが、そのままのアミノ末端鉄結合機能を有する変異体は、一貫して１：１より低い比率で飽和したことを示し、これはこのラクトフェリン変異体の鉄結合安定性がｐＨ７.０デ減少することを示唆している。さらに、鉄結合実験は、両葉におけるチロシン残基の突然変異は完全タンパク質の鉄結合能力を有効に破壊することを示す。Ｖ II.Ａ、ＶII.ＣおよびＶII.Ｄの章を参照。本明細書で開示されるように、突然変異していない葉からのｐＨ依存鉄放出実験はラクトフェリンのアミノ末端葉およびカルボキシ末端葉に対する鉄結合安定性が類似ではないことを示している。そのままのカルボキシ末端鉄結合機能を含むラクトフェリン変異体からの鉄放出は天然のラクトフェリンで観察されるものと類似である。対照的に、そのままのアミノ末端鉄結合部位を有するラクトフェリン変異体はｐＨ７〜５の間の鉄結合タンパク質すべてを放出ずるのに一層酸性に対する不安定性を有する。従って、これら２葉間の全体的な構造ホモロジ（４０％）にもかかわらず、ラクトフェリンのアミノ末端葉とカルボキシ末端葉は鉄結合のｐＨ安定性において異なっていることを証明している。さらに、鉄結合カルボキシ末端葉は、野生型タンパク質の特徴であるアミノ末端葉に対する鉄結合の安定性を付与するために必要である。ラクトフェリンのアミノ末端葉およびカルボキシ末端葉に対する鉄結合のフ均等が以前に報告されている。マズイエーら、１９８９、Biochem．Biophys．Acta .６２９：３９９−４０８;デイ（Day）ら、１９９２、J．Biol．Chem．１６７：１３８５７−１３８６２；シマザキ（Shimazaki）ら、１９９３、J．Dairy Scl ．７６：９４６−９５５。ヒトラクトフェリンのクロ−ニングしたアミノ末端断片を用いた実験（デイら、１９９２、J．Biol．Chem．１６７：１３８５７−１３８６２）およびウシラクトフェリンにタンパク質分解的に由来のカルボキシ末端断片（シマザキら、１９９３、J．Dairy Scl．７６：９４６−９５５）を用いた実験は本発明において報告されるように鉄結合のｐＨ依存性において類似の相違を示した。しかしながら、以前の報告はカルボキシ末端葉またはその位置グはアミノ末端葉鉄結合機能を安定させるために必要であることを示したが、これらの実験はカルボキシ末端葉または機能的なカルボキシ末端鉄結合活性の構造的な存在が、アミノ末端葉に対する鉄結合の安定化に必要か否かを決定するために残されて制限されている。本発明はこれらの実験を拡張し、ついで機能的なカルボキシ末端葉によって主として駆動される協調的相互作用が鉄結合安定化に必要であることを示している。トランスフェリンファミリーの進化における２葉構造の選択に関するバイアスは未知である。本開示はラクトフェリンの場合におけるこの選択に関する機能的な論理的根拠を提供する。このように、本発明は２葉構造の進化が、ラクトフェリンにこのタンパク質の独特の機能活性に当たるようである、独特の鉄結合特性を付与したことを示す。興味深いことに、トランスフェリンはラクトフェリンとこのタンパク質のｐＨ依存性鉄放出特性およびタンパク質分解的に由由来するアミノ末端断片が類似であるということを示す点で異なっている。マズイエーら、１９８９、Biochem．Biophys．Acta．６２９：３９９−４０８；リンバック−ジンズ（Lieback-Zins）ら、１９８０、J．Biol．Chem．２５５：７０８−７１３。これらの発見は、トランシフェリンの２葉間の協調性の欠如が、このタンパク質の特徴的に弱い鉄結合安定性を説明する重要な要因であることを示唆するかもしれない。本明細書に記載した実験と共に、ラクトフェリンおよびトランスフェリンの異なる鉄結合特性が少なくとも一部分は、増加した酸安定性および２葉タンパク質の特徴である本葉にｐＨの安定性を付与するためアミノ末端葉との協調的機能を有するラクトフェリンのカルボキシ末端鉄結合葉の進化のためであることを示唆するかもしれない。Ｃ．ラクトフェリン変異体該タンパク質の鉄結合特性に貢献しているラクトフェリンポリペプチドにおけるそれらの領域、配列および構造の同定に基づき、本発明は、修飾した鉄結合能力を有する新規のラクトフェリン変異体またはその一部分の設計および産出のガイダンスを提供する。典型的には本発明のラクトフェリン変異体は、以下に限るものではないが、改良された抗微生物活性に対して一層高い親和性を有するラクトフェリン変異体、改良された鉄放出特性を有する鉄に対して一層低い親和性を有するラクトフェリン変異体または修飾したｐＨまたは温度条件または鉄結合および／または鉄放出の範囲を有するラクトフェリン変異体を含む改良された特性を有する。さらに、本発明は他の改良された特性、例えば治療上の耐性、免疫応答性または生物学的半減期などを有する一方、鉄結合能も保有しているラクトフェリン変異体の設計を可能にしている。本発明のラクトフェリン変異体は、以下に限るものではないが、ヒト、マウス、ラット、ウシおよびブタラクトフェリンを含む多様な哺乳類の野生型ラクトフェリン由来であるかもしれない。該野生型ラクトフェリンは一般的に公知である多様な方法によって突然変異されるかもしれない。他の個所、サンブルック（Sa mbrook）ら、１９９０、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular cloning:a laboratory manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、ニューヨーク；クンケル（Kunkel）ら、１９８７、Meth．Enzymol．１５４：３６７−３８２；クンケル、１９８５、Proc．Natl．Acad．Sci．USA ８２：４８８ −４９２参照。好ましい態様において、該ラクトフェリン変異体は、少なくとも１つの鉄結合部位に影響を及ぼす少なくとも１つの突然変異を含む。そのような鉄結合部位は、野生型ラクトフェリンに比較して修飾した鉄結合特性を有するかもしれない。例えば、鉄に対する親和性は増加または減少するかもしれない。さらに、鉄に対する親和性は修飾したpH範囲の特徴を示すからもしれない。代わりに、該鉄結合部位はラクトフェリン変異体またはその一部は全く鉄と結合しないように修飾されるかもしれない。他の態様において、該ラクトフェリン変異体は、ラクトフェリンの治療上の耐性、生物学的安定性または免疫応答性の修飾に影響を及ぼすが、一方でその生物学的活性を保有している少なくとも１つの突然変異を含まない。Ｄ．ラクトフェリン変異体の発現および産生ラクトフェリン変異体をコードする本発明の核酸配列は、ラクトフェリン変異体の発現を可能にするような方法で真核生物細胞においてその発現に適しているベクターに挿入されるかもしれない。代わりに、本発明のラクトフェリン変異体の一部をコードする核酸配列は真核生物細胞における発現を可能にするベクターに挿入されるかもしれない。好ましくは、ラクトフェリン変異体の一部は、修飾されていてもよい少なくとも１つの鉄結合部位を含む。好ましい態様において、ラクトフェリンは組換え発現系において産生される。他の個所、ウォードら、１９９２、Biotechnology １０：７８４−７８９；ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８−５０３参照。この目的のため、ラクトフェリンの望ましい形態の核酸コーディング（例えば、米国特許第５，５７１,６９１号（参照のためその全体を包含する）参照）は、特定のペプチドまたはタンパク質の発現に適当な条件下でついで培養され、細胞宿主において発現上は組み込まれる。多様な遺伝子発現系がこの目的に適合し、ついで典型的に選択された宿主によってもともと使用される発現コントロールから所望の遺伝子の発現を駆り立てる。本発明のラクトフェリン変異体は、天然に存在するラクトフェリンのように典型的には、いくつかのアミノ酸残基でのグリコシル化などの翻訳後修飾を必要とするので、多くのラクトフェリン変異体またはその一部は真核生物宿主中で産生されることが必要である。好ましい態様において、ラクトフェリン産物は、ウォ一ドら、１９９２、Gene １２２：２１９−２２３；および米国特許第５,５７１ ,８９６号および５,５７１,６９７号（参照のためその全体を包含する）に記載されるように、アスペルギルス発現系によって製造される。ラクトフェリン変異体またはその一部のグリコシル化されていない形態が製造される場合は、しかしながら、その産物は例えば大腸菌などの細菌宿主において便利に達成されるかもしれない。そのような産物に関して、選択されたラクトフェリン変異体またはその一部に関すろ核酸コーディングは、例えば大腸菌のlac 、trpまたはPL遺伝子の発現コントロール下で有用に置かれるかもしれない。ラクトフェリン変異体またはその一部に関する核酸コーディングの別発現自体の代わりとして、該宿主は、ラクトフェリン産物が発現産物の単離および安定性を容易にする運搬タンパク質と放出可能に結合する融合タンパク質として、ラクトフェリン産物を発現するよう適合されることができる。さらに別法において、該ラクトフェリン変異体またはその一部は組織合成によって産出されるかもしれない。特にラクトフェリン変異体の産物、例えば約２０〜約５０アミノ酸長のペプチドなどが明らかな場合には、好ましくは自動化されたペプチド合成のうまく確立された技術が使用される。一般的な記載は、例えば、ステュワート（J．M．Stewart）およびヤング（J．D．Young）、ソリッド・フェイズ・ペプチド・シンセシス（Solld Phase Peptide Synthesis）、第２版、１９８４、ピアス・ケミカル・カンパニー（Pierce Chemlcal Company)、ロックフォード（Rockford）、イリノイ；およびボダンスキー（M．Bodanszky）およびボダンスキー（A．Bodanszky）、ザ・プラクティス・オブ・ペプチド・シンセシス（The Practice of Peptide Synthesis）、１９８４、スプリンガー−ヴェアラーグ（Springer-Verlag）、ニューヨーク；アプライド・バイオシステムズ（Ap plled Biosystems）４３０Ａユーザーズ・マニュアル、１９８７、ABI Inc.フォスター・シティー、カリフォルニア；およびソリッド・フェイズ・ペプチド・シンセシス−ア・プラクティカル・アプローチ（A Practical Approach）、アザートン（E．Atherton）およびシェパード（R．C．Sheppard）、IRLプレス、オックスフォード（１９８９）に見られる。これらの技術において、ラクトフェリン変異体部分は、FmocまたはtBocプロトコールのいずれかを用いて適切に保護されたアミノ酸の連続的付加によって、Ｃ−末端の樹脂コンジュゲート残基から増殖する。Ｅ．応用本発明のラクトフェリン変異体は広範囲な多様案応用に使用されることができる。例えば、改良された鉄結合能力を有するラクトフェリン変異体またはその一部は、ヒトまたは動物の食物に添加するか、点眼剤、点鼻剤、コンタクトレンズおよびたの眼球ケア溶液、局所的皮膚ケア産物、マウスウォッシュ、チューイングガムおよび歯磨き粉に添加するなど、感染の治療を含み、抗微生物上の応用に使用されるかもしれない。修飾されたｐＨまたは温度条件を有するラクトフェリンまたはその一部はまた上記の応用に関して有用である。それらはさらに、増強されたかまたは修飾された鉄輸送および運搬に関して治療上の添加物として使用されてよい。ラクトフェリン変異体およびその一部の他の応用は、１９９７年４月１０日に出願された代理人整理番号８２０６−０４１−８８８、継続中の分割出願（参照のため全体を包含する）において記載されているように炎症性皮膚疾患の治療を含む。上記で同定した出願の多くに関しては、例示として理解されるのみであるが、改良された治療耐性、修飾した生物学的安定性または免疫応答性を有するラクトフェリン変異体およびその一部は特に好ましい。Ｆ．医薬製剤および投与経路治療上の利用に関して、ラクトフェリン変異体またはその一部は、個々の治療剤または治療剤を組み合わせた製薬組成物とコンジュゲートしての使用に利用可能な任意の従来手段によって投与することができる。各々は単独で投与されることができるが、一般的には選択された投与経路および標準的な製薬学的な実例に基づいて選択された製薬学的担体と共に投与される。本発明の医薬組成物は経口、非経印局所または直腸投与または吸入に合わせてもよく、単位用量形態におけるもので当業者によく知られた方法で合わせてよい。非経口投与には以下に限るものではないが、皮下注入、静脈内、腹腔内または筋肉内投与を含む。活性成分での治療は、治療されるべき徴候、例えば感染徴候または皮膚障害、例えば乾癬、接触性皮膚炎、ＵＶ誘発性炎症、乳児のオムツかぶれ、喘息、関節炎などが診断された後ならいつでも開始してよい。治療は、最初の段階で多大な感染または炎症を予防するために、予防的または疾患の初期に開始されるのが好ましい。典型的に、治療は疾患が治癒するまで続けられる。感染、喘息または関節炎などの慢性疾患の場合またはアレルゲンに持続的にさらされた場合には、治療は徴候の治癒を越えて拡張されなければならない。投与量はもちろん、（１）特定のラクトフェリン産物の薬物動態的特徴およびその様式および投与経路、（２）受容体の年齢、健康状態、背丈および体重、（３）徴候の特性および範囲、（４）共存する治療の種類、（５）治療頻度および（６）望ましい効果などの公知の要因に依存して変化する。活性成分の一日用量は上記の要因に依存して当業者によって決定されることができる。活性成分は、吸入または例えば内枠ジョイントまたはカートリッジなどの注入として局所的に投与されるかもしれない。しかしながら、代わりにラクトフェリン変異体は、硬セラチンカプセルまたは軟ゼラチンカプセル、錠剤または粉末剤などの固体または半固体の投与形態において、またはエリキシル剤、シロップまたは懸濁液などの液体投与形態において局所的に投与されることができる。また非経口的に無菌液体投与形態において投与されることもできる。他の投与形態は、パッチ剤または軟膏または経皮投与などの潜在的に可能な形態である。本発明のラクトフェリン変異体はまた、ラクトフェリン産物の延長されたかつ持続的な徐放性埋め込み装置としての製剤であってもよい。そのような持続性徐放性製剤には、ポリ（酪酸）、ポリ（ラクティック−コ−グリコリック酸（lact ic-co-glycolic acid）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの生物学的可逆可能なポリマーの成分を含む。ドラッグデリバリービヒクルにおける分解可能なポリマーの構造、選択および使用は、ドーム（A．Comb）ら、ポリマーズ・フォー・アドバンスト・テクノロジー（Polymers for AdvancedTechnol ogies）３：２７９−２９２（１９９２）を含むいくつかの刊行物において概説されている。医薬製剤におけるポリマーを選択および用いてのさらなるガイダンスは、チェイシン（M．Chaisin）およびレンジャー（R．Langer）編、「バイオデグラデブル・ポリマーズ・アズ・ドラッグ・レリバリー・システムズ（Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems)」、「ドラッグズ・アンド・ザ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（Drugs and the Pharmaceut ical Sciences）」第４５巻、デッカー（M．Dekker）、ニューヨーク、１９９０のテキストにおいて見出すことができる。リポソームをまた使用して、ラクトフェリン変異体またはその一部の徐放が提供されるかもしれない。使用法および関心のある薬剤のリポソーム製剤の製造法に関する詳細は、米国特許第４，９４４ ,９４８号、米国特許第５,００８,０５０号；米国特許第４,９２１，７０６号；米国特許第４,９２７,６３７号；米国特許第４,４５２,７４７号；米国特許第４ ,０１６,１００号；米国特許第４,３１１,７１２号；米国特許第４,３７０,３４９号；米国特許第４，３７２,９４９号；米国特許第４，５２９，５６１号；米国特許第５,００９,９５６号；米国特許第４,７２５,４４２号；米国特許第４，７３７,３２３号；米国特許第４,９２０,０１６号他の場所に見出されることができる。徐放性製剤は局所的に高濃度のラクトフェリン変異体が提供されるのが好ましい場合、例えば、関節炎の関節においてまたは局所的な皮膚炎症などに提供されるのが好ましい場合に特に興味深い。ゼラチンカプセルまたは液体を充填した軟ゼラチンカプセルは、活性成分およびラクトース、レシチンスターチ、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などの粉末化しているかまたは液体の担体を含んでいてよい。同様の希釈剤は打錠剤の製造に使用されることができる。錠剤およびカプセルの両者は、一定の時間をかけて薬物の持続的放出を提供するために徐放性産物として製造されることができる。打錠剤は糖衣またはフィルムコートされることによってどんなに不快な風味も覆うことができ、空気から錠剤を保護することができ、または消化管における選択的な崩壊のため腸内コートすることができる。経口投与のための液体投与形態は、患者の受容を高めるために着色および/または風味を含有することができる。適当な製薬学的担体はさらに、レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ (Remington's Pharmaceutical Sciences)、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company）、イーストン、ペンシルバニア（１９９０）なる、本分野において標準的な参照テキスト（参照のため本明細書に全体を包含する）に記載されている。以下の実施例は本発明をより詳細に説明する。以下の準備および実施例は当業者が本発明を一層明確に理解し、かつ実施できるように与えられる。本発明はしかしながら、例示された態様によって範囲を制限されるものではないし、その例示態様は本発明の１側面の例示を意図するだけであり、かつ機能的に同等の方法は本発明の範囲内にある。事実、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の多様な改変が前記明細書および添付の図面から当業者には明らかであろう。そのような改変は付されたクレームの範囲内に存在すると意図されている。ＶII．実施例 A．材料と方法ｐＰＬＦ−２６、全世界的なアスペルギルス・アワモリ発現ベクターの構築。アスペルギルス・アワモリにおけろラクトフェリン製造のための、発現ベクターｐＰＬＦ−１９の構築は以前に記載されている。ウォードら、１９９５、Biotec hnology １３：４９８−５０３；米国特許第５,５７１,８９６号。ラクトフェリン変異体をコードするｃＤＮＡの独特のクローニングサイトを含む発現ベクターの構築のため、ｐＰＬＦ−２６を製造した。端的には、ｐＰＬＦ−１８（ウォードら、１９９５、Biotechno1ogy １３：４９８−５０３）をSphIで消化し、３. ３Kbおよび４.４Kbの２つの断片を産生する。ラクトフェリンｃＤＮＡを含むその３．３KbSphI断片はSphI消化したpALTER(プロメガ（Promega）、マジソン、ウィスコンシン)にサブクローニングしてpＬＦ１８sp.Altを産生する。その４.４K bSphI断片を退けてＰＲ１８.２を産生する。市販されており利用可能なpALTERキット（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）を用いるイン・ビトロ突然変異誘発を使用して、成熟ラクトフェリンｃＤＮＡの開始でNotI制限部位をpNot.９を産生するpLFI８Sp．Altに導入する。突然変異誘発に使用された５'リン酸化オリゴヌクレオチドは以下である：ＰＲ１８.２をEcoRIで消化し、得られた２つの断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて修復し、正しい方向に再度ライゲーションした。得られたプラスミドＰ▲Ｅ１２をSphIで消化し、ついでpPLP−２５を産生するpNot.９からの３．３Kbとライゲーションした。PL０３はβ−チュブリンプロモーターのコントロール下でフレオマイシン耐性遺伝子をコードするものであるが、EcoRIで消化し、得られた、断片をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて修復し、正しい方向に再度ライゲーションした。得られたベクターPLO３▲Ｒ１をHindIII で消化し、ついで得られた２.３Kb断片をpPLP-２６を産生するラクトフェリンｃＤＮＡと同方向にサブクローニングした。鉄結合欠損ラクトフェリン変異体、MN-2Y、MC-2Yおよ訳MNC-4Yの構築。EcoRI／B amHI末端を有する合成５'リン酸化オリゴヌクレオチドを産生してNotI部位をpAL TERに導入した。オリゴヌクレオチドの配列は以下である。上鎖は下鎖：オリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、pALTLinkを産生するEcoRI／BamHI消化 pALTERにライゲーションした。pLF-２６をNotI／EcoRIで消化し、ついで得られた２．１Kb断片含有ヒトラクトフェリンｃＤＮＡをNotI／EcoRI消化pALTLINKにサブクローニングした。得られたプラスミドpALThLFを使用し、続いて突然変異誘発実験を行った。アミノ末端葉（Tyr ９３、Tyr １９３）、カルボキシ末端葉（Tyr ４３６、Tyr ５２９）およびアミノ末端およびカルボキシ末端葉（Tyr ９３、Tyr １９３、Tyr ４３６およびTyr ５２９）のラクトフェリンによる鉄結合に関与するチロシン残基をpALTERキットを用いてイン・ビトロ突然変異誘発により対応するアラニン残基に変換した。突然変異誘発に使用した５'リン酸化オリゴヌクレオチドは以下である。得られたプラスミド、pALTMN-２Y、pALTMC-２YおよびpALTMNC−４YをNotI／EcoR Iで消化し、ついでアスペルギルス菌細胞、すなわちp２６MN-2Y、ｐ２６MC-２Y およびp２６MNC-４Y中などでのラクトフェリンの発現にそれぞれ適した発現プラスミドを産生するNotI／EcoRI消化したpPLP−２６にサブクローニングした。すべてのオリゴヌクレオチド配列および構築ジャンクションを、市販されており、利用可能なシークエナーゼ・バージョン２.０キット（Sequenase Version 2.0 k it）（ユナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイション（United S tates Biochemical Corporation）、クリーブランド、オハイオ）を用いてシークエンシングした。 MN-2Y、MC-2YおよびMNC-4Yの発現および精製。アスペルギルス・アワモリ発現ベクターである、p２６MN-２Y、p２６MC-２Yおよびp２６MNC-４Yをアスペルギルス・アワモリに形質転換して得られたトランスフォーマントを以前に記載したように７日間培養した。ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８−５０３。その培養培地をＥＬＩＳＡアッヤイを用いて鉄結合変異体に関してスクリーニングした。ビジャ（Vija）ら、１９８５、J．Immunol．Meth．７６：７３− ８３。陽性の培養物（>５０mg／l）を２リットルフラスコで７日間培養し、ついでそのラクトフェリン変異体をＣＭ−セファデックス(CM-Sephadex)を用いた鉄交換クロマトグラフィーにより精製した。ウォードら、１９９５、Biotechnolog y １３：４９８−５０３。そのタンパク質を０.１Ｍのクエン酸に対して透析し、H₂Oおよび5mMリン酸ナトリウム、pH７.５（３ｇ）に対して拡張透析した。受容体結合アッセイ。受容体結合アッセイを本質的には記載されたように、８日齢カコ−２溶解膜（３００ng）を用いて、タンパク質／アビジンマイクロタイタープレートアッセイ（レジマン（Rejiman）ら、１９９４、Int．J．Biochem.２６：２０１−２０６）により行った。ラクトフェリン変異体に対する鉄結合の鉄飽和およびPH安定性。MN-2Y、MC-2Y およびMNC-4Y（５ｍｇ）を４倍の過剰量のFeCl₃：⁵⁹FeCl₃:NTA（４００：１：８）とインキュベートした。ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８−５０３。そのサンプルを室温で３０分間インキュベートした。そのサンプルをNAP−１０カラム（ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を通して精製し、続いてラクトフェリン変異体に非特異的に結合した任意の鉄を除去するために０.０５M Tris／HCl、０.２M NaCl、pH７.０に対して１２時間の透析を行った。透析後にラクトフェリン変異体に結合した鉄を液体シンチレーションカウンティングにより定量した。ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８−５０３。 B．実施例１：ラクトフェリンのアミノ末端およびカルボキシ末端ドメインにおける鉄結合欠損変異体の発現および精製２つのドメイン構造のラクトフェリン独特の鉄結合特性への貢献を調べるために、部位関連突然変異誘発法を使用して、タンパク質のいずれか一方の葉または両葉において欠損しているタンパク質をコードするヒトラクトフェリンｃＤＮＡに突然変異を産生した。特に、Tyr ９３、Tyr １９３を突然変異させて、ラクトフェリンのアミノ末端半分において鉄を結合することができない変異体Ala ９３、Ala １９３を産生する(MN-2Y)。ラクトフェリンTyr ４３６、Tyr ５２９のカルボキシ末端半分における対応チロシン残基をアラニン残基に変換して、カルボキシ末端ドメイン（MN -2Y）の鉄結合機能の不活性化を生じる。ラクトフェリンによる鉄結合に関与する全部で４つのチロシン残基（すなわちTyr ９３、Tyr １９３、Tyr ４３６およびTyr ５２９）をまた突然変異させて、ラクトフェリンの両葉において鉄結合が可能ではない変異体を産生する対応するアラニン残基を得た（MNC-4Y）。そのラクトフェリン変異体を組換えヒトラクトフェリンに関して以前に記載されるように、アスペルギルス・アワモリから発現させて精製した。ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８-５０３、米国特許第５，５７１,８９６号。その精製したタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、ウエスタンイムノブロット分析または銀染色分析のいずれかを行う。図１参照。図１ Aレーン１-４に示すように、ヒトラクトフェリンに対して特異的なポリクローナルIgGウエスタンイムノブロット分析は、３つのラクトフェリン変異体の各々に関する野生型組換えラクトフェリンの大きさに対応する免疫応答性のバンドを検出した。銀染色分析によって複製ゲルの分析は、そのラクトフェリン変異体が＞９５％純度であり、期待される分子量〜８OkDaの単独のバンドがそのタンパク質の各々に関して観察されることを示す。図１B、レーン１-４参照。従って、ラクトフェリン変異体の大きさおよび免疫応答性は野生型組換えラクトフェリンから区別可能である。 C．実施例：ラクトフェリンの鉄結合欠損変異体は野生型組換えヒトラクトフェリンに対する類似の腸内受容体結合特性を有するアミノ酸アラニンおよびチロシンの類似性に基づき、鉄結合ラクトフェリン変異体におけるチロシンからアラニン残基への１つのアミノ酸置換は、そのタンパク質に対する最小の構造を生じると仮定されることができる。従って、鉄結合から独立である鉄結合欠損変異体の活性は、野生型組換えヒトラクトフェリンのその活性と類似であるべきである。出願人およびその他の人々は以前に、ヒト腸内細胞に関する鉄飽和ラクトフェリンの特異的なかつ飽和性受容体の存在を示している。アイアーら、１９９３、Eur．J．Clin．Nutr．４７：２３２−２４１；コックス（Cox）ら、１９７９、Biochem．Biophys．Acta．５５８：１２９-１４１；フ（Hu）ら、１９８８、Biochem．J．２４９：４３５−４４１；ギスレイソン（Gislason）ら、１９９５、J．Pediatr．Gastroent．Nutr．２１：３７−４３；ミコガミ（Mikogami）ら、１９９４、Am．J．Physiol．２６７：Ｇ１-Ｇ８；ウォードら、Biotechnology １３：４９８-５０３。従って、鉄結合ラクトフェリン変異体に関する競合受容体結合アッセイを使用するための必要条件として、鉄飽和組換えラクトフェリンに対する無鉄関連受容体の結合動力学が確立されることが必要である。競合受容体結合アッセイは以前に記載されたように行われる。ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８-５０３。ビオチン化鉄飽和組換えヒトラクトフェリン（０.４μＭ）をO-2O倍の過剰モルの未標識アポ-または鉄飽和組換えヒトラクトフェリンの存在下で、ヒト腸内カコ-２細胞膜とインキュベートし、ついでビオチン／アビジンマイクロタイターアッセイを行った。ウォードら、１９９５、Biotechnology １３：４９８-５０３。この分析の結果を図２Aに示す。驚くべきことに、アポ飽和ラクトフェリンおよび鉄飽和ラクトフェリンの両者は、ヒト腸内カコ-２細胞膜に対する鉄飽和ビトオチン化ラクトフェリンの結合を除去する比較可能な能力を示し、そのことはラクトフェリンの両形態が類似のラクトフェリン腸内細胞受容体に関する類似の親和性を有することを示した。ラクトフェリンは鉄をこれらの受容体を介して腸内細胞へと運搬すると提起されているが、類似関連受容体結合親和性または無鉄および鉄飽和ラクトフェリンは、これらの受容体を介してラクトフェリンが鉄を運搬する能力が、第一に腸ルーメンにおいて存在する無鉄ラクトフェリンに対して鉄飽和ラクトフェリンの相対的量に依存することを示唆する。その腸内受容体に関するアポーラクトフェリンの親和性を確立すると、ラクトフェリン変異体での競合受容体結合アッセイを野生型タンパク質の機能活性と変異体の機能活性に関して比較するために上記のように行った。この分析の結果を図２B、２Cおよび２Dにおいて示す。全部で３つの鉄結合欠損変異体は、野生型タンパク質に比較してカコ-２膜への無鉄ビオチン化ラクトフェリンの結合を特異的に阻害する能力において、有意差を全く示さなかった（＜２倍の変動）。これらの結果は、チロシン残基の突然変異がそのタンパク質の鉄独立受容体結合活性を妨害しないことを示唆している。 D．実施例３：ラクトフェリンのアミノ末端およびカルボキシ末端葉における鉄結合に関するチロシン残基の突然変異が選択的にタンパク質の突然変異した葉の鉄結合能力を妨害するラクトフェリンのいずれか一方または両方の葉における２つのチロシン残基の突然変異が、その突然変異した葉の鉄結合能力を妨害するのに十分であることを確かめるために、⁵⁹FeCl₃を用いて鉄飽和分析を行った。この分析の結果を図３に示す。４倍過剰量の鉄の存在下で、野生型組換えラクトフェリンは期待されるように、２：０モル比の鉄／タンパク質で飽和した。完全なカルボキシ末端鉄結合機能を有するMN-2Yは１：１モル比で飽和する一方、完全なアミノ末端を有するMC-2Yは１：１より低い比率で飽和し、そのことはpH ７.０にてこのラクトフェリン変異体から幾分、鉄の損失が考えられることを示す。従って、ラクトフェリンのアミノ末端半分またはカルボキシ末端半分のいずれが一方における、鉄結合に関与するチロシン残基の妨害は、突然変異した葉でのみ選択的に鉄結合能力が廃止されることを示している。さらに、この分析からの結果は、ラクトフェリンによる鉄結合に関与する全部で４つのチロシン残基の突然変異が、選択的にこのタンパク質の鉄結合能力を除去することを示した。 E．実施例４：ラクトフェリンのアミノ末端およびカルボキシ末端葉の間の協調性がこのタンパク質の独特な鉄結合安定性に貢献する鉄結合欠損ラクトフェリン変異体は大きさ、免疫応答性および受容体結合分析によって決定されるように、野生型組み換えラクトフェリンに類似であることを確立すると、これらのラクトフェリン変異体からのpH依存性鉄放出を分析して、ラクトフェリンの鉄結合安定性への２葉構造の貢献を決定した。ラクトフェリン変異体を⁵⁹FeCl₃で飽和させて、pHが７〜２の範囲のバッファーに関して４℃で４８時間透析した。そのラクトフェリン変異体に結合したままの鉄の量を液体シンチレーションカウンティングで定量した。この分析の結果を図４に示す。完全なカルボキシ末端鉄結合末端鉄結合葉を保有しているMN-2Yからの鉄放出外形は、組換えラクトフェリンの外形に類似であり、pH５.０で鉄放出が開始し、pH２.０で完了する。対して、完全なアミノ末端鉄結合葉を含むMC- 2YからのpH依存性鉄放出は顕著に異なる。この変異体からの鉄放出はpH7.Oで開始され、これはMC-2Y（図４）の鉄飽和が１：１より少ないことと一致する。さらにMC-2Yからの鉄放出はpH５.０で完了する。これらの結果は、ラクトフェリンのアミノ末端およびカルボキシ末端葉が鉄結合のpH安定性に関して異なり、かつ機能的な鉄結合カルボキシ末端葉が野生型タンパク質に特徴的である、アミノ末端ドメインに対する増加したpH安定性を付与するのに必要であることを示唆する。これらの観察に基づき、ラクトフェリンの２つの半分の間の協調的な相互作用は、主としてカルボキシ末端葉によって強いられ、このタンパク質に独特である鉄結合のpH安定性に貢献すると結論づけることができる。本明細書の態様内に引用された全ての参照文献は、その全体を参照のため本明細書に引用する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年６月１５日（１９９８．６．１５）【補正内容】請求の範囲１．ラクトフェリン変異体またはその一部がさらに少なくとも１つのラクトフェリンの鉄結合部位に対応する配列を含むと定義され、ラクトフェリン変異体またはその一部が修飾した鉄結合能力を有し、少なくとも１つのラクトフェリンの鉄結合部位に対応する配列が、アミノ末端葉におけるAsp ３９６、Tyr ９３、Tyr １９３およびHis ２５４およびカルボキシ末端葉におけるAsp ３９６、Tyr ４３６、Tyr ５２９およびHis ５９８よりなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸の突然変異または欠失を含むラクトフェリン変異体またはその一部をコードする核酸配列。２．MN-2Y、MC-2YおよびMNC-4Yよりなる群から選択されるラクトフェリン変異体をコードする核酸配列。３．（a）プロモーター；（b）請求項１に記載のラクトフェリン変異体またはその一部をコードするDNA；および（c）転写および翻訳開始配列および転写および翻訳終結配列；を含む組換えベクターであって、該ベクターがラクトフェリン変異体を産生することができ、プロセシングしたタンパク質と同じように発現することができる組換えベクター。４．ラクトフェリン変異体またはその一部の発現に適合したベクターであって、該ベクターが請求項１に記載のラクトフェリン変異体またはその一部をコードするDNAを含み、該細胞中の該DNAの発現に必要な調節配列を含むベクター。５．（a）請求項１に記載のラクトフェリン変異体またはその一部をコードする核酸；および（b）プロモーター、および転写および翻訳開始配列および転写および翻訳終結配列；を含むベクターであって、該ベクターが真核生物細胞中のヒトラクトフェリンの発現に使用されるベクター。６．p26MN-2Y、p26MC-2Yおよびp26MNC-4Yよりなる群から選択されるベクター。７．請求項５に記載のべクターを含む形質転換した真核生物細胞。８．該細胞が細菌類、哺乳類および昆虫細胞よりなる群から選択される請求項７に記載の真核生物細胞。９．該真核生物細胞がアスペルギルス・オリゼ、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・ニードランスおよびアスペルギルギルス・アワモリよりなる群から選択される細菌細胞である請求項８に記載の真核生物細胞。１０．請求項６に記載のベクターを含む形質転換した真核生物細胞。１１．該細胞が細菌類、哺乳類および昆虫細胞よりなる群から選択される請求項１０に記載の真核生物細胞。１２．該真核生物細胞がアスペルギルス・オリゼ、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・ニードランスおよびアスペルギルギルス・アワモリよりなる群から選択される細菌細胞である請求項１１に記載の真核生物細胞。１３．（a）該ベクターが真核細胞中でラクトフェリン変異体およびその一部の発現に適しており、 i）請求項１に記載の核酸；および ii）プロモーター、転写および翻訳開始配列および転写および翻訳終結配列；を含むベクターで真核生物細胞を形質転換し、（b）ラクトフェリン変異体タンパク質が形成され栄養培地に分泌され、単離されるまで、適当な栄養培地において該形質転換した真核生物細胞を培養するよりなる工程を含む請求項１に記載のラクトフェリン変異体またはその一部を産生する方法。１４．請求項１に記載の核酸によってコードされるラクトフェリン変異体またはその一部。１５．MN-2Y、MC-2YおよびMNC-4Yよりなる群から選択されるラクトフェリン変異体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．ラクトフェリン変異体またはその一部がさらに少なくとも１つのラクトフェリンの鉄結合部位に対応する配列を含むと定義され、ラクトフェリン変異体またはその一部が修飾した鉄結合能力を有するラクトフェリン変異体またはその一部をコードする核酸配列。２．MN-2Y、MC-2YおよびMNC-4Yよりなる群から選択されるラクトフェリン変異体をコードする核酸配列。３．（a）プロモーター；（b）請求項１に記載のラクトフェリン変異体またはその一部をコードするDNA；および（c）転写および翻訳開始配列および転写および翻訳終結配列；を含む組換えベクターであって、該ベクターがラクトフェリン変異体を産生することができ、プロセシングしたタンパク質と同じように発現することができる組換えベクター。４．ラクトフェリン変異体またはその一部の発現に適合したベクターであって、該ベクターが請求項１に記載のラクトフェリン変異体またはその一部をコードするDNAを含み、該細胞中の該DNAの発現に必要な調節配列を含むベクター。５．（a）請求項１に記載のラクトフェリン変異体またはその一部をコードする核酸；および（b）プロモーター、および転写および翻訳開始配列および転写および翻訳終結配列；を含むベクターであって、該ベクターが真核生物細胞中のヒトラクトフェリンの発現に使用されるベクター。６．p26MN-2Y、p26MC-2Yおよびp26MNC-4Yよりなる群から選択されるベクター。７．請求項５に記載のベクターを含む形質転換した真核生物細胞。８．該細胞が細菌類、哺乳類および昆虫細胞よりなる群から選択される請求項７に記載の真核生物細胞。９．該真核生物細胞がアスペルギルス・オリゼ、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・ニードランスおよびアスペルギルギルス・アワモリよりなる群から選択される細菌細胞である請求項８に記載の真核生物細胞。１０．請求項６に記載のベクターを含む形質転換した真核生物細胞。１１．該細胞が細菌類、哺乳類および昆虫細胞よりなる群から選択される請求項１０に記載の真核生物細胞。１２．該真核生物細胞がアスペルギルス・オリゼ、黒色アスペルギルス、アスペルギルス・ニードランスおよびアスペルギルギルス・アワモリよりなる群から選択される細菌細胞である請求項１１に記載の真核生物細胞。１３．（a）該ベクターが真核細胞中でラクトフェリン変異体およびその一部の発現に適しており、 i）請求項１に記載の核酸；および ii）プロモーター、転写および翻訳開始配列および転写および翻訳終結配列；を含むベクターで真核生物細胞を形質転換し、（b）ラクトフェリン変異体タンパク質が形成され栄養培地に分泌され、単離されるまで、適当な栄養培地において該形質転換した真核生物細胞を培養するよりなる工程を含む請求項１に記載のラクトフェリン変異体またはその一部を産生する方法。１４．請求項１に記載の核酸によってコードされるラクトフェリン変異体またはその一部。１５．MN-2Y、MC-2YおよびMNC-4Yよりなる群から選択されろラクトフェリン変異体。