DE60112465T2 - Transglutaminasehemmer in lebensmittelqualität und seine verwendung - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen Transglutaminase-Inhibitor, der aus Milch erhältlich ist, ein Verfahren zum Erhalt des Transglutaminase-Inhibitors aus Milch, die Verwendung des Transglutaminase-Inhibitors bei der Regulierung der Quervernetzung von Proteinen und seine Verwendung in Lebensmittelprodukten oder in pharmazeutischen Zusammensetzungen, sowie die Verwendung des Transglutaminase-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung bestimmter Krankheiten.
- Transglutaminase (Protein-Glutamin-γ-Glutamyltransferase, EC 2.3.2.13) katalysiert Acyltransferreaktionen, bei denen zwischen Proteinen kovalente Quervernetzungen eingeführt werden, wodurch Moleküle mit hohem Molekulargewicht erzeugt werden. Transglutaminasen sind eine Gruppe von Enzymen (von denen einige Ca2+-abhängig sind) , die die Bildung von Isopeptidbindungen zwischen den Seitenketten von Glutamin- und Lysinresten katalysieren. Wenn ein Lysin, das an ein Protein gebunden ist als primärer Amindonor dient, führt die Reaktion zu einer ε-(γ-Glutamyl)-Lys-Isopeptidbindung, die dazu dient, Proteine querzuvernetzen. Die entstehende Bindung ist kovalent, stabil und wird als relativ resistent gegenüber Proteolyse betrachtet. Die Enzyme wurden aus einer Vielzahl von Quellen isoliert und gereinigt, unter anderem aus Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Säugetieren (Zhu, Y., Rinzema, A., Tramper, J., J. Appl. Microbial Biotechnol (1995) 44:277-282). Die biologischen Rolle und die strukturellen Eigenschaften der Transglutaminasen aus verschiedenen Quellen unterscheiden sich enorm; alle enthalten jedoch ein Cystein in der aktiven Region, das verantwortlich für die Quervernetzungsreaktion ist, und daher ist die Quervernetzung von Proteinen eine Eigenschaft, die alle Typen von Transglutaminasen gemein haben. Unter den Trans glutaminasen ist die Plasmaglutaminase (Faktor XIIIa) aus Säugetieren und Menschen eines der am besten untersuchten Enzyme. Dieses Enzym spielt eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung, da das Enzym Fibrinmoleküle quervernetzt und dadurch die Haltbarkeit des Fibrinnetzwerks in Blutgerinnseln erhöht. Ein weiterer Glutaminase-Typ, ebenfalls aus Säugetieren und Menschen, wird im Allgemeinen als Gewebetransglutaminase bezeichnet. von diesem Transglutaminase-Typ wurde gezeigt, dass er an mehreren Prozessen wie Huntington-Erkrankung, Apoptose, Zöliakie und Alzheimer beteiligt ist. Andere Prozesse, bei denen Transglutaminasen eine Rolle spielen, sind dermatologische Beschwerden, Katarakt, spinobulbäre Atrophie (Kennedy-Erkrankung), (spino)cerebellare Ataxie, dentatorubralepallidolysiale Atrophie, entzündliche Erkrankungen des Zentralnervensystems, einschließlich Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, Diabetes, wie beispielsweise Insulinabhängige Diabetes mellitus, Tetanus und andere Clostridienbedingte Krankheiten, Rett-Syndrom, HIV-Infektionen und entzündliche Prozesse.
- Die Entdeckung einer Ca2+-unabhängigen bakteriellen Transglutaminase aus einem Streptovertillium-Stamm hat der Forschung an Transglutaminasen großen Auftrieb gegeben, da es möglich ist, das Enzym in großen Mengen herzustellen. Da das Enzym in großen Mengen verfügbar geworden ist, gibt es gegenwärtig ein zunehmendes Interesse an der Anwendung des Enzyms in verschiedenen Technologiebereichen.
- Einige Transglutaminase-Anwendungen betreffen den Bereich der Herstellung von Lebensmitteln und von Proteinzusätzen für Lebensmittel. Die Proteinquervernetzungsaktivität des Enzyms kann verwendet werden, um die Textur und Struktur von Lebensmittelprodukten und die funktionellen Eigenschaften von Proteinen zu verbessern. EP-A-0 610 649 offenbart die Verwendung von Transglutaminasen bei der Herstellung von Yoghurt.
- WO 93/19610 beschreibt die Verwendung von Transglutaminasen in Milch, wobei ein Produkt bereitgestellt wird, das eine verbesserte Konsistenz aufweist.
- Wegen der großen Anzahl biologischer Prozesse, bei denen Transglutaminasen beteiligt sind, und der zunehmenden Verwendung von Transglutaminasen besteht ein breites Interesse an Verbindungen, die die Aktivität von Transglutaminasen modifizieren oder inhibieren. Verschiedene Inhibitoren, u.a. Monodansylcadaverin, Mono- und Diamine wie z.B. Cystamin, Putrescin, GABA (Gamma-Aminobenzoesäure), N-Benzyloxycarbonyl, 5-Deazo-4-oxonorvalin, p-Nitrophenylester, Glycinmethylester, CuSO4 und Tolbutamid wurden in WO 99/65516 zur Verwendung bei der Behandlung zahlreicher Pathologien beschrieben. Amine wie z.B. Spermin und Spermidin wurden als Substrate für Transglutaminase genannt. Inhibitoren wie z.B. Monodansylcadaverin, Putrescin, Spermin, Spermidin und Glycinmethylester sind primäre Amine, die die Proteinquervernetzungsaktivität von Transglutaminase durch kompetitive Reaktionen inhibieren; sie blockieren die Transglutaminase-Aktivität nicht. Von anderen wohl bekannten Transglutaminase-Inhibitoren, wie z.B. N-Ethylmaleimid, Iodacetat und para-Chlormercuribenzoesäure ist bekannt, dass sie durch kovalentes Blockieren des Cysteins in der aktiven Region der Transglutaminase wirken. Jedoch ist von diesen Verbindungen bekannt, dass sie toxisch sind und daher nicht geeignet für den Einsatz in Lebensmitteln und Lebensmittelzusätzen. Andere Transglutaminase-Inhibitoren, die in der Patentliteratur beschrieben sind, sind Isoxazole, Imidazole (US-A-5,098,707), und Thiadiazole (WO-A-99/45027).
- Natürliche Transglutaminasen-Inhibitoren sind selten. Von bestimmten spezifischen Peptiden ist bekannt, dass sie Transglutaminase inhibieren (WO-A-95/17426). Von dem antimikrobiellen Mittel Cerulinin, das von einem Pilz hergestellt wird, wird berichtet, dass es ein natürlicher nicht-peptidischer In hibitor der Plasma-Transglutaminase ist (Tymiak, A.A., Tutle, J.G., Kimball, S.D., Wang, T. Lee, V.G. (1993) J. Antiobiot. 46:204-206). Außerdem haben Alutacensäuren (alutacenoic acids), die aus Pilzen isoliert wurden, eine Aktivität als potente Inhibitoren der Plasma-Transglutaminase gezeigt (Kogen, H., Kiho, T., Tago, K., Miyamoto, S., Fujioka, T., Otsuka, N., Suzuki-konagai, K., Ogita, T., 2000. J. Am. Chem. Soc. 122:18421-18430).
- Einer der Nachteile bei der Verwendung von Transglutaminasen in Lebensmitteln besteht darin, dass die Produkte in denen das Enzym in aktiver Form verbleibt einen negativen gesundheitlichen Effekt haben könnten. Es ist daher bevorzugt, die Aktivität des Enzyms vor der Konsumierung des Produkts zu kontrollieren. Die Kontrolle des Enzyms erfolgt vorzugsweise dadurch, dass das Enzym vollständig inhibiert oder inaktiviert wird.
- Die Inaktivierung des Enzyms kann durch thermische Behandlung des Produkts erreicht werden. Die thermische Behandlung von Produkten kann jedoch in vielen Fällen zu unerwünschten Veränderungen der Eigenschaften der Produkte führen. Im Fall von Lebensmitteln kann dies zu einem Produkt führen, das für den Konsumenten weniger attraktiv ist. Bei den Transglutaminase-Inhibitoren, die gegenwärtig im Stand der Technik bekannt sind, handelt es sich im Allgemeinen um Verbindungen oder Zusammensetzungen, die (hauptsächlich wegen ihrer Toxizität) nicht zugelassen sind oder aus anderen Gründen als ungeeignet für die Anwendung in Lebensmitteln eingestuft werden. Dementsprechend existiert ein Bedarf für Transglutaminase-Inhibitoren, die für die Anwendung in Lebensmitteln geeignet sind (d.h. lebensmittelgeeignet) und gleichzeitig eine wirksame Inhibierung der Transglutaminase-Aktivität bereitstellen, während nachteilige Wirkungen des Inhibitors, entweder auf das Produkt oder auf den Konsumenten, zumindest wesentlich reduziert werden oder abwesend sind.
- Die Erfinder haben nunmehr herausgefunden, das Milch einen Transglutaminase-Inhibitor enthält. Bei Quervernetzungsexperimenten von entrahmter Milch mit Transglutaminase wurde herausgefunden, dass die Bildung von Caseinpolymer mit hohem Molekulargewicht nur zu einem geringen Grad stattfindet. Intensive Hitzebehandlung der entrahmten Milch führte zu einem deutlich höheren Grad der Quervernetzung, wie sich anhand der Bildung großer Polymere und dem Verschwinden von Caseinmonomeren beobachten ließ. Die Entfernung von Casein und Molkeproteinen aus der Milch ergab eine Fraktion, in der die Transglutaminaseinhibierende Aktivität erhalten war. Es wurde ferner herausgefunden, dass dieser Inhibitor nicht nur die bakterielle Transglutaminase inhibiert, sondern auch bei der Inhibierung der Aktivität von zwei Transglutaminasen wirksam ist, die im Blut auftreten. Durch eine Kombination von Isolierungs- und Reinigungs-Schritten kann der Inhibitor zum Teil gereinigt werden, wobei die Inhibierungsaktivität beibehalten wird. Die auf diese Weise erhaltene Fraktion kann zur Transglutaminase-Inhibierung verwendet werden.
- In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, die einen Transglutaminase-Inhibitor enthält, welcher aus Milch erhältlich ist, zur Kontrolle der Aktivität einer Transglutaminase bei der Quervernetzung von Proteinen bereit. In einem zweiten Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, die einen Transglutaminase-Inhibitor enthält, welcher aus Milch erhältlich ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Alzheimer, Hämophilie, Apoptose, Zöliakie, Huntington-Erkrankung, dermatologischen Beschwerden, Katarakt, spinobulbärer Atrophie (Kennedy Erkrankung), (spino)cerebellarer Ataxie, dentatorubraler-pallidolysialer Atrophie, entzündlichen Erkrankungen des Zentralnervensystems, einschließlich Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, Diabetes, wie beispielsweise Insulin abhängiger Diabetes mellitus, Tetanus und anderen Clostridienbedingten Krankheiten, Rett-Syndrom, HIV-Infektionen und entzündlichen Prozessen bereit.
- Bevorzugte Ausführungsformen werden in den Ansprüchen 3-13 beschrieben.
- Der Inhibitor ist insbesondere aus der Molke-Fraktion erhältlich, die man aus entrahmter Milch erhält, indem man aus der Milch den Bruch (curd) bildet, z.B. durch die Verwendung von Mikroorganismen oder Proteasen oder durch die Ansäuerung mit lebensmittelgeeigneter Säure, den Bruch (curd) von der Molke in einem Zentrifugations-Schritt abtrennt, und anschließend die erhaltene Molke einem Ultrafiltrations-Schritt unterzieht. In einer alternativen Ausführungsform ist der Inhibitor erhältlich, indem die entrahmte Milch einem Diafiltrations-Schritt unterzogen wird.
- Indem man die aus Milch erhältliche Molke-Fraktion einem Ultrafiltrations-Schritt unterzieht, wird die gewünschte Fraktion, die den Transglutaminase-Inhibitor enthält, im Permeat erhalten, das von den Molkeproteinen getrennt wird. Vorzugsweise wird die Molke-Fraktion mittels einer Membran ultrafiltriert, die eine Ausschlussgrenze von 10 kDa besitzt. Der Grenzwert der Ausschlussgrenze der Membran wird durch die Fähigkeit bestimmt, zwei der Hauptmolkeproteine zu entfernen (Lactalbumin (14,1 kDa) und β-Lactalbumin (18 kDa)). Da man annimmt, dass das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Inhibitors etwa 200 Da beträgt, wird eine geeignete Ausschlussgrenze oberhalb von 1 kDa liegen, jedoch sind Ausschlussgrenzen von 2, 3, 4 oder 5 bis 10 kDa ebenfalls geeignet.
- In dem Fall, dass die gewünschte Fraktion, die den Transglutaminase-Inhibitor enthält, durch Diafiltration erhalten wird, ist es bevorzugt, dass die Diafiltrationsmembran eine Aus schlussgrenze von ungefähr 3 kDa hat. Eine geeignete Membran zur Diafiltration wird jedoch eine Ausschlussgrenze im gleichen Bereich wie die Membran zur Ultrafiltration aufweisen, von 1 bis 10 kDa.
- Die Erfindung verwendet z.B. ein Verfahren zum Erhalt einer einen Transglutaminase-Inhibitor enthaltenden Zusammensetzung aus der Molke-Fraktion, die aus entrahmter Milch erhältlich ist, indem man den Bruch (curd) der Milch bildet, den Bruch (curd) von der Molke in einem Zentrifugations-Schritt abtrennt, und die Molke anschließend einem Ultrafiltrations-Schritt unterzieht. Vorzugsweise wird der Bruch (curd) durch Ansäuern der Milch mit einer lebensmittelgeeigneten Säure hergestellt, wie z.B. Salzsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Milchsäure oder Glucon (delta-Glucon), oder alternativ dazu durch Zusatz von säureproduzierenden Mikroorganismen. Alternativ dazu umfasst der Prozess einen Schritt, bei dem man die entrahmte Milch einem Diafiltrations-Schritt unterzieht.
- In US-A-5,198,213 wird beschrieben, dass die obere Fraktion der Molke, die die Proteine mit höherem Molekulargewicht enthält, eine messbare aber niedrige Menge immunologisch aktiver Immunglobuline und andere Pathogen-spezifische Antikörper enthält. Es wird kein Bezug auf irgendwelche nützlichen Anwendungen der die niedermolekularen Verbindungen enthaltenden Molke-Fraktionen genommen, die in Verbindung mit Transglutaminase stehen.
- WO-A-98/48640 offenbart eine insulinfreie Proteinfraktion, die aus größeren Proteinen besteht. Diese Fraktionen werden in Kindernahrung und anderen Nährpräparaten verwendet.
- In WO-A-98/09717 wird eine besondere Separationstechnik beschrieben. In den Beispielen 3 und 4 werden Proteine aus Milch bzw. Molke gewonnen. Es werden keine bestimmten Verwendungen gemäß der vorliegenden Erfindung für die besagten Produkte angeführt, insbesondere nicht für die niedermolekularen Fraktionen.
- Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird angenommen, dass die den Transglutaminase-Inhibitor enthaltende Zusammensetzung, die auch als Transglutaminase-Inhibitor bezeichnet wird, ein niedermolekulares Material ist, vorzugsweise mit einem Molekulargewicht in einer Größenordnung von ungefähr 200 Da.
- Bezüglich der Eigenschaften des erfindungsgemäßen Transglutaminase-Inhibitors wurde herausgefunden, dass der Inhibitor kein freies Metallion ist.
- Der erfindungsgemäße Inhibitor inhibiert die Transglutaminase-Aktivität bei der Quervernetzung von Casein und anderen Proteinen und in verschiedenen Transglutaminase-Aktivitätsassays. Der Inhibitor kann in Form einer Molke-Fraktion verwendet werden. Es ist bevorzugt, dass die Fraktion, die den Inhibitor enthält, einem Konzentrations-Schritt unterzogen wird. Ein geeigneter Konzentrations-Schritt ist die Lyophilisierung oder Sprühtrocknung. In dieser Ausführungsform der Erfindung wird der Inhibitor in einer konzentrierten Form erhalten, wobei das Inhibierungsvermögen des Inhibitors nicht wesentlich beeinträchtigt ist. Das Wiederauflösen des getrockneten Produkts aus dem Lyophilisierungs- und/oder Sprühtrocknungs-Schritt hat den weitgehenden Erhalt der inhibierenden Wirkung auf Transglutaminase zur Folge.
- In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der Inhibitor weiter auf gereinigt sein. Geeignete Aufreinigungs-Schritte sind Gelfiltration und/oder Ionenaustauschverfahren. Beim Auf reinigen des Inhibitors wird vorzugsweise zumindest ein Teil der Laktose entfernt.
- Der erfindungsgemäße Inhibitor ist über einen breiten Temperaturbereich stabil. Die Isolierungs-, Aufreinigungs- und Konzentrations-Schritte, mit denen der Inhibitor erhalten wird, können bei Temperaturen von bis zu etwa 80°C ausgeführt werden. Es sollte darauf geachtet werden, die obere Grenze dieses Temperaturbereichs nicht zu überschreiten. Das Überschreiten der oberen Temperaturgrenze hat im Allgemeinen einen Verlust oder eine unerwünschte Reduktion der Aktivität des Transglutaminase-Inhibitors zur Folge. Vorzugsweise wird der Inhibitor nicht auf Temperaturen von über 70°C, besonders bevorzugt nicht auf Temperaturen von über 60°C erhitzt.
- Der erfindungsgemäße Inhibitor ist aus Milch erhältlich. Die Milch, aus der eine den erfindungsgemäßen Inhibitor erhaltende Fraktion erhalten werden kann, kommt aus Tieren und vorzugsweise aus Haustieren wie z.B. Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel, Büffel, Rotwild, Esel, Rentier; es ist im Prinzip auch möglich humane Milch als geeignete Quelle zu verwenden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Inhibitor aus Kuhmilch erhalten. Die Milch ist vorzugsweise unbehandelt oder zumindest nicht ausgiebig hitzebehandelt. Die fetthaltige Fraktion wird vorzugsweise entfernt, z.B. durch Zentrifugation. Proteine werden vorzugsweise durch Ultrafiltration entfernt, durch Ausfällen und/oder durch Diafiltration oder durch eine Kombination dieser Techniken; die Inhibitor-Zusammensetzung befindet sich im Permeat des Ultrafiltrations- und Diafiltrations-Schritts.
- Der erfindungsgemäße Inhibitor bindet auf eine im Wesentlichen kovalente Weise an Transglutaminase, wie durch MALDI-TOF-Analyse gezeigt wurde. Weiterhin wurde durch Titrationsexperimente herausgefunden, dass der Inhibitor in ungefähr äquimolarer Menge an Transglutaminase bindet. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird davon ausgegangen, dass der erfindungsgemäße Inhibitor an Transglutaminase-Cysteinreste gebunden ist.
- Die Erfindung findet bei der Herstellung von Lebensmitteln und Lebensmittelprodukten Anwendung. Wenn Transglutaminase zur Quervernetzung von Proteinen verwendet wird, um die Struktur von Protein-haltigen Lebensmitteln zu verbessern, z.B. bei Lebensmitteln wie Milchprodukten (Yoghurt), Fleisch oder Fisch, kann die Transglutaminase-Aktivität durch Zusatz des erfindungsgemäßen Inhibitors unterbunden oder reduziert werden.
- Ein wichtiger Aspekt des erfindungsgemäßen Inhibitors ist die Verwendung des Inhibitors zur Regulierung des Quervernetzungsgrades. Es wurde herausgefunden, dass die partielle Quervernetzung von β-Casein bei Erhitzung zur Bildung eines Gels führt, während nicht-quervernetztes β-Casein oder ausgiebig quervernetztes β-Casein beim Erhitzen kein Gel bildet. Die Regulierung des Quervernetzungsgrades wird durch den Zusatz des erfindungsgemäßen Inhibitors auf einfache Weise erreicht, während andere Mittel zur Aktivierung, z.B. durch Erhitzen, leicht zur Zerstörung der Proteinfunktionalität führen können. Ferner kann der erfindungsgemäße Inhibitor in einer Form verwendet werden, die eine kontrollierte Freisetzung erlaubt, wie z.B. in verkapselter Form. Es ist leicht vorstellbar, dass der Zusatz von Transglutaminase in Kombination mit (mikro)verkapseltem Inhibitor zu einem Substrat zu einer homogenen Verteilung sowohl von Transglutaminase als auch von Inhibitor führt. Die Quervernetzung der Proteine kann dann durch das Freisetzungs-Profil des Inhibitors gesteuert werden. Dies ist vorteilhaft wenn das Produkt nach der Quervernetzung viskos oder geliert ist.
- In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Transglutaminase-Inhibitors. Die pharma zeutische Verwendung wird zur Behandlung von Krankheiten verwendet, wie sie in Anspruch 2 beschrieben werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann mindestens einen Transglutaminase-Inhibitor in einer pharmazeutisch verträglichen Form umfassen, wahlweise kombiniert mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Diese Zusammensetzungen können durch jedes Mittel verabreicht werden, das den beabsichtigten Zweck erreicht. Die Mengen und Verabreichungspläne der pharmazeutischen Zusammensetzung können von durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet der Behandlung dieser Krankheiten leicht bestimmt werden.
- Wie erwähnt bezieht sich die Erfindung ferner auf die Verwendung des Transglutaminase-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, bei denen Transglutaminase eine Rolle spielt, wie z.B. Alzheimer, Hämophilie, Apoptose, Zöliakie, Huntington-Erkrankung, dermatologische Beschwerden, Katarakt, spinobulbäre Atrophie (Kennedy Erkrankung), (spino)cerebellare Ataxie, dentatorubrale-pallidolysiale Atrophie, entzündliche Erkrankungen des Zentralnervensystems, einschließlich Multipler Sklerose, rheumatoide Arthritis, Diabetes, wie z.B. Insulin-abhängige Diabetes mellitus, Tetanus und andere Clostridien-bedingte Krankheiten, Rett-Syndrom, HIV-Infektionen und entzündliche Prozesse.
- Beschreibung der Figuren:
-
1 : Quervernetzung von entrahmter Milch mit bakterieller Transglutaminase (30 μg/ml), vor und nach Hitzebehandlung (3 h, 80°C).
Bahn 1 Molekulargewichtsmarker
Bahn 2 unbehandelte, entrahmte Milch + Transglutaminase, t = 0 min;
Bahn 3 unbehandelte, entrahmte Milch + Transglutaminase, t = 10 min;
Bahn 4 unbehandelte, entrahmte Milch + Transglutaminase, t = 30 min;
Bahn 5 unbehandelte, entrahmte Milch + Transglutaminase, t = 120 min;
Bahn 6 erhitzte, entrahmte Milch + Transglutaminase, t = 0 min;
Bahn 7 erhitzte, entrahmte Milch + Transglutaminase, t = 10 min;
Bahn 8 erhitzte, entrahmte Milch + Transglutaminase, t = 30 min;
Bahn 9 erhitzte, entrahmte Milch + Transglutaminase, t = 120 min. -
2 : Aktivitätsassay von bakterieller Transglutaminase nach Inkubation mit der Inhibitor-Fraktion.
A: bakterielle Transglutaminase nach Inkubation mit der Inhibitor-Fraktion, erhalten durch Ultrafiltration der Molke-Fraktion.
B: bakterielle Transglutaminase nach Inkubation mit der Inhibitor-Fraktion, erhalten durch Gelfiltration der Molke-Fraktion. -
3 : Auftrennung von proteinfreier Inhibitor-Fraktion auf Biogel P2. Die Inhibitor-Fraktion wurde mittels Methode 1 erhalten. Die Position, an der der Inhibitor eluierte, ist in der Figur dargestellt. -
4 : Quervernetzung von Casein mit unbehandelter bakterieller Transglutaminase sowie mit bakterieller Transglutaminase, die mit der proteinfreien Inhibitor-Fraktion vorinkubiert wurde.
A: Quervernetzung von Casein mit unbehandelter Transglutaminase
Bahn 1 Molekulargewichtsmarker
Bahn 2 Casein nach Quervernetzung mit Transglutaminase t = 0 min;
Bahn 3 Casein nach Quervernetzung mit Transglutaminase t = 10 min;
Bahn 4 Casein nach Quervernetzung mit Transglutaminase t = 20 min;
Bahn 5 Casein nach Quervernetzung mit Transglutaminase t = 40 min.
B: Quervernetzung von Casein mit Transglutaminase nach Vorinkubation mit Inhibitor.
Bahn 1 Molekulargewichtsmarker
Bahn 2 Casein nach Quervernetzung mit Transglutaminase t = 0 min;
Bahn 3 Casein nach Quervernetzung mit Transglutaminase t = 10 min;
Bahn 4 Casein nach Quervernetzung mit Transglutaminase t = 20 min;
Bahn 5 Casein nach Quervernetzung mit Transglutaminase t = 40 min. - Beispiele
- Materialien und Methoden
- Materialien. Source Q, Source S und Superdex peptide 30 wurden von Pharmacia (Uppsala, Schweden) bezogen. Biogel P2 wurde von BioRad bezogen. N,N,-Dimethylcasein, Casein, Cbz-Glutaminylglycin, Hydroxylamin und Meerschweinchenleber-Transglutaminase wurden von Sigma bezogen. Alle anderen Reagenzien hatten ana lytischen Reinheitsgrad. Entrahmte Milch wurde von einem lokalen Geschäft bezogen, frische Milch wurde direkt von einem Bauernhof bezogen. Streptoverticillium mobaraense wurde wie beschrieben [1] kultiviert und die Aufreinigung von Transglutaminase wurde gemäß [2] durchgeführt. Humane Plasma-Transglutaminase wurde von den Behring Werken bezogen.
- Quervernetzung von Proteinen aus entrahmter Milch
- Proteine aus entrahmter Milch wurden durch Zusatz von 30 μg bakterieller Transglutaminase pro ml entrahmter Milch quervernetzt. Als Kontrolle wurde entrahmte Milch bei 80°C 3 Stunden lang vor Zusatz der Transglutaminase inkubiert. Die Inkubationen wurden bei 37°C durchgeführt, und es wurden in Zeitintervallen Proben entnommen. Die Quervernetzungsreaktion wurde durch Inkubation bei 80°C für 5 Minuten beendet. Die Analysen der Quervernetzungsreaktionen wurde mittels Gelelektrophorese durchgeführt.
- Messung der Transglutaminase-Inhibierung durch Aktivitätsassays
- Eine quantitative Analyse der Inhibierung von Bakterien- und Meerschweinchen-Transglutaminase-Aktivität wurde mit Hilfe des Hydroxamatassays [3] durchgeführt. 30 μl (1 mg/ml) Transglutaminase wurden mit variablen Mengen Inhibitor-Fraktion (0 bis 30 μl) inkubiert. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Kopplung des Inhibitors an die Transglutaminase zu gewährleisten. Es wurden Aktivitätsmessungen mit den inhibierten Fraktionen durchgeführt.
- Die quantitative Analyse der Inhibierung von Plasma-Transglutaminase-Aktivität wurde durch Inkorporation von Monodansylca daverin in dimethyliertes Casein nach Lorand [4] durchgeführt. Die Plasma-Transglutaminase wurde in diesem Assay gemessen, da dieses Enzym keine Aktivität im Hydroxamatassay zeigt. Dithiotreitol wurde aus dem Reaktionsmisch weggelassen, um eine mögliche Entfernung des Inhibitors von der Transglutaminase durch Reduktion zu verhindern. Die Inhibierung wurde aus der relativen Aktivitätsabnahme berechnet.
- Messung von Transglutaminase-Inhibierung durch Quervernetzungsexperimente
- Es wurden qualitative Analysen der Inhibierung bakterieller Transglutaminase-Aktivität durch Quervernetzung von Casein durchgeführt. 20 μg Transglutaminase wurden mit 200 μl der μl-trafiltrierten Inhibitor-Fraktion inkubiert. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um die Kopplung des Inhibitors an die Transglutaminase zu gewährleisten. Der Standardreaktionsansatz (Gesamtvolumen 2 ml) enthielt 50 mM Natriumacetat pH 6, 10 mg/ml Casein, und 10 μg vorinkubierte Transglutaminase. Die Inkubationen wurden bei 40°C durchgeführt, und es wurden in Zeitintervallen Proben entnommen. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 80°C für 5 Minuten beendet. Die Analyse der Quervernetzungsreaktionen wurde mittels Gelelektrophorese durchgeführt.
- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
- Die Bestimmung der Molekulargewichte der Untereinheiten wurde unter denaturierenden Bedingungen durch SDS-PAGE nach Laemmli [5] durchgeführt, wobei fertige Gele und eine Mini-Protean-Ausrüstung (Bio-Rad) verwendet wurden. Enzym- oder Reaktionsgemischproben wurden durch Inkubation für 5 Minuten bei 100°C in 2 % SDS und 1 % Dithiotreitol denaturiert. Die Gele wurden zur Proteindetektion mit Coomassie Brilliant Blue G250 gefärbt. Ein Kalibrierungskit für hohes Molekulargewicht (Pharmacia) wurde verwendet, um die Molekularmassen herzuleiten.
- Herstellung einer im Wesentlichen proteinfreien Inhibitor-Fraktion.
- Methode 1
- Entrahmte Milch wurde durch Zusatz von Salzsäure auf pH 4,4 gebracht. Ausgefälltes Casein wurde durch Zentrifugation (20 min, 25000 g) entfernt. Der klare Überstand wurde mit einer 10 kDa-Membran (Amicon) ultrafiltriert. Die konzentrierten Molkeproteine wurden entfernt, und die Lösung, welche durch die Membran hindurchgetreten war, wurde eingefroren oder lyophilisiert.
- Der Inhibitor konnte durch Gelfiltration auf einer Superdex 30 Peptidsäule oder Biogel P2 weiter auf gereinigt werden, um Laktose und andere Nicht-Inhibitorkomponenten zu entfernen.
- Methode 2
- 1 Liter entrahmte Milch wurde gegen 5 Liter entionisiertes Wasser dialysiert, wobei ein Dialyseschlauch mit einer Ausschlussgrenze von 3500 Da verwendet wurde. Nach 24 Stunden Dialyse wurde der Dialyseschlauch mit der Proteinfraktion entfernt. Die Lösung, die die Moleküle mit einer Größe von weniger als 3500 enthielt, enthielt den Transglutaminase-Inhibitor. Diese Fraktion kann lyophilisiert werden, um den Inhibitor aufzukonzentrieren. Lösungen des Inhibitors können durch Auflösen der lyophilisierten Probe in Wasser hergestellt werden. Verbliebene unlösliche Verbindungen wurden durch Zentrifugation entfernt.
- Maldi TOF-Analyse von Transglutaminase vor und nach Inhibierung
- Bakterielle Transglutaminase (1 mg) wurde mit 10 ml Inhibierungs-Fraktion inkubiert, die durch Methode 1 erhalten wurde. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Inhibierung der Transglutaminase im Hydroxamatassay getestet. Die inhibierte Transglutaminase wurde mit einem 30 kDa Amicon-Filter ultrafiltriert, um ungebundene Komponenten zu entfernen und die bakterielle Transglutaminase aufzukonzentrieren. Die Molekülmassen der inhibierten Transglutaminase und der Blindprobe wurden unter Verwendung von Maldi TOF gemessen.
- Ergebnisse
- Quervernetzung von Proteinen aus entrahmter Milch
- Die SDS-PAGE-Analyse nach Quervernetzung von entrahmter Milch zeigte nur geringe Hinweise auf eine Quervernetzung (
1 ). Nach Hitzebehandlung bei 80°C für 3 Stunden zeigte die entrahmte Milch jedoch eine normale Quervernetzung der Caseine. Eine weiterer Zusatz von Transglutaminase zur nicht-erhitzten entrahmten Milch ergab eine Quervernetzung, die mit der der erhitzten entrahmten Milch vergleichbar war (Daten nicht gezeigt). - Messung der Transglutaminase-Inhibierung durch Aktivitätsassays
- Die Aktivitäten der bakteriellen Transglutaminase nach Inkubation mit der Inhibitor-Fraktion waren verringert, wie im Hydroxamatassay beobachtet werden konnte (
2a ). Abhängig vom Typ der verwendeten Inhibitor-Fraktion waren Bestandteile in der Fraktion für Störungen der Aktivitätsmessungen verantwortlich. Diese Bestandteile verursachten eine Farbentwicklung, die mit den Absorptionsmessungen der Transglutaminase-Aktivität interferierten. Eine weitere Aufreinigung des Inhibitors mittels Gelfiltration entfernte die interferierenden Bestandteile, was zu einer linearen Inhibierungskurve führte (2b ). - Meerschweinchenleber-Transglutaminase ergab ähnliche Ergebnisse (Daten nicht gezeigt).
- Die Aktivitäten der Plasma-Transglutaminase waren nach Inkubation mit der Inhibitor-Fraktion verringert, wie im Fluoreszenzassay beobachtet werden konnte (Daten nicht gezeigt). Dieses Ergebnis zeigt eindeutig, dass es möglich ist, Plasma-Transglutaminase mit dem Inhibitor vollständig zu inaktivieren.
- Messung von Transglutaminase-Inhibierung durch Quervernetzungsexperimente
- Eine Quervernetzung von Casein wurde nicht mit bakterieller Transglutaminase nach Inhibierung mit der gemäß Methode 1 erhaltenen Fraktion beobachtet (
3 ). Die Kontrolle mit unbehandelter Transglutaminase zeigte normale eine Quervernetzung. - Herstellung einer proteinfreien Inhibitor-Fraktion
- Methode 1
- Caseine wurden durch Zentrifugation nach Präzipitation bei pH 4,4 entfernt. Die Molkeprotein-Fraktion wurde anschließend mit einer 10 kDa Ultrafiltrationseinheit (Amicon) ultrafil triert. Die niedermolekulare Fraktion, die durch die Membran hindurchgetreten war, zeigte Transglutaminase-Inhibierung, wie in
2a erkennbar ist. Eine Aufkonzentrierung dieser Fraktion wurde durch Lyophilisierung der Lösung und Auflösen der Feststoffe in einem kleinen Volumen Wasser erreicht. Die aufkonzentrierte Fraktion wurde auf einem Biogel P2 (4 ) weiter aufgereinigt. - Methode 2
- Caseine und Molkeproteine wurden von der Inhibitor-Fraktion durch Dialyse der entrahmten Milch abgetrennt. Die Proteine verblieben im Dialyseschlauch, während der Inhibitor zusammen mit anderen niedermolekularen Komponenten durch die Dialysemembran hindurchtrat. Die Dialyseprozedur verursachte eine Verdünnung des Inhibitors; deshalb wurde die Lösung lyophilisiert und die Feststoffe in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst.
- Maldi TOF-Analyse von Transglutaminase
- Das Molekulargewicht von Transglutaminase, bestimmt durch Maldi TOF, betrug 37900 Da. Das Molekulargewicht der inhibierten Transglutaminase betrug 38064 Da. Da es möglich ist, dass nur ein Teil des Inhibitors an die Transglutaminase gekoppelt ist, muss die erhaltene Masse nicht mit der Masse des Inhibitors übereinstimmen.
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-
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- 2 Zhu, Y., Rinzema, A., Tramper, J., Bruin, E. de und Bol, J, (1998) Appl. Micr. Biotech. 49, 251-257
- 3 Folk, J.E. und Cole, P.W. (1965) J. Biol. Chem. 241, 2951
- 4 Lorand, L., Lockridge, O.M., Campbell, L.K., Myhrman, R. und Bruner-Lorand, J. (1972) Anal. Biochem 44, 221-231
- 5 Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685
Claims (13)
- Verwendung einer aus Milch erhältlichen Zusammensetzung, die einen Transglutaminase-Inhibitor enthält, bei der Kontrolle der Transglutaminase-Aktivität bei der Quervernetzung von Proteinen.
- Verwendung einer aus Milch erhältlichen Zusammensetzung, die einen Transglutaminase-Inhibitor enthält, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Alzheimer, Hämophilie, Apoptose, Zöliakie, Huntington-Erkrankung, dermatologischen Beschwerden, Katarakt, spinobulbärer Atrophie (Kennedy Erkrankung), (spino)cerebellarer Ataxie, dentatorubraler-pallidolysialer Atrophie, entzündlichen Erkrankungen des Zentralnervensystems, einschliesslich Multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis, Diabetes, wie beispielsweise Insulin-abhängiger Diabetes mellitus, Tetanus und anderen Clostridien-bedingten Krankheiten, Rett-Syndrom, HIV-Infektionen und entzündlichen Prozessen.
- Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der die Zusammensetzung, die den Transglutaminase-Inhibitor enthält, aus der Molke-Fraktion erhältlich ist, welche aus entrahmter Milch erhältlich ist, indem man aus der Milch einen Bruch (curd) bildet, den Bruch (curd) von der Molke in einem Zentrifugations-Schritt abtrennt, und anschließend die Molke einem Ultrafiltrations-Schritt unterzieht.
- Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei der die Zusammensetzung, die den Transglutaminase-Inhibitor enthält, erhältlich ist, indem man entrahmte Milch einem Diafiltrations-Schritt unterzieht.
- Verwendung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei der man das aus dem Ultrafiltrations-Schritt oder dem Diafiltrations-Schritt erhaltene Filtrat ferner einem Konzentrierungs-Schritt unterzieht.
- Verwendung nach Anspruch 3, bei der der Konzentrierungs-Schritt eine Lyophilisation umfasst.
- Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, bei der die Molke-Fraktion zumindest teilweise in einem Reinigungs-Schritt, der eine Gelfiltration und/oder eine Ionenaustausch-Chromatographie umfasst, weiter aufgereinigt wird.
- Verwendung nach Anspruch 7, bei der die Reinigung die Entfernung von zumindest einem Teil der Laktose umfasst.
- Verwendung nach Anspruch 3, bei der der Bruch (curd) durch Ansäuern der Milch mit lebensmittelgeeigneter Säure oder durch Zufügen von Säure-produzierenden Mikroorganismen gebildet wird.
- Verwendung nach Anspruch 8, bei der die Milch auf einen pH-Wert von 2,8 bis 5,2, vorzugsweise 3-5, insbesondere bevorzugt 4,0-4,6, angesäuert wird.
- Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Milch von Haustieren, vorzugsweise Kuh, Ziege, Schaf, Rotwild, Esel, Rentier oder von Menschen stammt.
- Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Milch bei einer Temperatur von weniger als 80°C hitzebehandelt worden ist.
- Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der der Transglutaminase-Inhibitor ein Molekulargewicht in der Grössenordnung von etwa 200 Dalton hat.
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