DE69433296T2

DE69433296T2 - Eisen-lactoferrin kombination und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE69433296T2
Application number: DE69433296T
Authority: DE
Inventors: Shunichi Dosako; Toshio Sakurai; Naomichi Kobayashi
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1993-02-16
Filing date: 1994-02-16
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2014-02-17
Also published as: US5606086A; DE69433296D1; EP0656366B1; WO1994019375A1; JP2835902B2; JPH06239900A; EP0656366A1; EP0656366A4

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft thermisch stabile und hitzebeständige Eisen-Lactoferrin-Komplexe, die mit einer großen Menge Eisen gebunden sind, sowie deren Herstellung.
Die hitzebeständigen Lactoferrin-Komplexe der vorliegenden Erfindung enthalten eine große Menge Eisen, zeigen keinen eisenspezifischen adstringierenden Geschmack und verhindern die Beschleunigung der Peroxidbildung durch Eisen. Somit sind diese Komplexe als Rohmaterialien für Nahrungsmittel, Arzneimittel, Futtermittel, Kosmetika und dergleichen zur Prävention und Behandlung von Anämie, zur Erhöhung des Eisengehalts, oder zur Verhinderung der Infektion durch pathogene Mikroorganismen nützlich.
Hintergrund der Erfindung
Verschiedene physiologische Aktivitäten von Lactoferrin (im weiteren als Lf abgekürzt), wie die Beschleunigung der Eisenabsorption, Verhinderung von Lipoperoxidbildung, antibakterielle und antivirale Aktivität, Zellproliferation und Kontrolle des Immunsystems, sind bekannt. Deshalb ist Lf zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Arzneimitteln, Futtermitteln und Kosmetika versucht worden. Diese Produkte werden im allgemeinen vor der Verwendung thermisch pasteurisiert oder mit kochendem Wasser behandelt. Jedoch hat Lf den wesentlichen Nachteil einer Instabilität bei Hitze. Eine Hitzebehandlung verursacht Präzipitate aufgrund einer thermischen Denaturierung, und die Eisenbindungseigenschaft geht verloren, was zu einem physiolo gisch inaktiven Zustand führt. Untersuchungen zur Stabilisierung von Lf bei Hitze wurden durchgeführt und es hat sich gezeigt, dass eine Erwärmung bei pH 4 die Bindungseigenschaft von Lf an Eisen nicht beeinträchtigt (Davidson und Lonnerdal. Am. J. Physiol., 257: G930–934, 1989). Jedoch degeneriert bei pH 4 wärmebehandeltes Lf allmählich und verliert seine physiologischen Eigenschaften. Zudem hat eine Erwärmung von Lf bei einer niedrigen Ionenstärke dessen physiologische Aktivität aufrecht erhalten (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 108629/1992). Jedoch ist die praktische Ionenstärke in herkömmlich verwendeten Produkten nicht notwendigerweise niedrig. Der relative Einfluss auf die Wärmestabilität von Lf des pH und der Wärmeleitfähigkeit Ω wurde untersucht, um so ein Verfahren für die Hitzebeständigkeit von Lf zu entwickeln, und es hat sich gezeigt, dass Lf-Lösungen gegen Hitze stabilisiert werden können, indem log Ω so eingestellt wird, dass den folgenden Gleichungen genügt wird (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 9269/1992). log Ω ≤ (2,96/pH) + 0,64 (pH < 5) log Ω ≤ (29,37/pH) + 4,62 (5 ≤ pH ≤ 7,9) log Ω ≤ –0,917 (pH > 7,9)
Lf-Lösungen außerhalb der oben angegebenen Bereiche erfordern eine getrennte Pasteurisierung der Lf-Lösungen und anderen Rohmateriallösungen, gefolgt von einem aseptischen Mischen der pasteurisierten Lösungen. Japanische Vorschriften verlangen eine einzelne Pasteurisierung durch Erhitzen nach dem Mischen, und erlauben kein getrenntes Pasteurisieren und Mischen.
Offenbarung der vorliegenden Erfindung
Die Erfinder haben Untersuchungen vorgenommen, um die oben genannten Probleme zur Stabilisierung von Lf gegen Hitze zu lösen, und haben die Schlussfolgerung gezogen, dass es notwendig ist, Lf selbst zu modifizieren, um diesem eine Hitzebeständigkeit zu verleihen, während die Eisenbindungsfähigkeit aufrechterhalten wird. Die Erfinder fanden, hitzebeständige Eisen-Lf-Komplexe mittels Reaktionen von Eisensalzlösungen, welche Karbonsäure- oder Hydrogenkarbonsäureionen enthalten, und Lfs-Lösungen herzustellen. Die Eisensalzlösung muss einen pH ≤ 4 haben, wenn sie in Wasser gelöst wird, um die hitzebeständigen Komplexe von Lf und Eisen mittels Karbonsäure- oder Hydrogenkarbonsäureionen zu ergeben. Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung hitzebeständige Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe bereitzustellen. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung von hitzebeständigen Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexen bereitzustellen.
Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft hitzebeständige Eisen-Lf-Komplexe, in welchen Lfs mit Eisen über Karbonsäure und/oder Hydrogenkarbonsäure gebunden sind.
Zusätzlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexen. Eine wässrige Lösung von Lf wird zu Eisensalz hinzugegeben, welche einen pH ≤ 4 hat, wenn sie in Wasser gelöst wird, oder eine wässrige Lösung, in welcher Lf zusammen mit dem Eisensalz gelöst ist. Die wässrige Lösung wird durch Zugeben von Salz(en), die Karbonsäureionen oder Hydrogenkarbonsäureionen zum Binden von Eisen an Lf über Kohlensäureionen und/oder Hydrogenkohlensäureionen enthalten, auf einen pH ≤ 7 eingestellt.
Die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung zeigen eine ausgezeichnete Hitzebeständigkeit und sind löslich bei pH ≤ 7.
Jedoch, 1) fallen die gewonnenen Komplexe bei einem pH ≥ 7,1 aus, und 2) werden langsam unlöslich bei einer Lagerung bei pH ≤ 7, wenn 150 oder mehr Moleküle Eisen an ein Molekül Lf gebunden sind.
Deshalb ist es eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, hitzebeständige Lf-Komplexe und Verfahren zu deren Herstellung anzugeben, welche für einen langen Zeitraum in einem breiten pH-Bereich stabil sind.
Die Erfinder haben Untersuchungen angestellt, um die oben genannten Probleme zu lösen und fanden, dass 1) Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe durch Mischen einer Karbonsäure- und/oder Hydrogenkarbonsäureionen enthaltenden Lösung mit Lfs und einem Eisensalz gebildet werden, und dass 2) die Komplexe durch Hinzufügen von Lfs und einer Eisensalzlösung zu einer Karbonsäure- und/oder Hydrogenkarbonsäureion-Lösung bis Lf- und Eisen-(Hydrogen)karbonsäureverhältnisse in einem bestimmten Bereich liegen, gebildet werden können. Die sich ergebenden hitzebeständigen Komplexe enthalten Eisen in hohen Verhältnissen und sind in einem weiten Bereich von pH-Werten für einen langen Zeitraum stabil.
Ferner fanden die Erfinder heraus, dass die Komplexe hitzebeständig sind, ohne einen eisenspezifischen adstringierenden Geschmack, und eine Peroxidbildung von Eisen verhindern, und kamen so auf die vorliegende Erfindung.
Ein weiteres charakteristisches Merkmal der vorliegenden Erfindung betrifft Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe mit 15–1000 Moleküle Eisen und 15 Moleküle oder mehr Karbonsäure und/oder Hydrogenkarbonsäure pro einem Molekül Lf.
Diese Lf-Komplexe bilden kein Präzipitat mit einem charakteristischen adstringierenden Geschmack von Eisen, wenn sie bei einem pH 2,1–9,0 für wenigstens einen Monat bei gewöhnlicher Temperatur gelagert und mit hohen Temperaturen behandelt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung dieser Eisen-Lf-Komplexe.
Das heißt, die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexen durch Mischen von Lösung A, welche zusammengesetzt ist aus i) einem Karbonat oder ii) einem Hydrogenkarbonat oder iii) Karbonat und Hydrogenkarbonat und Lösung B, welche zusammengesetzt ist aus iv) Eisen und v) Lfs, um Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lactoferrin-Komplexe mit den folgenden charakteristischen Merkmalen 1) bis 4) zu ergeben.
Jedoch beträgt vi) die molare Konzentration der Eisenionen in Lösung B höchstens 1/3 oder weniger der viii) molaren Konzentrationen von Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen in einer gemischten Reaktionslösung von vii) Lösung A und dem gesamten oder einen Teil von Lösung B. Die molare Konzentration von ix) Lfs in Lösung B ist 1/15–1/1000 von jener der x) Eisenionen in Lösung B, und 1/50 oder weniger der molaren Konzentrationen von xi) Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen in der gemischten Reaktionslösung.

1) die Komplexe enthalten 15–1000 Moleküle Eisen und 15 oder mehr Moleküle Karbonsäure und/oder Hydrogenkarbonsäure pro einem Molekül Lfs,
2) die Komplexe bilden kein Präzipitat wenigstens für einen Monat bei pH 2,1–9,0 bei gewöhnlichen Temperaturen,
3) die Komplexe bilden kein Präzipitat durch Erwärmen, und
4) die Komplexe haben keinen eisenspezifischen adstringierenden Geschmack.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexen durch Mischen einer Lösung A, welche i) Karbonsäure, ii) Hydrogenkarbonsäure oder iii) Karbonsäure und Hydrogenkarbonsäure und iv) Lfs enthält, und einer Lösung B, welche v) Eisen enthält, um Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe mit den folgenden charakteristischen Merkmalen 1) bis 4) zu ergeben.
Jedoch ist vi) die Konzentration von Eisenionen in Lösung B 1/3 oder weniger der vii) molaren Konzentrationen von Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen in einer gemischten Reaktionslösung von viii) Lösung A und dem gesamten oder einen Teil von Lösung B. Die molare Konzentration von ix) Lf in Lö sung A ist 1/15–1/1000 von jener der x) Eisenionen in Lösung B, und 1/50 oder weniger der molaren Konzentrationen von xi) Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen in der gemischten Reaktionslösung.

1) die Komplexe enthalten 15–1000 Moleküle Eisen und 15 oder mehr Moleküle Karbonsäure und/oder Hydrogenkarbonat pro einem Molekül Lfs,
2) die Komplexe bilden kein Präzipitat wenigstens für einen Monat bei pH 2,1–9,0 bei gewöhnlichen Temperaturen,
3) die Komplexe bilden kein Präzipitat durch Erwärmen, und
4) die Komplexe haben keinen eisenspezifischen adstringierenden Geschmack.

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Lfs umfassen Lfs, isoliert von Milch von Säugern, wie Menschen und Kühe, Transferrrin, isoliert vom Blut oder Eingeweiden, und Ovotransferrin, isoliert von Eiern. Diese Lfs werden in großer Menge durch mehrere bekannte Verfahren isoliert und jedes Lf, das durch eines dieser Verfahren gewonnen wird, kann verwendet werden. Ferner können auch Lfs verwendet werden, die durch gentechnische Verfahren unter Einsatz von Mikroorganismen, Tierzellen oder transgenen Tieren erzeugt werden.
Enzymatisch hydrolisierte Lfs können als Lf verwendet werden. Eine vollständige Reinigung von Lfs ist nicht erforderlich und Rohkomponenten, die noch einige andere Komponenten enthalten, können auch verwendet werden.
In der ersten Erfindung werden Eisensalze verwendet, die einen pH ≤ 4 haben wenn sie in Wasser gelöst werden, beispielsweise FeCl₃, Fe (NO₃)₃ und Fe₂ (SO₄)₃. Andere Eisensalze, welche einen pH > 4 haben wenn sie in Wasser gelöst werden, können selbst durch Einstellen auf einen pH ≤ 4 mittels der Zugabe einer Säure keine Hitzebeständigkeit verleihen. In der vorliegenden Erfindung werden Eisensalze in einer Menge von 20–500 mg, vorzugsweise 40–500 mg, als Eisenionen für ein g Lf verwendet. Die Menge von Eisen über 500 mg hinaus, führt zu einem teilweisen Ausfällen von Eisen mit Lf.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Alkalisalze sind Salze, einschließlich Karbonsäureionen oder Hydrogenkarbonsäureionen. Ammoniumkarbonat, Natriumkarbonat, Kaliumkarbonat und dergleichen werden beispielhaft als Alkalisalze angegeben, die Karbonsäureionen enthalten. Ammoniumhydrogenkarbonat, Natriumhydrogenkarbonat, Kaliumhydrogenkarbonat und dergleichen sind beispielhafte Hydrogenkarbonsäureionen enthaltende Alkalisalze. Diese Alkalisalze können in Konkurrenz mit herkömmlichen Alkalihydroxiden, wie NaOH, Ammoniakwasser und KOH verwendet werden. Ein Hydrogenkarbonationen freisetzendes Alkalisalz kann zur Einstellung des pH während der Präzipitation verwendet werden. Jedoch sind Hydrogenkarbonsäureionen und Eisen in äquimolarer Menge an Lf gebunden notwendig, das heißt, 22–562 mg, vorzugsweise 35–400 mg Hydrogenkarbonsäureionen pro einem g Lf. Deshalb sollen 120 mg bis 5 g, vorzugsweise 350 mg bis 5 g Alkalihydrogenkarbonat pro 1 g Lf zu einer gemischten Lösung von Lf und Eisensalz hinzugegeben werden. Eine Zugabe von Hydrogenkarbonat von weniger als 350 mg, insbesondere weniger als 120 mg, vermindert die Menge an Eisen zur Bindung mit Lf über Hydrogenkarbonsäureionen und führt zu einer ungenügenden Hitzebeständigkeit von Lf. Andererseits verursachen Hydrogenkarbonsäureionen über 5 g Präzipitate durch eine Reaktion von überschüssigen Hydrogenkarbonsäureionen und Eisen. In der Reaktion soll die letzte hitzebeständige Lf-Eisensalzlösung einen pH ≤ 7 haben, oder andere Präzipitate werden gebildet.
Die Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung mit Hitzebeständigkeit haben eine Oberflächenstruktur, die verschieden ist, von jener von natürlichem Lf. Lf enthält eine Anzahl von basischen Aminosäuren, wie Lysin und Arginin, und lädt sich mit der Zugabe einer Eisenverbindung durch Ansäuern positiv auf. Das positiv geladene Lf bindet sukzessiv mit Hydrogenkarbonsäureionen und Eisen und bildet den hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplex der vorliegenden Erfindung. Die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe sind sogar bei einem Erhitzen auf 90°C stabil.
Allgemein ist die Bildung eines Lf vom eisengesättigten Typ durch Mischen mit einem Eisensalz und einem Hydrogenkarbonat seit langem bekannt. Das Lf vom eisengesättigten Typ weist eine Struktur aus zwei ähnlichen Bereichen eines N-Lappen bzw. eines C-Lappens auf, die ein Molekül Eisen binden. Das heißt, de N-Lappen weist vier Aminosäurereste von Asp60, Tyr92, Tyr192 und His253 auf, in welchen die Zahlen die Reihenfolge der Aminosäure vom N-Terminus angeben, welche gebunden sind mit einem Molekül der Eisenionen, und ein Hydrogenkarbonsäureion ist ferner mit dem Eisenion gebunden. Ähnlich weist der C-Lappen Asp395, Tyr435, Tyr528 und His597 auf, welche mit einem Eisenion binden (B. F. Anderson et al., J. Mol. Biol., 209, 711–734, 1989). Deshalb bindet Lf vom eisengesättigten Typ allgemein mit 1,4 mg Eisen bzw. 1,5 mg Hydrogenkarbonsäureionen pro 1 g Lf und führt zu einem leichten Anstieg der Stabilität im Vergleich zu jener von eisenfreiem Lf, präzipitiert jedoch durch Erhitzen auf 65°C oder höher.
Ferner bildet die Zugabe einer großen Menge Eisen zu Lf eine Eisen-Lf-Bindung unter Verlust von freiem Eisen aus, und ergibt eine stabilisierte Eisenlösung (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 141067/1992). Jedoch ist keine Hitzebeständigkeit von Lf durch die Zugabe einer großen Menge Eisen oder die Verwendung eines Karbonats oder eines Hydrogenkarbonats offenbart. Kein Beispiel der oben genannten japanischen, offengelegten Patentanmeldung offenbart die Verwendung eines Karbonats oder eines Hydrogenkarbonats. Deshalb sind die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung, welche Lf gebunden mit Eisen über ein Karbonsäureion und/oder Hydrogenkarbonsäureion aufweisen, ganz verschieden von jenen der bekannten Verbindungen.
Die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung enthalten weit mehr Eisen und Hydrogenkarbonsäureionen, als jene des Lf vom sogenannten eisengesättigten Typ, welche eine panzerartige Umhüllung bilden. Somit werden die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung wegen des Eisenpanzers nur schwer von einem Antikörper erkannt.
Der Antikörpererkennungstest der hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung ist unten angegeben:
Testexperiment 1
In einem Citratpuffer wurde Rinder-Lf gelöst. Eisen wurde von der Lösung entfernt, welche gegen Wasser dialysiert wurde, um 2 mg/ml einer Rinder-Lf-Lösung zu ergeben. Die Lösung wurde mit verschiedenen Mengen von FeCl₃ gemischt und mit 0,12–0,5 g NaHCO₃ pro 1 g Lf versehen, um pH 6,5 einzustellen. Die sich ergebende Lf-Lösung wurde mit gleichen Mengen von 0,1 M Imidazol-Puffer gemischt, welcher pH 6,6 aufwies und welcher 0,3 M NaCl enthielt. Getrennt wurde eine ELISA-Platte mit einem Anti-Rinder-Lf-Antikörper beschichtet, blockiert mit BlockAce (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), und mit der oben hergestellten Rinder-Lf-Lösung versehen. Die Mischung hat eine Stunde lang bei Raumtemperatur reagiert, wobei die mit Peroxidase markierten Anti-Rinder-Lf-Antikörper reagierten. Nach der Reaktion wurde die Platte gründlich gewaschen und anschließend mit ABTS-Substrat versehen. Eine Absorptionsrate bei 405 nm wurde bestimmt. Die Antikörpererkennungsraten bei verschiedenen Konzentrationen von Eisen sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Wie oben gezeigt, nahm die Konzentration von mit Antikörpern erkanntem Lf mit der Zunahme von über Hydrogenkarbonsäureionen an Lf gebundenes Eisensalz ab. Es wurde eine Lf- und Eisenlösung unter Verwendung von NaOH anstelle von NaHCO₃ und Einstellen von pH 6,5 als eine Kontrolllösung hergestellt, jedoch bildeten sich Präzipitate und diese konnte nicht für ELISA verwendet werden.
Die Hitzestabilität von Lf wurde unter Einsatz von verschiedenen Eisensalzen untersucht.
Testexperiment 2
Verschiedene Eisensalze, die in der unten angegebenen Tabelle 2 gezeigt sind, wurden zu einer Lf-Lösung gegeben, um eine Eisenkonzentration von 120 mg pro 1 g Lf herzustellen, und ein pH 6,3 wurde mit einer 1 M NaHCO₃-Lösung eingestellt. Die gewonnene Lösung wurde mit Imidazol für eine Endkonzentration von 0,05 M Imidazol und 0,15 M NaCl, pH 6,6, gemischt, und für 10 min auf 90°C erhitzt, wobei ein Ausfällen von Lf beobachtet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Wie oben gezeigt, (1) vermittelten Eisensalze, die einen pH ≤ 4 haben, wenn sie in Wasser gelöst sind, Lf eine Hitzebeständigkeit, jedoch konnten die anderen Eisensalze Lf keine Hitzebeständigkeit vermitteln, (2) konnten Eisensalze mit einem pH > 4, wenn sie in Wasser gelöst sind, keine Hitzebeständigkeit vermitteln, ungeachtet der Einstellung auf einen pH ≤ 4 mit einer Säure, und (3) mussten Eisensalze innerhalb einer vorbestimmten Menge hinzugegeben werden.
Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung zeigen bei ungefähr neutralem pH-Bereich eine Hitzebeständigkeit, die verschieden von jener in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 141067/1992 ist.
Testexperiment 3
In 15 ml einer wässrigen Lf-Lösung einer Konzentration von 2,7 mg/ml wurde FeCl₃ hinzugegeben, um eine finale Eisenionenkonzentration von 20–1000 μg/ml zu erstellen, 4–210 mg NaHCO₃ wurden hinzugegeben, um einen pH 6,2 einzustellen und die Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung zu ergeben. Getrennt wurden 15 ml einer wässrigen FeSO₄·7 H₂O-Lösung bei Konzentrationen von 20–1000 μg/ml zu Lf hinzugegeben, um eine Konzentration von 2,7 mg/ml zu ergeben, gemäß der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 141067/1992. Während des Verfahrens wurde eine Hydrogenkarbonatlösung nicht verwendet. Dies sich ergebenden Lösungen wurden mit 20 ml Wasser hergestellt, und jeweils 8 ml der Lösung wurden mit jeweils 8 ml der Pufferlösung gemischt (0,1 M Imidazol, HCl und 0,3 M NaCl, pH 6,6 oder pH 7,3). Die gemischten Lösungen wurden auf einen pH von 6,5 oder 7,2 eingestellt. Die gewonnenen Lösungen wurden auf 90°C für 10 min erhitzt, durften auf Raumtemperatur abkühlen, wurden bei 3000 U/min für 10 min zentrifugiert und der Lf-Gehalt im Überstand wurde mit dem ProteinAssay (Bio-Rad Col, Ltd.) bestimmt. Die Verhältnisse von in den Überständen verbliebenem Lf sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Wie oben gezeigt, hatten die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung eine Hitzestabilität von 73% oder höher im Bereich von 20–500 mg und 90% oder höher im Bereich von 40–500 mg Gesamteisengehalt pro 1 g Lf bei pH ≤ 7 in der Endlösung.
Die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung unterliegen keinen bestimmten einschränkenden Bedingungen zur Herstellung von Produkten, welche die Komplexe enthalten. Jedoch werden die Komplexe vorzugsweise für die Produkte verwendet, welche die folgenden Beziehungen zwischen End-pH und elektrischer Leitfähigkeit Ω aufweisen: log Ω > (2,96 pH) + 0,64 (4 ≤ pH < 5) log Ω > (29,37 pH) - 4,62 (5 ≤ pH ≤ 7)
Wenn der pH und die elektrische Leitfähigkeit Ω außerhalb des Bereichs der oben genannten Beziehungen liegen, dann kann ein bekanntes Pasteurisierungsverfahren (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 8269/1992) in befriedigender Weise verwendet werden, und wenn pH > 7 gilt, kann das hitzebeständige Lf der vorliegenden Erfindung nicht angewendet werden. Eine bestimmte Menge einer Säure kann hinzugegeben werden, um in den Produkten pH ≤ 7 einzustellen, wenn die Produkte einen pH > 7 zeigen. Dann können die Produkte thermisch pasteurisiert oder durch herkömmliche Verfahren sterilisiert werden. Eine Wärmebehandlung wird durch eine Niedrigtemperatur-Erhitzung auf 65°C für 30 min, oder 120°C für 2–3 s, oder 140–150°C für 3–5 s, oder durch Retortenbehandlung durchgeführt. Eine Verdampfung kann zu Pulverzubereitungen führen, die hitzebeständige Lf-Eisen-Komplexe enthalten. Eine Lyophilisierung kann auch angewendet werden um trockene Produkte zu erhalten, jedoch ist eine preiswertes Sprühtrocknen für die Herstellung einer großen Menge von Produkten zu bevorzugen.
Die durch diese Verfahren gewonnenen hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe enthalten Eisen und werden vorzugsweise zur Prävention und Behandlung von Anämie als Nahrungs- und Futterzusätze und Arzneimittel eingesetzt. Die Komplexe sind zur Herstellung von pathogenfreien Arzneimitteln (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 220130/1991), Futtermittel, Nahrungsmittel und Kosmetika geeignet. Die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise zur Herstellung von eisenangereicherten Getränken verwendet, da sie trotz ihres Eisengehalts den Geruch von Eisen nur wenig abgeben.
Von der zweiten Erfindung des vorliegenden Patents können wässrige Lösungen zur Herstellung von Lactoferrin-Komplexen, welche ein Karbonat und/oder ein Hydrogenkarbonat enthalten, kohlensaures Wasser, NH₄HCO₃, NaHCO₃, KHCO₃, Na₂CO₃, CaCO₃ oder deren gemischte Lösungen umfassen. Ferner können NaOH, Ammoniakwasser, KOH, HCl, Zitronensäure, Milchsäure und dergleichen als ein Mittel zum Einstellen des pH hinzugefügt werden. Die Lösungen können gegebenenfalls weitere Bestandteile, wie Zucker, Proteine und Fette, enthalten.
Die Eisenverbindungen, welche einen pH ≤ 4 haben, wenn sie in entionisiertem Wasser gelöst sind, können verwendet werden, um die Komplexe herzustellen, und umfassen hauptsächlich trivalente Eisenverbindungen, zum Beispiel FeCl₃, Fe(NO₃)₃ und Fe₂(SO₄)₃. Eisensalze, welche einen pH > 4 haben, wenn sie in entionisiertem Wasser gelöst werden, zum Beispiel FeSO₄, können die Lf-Komplexe nicht bilden, sogar dann nicht, wenn die Lösung auf pH ≤ 4 gebracht wurde.
Eine Eisenverbindung wird zu 1 mol Lf in Verhältnissen von 15 mol oder mehr, vorzugsweise 30 mol oder mehr, stärker bevorzugt 60–1000 mol, und in geeigneter Weise bei 480 mol oder weniger, hinzugegeben. Ferner sind 240 mol oder weniger bevorzugt, um die Reaktionsdauer ohne eine Abnahme in der Ausbeute abzukürzen. Eine überschüssige Menge einer Eisenverbindung bildet Eisen enthaltende Präzipitate.
Die Unterschiede in der Stabilität der Lactoferrin-Komplexe der zweiten Erfindung, welche durch die Art der verwendeten Eisensalze verursacht sind, werden durch das folgende Testexperiment bestimmt.
Testexperiment 4
(Materialien)

(Lösung A) 1 l einer 1 mol/l NaHCO₃-Lösung, pH 8,3.
(Lösung B1) 0,2 l von verschiedenen Eisensalzlösungen, welche 5 millimol Eisen enthalten.
(Lösung B2) 0,8 L einer Lösung, welche 33 μmol Lf enthält (Oreofina Co., Ltd.)

Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt, um Lösung B zu ergeben. Die Lösung B wurde zur Lösung A hinzugegeben, um einen Eisen-Lf-Komplex zu liefern. Dies sich ergebende Lösung wurde entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert. Die kondensierte Lösung wurde mit einem Scheinpuffer, enthaltend 0,05 M Imidazolpuffer, enthaltend 0,15 M NaCl bei pH 7,5 verdünnt, um Eisenkonzentration von 3,6 mmol/L zu ergeben, und auf 90°C für 10 min erwärmt. Die Bildung von Präzipitaten wurde beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Wie oben gezeigt, konnte kein Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplex ohne Verwendung von Eisensalz, welches einen pH ≤ 4 in einer entionisierten wässrigen Lösung hat, gewonnen werden. Ferner konnte kein Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplex selbst bei Einstellung auf pH ≤ 4 erhalten werden, wenn ein Eisensalz verwendet wurde, das einen pH > 4 in einer entionisierten wässrigen Lösung hatte.
Die Konzentrationsverhältnisse von Eisenionen und Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen beeinflussen stark die Hitzestabilität der Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe. Das folgende Testexperiment zeigt die wichtigen Merkmale der Verhältnisse.
Testexperiment 5
(Materialien)

(Lösung A) 1 l NaHCO₃ bei verschiedenen Konzentrationen.
(Lösung B1) 0,2 l von FeCl₃-Lösungen.
(Lösung B2) 0,8 l einer Lösung, welche 1 millimol Lf enthält.

Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt, um Lösung B zu ergeben. Die Lösung B wurde mit entionisiertem Wasser verdünnt und dann zu Lösung A hinzugegeben, um Lf gebunden mit Eisen zu ergeben. Wenn jedoch die finalen Hydrogenkarbonsäureionen 0,6 M oder mehr betrugen, wurde NaHCO₃ während des Mischverfahrens der Lösungen A und B hinzugegeben, oder eine erforderliche Menge von NaHCO₃ wurde zuvor zur Lösung A hinzugegeben, welche vor der Zugabe zur Lösung B gesättigt war. Die gewonnene Lösung wurde entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert, und mit dem Scheinpuffer verdünnt, um eine Eisenkonzentration von 3,6 mmol/l zu ergeben. Die verdünnten Lösungen wurden auf 90°C für 10 min erhitzt und die Bildung von Präzipitaten von Lf wurde beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Das minimale Verhältnis von Hydrogenkarbonsäureionen zu Eisen in der Tabelle 5 wurde durch Teilen der molaren Konzentration von Hydrogenkarbonsäure der Mischung der Lösungen A und B durch die Eisenkonzentration in Lösung B berechnet.
Tabelle 5 Lösung B1 enthaltend 30 millimol Eisen
Tabelle 6 Lösung B1 enthaltend 200 millimol Eisen und 10-fach verdünnte Lösung B (Lösung B enthielt 20 mmol/l Eisen)
Wie oben gezeigt, waren Zuwächse in der Konzentration der Hydrogenkarbonsäureionen in den Mischlösungen A und B mit der Zunahme der Eisenkonzentration in Lösung B erforderlich. Somit sind zur Herstellung der Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe wenigstens drei Moleküle, vorzugsweise 10 Moleküle oder mehr, von Karbonat und/oder Hydrogenkarbonat um das eine Molekül Eisen herum bei der Zugabe der Lösung B zur Lösung A erforderlich. Ferner sind 30 Moleküle oder mehr, vorzugsweise 60 Moleküle oder mehr, stärker bevorzugt 100 Moleküle oder mehr, von Karbonsäure und/oder Hydrogenkarbonsäureionen um das eine Molekül Eisen herum notwendig, um ein Molekül Lf mit mehr als 200 Molekülen Eisen zu binden.
Das folgende Testexperiment wurde durchgeführt, um zu untersuchen, wie viel Karbonat und/oder Hydrogenkarbonat notwendig ist, um die Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Testexperiment 6
(Materialien)

(Lösung A) 1 l NaHCO₃ bei verschiedenen Konzentrationen.
(Lösung B1) 0,2 l der Lösung, enthaltend 100 mmol FeCl₃.
(Lösung B2) 0,8 l der Lösung, enthaltend ein mmol Lf.

Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt, um Lösung B zu ergeben.
Die Lösung B wurde zur Lösung A bei 4°C und 37°C unter einem leichten Rühren gegeben, um Lf gebunden mit Eisen zu ergeben. Die sich ergebende Lösung wurde mit dem Scheinpuffer verdünnt, um 3,6 mmol/l Eisenlösung zu ergeben, und auf 90°C für 10 min erhitzt, um die Bildung von Präzipitaten von Lf zu beobachten. Zudem wurde die Reaktionsmischung, welche 192 Stunden reagiert hatte, mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 filtriert, um Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe von der wässrigen Lösung zu trennen. Die Konzentration von Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen im Filtrat wurde durch Ionenchromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7-1 Reaktionstemperatur bei 4°C
Tabelle 7-2 Reaktionstemperatur bei 37°C
Wie oben gezeigt, können die Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung bei niedrigen Temperaturen für einen lange Reaktionsdauer bei einem gleichen Verhältnis von Karbonat- und Hydrogenkarbonationen zu Eisen gebildet werden. Jedoch ergeben die niedrigeren Konzentrationen von Karbonat- und Hydrogenkarbonationen sogar bei einer langen Reaktionsdauer nicht die gewünschte Komplexe. Ferner, wenn 1 oder weniger das minimale Verhältnis von Hydrogenkarbonsäureionen zu Eisen in dem Filtrat der Ultrafiltration nach einer Reaktion von 192 Std. war, wurden die Konzentrationen der Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen in dem Filtrat gleich mit jenen in dem entionisierten Wasser, was eine vollständige Komplexbildung des gesamten Hydrogenkarbonats in Lösung A mit Eisen-Lf-Komplexen ergab. Kein Komplex kann unter der Reaktionsbedingung von Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen/Eisen-Verhältnissen von 2 oder geringer bei 37°C gebildet werden.
Obige Ergebnisse zeigen, dass die Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung 1 oder mehr Moleküle von Karbonsäure- und/oder Hydrogenkarbonsäureionen zum Binden von einem Molekül Eisen enthalten. Ansteigende Konzentrationen von Karbonsäure- und/oder Hydrogenkarbonsäureionen beschleunigten eindeutig die Reaktionsrate der Bildung von Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexen.
Obige Experimente zeigten auch, dass Eisen-Lf-Komplexe gebildet werden können, wenn i) die molare Eisenionenkonzentration in Lösung B gleich war zur iii) molaren Konzentration von Karbonsäure- und/oder Hydrogenkarbonsäureionen in ii) einer Mischung aus Lösung A und einem Teil oder dem ganzen von Lösung B (Reaktionslösung). Jedoch erfordert diese Bedingung eine extrem lange Reaktionsdauer und ist naturgemäß unpraktisch.
Kawakami et al. lösten Eisen durch Mischen i) 900 μl von 86 mMol/L FeCl₃ und 1,23–55,56 mmol/l Lf und ii) 100 μl von 0,2 Mol/L NaHCO₃ (H. Kawakami, S. Dosako und I. Nakajima, Biosci. Biotech. Biochem., 57: 1367–1377, 1993). In dem Bericht wurden die Hitzebeständigkeit und der Geschmack nicht untersucht und der Eisengehalt war von dem der vorliegenden Erfindung verschieden. Deshalb liegt die Offenbarung in dem Bericht außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, jedoch wird die vorliegende Erfindung mit der Offenbarung als Bezug verglichen.
Eine bestimmte Mischmethode der beiden Lösungen ist in dem Bericht nicht offenbart, jedoch sind im allgemeinen zwei Lösungen sofort oder fast sofort gemischt worden. Die Mischlösung (Reaktionslösung) enthält 0,02 mol/l Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen und die Konzentration von Eisen in der Lösung von FeCl₃ beträgt 86 mmol/l. Das minimale Verhältnis von Hydrogenkarbonsäureionen zu Eisen beträgt 0,23. Dieses Verhältnis entspricht ungefähr dem minimalen Verhältnis von Hydrogenkarbonsäureionen zu Eisen von 0,25 in dem Fall einer Reaktionsdauer von 48 Std. in Tabelle 7-2, welche Bedingung Lf keine Hitzebeständigkeit vermitteln kann. Die Verwendung von Lösungen, deren Zusammensetzungen die gleichen sind, wie jene, die in Kawakami et al. offenbart sind. Die hitzebeständigen Lf-Komplexe dieser Erfindung können gewonnen werden, wenn das folgende Verfahren durchgeführt wird. Zunächst, mische 133 μl von Lösung i) mit Lösung ii) bei 4°C für 96 Std. Füge dann die restlichen 767 μl von Lösung i) zur Mischung hinzu. In dem ersten Schritt dieses Verfahrens ist die Konzentration von Karbonsäure- und Hydrogenkarbonsäureionen äquivalent zu 86 mmol/l FeCl₃ in Lösung i). Das minimale Verhältnis von Hydrogenkarbonsäureionen zu Eisen entspricht der vierten Reihe bei Reaktionszeit 96 Std. in Tabelle 7-1. Deshalb kann der erste Schritt einen hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplex bei einer bestimmten Rate von 14,8% ergeben (133 μl/900 μl). Jedoch erlangt das restliche Lf in dem zweiten Schritt keine Hitzebeständigkeit. Kein solches Reaktionsverfahren ist in Kawakami et al. offenbart. Zusätzlich beträgt die Reaktionstemperatur 37°C, weshalb kein hitzebeständiger Eisen-Lf-Komplex angesichts des vorliegenden Testexperiments erwartet wird.
Ein weiterer wichtiger Faktor, welcher die Hitzestabilität der Komplexe beeinflusst, ist ein Konzentrationsverhältnis von Lf und Karbonsäure- und/oder Hydrogenkarbonsäureionen. Dieser Faktor wurde durch das folgende Testexperiment untersucht.
Testexperiment 7
(Materialien)

(Lösung A) 1 l von NaHCO₃-Lösungen bei verschiedenen Konzentrationen.
(Lösung B1) 0,2 l einer Lösung, welche 1,5 mmol FeCl₃ enthält.
(Lösung B2) 0,8 l einer Lösung, welche 0,5 mmol Lf enthält.

Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt, um Lösung B zu ergeben. Die Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, um einen eisengebundenen Lf-Komplex zu ergeben. Die gewonnene Lösung wurde entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert. Ferner wurde die kondensierte Lösung mit dem Scheinpuffer verdünnt, um 3,6 mmol/l Eisenkonzentration zu ergeben. Die verdünnte Lösung wurden auf 90°C für 10 min erhitzt. Die Bildung von Präzipitaten von Lf wurde beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Das minimale Verhältnis von Hydrogenkarbonsäureionen zu Eisen wurde durch Teilen der molaren Konzentration von Hydrogenkarbonsäureionen in einer Mischung der Lösungen A und B durch die molare Konzentration von Lf in Lösung B berechnet.
Tabelle 8
Wie oben gezeigt, ist das Erfordernis der Gegenwart von wenigstens 50 Molekülen, vorzugsweise 100 Molekülen, stärker bevorzugt 200 Molekülen von Karbonsäure und Hydrogenkarbonsäure (Ionen) um ein Molekül Lf in der Lösung klar erforderlich.
Die Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung enthalten im Vergleich weit mehr gebundenes Eisen und Karbonat und/oder Hydrogenkarbonat als das sogenannte herkömmliche Lf vom eisengesättigten Typ, welches in Anderson et al. zwei an Lf gebundene Moleküle Eisen aufweist.
Die Zugabe einer großen Menge Eisen, um Lf eine Hitzebeständigkeit zu vermitteln, oder das Erfordernis von Karbonsäureionen oder Hydrogenkarbonsäureionen, oder die Verwendung von Kohlendioxid, Karbonat oder Hydrogenkarbonat ist in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 141067/1992 nicht offenbart. Deshalb sind die Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung ganz verschieden von dem oben genannten Stand der Technik.
Von den Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexen der vorliegenden Erfindung wird angenommen, dass sie modifizierte Lf-Strukturen hoher Ordnung aufweisen, wie tertiäre oder quaternäre Strukturen mit Karbonat und/oder Hydrogenkarbo nat und Eisen, oder Strukturen, in denen Lf mit Karbonat und/oder Hydrogenkarbonat und Eisen umgeben ist. Tatsächlich nimmt die Erkennungsrate der Karbonat- und/oder Hydrogenkarbonat-Eisen-Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung durch Anti-Lf-Antikörper, welche allgemein eisengesättigtes Lf erkennen, mit der Zunahme der Bindung von Karbonat und/oder Hydrogenkarbonat und Eisen mit Lf ab. Die Abnahme wird durch das folgenden Testexperiment gezeigt.
Testexperiment 8
Eine Lf-Probe wurde gewonnen durch Dialyse einer Lf-Lösung gegen Citratpuffer, enthaltend 0,1% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), zum Entfernen von Eisen, und Dialyse gegen Wasser, gefolgt von einer Lyophilisierung. Lösung A: 1 l von 1 mol/l NaHCO₃, pH 8,3, Lösung B1: 0,2 l einer Lösung, enthaltend 0–480 mMol FeCl₃ und Lösung B2: 0,8 l einer Lösung, enthaltend 1 mol Lf, wurden hergestellt. Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt und diese Mischung wurde 1 bis 100-fach mit entionisiertem Wasser verdünnt, um die Lösung B zu ergeben. 1 l von Lösung B wurde zu 1 l von Lösung A gegeben, um eine eisengebundene Lf-Lösung zu ergeben. Die sich ergebende Lösung wurde nacheinander 2-fach mit dem Scheinpuffer verdünnt.
Getrennt wurde eine ELISA-Platte mit einem Anti-Rinder-Lf-Antikörper beschichtet und blockiert mit BlockAce (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.). Dann wurde die oben hergestellte Lf-Lösung zu der Platte gegeben und für eine Std. bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Reaktion mit den mit Peroxidase markierten Anti-Rinder-Lf-Antikörpern. Die Platte wurde gründlich gewaschen, ABTS-Substrat wurde hinzugegeben und die Absorptionsrate bei 405 nm wurde bestimmt. Wenn zwei Moleküle Eisen an Lf gebunden waren, wurde Lf in ähnlicher Weise erkannt, wie jenes, welches kein Eisen enthielt, jedoch war Lf mit einer Zunahme des Eisengehalts nicht erkennbar. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. Die Erkennungsrate in der Tabelle ist das Verhältnis der durch diesen ELISA bestimmten Menge zur Menge an Lf, welches in der Eisen-Lf-Lösung enthalten ist.
Tabelle 9
Die oben genannten Lf-Komplexe (im weiteren abgekürzt als Lf-Komplex der zweiten Erfindung) sind verschieden von dem zuvor genannten Lf-Komplex (im weiteren abgekürzt als Lf-Komplex der ersten Erfindung) in der Stabilität mit dem pH, und ferner von jenem des Lf, welches in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 141067/1992 offenbart ist. Die Unterschiede sind durch das folgende Experiment gezeigt.
Testexperiment 9
Der Lf-Komplex der zweiten Erfindung wurde in einer ähnlichen Weise wie jener des Testexperiments 8 hergestellt. Der Lf-Komplex der ersten Erfindung wurde durch Zugeben von FeCl₃ zu 33,75 mmol/l wässriger Lf-Lösung für einen Eisengehalt von 0,5–16,2 mmol/l hergestellt, und mit NaHCO₃ auf einen pH 6,2 eingestellt. Ferner wurde die in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 141067/1992 offenbarte Lf-Lösung durch Lösen von Lf in einer wässrigen Lösung von FeSO₄·7 H₂O, enthaltend 187–6000 mmol Eisen/dl, um eine Konzentration von 12,5 mmol/dl zu ergeben, hergestellt. In diesem Fall wurden keine Karbonsäure- und/oder Hydrogenkarbonsäureionen, Karbonat oder Hydrogenkarbonat verwendet. Verschiedene Eisen-und-Lf-Mischlösungen, welche durch die obigen drei Verfahren hergestellt wurden, wurden entsalzt und unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert, und verdünnt mit dem Scheinpuffer mit pH 6,4 oder 7,2, um 12,5 mmol/l Lf-Lösungen zu ergeben. Die sich ergebenden Lösungen wurden auf pH 6,5 bzw. 7,3 eingestellt, in Teströhrchen mit Schraubverschluss gegossen und versiegelt. Die versiegelten Lösungen wurden für 10 min auf 90°C erhitzt, durften auf Raumtemperatur abhkühlen, zentrifugiert bei 3000 U/min für 10 min, und der Lf-Gehalt im Überstand wurde unter Verwendung eines Protein Assay Kit (BioRad Co., Ltd.) bestimmt. Die Konzentration des im Überstand verbliebenen Lf ist in Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 10
Wie oben gezeigt, hatte der Lf-Komplex der zweiten Erfindung eine Hitzebeständigkeit sowohl bei pH 6,5 als auch bei 7,3. Jedoch zeigte der Lf-Komplex der ersten Erfindung eine Hitzebeständigkeit nur bei pH 6,5 wobei keine solche Eigenschaft bei pH 7,3 gefunden wurde. Der Lf-Komplex des Stands der Technik zeigte keine Hitzebeständigkeit bei pH 6,5 oder 7,3.
Der pH-Bereich der Hitzebeständigkeit des Lf-Komplexes der zweiten Erfindung wird im folgenden Testexperiment gezeigt.
Testexperiment 10
Die Lf-Komplexe wurde in ähnlicher Weise wie jene von Testexperiment 8 hergestellt, jedoch wurde der Eisengehalt in der Lösung B1 auf 1200 mmol erhöht.
Die Eisen-und-Lf-Mischlösungen wurden entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert, und mit dem Scheinpuffer verdünnt um den Lf-Gehalt auf 62,5 mmol/l einzustellen. Die Scheinpuffer wurden hergestellt aus Glycin-HCl für pH 2,0–3,5, Essigsäure für pH 3,5–6,0, Imidazol-HCl für pH 6,0–7,8 und Borsäure-KCl-NaOH für pH 7,8–9,3. Die Leitfähigkeit wurde mit NaCl eingestellt. Die verdünnten Lösungen wurden in Teströhrchen mit Schraubverschluss gegossen und versiegelt. Die versiegelten Lösungen wurden für 10 min auf 90°C erhitzt, durften auf Raumtemperatur abhkühlen, zentrifugiert bei 3000 U/min für 10 min, und der Lf-Gehalt im Überstand wurde unter Verwendung eines Protein Assay Kit (BioRad Co., Ltd.) bestimmt. Die Konzentration des im Überstand verbliebenen Lf ist in den Tabellen 11 und 12 gezeigt.
Tabelle 11 Für elektrische Leitfähigkeit bei 5 Millisiemens/cm
Tabelle 12 Für elektrische Leitfähigkeit bei 150 Millisiemens/cm
Wie oben gezeigt, wurde Hitzebeständigkeit nur in dem Bereich von 15–1000 Moleküle Eisen für 1 Molekül Lf erhalten, und wurde in dem pH-Bereich von 2,1–9,0 bestätigt. Ferner war die Hitzebeständigkeit höher bei 30 Molekülen Eisen pro 1 Molekül Lf als bei 15 Molekülen, höher bei 60 Molekülen Eisen als bei 30 Molekülen, noch höher bei 120 Molekülen Eisen als bei 60 Molekülen. Im übrigen wurde eine höhere Hitzebeständigkeit bei 480 Molekülen Eisen pro 1 Molekül Lf als bei 1000 Molekülen Eisen, stärker bevorzugt bei 240 Molekülen Eisen als bei 480 Molekülen Eisen, erhalten. Für mehr als 1000 Moleküle Eisen pro 1 Molekül Lf ergab ein pH über 5 eine höhere Hitzebeständigkeit als bei pH ≤ 5.
Lf, welches durch die erste Erfindung hergestellt wurde, konnte nicht mit 720 oder mehr Molekülen Eisen binden und verursachte eine Präzipitation, jedoch konnte der durch die zweite Erfindung gewonnene Lf-Komplex mit 1000 Molekülen binden, somit sind die Produkte der zweiten Erfindung verschieden von jenen, die durch die erste Erfindung hergestellt werden.
Von einer Pasteurisierung von Getränken im Stand der Technik, wie er in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 8269/1992 offenbart ist (hier im weiteren als Ref. Pat. abgekürzt) wurde berichtet, dass eine Präzipitation oder Degeneration bewirkt wurde, so dass Lf nicht mit Eisen bindet, mit Ausnahme der unten genannten Bereiche des End-pH und der elektrischen Leitfähigkeit Ω. log Ω (Millisiemens/cm) > (2,96 pH) + 0,64 (pH < 5) log Ω > (29,37 pH) – 4,62 (5 ≤ pH ≤ 7,9) log Ω > –0,917 (pH > 7,9)
Die Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung sind sehr stabil und hitzebeständig bei 150 Millisiemens/cm und im pH-Bereich 2,1–9,0, und können zur Herstellung von Produkten verwendet werden, in denen sie außerhalb der oben genannten Beziehung zwischen Ω und pH sind, ohne ein Problem zu verursachen. Ferner offenbart Ref. Pat. nur das Pasteurisierungsverfahren von Lf und beabsichtigte nicht die Bildung von Eisen-und-Lf-Komplexen. Ein einfaches Lösen von Lf, NaHCO₃ und FeCl₃ ist in dem Beispiel gezeigt. Während in der vorliegenden Erfindung Mischverfahren offenbart sind, nämlich Lösung B, zusammengesetzt aus iv) Eisen und v) Lactoferrinen, wurde hinzugegeben zur Lösung A, zusammengesetzt aus i) Karbonat oder ii) Hydrogenkarbonat, oder iii) Karbonat und Hydrogenkarbonat, oder Lösung B, zusammengesetzt aus v) Eisen, wurde zugegeben zu Lösung A, zusammengesetzt aus i) Karbonat oder ii) Hydrogenkarbonat oder iii) Karbonat und Hydrogenkarbonat und iv) Lactoferrinen. Zusätzlich offenbart die vorliegende Erfindung den Bereich der Eisenkonzentration in Lösung B. Stabile Eisen-und-Lf-Komplexe können gebildet werden, indem die oben genannten Bedingungen erfüllt sind, welche eine Langzeitstabilität bei weiten pH-Bereichen und eine gute Hitzebeständigkeit ohne eisenspezifischen adstringierenden Geschmack ergeben. Deshalb konnte das Beispiel in Ref. Pat. keinen Lactoferrin-Eisen-Komplex ergeben, und selbst wenn sich der Komplex ergeben hätte, wird angenommen, dass er von dem der vorliegenden Erfindung verschieden ist. Tatsächlich lehrt Ref. Pat., dass ein Getränk, das gemäß dem Verfahren hergestellt ist, einen bitteren Geschmack zeigt, wenn das Getränk 12 mg/100 ml oder mehr Eisen enthält. Andererseits zeigt ein ähnliches Produkt, das durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt ist, keinen bitteren Geschmack, sogar bei einer Konzentration von 29 mg/100 mol Eisen, wie weiter unten gezeigt wird. Sogar wenn Eisen-Lf-Komplexe durch Ref. Pat. erhalten worden wären, ist die maximale Konzentration von Eisen im Komplex fünf Mole küle Eisen pro 1 Molekül Lf, womit der durch Ref. Pat. hergestellte Eisen-Lf-Komplex außerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt.
Der Lf-Komplex der ersten Erfindung enthält 720 Moleküle Eisen pro 1 Molekül Lf und ist von jenem der zweiten Erfindung verschieden.
Der Unterschied in der Stabilität der ersten und zweiten Erfindungen der vorliegenden Erfindung wird in dem folgenden Testexperiment gezeigt.
Testexperiment 11
Eisen-Lf-Komlexe wurde in ähnliche Weise wie jene der Testexperimente 9 und 10 hergestellt, und zentrifugierte Lf enthaltende Lösungen wurden in Teströhrchen mit Schraubverschluss gegeben und versiegelt, für 10 min auf 90°C erhitzt, und für einen Monat bei 37°C aufbewahrt. Die gebildeten Präzipitate wurden mit dem bloßen Auge beobachtet. Kein Präzipitat, leichtes Präzipitat und vermehrtes Präzipitate wurden jeweils mit 0, 1 und 2 bewertet.
Die Testergebnisse für die Eisen-Lf-Komplexe, welche entsprechend den Testexperimenten 9 und 10 hergestellt wurden, sind in den Tabellen 13 bzw. 14 gezeigt.
Tabelle 13
Tabelle 14
Wie oben gezeigt, hatte der Eisen-Lf-Komplex der zweiten Erfindung sogar bei Erhitzen für 10 min auf 90°C eine hohe Lagerstabilität bei gewöhnlicher Temperatur im pH-Bereich von 2,1–9,0. Jedoch fehlte dem Eisen-Lf-Komplex der ersten Erfindung, der nur unter den Bedingungen 150 oder mehr Moleküle Eisen und 1 Molekül Lf bei pH 6,5 hergestellt wurde, Stabilität. Zusätzlich fehlte den Eisen-Lf-Komplexen, die entsprechend dem in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 141067/1992 offenbarten Verfahren hergestellt wurden, Hitzebeständigkeit bei pH 6,5 und 7,3 und wiesen natürlicherweise keine Lagerstabilität auf.
Es gibt keine bestimmte Einschränkung zum Herstellen von Produkten, welche Lf-Komplexe der vorliegenden Erfindung enthalten.
Eine Sterilisation wird durch herkömmliche Verfahren durchgeführt, einschließlich Wärmepasteurisierung oder Sterilisation. Eine Wärmebehandlung wird durch eine Niedrigtemperaturerwärmung bei 65°C für 30 min, oder 120°C für 2–3 s oder 140–150°C für 3–5 s oder durch Retortenbehandlung durchgeführt.
Eine Verdampfung kann Pulverzubereitungen, welche hitzebeständige Lf-Eisen-Komplexe enthalten, liefern. Eine Lyophilisierung kann auch angewendet werden, um trockene Produkte zu erhalten, jedoch ist ein kostengünstiges Sprühtrocknen zur Herstellung einer großen Menge von Produkten bevorzugt. Produkte, die zum Auflösen hergestellt werden, können mit Magermilch, Molke, Kasein, Gelatine, Saccharose und Stärke gemischt werden, um die Löslichkeit zu erhöhen.
Die sich ergebenden Lf enthaltenden Produkte, welche aus Lf-Komplexen hergestellt sind, enthalten Eisen und sind besonders geeignet zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Futtermitteln und Arzneimitteln zur Prävention und Behandlung von Anämie. Den Komplexen fehlt vollständig ein adstringierender Geschmack und können als Eisenlieferant für eisenangereicherte Nahrungsmittel und Arzneimittel zur oralen Verabreichung verwendet werden. Ferner verhindern die Produkte die Beschleunigung der Peroxidbildung von Eisen und können als Eisenlieferant für leicht oxidierbare Nahrungsmittel, wie Fett, verwendet werden.
Das folgende Testexperiment zeigt die Ergebnisse von Geschmackstests.
Testexperiment 12
Verschiedene Eisen-und-Lf-Komplexe, welche durch die drei Verfahren hergestellt waren, wurden entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert, wie jene des Testexperiments 9, mit dem Scheinpuffer auf pH 6,8 eingestellt, und mit destilliertem Wasser verdünnt, um eine Eisenkonzentration von 13 mg und 26 mg/100 ml zu ergeben. Die sich ergebenden Proben wurden wie folgt im Geschmack getestet:
Die Proben wurden von fünf jeweils männlichen und weiblichen Teilnehmern auf einen adstringierenden Geschmack geprüft, wobei der Scheinpuffer als eine Kontrolle verwendet wurde. Die Teilnehmer hatten verbundene Augen, um nicht von der Erscheinung beeindruckt zu sein. Die Kontrolle und eine Probe wurden sukzessiv geprüft, wobei wenigstens ein Tag Abstand vor dem nächsten Test eingehalten wurde. Die Proben wurden von jedem Teilnehmer zufällig geprüft, um tägliche Abweichungen zu vermeiden. Die Anzahl der Teilnehmer von den 10 Teilnehmern, welche den adstringierenden Geschmack erfassten, ist in Tabelle 15 gezeigt.
Tabelle 15
Wie oben gezeigt, wurde kein adstringierender Geschmack in dem Lf-Komplex wahrgenommen, insbesondere bei der zweiten Erfindung der vorliegenden Erfindung, welche eine ausgezeichnete Maskenwirkung zeigt. Die Lf-Komplexe der ersten Erfindung, Eisenkonzentration von 26 mg/100 ml und Fe/Lf-Molverhältnis von 150 oder darüber, zeigten bei einigen Teilnehmern einen adstringierenden Geschmack, und alle Teilnehmer nahmen einen adstringierenden Geschmack sogar bei niedrigster Konzentration und Molverhältnis bei jenen des Stands der Technik wahr.
Testexperiment 13
Verschiedene Molverhältnisse von Eisen-und-Lf-Komplexen wurden hergestellt, entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert, wie jene von Test 10. Die gewonnenen Lösungen wurden mit dem Scheinpuffer verdünnt, um Eisenkonzentrationen von 26 mg/100 ml zu ergeben und für 10 min bei 90°C pasteurisiert. Die sich ergebenden Proben wurden getestet wie jene von Testexperiment 12.
Tabelle 16
Wie oben gezeigt, unterdrückten die Eisen-Lf-Komplexe der zweiten Erfindung der vorliegenden Erfindung den adstringierenden Geschmack von Eisen, wenn 15–1000 Moleküle Eisen mit einem Molekül Lf binden bei einem pH von 2,1–9,0. Ein paar Teilnehmer nahmen einen adstringierenden Geschmack wahr, wenn 480 oder mehr Moleküle Eisen mit einem Molekül Lf binden bei einem pH-Bereich von 2,1–5,0. Jedoch wurde kein adstringierender Geschmack wahrgenommen, wenn der Eisengehalt auf 13 mg/100 ml eingestellt wurde.
Die beste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
In 8 l Wasser wurden 100 g Lf und 72,4 g Eisennitrat·9 H₂O gelöst und mit 5 g NaHCO₃ unter starkem Rühren versehen, um einen pH 6,4 einzustellen. Wasser wurde zur Mischung hinzu gegeben, um 10 L Gesamtvolumen zu erhalten, um eine hitzebeständige Eisen-Lf-Komplex-Lösung mit 10 g/l Lf, 100 mg/g Lf Eisenionen und 107 mg/g Lf Hydrogenkarbonsäureionen zu erhalten.
Die halbe Menge der Lösung, 5 l, wurde lyophilisiert um 5,3 g Pulver zu erhalten. Eine Säule mit zwei cm Innendurchmesser und 50 cm Höhe, Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech K. K.), ausge glichen mit 100 ml Wasser, wurde gefüllt, und 1 ml der obigen Lösung wurden auf die Säule geladen. Die Säule wurde mit Wasser eluiert und das Lf in den Hohlraumvolumenfraktionen wurde gesammelt und mit einem Protein Assay kit (Bio-Rad Co., Ltd.) für Lf und ICP für Eisen bestimmt. Die Hohlraumfraktionen enthielten 9,7 mg Lf und 1,03 mg Eisenionen, was ein Binden von 106 g Eisen an 1 g Lf bedeutet. Kein Lf oder Eisen wurde in den anderen Fraktionen eluiert.
Beispiel 2
In 100 ml Wasser wurden 0,5 g Lf und 0,4 g FeCl₃·6 H₂O gelöst und mit 1 M NaHCO₃-Lösung unter starkem Rühren versehen, um pH 3,5 einzustellen. Zusätzlich wurde 1 N NaOH hinzugefügt, um pH 6,2 einzustellen und eine hitzebeständige Eisen-Lf-Komplex-Lösung zu ergeben.
Getrennt wurden zwei kg Magermilchpulver in 20 l Wasser gelöst und durch Zugabe einer kleiner Menge Milchsäure auf pH 6,5 eingestellt. Die wiederhergestellte Magermilch wurde mit 100 ml des hergestellten hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexes gemischt, homogenisiert, pasteurisiert bei 120°C für zwei s mit einem Sterilisierer vom Plattentyp und sofort auf 5°C gekühlt. Die gekühlten Produkte enthielten 25 mg/l hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplex und 164 mg/g Gesamteisen mit einer elektrischen Leitfähigkeit von 6,5 ms/cm bei pH 6,5. Das gewonnene Produkt, welches die hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexe enthielt, wurde für zwei Wochen in einem Kühlschrank aufbewahrt. Ein Teil des aufbewahrten Produkts wurde für 10 min bei 1200 × g zentrifugiert, jedoch kein Präzipitat oder Eisengeruch wurde erfasst, was das stabile Vorliegen von hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplexen anzeigt.
Beispiel 3
In 100 ml Magermilch wurden 1,3 l der durch das Beispiel 1 hergestellten hitzebeständigen Eisen-Lf-Komplex-Lösung gelöst, homogenisiert und für vier s bei 150°C pasteurisiert, dann sofort auf 4°C gekühlt und jeweils 250 ml aseptisch in Papierbehälter gefüllt. Das aufgeteilte Produkt wurde bei 37°C für drei Monate aufbewahrt, zentrifugiert für 10 min bei 1200 × g, jedoch keine Präzipitat wurde beobachtet. Eine Coliformgruppe- oder Standardplattenzählung in den Produkten war negativ. Eine bräunliche Verfärbung wurde wegen des Eisengehalts vermutet, jedoch kein praktischer Nachteil ergab sich bei sehr schwachem Braun.
Beispiel 4
Es wurden jeweils 1 l von Lösung A, welche 1,2 mol NaHCO₃ und 10 μmol Lf (DMV Japan, Branch of Campina Melkunie BV) enthielt, und Lösung B, welche 1,5 mmol Fe₂(SO₄)₃ als Eisenionen enthielt, hergestellt. Lösung B wurde zu Lösung A gegeben, um eine Eisen-Lf-Komplex-Lösung herzustellen. Die sich ergebende Lösung wurde entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert und mit dem Scheinpuffer, pH 8,9, verdünnt, um eine Eisenkonzentration von 26 mg/100 ml zu ergeben. Die verdünnte Lösung wurde in Teströhrchen mit Schraubverschluss gegossen, versiegelt, auf 90°C für 10 min erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und für einen Monat bei Raumtemperaturen aufbewahrt. Es wurde eine Sinnesprüfung in der gleichen Weise durchgeführt wie beim Testexperiment 11 mit 10 Teilnehmern, jedoch nahm kein Teilnehmer einen adstringierenden Geschmack wahr.
Beispiel 5
Lösung A: 1 l einer Lösung, enthaltend 0,05 mol CaCO₃ und 1,2 mol NH₄HCO₃ wurde mit HCl auf pH 7,8 eingestellt. Lösung B1: 0,2 l einer Lösung, enthaltend 1,5 mmol Fe₃(SO₄)₃ als Eisenionen, und Lösung B2: 0,8 l einer Lösung, enthaltend 10 μmol hochreines Transferrin (Apotyp, abgeleitet von Rinderplasma Wako Pure Chemical Ind. Ltd.), wurden hergestellt. Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt und diese Mischung wurde zur Lösung A gegeben, um eisengebundenes Transferrin zu ergeben. Die Eisen-und-Transferrin-Mischlösung wurde entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert und mit dem Scheinpuffer, pH 6,8, verdünnt, um eine Eisenkonzentration von 26 mg/200 ml zu ergeben. Die verdünnte Lösung wurde in Teströhrchen mit Schraubverschluss gegossen, versiegelt, auf 90°C für 10 min erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und für einen Monat bei 37°C aufbewahrt. Kein Präzipitat wurde mit bloßem Auge gefunden. Es wurde eine Sinnesprüfung in der gleichen Weise durchgeführt wie beim Testexperiment 12 mit 10 Teilnehmern, jedoch bemerkte kein Teilnehmer einen adstringierenden Geschmack.
Beispiel 6
Lösung A: 1 l einer Lösung, enthaltend 0,5 mol Na₂CO₃ und 0,7 mol KHCO₃ wurde mit Essigsäure auf pH 8,3 eingestellt. Lösung B1: 0,2 l einer Lösung, enthaltend 1,5 mmol Fe₃(NO₃)₃ als Eisenionen, und Lösung B2: 0,8 l einer Lösung, enthaltend 10 μmol rohes Ovotransferrin (Typ IV, abgeleitet von Eiweiß, Sigma Chemical Co.) wurden hergestellt. Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt, und diese Mischung wurde zur Lösung A gegeben, um eisengebundenes Ovotransferrin zu ergeben. Die Eisen-und-Ovotransferrin-Mischlösung wurde entsalzt und mit einer Ultra filtrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert und mit dem Scheinpuffer, pH 6,2, verdünnt, um eine Eisenkonzentration von 26 mg/200 ml zu ergeben. Die verdünnte Lösung wurde in Teströhrchen mit Schraubverschluss gegossen, versiegelt, auf 90°C für 10 min erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und für einen Monat bei 37°C aufbewahrt. Kein Präzipitat wurde mit bloßem Auge gefunden. Es wurde eine Sinnesprüfung in der gleichen Weise durchgeführt wie beim Testexperiment 12 mit 10 Teilnehmern, jedoch bemerkte kein Teilnehmer einen adstringierenden Geschmack.
Beispiel 7
Lösung A: 8 l einer Lösung, enthaltend 24 mol NaHCO₃ mit Präzipitaten von ungelöstem NaHCO₃, Lösung B1: 2 l einer Lösung, enthaltend 20 mmol Fe₃Cl₃, und Lösung B2: 8 l einer Lösung, enthaltend 100 μmol Lactoferrin (Tatua Biologics, eine Abteilung der Tatua Co-operative Dairy Co., Ltd.) wurden hergestellt. Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt und diese Mischung wurde unter starkem Rühren zur Lösung A gegeben, um eisengebundenes Lactoferrin zu ergeben. Die Eisen-und-Lactoferrin-Mischlösung wurde entsalzt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Abschneidemolekulargewicht von 5000 kondensiert. Die resultierende Lösung wurde zu 20 l wiederhergestellter Magermilch gegeben, welche mit einer Rate von 100 g Magermilchpulver in 1 l Wasser hergestellt wurde, um eine Eisenkonzentration von 26 mg/200 ml zu ergeben. Die gemischte Lösung wurde mit einem Sterilisator vom Plattentyp bei 120°C für 2 s pasteurisiert, sofort auf 5°C gekühlt und für zwei Wochen bei 10°C aufbewahrt. Ein Teil der Lösung wurde bei 3000 U/min für 10 min zentrifugiert, jedoch wurde kein Präzipitat gefunden. Es wurde eine Sinnesprüfung in der gleichen Weise wie beim Testexperiment 12 mit 10 Teilnehmern unter Einsatz einer Kontrollprobe, die durch Pasteurisieren und Lagerung von wiederhergestellter Magermilch in einer ähnlichen Weise hergestellt wurde, durchgeführt, jedoch bemerkte kein Teilnehmer einen adstringierenden Geschmack, anormalen Geschmack oder Geruch.
Beispiel 8
Die in Beispiel 7 hergestellte und kondensierte Eisen-Lactoferrin-Mischlösung wurde in 20 l Rohmilch gegeben, um eine Eisenkonzentration von 26 mg/200 ml zu ergeben. Die Lösung wurde homogenisiert, pasteurisiert bei 150°C für vier s, sofort auf 4°C gekühlt, jeweils 250 ml aseptisch in Papierbehälter gefüllt, bei 37°C für drei Monate aufbewahrt und zentrifugiert. Kein Präzipitat wurde gefunden. Eine Koliformgruppe- oder Standarplattenzählung in den Produkten war negativ. Eine bräunliche Verfärbung wurde dem Eisengehalt zugesprochen, jedoch ergab sich kein praktischer Nachteil mit einem sehr blassen Braun. Es wurde eine Sinnesprüfung in der gleichen Weise wie beim Testexperiment 12 mit 10 Teilnehmern unter Einsatz einer Kontrollprobe, die durch Pasteurisieren und Lagerung von Rohmilch in einer ähnlichen Weise hergestellt wurde, durchgeführt, jedoch bemerkte kein Teilnehmer einen adstringierenden Geschmack, anormalen Geschmack oder Geruch.
Beispiel 9
Eine Eisen-Lactoferrin-Mischlösung, hergestellt und kondensiert in Beispiel 7 (Testgruppe), oder eine FeSO₄-Lösung (Kontrollgruppe Nr. 1) wurde in einem Phosphatpuffer, pH 7,2, gelöst, welcher Ascorbinsäure und Natriumascorbat bei 6,2 mg/100 g als Vitamin C enthielt. Die resultierenden Proben wurden bei 90°C für 10 min pasteurisiert, um die Testproben zu ergeben. Eine Kontrollgruppe Nr. 2 wurde durch Pasteurisieren eines Phosphatpuffers mit zugegebenem Vitamin C hergestellt.
Weibliche, 21 Tage alte Wistar-Ratten (Charles River Japan Inc.) unmittelbar nach Entwöhnung und einem Körpergewicht von 45–50 g wurden ausgewählt. Die ausgewählten Ratten wurden zwei Wochen lang mit einem Futtermittel mit Eisenmangel gefüttert (Oriental Yeast Co., Ltd., Eisengehalt 0,25 mg/100 g Futtermittel) um Anämie-Ratten mit einem Bluthämoglobin-Gehalt von sieben g/100 ml oder weniger zu erhalten. Die Ratten wurden in Gruppen mit vier Ratten pro Gruppe geteilt. Die Ratten wurden ferner mit dem Eisenmangel-Futtermittel gefüttert und eine Testprobe wurde bei einer Gabe mit einer Rate von 1 ml/Tag für sechs Wochen oral verabreicht. Sechs Wochen nach der letzten Verabreichung wurde Blut aus der Schwanzvene entnommen und Hämoglobin wurde mit einem automatischen Blutzähler (TOA Electronics Co., Ltd.) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 gezeigt.
Tabelle 17
Wie oben gezeigt, hatte der Eisen-Lf-Komplex der vorliegenden Erfindung eine Anämiebehandlungswirkung und ist besser als eine anorganische Eisenverbindung, FeSO₄.
Beispiel 10
Eine Eisen-Lactoferrin-Mischlösung, hergestellt und kondensiert in Beispiel 7, wurde zu Rohmilch gegeben, welche Ascorbinsäure und Natriumascorbat bei 30 mg/200 ml als Vitamin C enthielt, um eine Eisenkonzentration von 15 mg/200 ml zu ergeben. Die resultierende Lösung wurde in hitzebeständige Glasflaschen von ungefähr 200 ml Volumen gefüllt, um 10 ml oder weniger Kopfraum (Testgruppe) zu machen. Vitamin C-angereicherte Milch wurde durch Zugabe von Natriumeisencitrat anstelle von Eisen-Lf (Kontrollgruppe) hergestellt. Die resultierenden Gruppen wurden bei F = vier unter Verwendung einer Retorte sterilisiert, bei 37°C für zwei Wochen aufbewahrt und das restliche Vitamin C wurde mit einer Vorrichtung zur Bestimmung von Vitamin C (TOA Electronics Co., Ltd.) bestimmt. Die Restrate (%) wurde durch Teilen des gemessenen Werts durch den Anfangswert bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 18 gezeigt.
Tabelle 18
Wie oben gezeigt, zeigte der Eisen-Lf-Komplex der vorliegenden Erfindung weniger Abbau von Vitamin C als jener aus anorganischem Eisen, was angibt, dass der Komplex als ein effektiver Eisenlieferant mit weniger Bildung von oxidierten Produkten und Peroxiden nützlich ist.
Ferner wurde eine Sinnesprüfung in der gleichen Weise wie beim Testexperiment 12 mit 10 Teilnehmern unter Einsatz einer Kontrollprobe, die durch Retortenbehandlung von Vitamin C-angereicherter Milch ohne Zugabe von Eisen hergestellt wurde, durchgeführt, jedoch bemerkte kein Teilnehmer einen adstringierenden Geschmack, anormalen Geschmack oder Geruch.
Beispiel 11
In einem 0,2 mol/l Acetatpuffer, pH 4, wurden 1 g Lf (DMV Japan) gelöst, mit 26000 Einheiten Pepsin (Sigma Chemical Co.) versehen und bei 37°C für zwei Std. inkubiert, dann wurde pH 7,5 mit NaOH eingestellt. Die resultierende Lösung wurde mit 200000 Einheiten Trypsin (Sigma Chemical Co.) gemischt und für zwei Std. bei 37°C inkubiert. Eine Elektrophorese des gewonnenen abgebauten Lf bestätigte das Molekulargewicht von Abbauprodukten von 50 kDa, 40 kDa und 30 kDa.
Lösung A: 1 l Lösung, enthaltend 1,3 mol NaHCO₃ mit Präzipitaten von ungelöstem NaHCO₃, Lösung B1: 0,2 l Lösung, enthaltend 1,2 mmol FeCl₃ als Eisenionen, und Lösung B2: 0,8 l Lösung, enthaltend abgebautes Lactoferrin, welches 10 μmol intaktem Lactoferrin entspricht, wurden hergestellt. Die Lösungen B1 und B2 wurden gemischt und zur Lösung A gegeben, um eisengebundenes, abgebautes Lactoferrin zu ergeben. Die resultierende Lösung wurde in Teströhrchen mit Schraubverschluss gegossen, versiegelt, auf 90°C für 10 min erhitzt, auf Raumtemperatur gekühlt und für einen Monat bei 37°C aufbewahrt. Kein Präzipitat wurde mit bloßem Auge gefunden. Es wurde eine Sinnesprüfung in der gleichen Weise durchgeführt wie beim Testexperiment 12 mit 10 Teilnehmern, jedoch bemerkte kein Teilnehmer einen adstringierenden Geschmack.
Nützlichkeit in der Industrie
Die Eisen-Lf-Verbindungen, Komplexe, der vorliegenden Erfindungen enthalten eine große Menge Eisen und sind thermisch stabil. Somit können die Komplexe physiologische Aktivität von Lactoferrin und Eisen Nahrungsmitteln und Getränken, die durch Hitzebehandlung verarbeitet werden, vermitteln.
Ferner zeigen die Komplexe keinen eisenspezifischen adstringierenden Geschmack, verhindern eine beschleunigte Peroxidbildung und sind nützlich zur Prävention und zur Behandlung von Anämie, Eisenzufuhr, oder Prävention der Kontamination von Nahrungsmitteln, Arzneimitteln, Futtermitteln und Kosmetika mit pathogenen Mikroorganismen.

Claims

Hitzebeständige Lactoferrin-Eisen-Komplexe, bei welchen eine Aminogruppe von Lactoferrin mit Eisen über Hydrogencarbonsäureionen gebunden ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Eisensalzlösung einen pH ≤ 4 aufweist, die Komplexe bei pH ≤ 7 löslich sind, und die vorliegende Menge Eisensalz zwischen 20 und 500 mg pro Gramm Lactoferrin beträgt.
Hitzebeständige Lactoferrin-Eisen-Komplexe gemäß Anspruch 1, bei welchen 1 Gramm Lactoferrin mit 35–400 mg Hydrogenkarbonsäureionen und 20–500 mg Eisen gebunden ist.
Verfahren zur Herstellung von hitzebeständigen Lactoferrin-Eisen-Komplexen, umfassend das Zugeben von 20–500 mg Eisensalzen, welche bei Lösung in Wasser einen pH ≤ 4 haben, pro 1 g Lactoferrin zu einer Lactoferrinlösung und Einstellen des pH der Lactoferrinlösung auf pH ≤ 7 durch Zugeben von 0,35–5 g Hydrogencarbonsäureionen pro 1 g Lactoferrin in Form von deren Alkalisalz.