DE60217347T2

DE60217347T2 - Verfahren zur gewinnung von kaseinfraktionen aus milch und kaseinaten und herstellung neuer produkte

Info

Publication number: DE60217347T2
Application number: DE60217347T
Authority: DE
Inventors: Andrew Ayr LAW; Jeff Ayr LEAVER
Original assignee: Hannah Research Institute
Current assignee: Zenbury International Ltd Ireland
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2022-07-06
Also published as: DE60217347D1; US20040234666A1; EP1406507A1; WO2003003847A1; JP2004521650A; EP1406507B1; ES2282431T3; GB0116509D0; ATE349903T1

Description

Einleitung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur selektiven Präzipitation von Caseinfraktionen aus Magermilch oder von Caseinaten durch Hinzufügen eines Calciumsalzes bei basischem pH-Wert.
Die Erfindung betrifft insbesondere die Präparation reiner Fraktionen von αs-Casein und β-Casein, und zum ersten Mal eine Fraktion, die in hohem Grade an κ-Casein angereichert ist. Die Produkte sind zur Verwendung als Nahrung oder für die Herstellung von Novel-Food-Materialien geeignet und das Verfahren kann in industriellem Maßstab verwendet werden. Die gereinigten Caseinfraktionen haben bestimmte Eigenschaften und haben einen weiten Anwendungsbereich, einschließlich der Stabilisierung von Emulsionen und Schäumen, der Zubereitung von Säuglingsnahrung oder Zubereitungen, die für an metabolischen Störungen, beispielsweise Phenylketonurie (PKU), Erkrankte geeignet sind und der Herstellung essbarer Beschichtungen und biodegradierbarer Kunststoffe.
Die Fraktionen sind insbesondere auch als Ausgangsmaterialien für Verfahren geeignet, die eine begrenzte Proteolyse mit einbeziehen, um neue Käsearomen, Nutraceuticals und einen weiten Bereich von bioaktiven Peptiden zu erzeugen. Diese schließen Phosphopeptide und andere bioaktive Peptide mit antibiotischen, blutdrucksenkenden, immunomodulatorischen, antithrombotischen und opioidalen Funktionen ein.
Milchprodukte bilden einen großen Bestandteil an der menschlichen Ernährung, die Gesamtweltproduktion von Kuhmilch betrug 1998 ungefähr 57 Millionen Tonnen. Milch selbst ist eine verhältnismäßig komplizierte Mischung, wobei die Hauptbestandteile Fett, Mineralien, Zucker (Lactose) und Proteine sind. Die Proteine sind in der Milch mit einer Konzentration von ungefähr 35 g/l vorhanden und werden gewöhnlich in zwei Hauptkategorien aufgeteilt – Caseine, die im Quark zurückbehalten werden, und Molkeproteine, die während der Käseherstellung in der restlichen Flüssigkeit verbleiben.
Die Caseine betragen 80 % des Proteins in der Milch und treten, zusammen mit einem Großteil des Calciums und des Phosphats, in kolloidalen Partikeln von Submikrongröße auf, die als Caseinmicellen bezeichnet werden. Die Lichtstreuung durch Caseinmicellen gibt der Milch ihr charakteristisches weißes Aussehen. Die Unversehrtheit der Caseinmicellen ist für die Haltbarkeit von Milch entscheidend und die Eigenschaften der Produkte, die aus Milch hergestellt werden, sind zum Teil durch die Eigenschaften der Micellen bestimmt. Beispielsweise ist es bekannt, dass die Festigkeit von Käse direkt mit dem durchschnittlichen Durchmesser der Micellen in der Milch, aus der sie hergestellt werden, korreliert. Die weltweite Käseproduktion wurde 1998 auf ungefähr 15 Million Tonnen geschätzt. In zunehmendem Maße werden Milchproteine nicht als flüssige Milch, sondern als Bestandteile in Produkten konsumiert, die in größerem oder geringerem Ausmaß verarbeitet worden sind. Der Verarbeitungsgrad reicht von der Joghurt- und Hüttenkäseherstellung, in der die Micellen veranlasst werden, durch Ansäuerung zu aggregieren, bis zur Einbindung von Milchproteinfraktionen in Soßen und in Aufstrichen.
Wenn Milch auf pH 4,6 angesäuert wird, löst sich Calciumphosphat von den Caseinmicellen und die micellare Struktur wird gestört und veranlasst das Casein zu aggregieren und zu präzipitieren. Dieses Verfahren wird in der Herstellung von Natriumcaseinat verwendet, das durch Resuspendieren des sauren Caseinpräzipitats in wässeriger Lösung durch Hinzufügen von Natriumhydroxid bis ungefähr pH 7,0, gefolgt von einem Trocknungsvorgang, hergestellt wird. Andere Formen von Caseinaten mit unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften, wie Calciumcaseinat oder Ammoniumcaseinat, können erhalten werden, indem man das Casein auf pH 7,0 mit dem geeigneten Calcium- oder Ammoniumhydroxid einstellt. Die jährliche weltweite Produktion von Casein und Caseinaten beträgt ungefähr 250.000 Tonnen. Caseinate werden in der Herstellung einer breiten Vielzahl von verarbeiteten Nahrungsmitteln verwendet, in denen Nutzen aus ihren ausgezeichneten Schaum-, Emulgations- und wasserbindenden Eigenschaften gezogen wird.
Das Casein in Kuhmilch besteht aus vier unterschiedlichen Proteine, nämlich κ-, β-, α_s1- und α_s2-Casein. Der Aufbau des Gesamtcaseins ist durchschnittlich κ-, 11 %; β-, 35,0 %; α_s1-, 36 % und α_s2-, 10,0 %, wobei der Rest Abbauprodukte der Hauptcaseine ist. Die einzelnen Caseine haben ziemlich ähnliche Molekulargewichte und isoelektrische Punkte, und besitzen hohe Affinitäten für Ca²⁺ und anorganisches Phosphat, aber sie haben vollständig unterschiedliche Aminosäurereihenfolgen und -eigenschaften.
Nach ihrer Biosynthese durchlaufen alle Caseine Phosphorylierung an den Serin- und gelegentlich Threonin-Aminosäureresten in der charakteristischen Tripeptid-Abfolge Ser/Thr-X-A, wobei X jeden möglichen Aminosäurerest darstellt und A ein säurehaltiger Aminosäurerest wie Asp, Glu, SerP oder ThrP ist. Diese Phosphatzentren sind deshalb wichtig, weil sie an der Bindung von Calciumphosphat und am Aufrechterhalten der micellaren Struktur des Caseins beteiligt sind. Auf diese Art werden sowohl Protein als auch Calciumphosphat, die in der Nahrung wichtig sind, in beständig hohen Konzentrationen in der Milch gehalten. Das α_s1- und α_s2-Casein haben die meisten Serinphosphatgruppen in ihrer Struktur, die höchste negative Nettoladung bei basischem pH und die höchste Affinität für Ca²⁺. β-Casein liegt in dieser Hinsicht dazwischen, wobei κ-Casein nur eine Serinphosphatgruppe, die niedrigste negative Ladung und die geringste Affinität für Ca²⁺ hat.
Die Caseine als Gruppe sind sehr hydrophob und haben, wenn die micellare Struktur gestört wird, eine hohe Tendenz, in wässeriger Lösung zu aggregieren, wobei β-Casein am hydrophobsten, α_s1- und α_s2-Casein mittelmäßig und κ-Casein am wenigsten hydrophob ist. κ-Casein unterscheidet sich auch von den anderen Caseinen dadurch, dass es in der Milch als Reihe disulfid-verbundener Polymere auftritt und Kohlenhydratseitenketten enthält.
Die Caseine haben eine offene Struktur und durchlaufen leicht Proteolyse, aber sie zeigen unterschiedliche Anfälligkeiten auf eine Vielzahl proteolytischer Enzyme. Beispielsweise werden β- und α_s2-Casein leichter als die anderen Caseine durch in Milch vorhandenes Plasmin angegriffen. κ-Casein unterliegt auch leicht spezifischer Proteolyse mit Chymosin, und dieses bildet die Grundlage des Koagulationsvorgangs, der während der Käseherstellung auftritt. Der hydrophile Anteil des κ-Caseins, der aus der Oberfläche der Micellen hervorsteht und normalerweise deren Stabilität erhält, wird abgespalten und ermöglicht dem Rest des Caseins zu aggregieren und Quark zu bilden. Das in die Molke abgespaltene Fragment des κ-Caseins – das Caseinomakropeptid (Caseinmacropeptide; CMP) – hat bestimmte Eigenschaften und, da es keine aromatischen Aminosäuren enthält, ist es als diätetisches Protein für an der genetischen metabolischen Störung Phenylketonurie (PKU) Erkrankte geeignet.
Insbesondere, ist die κ-Caseinfraktion ungewöhnlich, weil es in einer spezifischen Weise durch das Enzym Chymosin in zwei gut definierte Anteile κ-Casein und CMP gespalten wird. Über CMP wurde berichtet, dass es nützliche pharmakologische Eigenschaften hat. Insbesondere enthält es keine aromatischen Aminosäuren, und speziell enthält es kein Phenylalanin. Dieses ist besonders bedeutend, weil CMP eine mögliche Quelle essentiellen Proteins für Patienten ist, die unter PKU leiden. PKU ist ein metabolischer Zustand, in dem die Patienten nicht imstande sind, die aromatische Aminosäure Phenylalanin zu metabolisieren. Dieser Zustand ist derart, dass sich Phenylalanin, wenn es verbraucht wird, im Blutstrom und Gehirngewebe ansammelt und letztendlich schwere Geistesstörungen verursachen kann. Dieser Zustand ist ernst und alle Kinder in Großbritannien werden routinemäßig bald nach der Geburt untersucht, um dieses Leiden zu identifizieren, und Schritte einzuleiten, die Ernährung zu verändern, um Phenylalanin auszuschließen. Jedoch sind nur wenige natürliche Proteine bekannt, die von dieser Aminosäure vollständig frei sind. Infolgedessen werden die diätetischen Anforderungen derjenigen, die an PKU leiden, durch eine Mischung von Aminosäuren entsprochen, in denen Phenylalanin durch spezielle enzymatische Behandlung entfernt worden ist. Diese Mischungen sind als Nährstoffe verhältnismäßig wirkungsvoll, aber kostspielig herzustellen und unschmackhaft.
Jedoch bietet CMP, hergestellt aus der hier beschriebenen κ-Caseinfraktion, eine praktische alternative Quelle essentieller Aminosäuren ohne die begleitende Gefahr der Einnahme von Phenylalanin.
Verfahren zum Fraktionieren von Caseinen aus dem Stand der Technik
In der Milch, sind die vier einzelnen Caseine, κ-, β-, α_s1- und α_s2-Casein, nah mit Mikrokörnchen von Calciumphosphat in micellarer Form verbunden. Um die Caseine zu fraktionieren, ist es notwendig, die micellare Struktur durch irgendeine Kombination von Säurebildung, durch Lab, durch Abkühlen oder durch Hinzufügen eines Komplexbildners mindestens teilweise zu auseinanderzubrechen. Die Caseine sind in ihrer Natur hydrophob und, einmal von den Micellen getrennt, müssen sie an der Re-Aggregation durch Hinzufügen eines chaotropen Mittels oder durch Abkühlen gehindert werden. Die einzelnen Caseine können dann auf der Grundlage der Unterschiede bezüglich ihrer negativen Nettoladung, der Affinität für Ca oder der Hydrophobizität getrennt werden.
Das am häufigsten verwendete Verfahren im Labormaßstab für das Trennen der vier Hauptcaseine ist die Anionenaustauschchromatographie. Auflösung der einzelnen Caseine hängt hauptsächlich von den Unterschieden bezüglich der negativen Nettoladungen der Proteine bei basischem pH und von ihrer Affinität für ein positiv geladenes Säulenmittel ab. Alle Trennungen erfordern, dass Casein bei hohen Konzentrationen eines chaotropen Mittels, wie etwa Harnstoff getrennt wird (> 3,3 M), und in Anwesenheit eines Reduktionsmittels, wie etwa 2-Mercaptoethanol, behandelt wird, um die Disulfidbindungen in der Reihe des κ- Caseinpolymers zu verringern (JOURNAL OF DAIRY SCIENCE, Bd. 49, 1966, Seite 792–795. Thompson, M. P. „DEAE-cellulose-urea chromatography of casein in the presence of 2-mercaptoethanol"). Auflösung und Flusseigenschaften der Säulenmittel sind über die Jahre verbessert worden, aber das Verfahren kann nicht leicht in den Großmaßstab überführt werden. Auch bei gründlicher Dialyse der Fraktionen, sind einige toxische Materialien anwesend, und die Caseinfraktionen sind nicht für Gebrauch in den Nahrungsmitteln verwendbar.
Trennung der Hauptcaseine vom vollständigen Casein ist auch im Labormaßstab mit Kationenaustauschchromatographie erzielt worden, wobei die Trennung auf der positiven Nettoladung der Caseine bei saurem pH und ihrer Bindung an ein negativ geladenes Säulenmittel basiert (JOURNAL OF DAIRY RESEARCH Bd. 36, 1969, Seite 259–268. Annan, W. D. und Manson, W. „A fractionation of the α_s-casein complex of cows' milk"; JOURNAL OF DAIRY RESEARCH Bd. 59, 1992, Seite 557–561. Leaver, J. und Law, AJR. „Preparative-scale purification of bovine caseins on a cation-exchange resin"). Kationenaustauschchromatographie kann nicht leicht in den Großmaßstab überführt werden und erfordert das Vorhandensein hoher Konzentrationen eines dissoziierend wirkenden Stoffs, wie Harnstoff (> 3,3 M), und eine vorherige Reduzierung mit einem Material, wie etwa 2-Mercaptoethanol. Die Caseinfraktionen sind folglich nicht für den menschlichen Verzehr geeignet.
Ein anderes Laborverfahren, das gelegentlich zur teilweisen Fraktionierung der Caseine verwendet wird, schließt das Hinzufügen hoher Konzentration von Harnstoff als chaotropes Mittel zum vollständigen Casein ein, um eine Dissoziation der einzelnen Caseine hervorzurufen. Eine grobe Trennung der α_s-, β- und κ-Caseinbestandteile wird dann auf der Grundlage der unterschiedlichen Löslichkeit in Harnstoff erhalten (JOURNAL OF DAIRY CHEMISTRY Bd. 46, 1963, Seite 1183–1188. Zittle, CA und Custer, JH. „Purification and some properties of α_s-casein and κ-casein"). Wegen der sehr hohen Konzentration an Harnstoff (6,6 M), die zum Dissoziieren des Caseins erforderlich ist, ist es praktisch nicht möglich, diese Trennungen in großem Maßstab ökonomisch durchzuführen, und die Produkte sind nicht als Nahrungsmittelmaterialien verwendbar.
Eine grobe Fraktionierung der Hauptcaseine kann auch entsprechend ihrer Löslichkeit in Ethanol in Anwesenheit verschiedener Salze erreicht werden (JOURNAL OF DAIRY SCIENCE Bd. 35, 1952, Seite 272–281. Hipp, N. J., Waldungen, M. L., Custer, J.H. und McMeekin, T.L. "Separation of α-, β- and κ-casein"). Verfeinerungen dieses Verfahrens sind verwendet worden, um gereinigte Fraktionen von κ-Casein aus den α₅- und β-Caseinen enthaltenden Mischungen zu erreichen (BIOCHIMICA BIOPHYSICA ACTA Bd. 47, 1961, Seite 240–242. McKenzie, H. A. und Spur, R. G. „An improved method for the isolation of κ-casein"; BIOCHEMISTRY Bd. 9, 1970, Seite 2807–2813. Talbot, B und Waugh, D. F. „Micelleforming characteristics of monomeric and covalent polymeric κ-caseins"). Diese Verfahren erfordern hohe Konzentrationen Ethanol, und die meisten verwendeten Salze sind giftig.
β-Casein ist stärker hydrophob als die anderen Hauptcaseine und neigt dazu bei niedrigen Temperaturen, wenn hydrophobe Interaktionen schwächer sind, zu dissoziieren, sogar an seinem isoelektrischen Punkt. Casein kann daher aus einer Lösung von Natriumcaseinat durch isoelektrische Präzipitation der anderen Caseine bei pH 4,5 und 2 °C hergestellt werden und durch Präzipitation von β-Casein aus dem Überstand bei Erwärmen auf 20 °C (JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Bd. 67, 1944, Seite 1725–1731. Warner, RC. „Separation of α- and β-casein").
Abkühlende Milch, insbesondere bei saurem pH, verursacht Dissoziation von einigen der Caseine, besonders von β-Casein, aus den Micellen. Die mit β-Casein angereicherte flüssige Phase kann dann von der anderen β-Casein-entleerten Phase getrennt werden. Über diese kälteinduzierte Solubilisierung von β-Casein, ausgehend vom Labcasein (die feste Substanz, die aus dem ersten Schritt der Käseerzeugung erhalten wird), ist berichtet worden (Patent Nr. WO9406306, „A process for producing beta-casein enriched products ". Ram, S., Loh, DW., Liebe, DC. und Dudley, EP.; Patent Nr. US 5397577 „Method for obtaining beta casein" Le Magnen, C. und Maugas, J-J.).
Patent US 5397577 beschreibt ein Verfahren zum Extrahieren von β-Casein aus einer Labcaseinsuspension oder -lösung durch das Ansäuern auf pH 4 bis 5 und Abkühlen auf –2 bis 10 °C. Zwei Phasen bilden sich, von denen die flüssige Phase β-Casein enthält und die feste Phase eine Mischung der anderen α_s1- und κ-Caseine ist und im Wesentlichen frei von β-Casein ist.
Patent WO9406306 beschreibt ein Verfahren zur teilweisen Extraktion von β-Casein durch das Aufbewahren einer wässrigen Mischung des Casein-Ausgangmaterials in der Kälte bei einem pH zwischen 3,5 und 8,0 für eine geeignete Zeit und Trennen der wässrigen Mischung in zwei Phasen, um eine feste Phase zu erhalten, die β-Casein depletiert ist und eine flüssige Phase, die β-Casein angereichert ist.
Das Patent FR 2592769 („Process for producing a material enriched in beta-casein, apparatus for implementing this process, and application of the products obtained by this process as foodstuffs, food supplements or additives in the food and pharmaceutical industries." Terre, E., Maubois, J-L., Brule, G. und Alice, P.) beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von einer β-Casein angereicherten Fraktion und einer entsprechend depletierten Fraktion, entweder durch Behandeln der Milch mit einem Calcium komplexierenden Mittel oder Behandeln einer Caseinatlösung mit einem Mittel, das das gesamte Casein polymerisiert und Abkühlen auf 0 bis –7 °C und Mikrofiltrieren des Materials auf einer anorganischen Membran bei tangentialem Fluss. Das mikrofiltrierte Material wird β-Casein angereichert und das Retentat entleert sein. Mikrofiltration bei niedriger Temperatur ist sehr langsam und ist als industrielle Anwendung weniger attraktiv.
Eine teilweise Trennung der Caseine kann im Labormaßstab durch Hinzufügen von Calciumchlorid bei neutralem pH zu Milch oder Caseinat erreicht werden (JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Bd.78, 1956, Seite 4576–4582. Waugh, DF und von Hippel, PH. "κ-Casein and the stabilization of casein micelles"; BIOCHIMICA BIOPHYSICA ACTA Bd. 47, 1961, Seite 240–242. McKenzie, HA und Wake, RG. "An improved method for the isolation of κ-casein"). Beide Methoden geben ein Präzipitat von α_s- und β-Caseinen und einen Überstand, der eine Mischung von κ-, α_s- und β-Caseinen enthält. Diese Methoden leiden unter dem Nachteil, dass sie eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation, um das feine Präzipitat vom Überstand zu trennen, und Dialyse erfordern, um überschüssiges Calciumchlorid von der mit κ-Casein angereicherten Fraktion zu entfernen und kann folglich nicht in den Großmaßstab überführt werden. Die Verwendung von hohen Konzentrationen von Calciumchlorid erschwert die Rückgewinnung der mit κ-Casein angereicherten Fraktion, da das Casein nicht der normalen isoelektrischen Präzipitation zugänglich ist. Auch das Hinzufügen von Kaliumoxalat, das giftig ist, zum Entfernen des überschüssigen Calciums schließt den Gebrauch dieser Fraktion als Nahrungsmittelmaterial aus.
Daher sind die vorhergehenden Verfahren der Caseinfraktionierung, die selektive Calciumpräzipitation einbeziehen, bei neutralem pH durchgeführt worden (JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Bd.78, 1956, Seite 4576–4582. Waugh, DF und von Hippel, PH."κ-Casein and the stabilization of caseinmicelles"; BIOCHIM. BIOPHYS. ACTA Bd. 47, 1961, Seite 240–242. McKenzie, HA und Wake, RG. "An improved method for the isolation of κ-casein"). Diese Verfahren beschreiben die teilweise Trennung derjenigen Caseine, die durch Hinzufügen von Calciumchlorid zu Milch oder Caseinaten bei nahe 7,0 erhalten werden. Beide Verfahren erforderten höhere Konzentrationen von Calciumchlorid (0,25–0,36 M) als bei der jetzigen basischen Präzipitation (0,059–0,071 M) und Präzipitation des α_s- und β-Caseins trat nicht bereitwillig, sondern erforderte stattdessen durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation. Auch die hohe Konzentration von Calciumchlorid im Überstand verhinderte die folgende saure Präzipitation der κ-Caseinfraktion und Hinzufügen von Oxalat zum Komplexieren des Calciums und Dialyse war notwendig, bevor das Protein zurückgewonnen werden konnte. Folglich war es nicht möglich, diese Verfahren in den Großmaßstab zu überführen und die Produkte waren nicht für den menschlichen Verbrauch geeignet.
Wegen der Hydrophobizität der einzelnen Caseinbestandteile, ist es schwierig, die Caseine im großen Maßstab zu fraktionieren, obwohl jedes der Proteine spezifische Funktionseigenschaften hat, die für die Lebensmittel- und pharmazeutische Industrie interessant sein können (PROCEEDINGS OF THE 25^th INTERNATIONAL DAIRY CONGRESS, 1998, Seite 74–86. Maubois, J.-L. "Fractionation of milk proteins"). Folglich neigen Caseine zurzeit, eher als eine Mischung aus den vier Proteinen, statt als einzelne Bestandteile genutzt zu werden. Eine einfache, billige Methode des Fraktionierens dieser Mischung der Proteine würde vorteilhaft sein, da sie Nahrungsmittel- und Pharmazeutikaherstellern ermöglichen würde, die Bestandteile zu verwenden, die derzeit so kostspielig sind, wie auch deren Verwendung größer als im Labormaßstab ausgeschlossen ist. Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das im industriellen Maßstab für die Produktion von gereinigten einzelnen Caseinfraktionen in einer Form verwendet werden kann, die für die Verwendung in Nahrungsmittel- oder Novel-Food-Produkten oder in der Zubereitung von Nutraceuticals, von Phosphopeptiden und von anderen bioaktive Peptiden verwendbar ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Fraktionierung der Caseine durch Hinzufügen von Calciumchlorid zu Milch oder Caseinaten bei basischem pH. Die Vorteile des Durchführens der selektiven Präzipitation bei basischem pH sind, dass das Calcium-empfindliche α_s- und β-Caseinsediment einfacher verfügbar ist und ohne Hochgeschwindigkeitszentrifugation erhalten werden kann. Auch wird eine niedrigere Konzentration von Calciumsalz bei basischem pH benötigt und die κ-Casein angereicherte Fraktion kann durch saure Präzipitation ohne die Verwendung von giftigen Komplexbildnern oder Dialyse erreicht werden. Das vorliegende Verfahren, anders als dasjenige bei neutralem pH, kann in industriellen Maßstab durchgeführt werden, und die Produkte sind für den Gebrauch als Nahrungsmittel- und Novel-Food-Materialien und als Ausgangsstoffe für das Zubereiten von Nutraceuticals, von Phosphopeptiden und einer Vielzahl bioaktiver Peptide geeignet.
Zusätzlich erlaubt das in dieser Anmeldung beschriebene Verfahren eine wirkungsvoll praktische und billige Trennung von CMP von den Mischungen der Molkeprotein-, Casein- und Proteosepeptonen, die in der Milch und in der Molke gefunden werden. Herkömmliche Methoden der Produktion von CMP verwenden κ-Casein Zubereitungen, die erhebliche Verunreinigungen enthalten. Wenn beispielsweise eine κ-Caseinzubereitung aus Magermilch hergestellt ist, enthält die Zubereitung kaltes denaturiertes β-Lactoglobulin. Auf der anderen Seite, wenn eine κ-Caseinzubereitung unter Verwendung vollständigen Caseins (gewöhnlich als Natrium- oder Kaliumsalz) hergestellt wird, enthält die Zubereitung einen kleinen Anteil von α_s-, und β-Casein. Während der Hydrolyse des κ-Caseins zum Bilden von CMP durch Chymosin, können beschränkt Proteolyseverunreinigungen auftreten. Infolgedessen besteht die Gefahr, dass die abschließende Zubereitung durch Phenylalanin enthaltende Peptide verunreinigt werden kann, und die Zubereitung daher für die Einnahme durch die, die an PKU leiden, daher ungeeignet wird.
Die Ziele der vorliegenden Erfindung schließen folglich ein:

– Ein neues Verfahren zum Extrahieren gereinigter Caseinfraktionen und β-Lactoglobulins aus Milch, wobei nicht nur die Proteinfraktionen, sondern eine teilweise β-Lactoglobulin depletierte saure Molke erhalten wird. Das Verfahren kann im industriellen Maßstab verwendet werden, und die Proteinfraktionen und die saure Molke sind für Gebrauch in Nahrungsmitteln oder zum Zubereiten von Novel-Food-Materialien geeignet, wie etwa menschliche Säuglingsnahrungszubereitung, Käsearomen, Emulsionen, essbare Beschichtungen und Nutraceuticals. Die gereinigten Fraktionen können auch verwendet werden, um biodegradierbaren Kunststoff, Phosphopeptide und andere bioaktive Peptide herzustellen.
– Ein neues Verfahren zum Extrahieren gereinigter Caseinfraktionen aus Caseinat. Das Verfahren kann im industriellen Maßstab verwendet werden, und die Caseinfraktionen sind für Gebrauch in der Nahrung, in Novel-Food-Produkten, Neutraceuticals und in biomedizinischen Anwendungen verwendbar, wie oben erwähnt.
– Ein neues Verfahren zur Produktion von CMP, das für Patienten der Metabolismusstörung Phenylketonurie geeignet ist.

Innerhalb dieses Dokumentes sollten Bezüge auf Caseinmicellen, Caseine, Caseinate und andere Bestandteile von Milch als alle in Verbindung stehenden inter- und intra-spezifischen Varianten dieser Bestandteile gedeutet werden, es sei denn der Kontext erfordert es anders. β-Casein hat beispielsweise bei unterschiedlichen Säugetieren eine etwas andere Primärstruktur; es ist dem Fachmann klar, dass die Erfindung auf alle diese Varianten zutrifft. Die Bezeichnung α_s-Casein bezieht sich eine auf Mischung aus α_s1- und α_s2-Casein.
Entsprechend einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erhalten von gereinigten Proteinfraktionen aus Milch bereitgestellt, einschließlich der Schritte:

i) Erhöhen des pH der Milch;
ii) Hinzufügen von Calciumchlorid, um die Fraktionen selektiv zu präzipitieren;
iii) Verringern des pH; und
iv) Zentrifugieren oder Filtrieren, um die Fraktionen zu trennen.

Vorzugsweise sind die Fraktionen α_s-, β- und κ-Casein.
Gewöhnlich ist die Milch Magermilch.
Vorzugsweise wird die Zentrifugation bei langsamer Geschwindigkeit durchgeführt.
Das Verfahren kann den Schritt Durchführen der Präzipitation des Überstands, der aus der Zentrifugation oder Filtration von Schritt (iv) erhalten wurde, bei saurem pH aufweisen, um eine stark an κ-Casein angereicherte Fraktion zu erhalten.
Im Schritt, in dem die κ-Casein angereicherte Fraktion erhalten wird, indem man den Überstand auf sauren pH einstellt, ist der pH vorzugsweise 3,8. Gewöhnlich ist der Gehalt an κ-Casein über 60 %, der des β-Lactoglobulins über 20 %.
Das Verfahren kann die Schritte erneutes Lösen der α_s- und β-Caseinbestandteile in Wasser und erneutes Durchführen selektiver isoelektrischer Präzipitation des α_s-Caseins bei saurem pH und niedriger Temperatur enthalten, um eine Fraktion mit hauptsächlich α_s-Casein erhalten.
Beim Schritt, in dem das α_s- und β-Casein Präzipitat wieder im Wasser gelöst wird, ist das Wasser vorzugsweise bei pH 7,0 und 20 °C.
Die Lösung von a_s- und β-Casein kann nach dem Wiederauflösen in Wasser abgekühlt werden, vorzugsweise auf 2 °C, und auf sauren pH, vorzugsweise auf pH 4,5, eingestellt werden.
Das Verfahren des Wiederauflösens und der der erneuten Präzipitation kann wiederholt werden, vorzugsweise weitere zwei Male, wobei eine Fraktion erhalten wird, die hauptsächlich α_s-Casein (mehr als 85 %) und eine Fraktion, die hauptsächlich β-Casein enthält (mehr als 95 %).
Dennoch kann das Verfahren weiter auch die Schritte Erwärmen des Überstands, der aus der selektiven isoelektrischen Präzipitation erhalten ist, und Durchführen sauerer Präzipitation enthalten, um die Fraktion zurückzugewinnen, die hauptsächlich β-Casein enthält. Die überstehende saure Molke ist teilweise β-Lactoglobulin depletiert, enthält aber alle anderen Molkeproteine in nicht denaturierter Form und ist an Calcium angereichert.
Vorzugsweise wird der Überstand auf 35 °C erwärmt.
Vorzugsweise wird der pH der Milch durch Hinzufügen einer alkalischen Lösung erhöht und durch Hinzufügen einer sauren Lösung verringert.
Vorzugsweise wird beim Schritt, bei dem der pH der Milch erhöht wird, Natriumhydroxid hinzugefügt.
Vorzugsweise ist die Temperatur der Milch beim Hinzufügen der alkalischen Lösung 30 °C.
Nachdem die alkalische Lösung hinzugefügt ist, kann die Milch wahlweise für einige Minuten stehen gelassen werden. Vorzugsweise wird die Milch für weniger als 5 Min. stehen gelassen.
Vorzugsweise ist die endgültige Konzentration von Calciumchlorid in der alkalischen Caseinatlösung 0,059 M.
Der pH kann durch Hinzufügen einer oder mehrer Mineralsäuren verringert werden.
Das Verfahren kann den Schritt Erhöhen des pH der in hohem Grade an κ-Casein angereicherten Fraktion und Durchführen einer Ultrafiltration zum Trennen des Materials mit niedrigem Molekulargewicht von den Caseinen, von den Molkeproteinen und von den Caseinmakropeptiden, aufweisen.
Der pH wird gewöhnlich auf einen neutralen Wert angehoben.
Vorzugsweise wird die Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße weniger als 25 kD, aber größer als 12 kD durchgeführt.
Weiterhin kann das Verfahren den Schritt Senken des pH der in hohem Maß an κ-Casein angereicherten Fraktion und Durchführen einer Ultrafiltration zum Trennen des Molkeproteins vom Caseinmakropeptid aufweisen.
Der pH wird gewöhnlich auf zwischen pH 4 und pH 5 gesenkt.
Vorzugsweise wird der pH auf pH 4,6 gesenkt.
Vorzugsweise wird die Ultrafiltration mit einer Membran mit einer Porengröße von mehr als 7 kD, aber weniger als 20 kD durchgeführt.
Entsprechend einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Erreichen gereinigter Proteinfraktionen aus einer Lösung von Natriumcaseinaten zur Verfügung gestellt, einschließlich der Schritte:

ii) Erhöhen des pH der Natriumcaseinatlösung auf ungefähr pH 11;
iii) Hinzufügen von Calciumchlorid zum selektiven Präzipitieren der Fraktionen;
iv) Verringern des pH; und
v) Zentrifugieren oder Filtrieren, um die Fraktionen zu trennen.

Vorzugsweise wird die Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit durchgeführt.
Das Verfahren kann auch den Schritt Durchführen der Präzipitation des Überstands, der aus der Zentrifugation oder der Filtration aus Schritt (iv) erhalten wird, bei saurem pH enthalten, um eine in hohem Grad an κ-Casein angereicherte Fraktion zu erreichen.
Im Schritt, in dem die κ-Casein angereicherte Fraktion erhalten wird, indem man den Überstand auf sauren pH einstellt, ist der pH vorzugsweise pH 3,8. Der κ-Caseingehalt dieser Fraktion würde normalerweise größer als 30 % sein.
Wahlweise kann die Fraktion, die an κ-Casein angereichert ist, durch selektive Präzipitation mit Ethanol weiter an κ-Casein angereichert werden. Die κ-Caseinfraktion kann wieder in Wasser bei pH 7,0 aufgelöst werden, bei pH 4,6 wieder ausgefällt werden, und dann mit 50 % Ethanol bei pH 7,0 und 25 °C unter Hinzufügen einer kleinen Menge 2M NaCl in 50 % Ethanol selektiv ausgefällt werden. Das κ-Caseinpräzipitat bildet sich bereitwillig und kann durch Filtration oder langsame Zentrifugation entfernt werden. (BIOCHEMISTRY Bd. 9, 1970, Seite 2807–2813. Talbot, B. und Waugh, D. F. "Micelle-forming characteristics of monomeric and covalent polymeric κ-caseins"). Der κ-Caseingehalt dieser Fraktion würde gewöhnlich über 65 % sein.
Das Verfahren kann die Schritte Wieder auflösen der α_s- und β-Caseinbestandteile in Wasser und Durchführen der erneuten selektiven isoelektrischen Präzipitation des α_s-Caseins bei saurem pH und niedriger Temperatur, um eine Fraktion zu erhalten, die hauptsächlich α_s-Casein enthält.
Beim Schritt, bei dem α_s- und β-Caseinpräzipitat in Wasser wieder aufgelöst wird, ist das Wasser vorzugsweise bei pH 7,0 und 20 °C.
Die Lösung von α_s- und β-Casein kann gekühlt werden, vorzugsweise auf 2 °C, und auf sauren pH eingestellt werden, vorzugsweise auf pH 4.5.
Vorzugsweise enthält das Verfahren auch die Schritte Erwärmen des Überstands, der aus der selektiven isoelektrischen Präzipitation erhalten wird, und Durchführen saurer Präzipitation, um die Fraktion zurückzugewinnen, die hauptsächlich β-Casein enthält. β-Casein kann aus dem Überstand durch Erwärmen, vorzugsweise auf 35 °C, präzipitiert werden.
Das Verfahren des Wiederauflösens und der erneuten Präzipitation wird wiederholt, vorzugsweise weitere zwei Male, und liefert eine Fraktion, die hauptsächlich α_s-Casein enthält (mehr als 85 %), und eine Fraktion, die hauptsächlich β-Casein enthält (mehr als 95 %).
Vorzugsweise wird der pH der Natriumcaseinatlösung durch Hinzufügen einer alkalischen Lösung erhöht und durch Hinzufügen einer sauren Lösung verringert.
Beim Schritt, in dem der pH der Natriumcaseinatlösung erhöht wird, kann der pH durch Hinzufügen von Natriumhydroxid besonders bevorzugt bis 11 angehoben werden.
Vorzugsweise ist die Temperatur der Natriumcaseinatlösung beim Hinzufügen der alkalischen Lösung 30 °C.
Die im pH erhöhte Natriumcaseinatlösung kann für einige Minuten, vorzugsweise weniger als 5 min, stehen gelassen werden.
Vorzugsweise ist die endgültige Konzentration von Calciumchlorid in der alkalischen Natriumcaseinatlösung 0,071 M.
Der pH kann auf 7,0 durch Hinzufügen einer oder mehrer Mineralsäuren verringert werden.
Das Verfahren kann auch den Schritt Erhöhen des pH der Fraktion, die in hohem Grade an κ-Casein angereichert ist, und Durchführen einer Ultrafiltration enthalten, um das Material mit niedrigem Molekulargewicht von den Caseinen, von den Molkeproteinen und vom Caseinmakropeptid zu trennen.
Der pH wird gewöhnlich auf einen neutralen Wert angehoben.
Vorzugsweise wird die Ultrafiltration mit einer Membran mit einer Porengröße kleiner als 25 kD, aber größer als 12 kD durchgeführt.
Weiterhin kann das Verfahren auch den Schritt Senken des pH der Fraktion, die in hohem Maß an κ-Casein angereichert ist, und Durchführen einer Ultrafiltration enthalten, um das Molkeprotein vom Caseinmakropeptid zu trennen.
Der pH wird gewöhnlich auf zwischen pH 4 und pH 5 gesenkt. Vorzugsweise wird der pH auf pH 4,6 gesenkt.
Vorzugsweise wird die Ultrafiltration mit einer Membran mit einer Porengröße mit mehr als 7 kD, aber weniger als 20 kD durchgeführt.
Das Caseinmakropeptid kann konzentriert und getrocknet werden. Gewöhnlich wird dieses durch Gefriersprühtrocknung (freeze spray drying) durchgeführt.
Die Erfindung wird jetzt mit Bezug auf die folgenden Abbildungen beschrieben, in denen:
1 ein Diagramm ist, das die Schritte veranschaulicht, die beim Fraktionieren von Casein aus Magermilch in α_s-Casein, β-Casein und einer an κ-Casein und β-Lactoglobulin (β-Lg) angereicherten Fraktion beteiligt sind, die einige α_s- und β-Caseine enthalten. Das Verfahren liefert auch eine saure Molke, die teilweise β-Lactoglobulin depletiert ist, wie im Beispiel 1 genau geschildert;
2 ein Diagramm ist, das die Schritte veranschaulicht, die beim Fraktionieren von Natriumcaseinat in α_s-Casein, β-Casein und einer an κ-Casein angereicherten Fraktion beteiligt sind, die α_s- und β-Caseine enthalten, wie im Beispiel 2 genau geschildert;
3 Anionenaustausch-Fast-Protein-Liquid-Chromatography-Profile des ursprünglichen Caseins der Magermilch und der Fraktionen zeigt, die aus dieser erhalten wurden, wie im Beispiel 1 genau geschildert. Die Analyse wurde durchgeführt wie im JOURNAL OF DAIRY RESEARCH Bd. 54, 1987, Seite 369–376. Davies, D. T. und Law, A. J. R. "Quantitative fractionation of casein mixtures by fast protein liquid chromatography" skizziert;
4 die Geldurchdringungprofile der Molkeproteine in der ursprünglichen Magermilch (___) und im Überstand zeigt, der nach Hinzufügen von Calciumchlorid und nach saurer Präzipitation der κ-Casein angereicherten Fraktion (---) erhalten wurde. Die Abbildung zeigt die Depletierung von β-Lactoglobulin aufgrund alkalischer Denaturierung und folgender Präzipitation bei saurem pH. Die Analyse wurde wie in MILCHWISSENSCHAFT Bd. 48, 1993, Seite 663–666. Law, A. J. R., Leaver, J., Banks, J. M. und Horne, D. S. "Quantitative fractionation of whey proteins by gel permeation FPLC" skizziert durchgeführt. (Ig, Immunglobuline; SA/Lf, Serumalbumin und Lactoferrin, β-Lg, β-Lactoglobulin; </PTI>; α-La, α-Lactalbumin);
5 Anionenaustausch-Fast-Protein-Liquid-Chromatography-Profile des ursprünglichen Natriumcaseinats und der Fraktionen zeigt, die aus diesem erhalten werden, wie in Beispiel 2 genau geschildert. Die Analyse wurde wie für Tabelle 3 angezeigt; durchgeführt;
6 Anionenaustausch-Fast-Protein-Liquid-Chromatography-Profile des ursprünglichen Natriumcaseinats (---) und der Fraktion von κ-Caseins zeigt, die aus diesem erhalten wurde, wie es in Beispiel 2 genau beschrieben ist, nach weiterer Reinigung durch alkoholische Präzipitation. Die Analyse wurde, wie für Tabelle 3 angezeigt, durchgeführt;
7 Anionenaustausch-Fast-Protein-Liquid-Chromatography-Profile des ursprünglichen Natriumcaseinats (oben), und Natriumcaseinat nach Aufbewahren bei 30 °C und pH 11,0 für 5,0 min zeigt. Die Analyse wurde, wie für Tabelle 3 angezeigt, durchgeführt;
8 das Kapillareelektrophoresemuster für das ursprüngliche Natriumcaseinat (oben) und Natriumcaseinat nach Aufbewahren bei 30 °C und pH 11,0 für 5,0 min zeigt. Analyse im Wesentlichen entsprechend der Methode im JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY Bd. 652, 1993, Seite 207–213. de Jong, N., Visser, S. und Olieman, C. "Determination of milk proteins by capillary electrophoresis";
9 die Kationenaustausch-Fast-Protein-Liquid-Chromatography-Profile des ursprünglichen Natriumcaseinats (oben) und des Natriumcaseinats zeigt, nachdem sie bei 30 °C und pH 11,0 für 15,0 min gehalten worden sind. Analyse wurde entsprechend dem Verfahren im JOURNAL OF DAIRY SCIENCE Bd. 74, 1991, Seite 2403–2409. Hollar, C. M., Law, A. J. R., Dalgleish, D. G. und Brown, R. J. "Separation of major casein fractions using cation-exchange fast protein liquid chromatography" ausgeführt; und
10 ein Diagramm ist, das die Verwendung der gereinigten Fraktionen veranschaulicht, die durch selektive Calciumpräzipitation aus Magermilch oder aus Caseinat erhalten werden, wie in den Beispielen 1 und 2 skizziert (1 und 2).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur selektiven Präzipitation von Caseinfraktionen aus Magermilch oder Caseinaten durch Hinzufügen eines Calciumsalzes bei basischem pH. Die Erfindung betrifft insbesondere die Zubereitung der reinen Fraktionen von α_s-Casein und β-Casein, und eine Fraktion, die in hohem Maße an κ-Casein angereichert ist. Das Verfahren kann im industriellen Maßstab eingesetzt werden, und die Produkte sind für den Gebrauch in der Nahrung oder zum Zubereiten von Novel-Food-Materialien, biodegradierbaren Kunststoffs, Nutraceuticals und bioaktiver Peptide geeignet (10).
Die vorhergehenden Methoden der Caseinfraktionierung, die selektive Calciumpräzipitation mit einbeziehen, sind bei neutralem pH durchgeführt worden und erforderten Hochgeschwindigkeitszentrifugation, da Präzipitation von α_s- und β-Caseinen nicht bereitwillig erfolgte. Die höheren Konzentrationen an Calciumchlorid verhinderten nachfolgende saure Präzipitation der κ-Caseinfraktion und erforderten das Hinzufügen von Oxalat, um Calcium zu komplexieren, und Dialyse, bevor das Protein zurückgewonnen werden konnte. Es war folglich nicht möglich, die Verfahren in größeren Maßstab zu überführen und die Produkte waren nicht für die menschliche Einnahme geeignet.
Beim vorliegenden Verfahren wird die Caseinfraktionierung durch selektive Calciumpräzipitation bei basischem pH durchgeführt. Wenn der pH von Magermilch auf ungefähr 11,0 erhöht wird, steigt die Ladung der negativ geladenen Caseine, insbesondere der Phosphatgruppen, und die Caseine dissoziieren von den Micellen. Die α_s-Caseine sind höher geladen als die β-Caseine und die κ-Caseine sind am wenigsten geladen. Wenn ein Salz wie Calciumchlorid hinzugefügt wird, binden die α_s1- und β-Caseine mehr Ca²⁺ als κ-Casein und präzipitiert bereitwillig den an κ-Casein angereicherten Überstand zurücklassend. Bei basischem pH durchläuft ein Teil des β-Lactoglobulins in der Milch Denaturierung (JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Bd. 81, 1959, Seite 4032–4036. Tanford, C., Bunville, L. G., Nozaki, Y. "The reversible trans-formation of β-lactoglobulin at pH 7.5"). Das denaturierte β-Lactoglobulin verbleibt im mit κ-Casein angereicherten Überstand. Wenn der pH im Folgenden auf ungefähr 3,8 verringert wird, bildet sich bereitwillig ein κ-Casein angereicherter Niederschlag, zusammen mit dem denaturierten β-Lactoglobulin und einigen α_s- und β-Caseinen (3). Der saure Überstand ist teilweise β-Lactoglobulin depletiert (4), aber enthält alle anderen Molkeproteine und zusätzlich Calciumchlorid, und ist für den Nahrungsmittelgebrauch geeignet.
Das Durchführen der selektiven Calciumpräzipitation bei basischem pH anstelle von neutralem pH hat mehrere Vorteile. Bei basischem pH werden die Caseinmicellen auseinander gebrochen und die Caseine dissoziieren, ohne giftige chaotrope oder komplexierende Mittel. Die Caseine haben auch höhere negative Nettoladungen und, wenn Calciumchlorid hinzugefügt wird, binden sie mehr Ca²⁺. Die Caseine können daher bei niedrigeren Konzentrationen des Calciumchlorids präzipitiert werden, als bei neutralem pH erforderlich sind. Bei basischem pH, setzen sich die Präzipitate von α_s- und β-Casein einfacher ab, wenn Calciumchlorid hinzugefügt wird, und können durch Filtration oder langsame Zentrifugation leicht getrennt werden. Die an κ-Casein angereicherte Fraktion im Überstand wird ähnlich leicht bei saurem pH präzipitiert, wenn die Calciumchloridkonzentration niedrig ist, und wird leicht durch Filtration oder langsame Zentrifugation getrennt. Beide Fraktionen können dann weiter gereinigt werden, wenn notwendig in industriellem Maßstab.
Beispielsweise kann eine weitere Verarbeitung durchgeführt werden, um Caseinmakropeptid (CMP) von der κ-Caseinfraktion zu trennen. CMP hat eine Molekulargröße von ungefähr 6.500 Dalton in der monomeren Form, gleichwohl CMP nur eine monomere Form bei sauren pH-Werten annimmt, z.B. pH 4. Bei einem neutralen pH nimmt CMP eine tetramere Gestalt an und hat eine effektive Molekulargröße von 25.000 Dalton. Folglich kann durch Änderung des pH, CMP veranlasst werden, sich als Molekül mit einer zu den Molkeproteinen vergleichbaren Größe zu verhalten, wie β-Lactoglobulin oder sich alternativ wie ein kleines Peptid zu verhalten. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um CMP aus den Mischungen entweder mit nativen Molkeproteinen (wie etwa aus Magermilch hergestellter κ-Casein Aufbereitungen) oder von anderen Peptiden (wie etwa einer in Milch vorhandener Proteospeptonfraktion oder von Peptiden, die durch unspezifischen Abbau aus anderen Caseinfraktionen abgeleitet wurden) effektiv zu trennen. Die Eigenschaften der verschiedenen Fraktionen werden unten gezeigt:
Die Unterschiede bezüglich der oben beschriebenen Eigenschaften können ausgenutzt werden, um CMP in einem sehr reinen Zustand und frei von Verunreinigungen, einschließlich Phenylalanin, herzustellen. So kann die mit dem oben beschriebenen Verfahren hergestellte κ-Caseinfraktion verarbeitet werden, um sehr reines CMP zu liefern. Gewöhnlich wird der pH der κ-Caseinfraktion auf einen neutralen pH erhöht, um das CMP in seine tetramere Form zu überführen. Danach Behandlung durch Ultrafiltration mit einer Membran mit der geeigneten Porengröße – üblicherweise trennt weniger als 25 kD, aber größer als 12 kD alle Materialien mit niedrigem Molekulargewicht von den Caseinen, von den Molkeproteinen und vom CMP.
Ansäuerung auf pH 4.6 resultiert in der Umwandlung des CMP zurück zur monomeren Form und in der Präzipitation der anderen Caseinfraktionen. In diesem Fall ergibt die Behandlung durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Membran mit der passenden Porengröße – gewöhnlich mehr als 7 kD, aber weniger als 20 kD – die Trennung des Molkeproteins vom CMP. CMP kann geeignet konzentriert werden und getrocknet werden, üblicherweise durch Gefrier- oder Sprühtrocknen. Es versteht sich, dass das oben beschriebene Verfahren nur aus einer von vielen geeigneten Kombinationen besteht – von denen einige die Reihenfolge der pH-Einstellungen umdrehen können – und ist nur als Beispiel wiedergegeben.
Die Anwendung der Prinzipien zur Reinigung von CMP ist nicht auf das Material beschränkt, das von der Magermilch abgeleitet wird, beispielsweise könnte das Verfahren auf die Trennung und an die Reinigung von CMP aus Käse- oder Labmolke in gleicher Weise angewendet werden. In derartigen Fällen ist eine einleitende Behandlung durch zentrifugale Trennung und/oder durch die Mikrofiltration (gewöhnlich mit einer Membran mit einem cut-off bei 1,8 μ) angebracht, um Kontaminanten, wie Quarkpartikel, Restfett und Bakterien, zu entfernen. Nach dieser Vorbehandlung können die oben beschriebenen Prinzipien eingesetzt werden, um CMP Zubereitungen frei von pHA und für die Nahrung von Patienten, die an PKU leiden, geeignet ist, herzustellen.
Bei niedrigen Temperaturen bleibt β-Casein an seinem isoelektrischen Punkt in Lösung und kann daher von den begleitenden α_s-Caseinen durch deren Präzipitation bei 2 °C und pH 4,6 folglich getrennt werden (JOURNAL OF AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Bd. 67, 1944, Seite 1725–1731. Warner, R. C. "Separation of α- and β-casein"). β-Casein wird dann durch Präzipitation aus dem Überstand bei 35 °C zurückgewonnen. Dieses Verfahren wird wiederholt bis das gesamte β-Casein aus den α_s-Caseinen extrahiert ist, wobei sich reine Fraktionen von α_s- und β-Casein ergeben (3).
Das Verfahren zum selektiven Präzipitieren gereinigter Caseinfraktionen einer Caseinatlösung folgt im Wesentlichen den gleichen Prinzipien, die für Magermilch beschrieben wurden, außer dass der Überstand nach Hinzufügen von Calciumchlorid nur κ-, β- und α_s-Caseine enthält (Tabelle 5). Wie vorher erwähnt, können die Caseine aufgrund von ihren Löslichkeit in Ethanol teilweise gereinigt werden (BIOCHEMISTRY Bd. 9, 1970, Seite 2807–2813. Talbot, B. und Waugh, D. F. "Micelleforming characteristics of monomeric and covalent polymeric κ-caseins"). Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die κ-Caseinfraktion zu reinigen. Die erste κ-Caseinfraktion wird wieder ausgefällt, um restliches Calcium zu entfernen und um aus der Ethanollösung selektiv zu präzipitieren, wobei α_s1- und β-Caseine im Überstand verbleiben. Der Niederschlag bildet sich bereitwillig und kann durch langsame Zentrifugation entfernt, wobei eine an κ-Casein angereicherte Fraktion erhalten wird (6).
Wie für Magermilch, hat die Fraktionierung von Natriumcaseinat bei hohem pH-Wert gegenüber vorhergehenden Verfahren, die Calciumpräzipitation bei neutralem pH oder Trennung in Anwesenheit chaotroper Mittel mit einzubeziehen, den Vorteil, das sie alle drei Caseinatfraktionen frei von giftigen Materialien liefert, die daher für die Verwendung als Nahrungsmittelbestandteile geeignet sind. Die niedrigeren Calciumkonzentrationen, die bei basischem pH erforderlich sind, ermöglichen die anschließende Wiedergewinnung der κ-Casein angereicherten Fraktion, ohne die Notwendigkeit für das Hinzufügen eines giftigen Komplexbildners oder Dialyse, die nicht leicht in großem Maßstab durchgeführt werden kann. Ähnlich ermöglicht die verbesserte Trennung von α_s- und β-Caseinpräzipitat vom κ-Caseinüberstand die Übertragung auf Großmaßstabverfahren zum Produzieren von Lebensmittelmaterialien, ohne das Erfordernis einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation.
Verlängerte Behandlung bei basischem pH, besonders bei hoher Temperatur, kann zu Dephosphorylierung des Caseins führen (JOURNAL OF DAIRY RESEARCH, Bd. 39, 1972, Seite 189–194. Manson, W. und Carolan, T. "The alkali-induced elimination of phosphate from β-casein"). Das Dehydroalanin, das im Casein als Ergebnis der Dephosphorylierung gebildet ist, und vielleicht auch wegen des Abbaus von SH-Gruppen des Cysteins, reagiert mit ε-Aminogruppen der Lysinreste und bildet Lysinoalanylreste. Diese Reaktion führt zu einer Verringerung der Menge des Lysins, das für die Nahrung vorhanden ist, und zu erhöhter Vernetzung und zur Verringerung der Bekömmlichkeit der Caseine. Ähnliche Reaktionen treten auf, wenn Milch erwärmt wird, und es gibt einige Hinweise aus Tierstudien, dass Lysinolanin schädlich sein kann, wenn es in großen Mengen gefüttert wird (JOURNAL OF NUTRITION, Bd. 98, 1969, Seite 45–56. De Groot, A. P. und Slump, P. "Effects of severe alkali treatment of proteins on amino acid composition and nutritive value"). Es wird angenommen, dass das Gesundheitsrisiko von Menschen durch Essen von hitze- oder von alkalibehandelten Milchproteinen klein ist (JOURNAL OF DAIRY RESEARCH, Bd. 49, Seite 725–736. de Koning, P. J. und van Rooijen, P. J. "Aspects of the formation of lysinoalanine in milk and milk products").
In der vorliegenden Arbeit jedoch führten wir eine sorgfältige Studie der Effekte der alkalischen Behandlung auf Milchproteine durch und wendeten Verfahren, wie Anionen- und Kationen-Fast-Protein-Liquid-Chromatography und Kapillarelektrophorese, an. Diese Verfahren sind vorher erfolgreich verwendet worden, um die analogen Änderungen in den Proteinen zu ermitteln, die durch das Erwärmen verursacht werden (MILCHWISSENSCHAFT, Bd. 49, 1994, Seite 125–129. Law, A. J. R., Horne, D. S., Banks, J. M. und Leaver, J. "Heat-induced changes in the whey proteins and Caseins"; JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY Bd. 652, 1993, Seite 207–213. de Jong, N., Visser, S. und Olieman, C. "Determination of milk proteins by capillary electrophoresis"). Alle Veränderungen, die bei starker alkalischer Behandlung auftraten, wie Dephosphorylierung, Entfernung von -SH- und Kohlenhydratgruppen (Sialinsäure), führten alle zu einer Verringerung der negativen Ladung der Proteine, und diese Veränderungen, die auch beim Erwärmen eintreten, können durch Anionen-Fast-Protein-Liquid-Chromatography (FPLC) schnell ermittelt werden. Ähnlich führt die Desaminierung der ε-Amino Lys und Arg Resten, die bei längerer Behandlung mit basischem pH auftritt, zum Verlust positiven Ladungen in den Proteinen und diese Veränderungen können mit Kationen-Fast-Protein-Liquid-Chromatography FPLC und Kapillarelektrophorese bei saurem pH festgestellt werden.
Diese Verfahren wurden verwendet, um Caseine zu untersuchen, die den basischen Bedingungen unterworfen worden waren, die für selektive Präzipitation der Caseinfraktionen aus Magermilch oder Natriumcaseinat erforderlich sind. Die Ergebnisse der Anionenaustausch FPLC (7) zeigen, dass es innerhalb der kurzen Zeiten, die erforderlich sind, um Dissoziation der Caseinmicellen in der Milch (5 min) zu erreichen, keine messbaren Veränderungen in den Profilen oder im Bereich der Spitzen der einzelnen Caseine gab. Während die Trennung auf negativer Nettoladung basiert, scheint es, dass es keine beträchtlichen Veränderungen in den Ladungen der einzelnen Caseine gab und dass insbesondere Dephosphorylierung nicht stattfand. Resultate der Kapillarelektrophorese (8) und der Kationenaustausch FPLC (9) zeigen ähnlich, dass bei folgender alkalischer Behandlung für 5 min keine messbaren Veränderungen in den Profilen oder im Bereich der Spitzen der Caseine waren. Beide Verfahren wurden bei saurem pH durchgeführt und zeigen, da Trennungen auf positiver Nettoladung basieren, dass kurze alkalische Behandlung keinen Effekt auf positiv geladene Gruppen hatte, wie etwa Lys und Arg in den Caseinen. Das gemeinsame Ergebnis zeigt, dass die kurze Behandlung unter den basischen Bedingungen, die für die selektive Präzipitation der Caseine aus Magermilch- oder Natriumcaseinat erforderlich ist, keine chemische Schädigung der Proteine verursachte.
Während der alkalischen Behandlung von Magermilch, durchläuft β-Lactoglobulin eine Konformationsänderung, und wird darauf bei seinem isoelektrischen Punkt unlöslich (JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY Bd. 81, 1959, Seite 4032–4036. Tanford, C., Bunville, L. G. und Nozaki, Y. "The reversible trans-formation of β-lactoglobulin at pH 7.5"). Unter den basischen Bedingungen, die für die selektive Calciumpräzipitation der Caseine erforderlich sind, wird ein Teil des β-Lactoglobulins denaturiert, aber die anderen Molkeproteine, wie gezeigt durch Gelpermeations FPLC (4), wurden nicht denaturiert und behielten ihre Löslichkeit an ihren isoelektrischen Punkten. Vorhergehende Resultate aus reverse phase HPLC, Kapillarelektrophorese und Trypsin-Verdauung der Proteine aus Magermilch, die kurz bei basischem pH gehalten wurden, zeigten, dass es keine bedeutenden Veränderungen in den chemischen Eigenschaften der Proteine gab (PATENTANMELDUNG, 2001, Leaver, J. und Law, A. J. R. "Milk and cheese extraction process, including methods of extracting β-lactoglobulin and caseins from milk and milk products, and novel products thereby produced").
Beispiel 1
Magermilch wurde auf 30 °C erwärmt und der pH wurde unter Rühren schnell auf 11,0 durch Hinzufügen von 5M Natriumhydroxid eingestellt. Bei fortdauerndem Rühren wurde eine 0,5 M Lösung Calciumchlorid hinzugefügt, wobei das Gesamtvolumen des hinzugefügten Calciumchlorid 133 ml pro Liter Magermilchlösung und die endgültige Konzentration 0,059 M war. Salzsäure (5M) wurde dann unter Rühren hinzugefügt, um den pH der Magermilch auf 7,0 zu verringern. Ein Präzipitat (A) wurde gebildet, das entweder durch Zentrifugation gesammelt wurde oder durch Absetzen und durch Filtration entfernt wurde. Dieser Niederschlag war reich an α_s- und β-Caseinen und enthielt wenig κ-Casein. Der pH des Überstands wurde auf 3,8 durch Hinzufügen und Rühren von 1 M HCl verringert. Ein zweites Präzipitat (B) bildete sich, das genauso wie Niederschlag A. gesammelt wurde. Das Präzipitat B enthielt κ-Casein (60 %) und β-Lactoglobulin (20 %) und geringe Mengen von α_s- und β-Caseinen (3). Der Überstand der sauren Molke war teilweise β-Lactoglobulin depletiert (4).
Präzipitat A wurde erneut in Wasser bei ungefähr der gleichen Konzentration wie im Ausgangscaseinat unter kräftigem Rühren bei 20 °C rückgelöst, wobei der pH durch Hinzufügen von 1M HCl kontinuierlich auf 7,0 eingestellt wurde. Nach vollständiger Auflösung wurde die Lösung auf 2 °C gekühlt und der pH wurde unter Rühren durch Hinzufügen von 1 M HCl auf 4,5 eingestellt. Ein Präzipitat (C) bildete sich und, nach Rühren für 15 Minuten bei 2 °C, wurde dieses vom Überstand (D) entweder durch Filtration oder Zentrifugation geerntet. Dieses Präzipitat war in hohem Maß mit α_s-Casein angereichert, enthielt aber etwas β-Casein. Die Menge an β-Casein in dieser Fraktion wurde durch Wiederauflösen des Präzipitats in Wasser und Wiederholen der Präzipitation bei 2 °C für zwei weitere Male verringert. Eine Analyse zeigte, dass mehr als 85 % des Proteins α_s-Casein war (3).
Der Überstand D, wurde auf 35 °C erwärmt und der pH wurde auf 4,6 unter Rühren durch Hinzufügen eines kleinen Volumens von 1 M HCl eingestellt. Ein Präzipitat (E) bildete sich, der durch Zentrifugation oder Filtration genauso wie Niederschlag A. geerntet wurde. Eine Analyse zeigte, dass mehr als 95 % des Proteins β-Casein war (3).
Beispiel 2
Natriumcaseinat wurde in Wasser bei einer Konzentration von 27 g/l unter Rühren bei ungefähr 37 °C für 10 Minuten aufgelöst (4). Die Lösung wurde auf 30 °C abgekühlt und der pH unter Rühren schnell auf 11,0 durch Hinzufügen von 5M Natriumhydroxid eingestellt. Beim fortdauernden Rühren, wurde eine 0,5 M Lösung Calciumchlorid hinzugefügt, wobei das Gesamtvolumen des hinzugefügten Calciumchlorids 166 ml pro Liter Caseinatlösung und die endgültige Konzentration 0,071 M war. Salzsäure (5M) wurde dann unter Rühren hinzugefügt, um den pH der Caseinatlösung auf 7,0 zu verringern. Ein Präzipitat (A) wurde gebildet, das entweder durch Zentrifugation gesammelt oder Absetzenlassen und durch Filtration entfernt wurde. Dieses Präzipitat war an α_s- und β-Caseinen angereichert und enthielt wenig oder kein κ-Casein. Der pH des Überstands wurde unter Rühren durch Hinzufügen von 1 M HCl auf 3,8 verringert. Ein zweites Präzipitat (B) bildete sich, das genauso wie Präzipitat A gesammelt wurde. Präzipitat B war in hohem Maß an κ-Casein angereichert und enthielt ungefähr gleiche Mengen an α_s-, β- und κ-Casein (4). Präzipitat B konnte weiter durch Auflösen in Wasser bei pH 7,0 und erneutes Präzipitieren bei pH 4,6 gereinigt werden, um den Calciumsalzgehalt zu verringern. Das Präzipitat wurde bei pH 7,0 wieder gelöst und κ-Casein aus einer 50 % Ethanollösung durch Hinzufügen von etwas 2 M Natriumchlorid in Ethanol selektiv präzipitiert, wobei die meisten der α_s1- und β-Caseine im Überstand verblieben. Das Präzipitat wurde bereitwillig gebildet und konnte durch langsame Zentrifugation oder Filtration getrennt werden. Die Fraktion hatte ungefähr 65 % κ-Casein (6) und war, da giftige Materialien nicht beteiligt waren, als Nahrungsmittelbestandteil verwendbar.
Präzipitat A wurde erneut in Wasser bei ungefähr derselben Konzentration wie im Ausgangscaseinat durch kräftiges Rühren bei 20 °C mit einem pH, der ununterbrochen durch Hinzufügen von 1 M HCl auf 7,0 eingestellt wurde, gelöst. Nach vollständiger Lösung wurde die Lösung auf 2 °C gekühlt und der pH wurde unter Rühren durch Hinzufügen von 1 M HCl auf 4,5 eingestellt. Ein Präzipitat (C) wurde gebildet und, nach Rühren für 15 Minuten bei 2 °C, wurde dieses vom Überstand (D) entweder durch Filtration oder Zentrifugation geerntet. Dieses Präzipitat war in hohem Maß mit α₅-Casein angereichert, enthielt aber etwas β-Casein. Die Menge von β-casein wurde in dieser Fraktion durch das Wieder auflösen des Präzipitats im Wasser und Wiederholen der Präzipitation bei 2 °C für weitere zwei Male verringert. Eine Analyse zeigte, dass mehr als 85 % des Proteins α_s-Casein war (5).
Der Überstand D wurde auf 35 °C erwärmt und der pH wurde unter Rühren durch Hinzufügen eines kleinen Volumens 1M HCl eingestellt. Ein Präzipitat (E) bildete sich, das durch Zentrifugation oder Filtration genauso wie Präzipitat A. geerntet wurde. Eine Analyse zeigte, dass mehr als 95 % des Proteins β-casein war (5).
Anwendungen für die gereinigten Caseinfraktionen
Die gereinigten Caseinfraktionen können in großem Maßstab hergestellt werden, frei von giftigen Materialien frei ist und können Nahrungsmitteln hinzugefügt werden oder zur Herstellung neuer Nahrungsmittelprodukte verwendet werden. Die einzelnen Caseine haben unterschiedliche Strukturen und Eigenschaften und können folglich ausgewählt werden, um optimale Funktionseigenschaften zu einem bestimmten Zweck zu geben. β-Casein ist beispielsweise hydrophober und in Ethanol besser löslich als die andere Caseine, wohingegen κ-Casein hydrophil und leicht aus Ethanollösungen präzipitierbar ist. Ähnlich binden die α_s-Caseine, die reich an Phosphatgruppen sind, bereitwillig zweiwertige Ionen und sind für Calciumkonzentrationen viel empfindlicher als κ-Casein, das nur eine einzige Phosphatgruppe hat. κ-Casein hat auch spezielle Eigenschaften wegen des Auftretens einer Reihe Disulfid-verbundener Polymere, des Vorhandenseins hydrophiler Kohlenhydratseitenketten und seiner Fähigkeit, die anderen Caseine in wässerigen Lösungen zu stabilisieren. Die Caseinfraktionen zeigen auch unterschiedliche Anfälligkeiten gegenüber unterschiedlichen Enzymen, und sind geeignete Ausgangsmaterialien für das Herstellen einer Vielfalt von Peptiden, wie unten beschrieben.
Während der Käsereifung durchlaufen die Caseine Proteolyse und die resultierenden Peptide und Aminosäuren bilden einen wichtigen Beitrag zum Aroma der gereiften Käse. In den frühen Stadien des Reifens, verursachen Chymosin und Plasmin Proteolyse von großen und mittelgroßen Peptiden, während in späteren Stadien andere proteolytische Enzyme kurze Peptide und schließlich Aminosäuren produzieren. Jedoch ist die Reifung ein langsamer Prozess, und es gibt ein beträchtliches Potential für sich entwickelnde Käsearomen durch schnelle Proteolyse isolierter Caseine. Während dieses Vorgangs können hydrophobe Peptide, besonders aus β-Casein produziert werden, die ein bitteres Aroma haben. Die gereinigten Caseinfraktionen, die hier beschrieben werden, können als Ausgangsmaterialien benutzt werden, die eine größere Kontrolle über die Art der gebildeten Peptide und die entwickelten Aromen erlaubt.
Kontrollierte Hydrolyse der Caseine durch saure oder basische Bedingungen oder durch begrenzte enzymatische Proteolyse liefert Peptide, die schäumende Fähigkeit erhöht haben, wobei die kleinen Moleküle schneller als die Stammcaseine zu den Schnittstellen diffundieren. Peptide aus Caseinen haben die Vorteile hitzebeständig zu sein, haben niedriges allergisches Potenzial und erleichtern Calciumbindung. Spezifische Hydrolysate werden auch verwendet, um die Gärungrate zu optimieren und die Zellzahl von bestimmten bioaktiven Bakterienstämmen in der Joghurtverarbeitung zu erhöhen. Die Verwendbarkeit von gereinigten Fraktionen, die durch das vorliegende Verfahren erreicht werden, erleichtert die Herstellung einer breiten Vielzahl von Peptiden, die die erforderlichen Eigenschaften haben.
Obgleich die meiste Muttermilchersatznahrung auf Kuhmilch basiert, ist die Konzentration von Gesamtprotein in der menschlichen Milch niedriger, und die relativen Anteile der einzelnen Proteine unterscheiden sich beträchtlich von denen in Kuhmilch. Insbesondere enthält menschliche Milch kein β-Lactoglobulin, und der relative Anteil an α_s-Caseinen ist sehr niedrig. Demgegenüber sind die relativen Anteile von α-Lactalbumin, Lactoferrin und von κ- und β-Caseinen in der menschlichen Milch hoch. Auch β-Casein, das ungefähr 60 % vom Gesamtcasein in der menschlichen Milch ausmacht, tritt als eine Reihe unterschiedlich phosphorylierter Polypeptide auf, deren Gesamtgrad der Phosphorylierung niedriger als in Kuhmilch ist. Es wird angenommen, dass Unterschiede bezüglich der Zusammensetzung einige der Probleme erklären können, die mit Füttern von Kuhmilch an Kinder verbunden sind. Beispielsweise ist die Allergenizität von Kuhmilch zum Teil mit dem Vorhandensein von β-Lactoglobulin in Verbindung gebracht worden. Ähnlich können Schwierigkeiten in der Verdauung aufgrund der härteren Beschaffenheit des Quarks liegen, der im Magen bei saurem pH gebildet wird, wenn Milch weniger gering phosphoryliertes β-Casein und mehr der stark phosphorylierten α_s-Caseine hat. In den letzten Jahren hat es eine stufenweise Änderung in der Herstellung von Säuglingsnahrung in der Richtung gegeben, ein Produkt zu erhalten, das der menschlichen Milch genauer ähnelt. Die Massenproduktion einzelner Caseinfraktionen und Molke, die teilweise β-Lactoglobulin depletiert ist, wie hier beschrieben, könnte helfen, dieses zu erreichen. Gereinigtes β-Casein kann teilweise durch Einwirken von Phosphatase dephosphoryliert sein und mit κ-Casein und der Molke rekombiniert sein, um Milch in ihrer Proteinzusammensetzung stärker menschlicher Milch zu ähneln.
Gemeinsam mit vielen langkettigen natürlichen oder synthetischen Molekülen, können die Caseine, um Polymere zu bilden, üblicherweise durch Wärmezufuhr und hohem Druck quervernetzt werden, gefolgt von der Behandlung mit Formalin (In CASEIN AND ITS INDUSTRIAL APPLICATIONS, 1939, Seite 181–232, Reinhold Publishing Corporation, New York, Brother, G. H. "Casein Plastics"). Dieses Verfahren wurde weithin verwendet, um eine Vielzahl von Kunststoffen mit zufrieden stellender Beschaffenheit und Farbe herzustellen, wurde jedoch wegen der Kosten der Rohstoffe und der Gefahren des Formalins durch Verfahren ersetzt, die synthetische Polymere verwenden. Jedoch gibt es einen Markt für essbare Nahrungsmittelbeschichtungen und biodegradierbaren Kunststoff und, indem man mildere Vernetzungverfahren verwendet, die Hinzufügen von Calcium bei basischem pH einbeziehen, ist es möglich, die hier beschriebenen einzelnen Caseinfraktionen zu benutzen, um eine Vielzahl weicher Kunststoffe zu produzieren, die geeignete Eigenschaften haben.
In den letzten Jahren wurde erreicht, dass der proteolytische Abbau von Casein in Milch oder während der Verdauung bioaktive Peptide erzeugt, die spezielle physiologische Funktionen haben. Bioaktive Peptide schließen Phosphopeptide, Peptide mit antibiotischer, blutdrucksenkender, immunomodulatorischer, antithrombotischer und opioidaler Funktion ein (JOURNAL OF DAIRY SCIENCE, Bd. 83,2000, Seite 1187–1195. Clare, D. A. und Swaisgood, H. E. "Bioactive milk peptides: A prospectus").
Man nimmt an, dass Caseinphosphopeptide nach Trypsinfreigabe von den einzelnen Caseinen und, wegen der charakteristischen Gruppierung der Phosphoserinreste und der hohen negativen Ladung der Phosphatzentren, als Träger unterschiedlicher Mineralien zu fungieren, insbesondere Calcium (PROCEEDINGS OF 25^th INTERNATIONAL DAIRY CONGRESS, 1998, Seite 200–208. Holt, C. "Casein structure and casein-calcium phosphate interactions.") Die Caseinphosphopeptide sind gegen enzymatische Proteolyse im Darm weitgehend beständig und werden normalerweise mit Calciumphosphat komplexiert aufgefunden. Diese Komplexbildung resultiert in einer gesteigerten Löslichkeit und einer erhöhte Absorption des für die Knochenkalkbildung benötigten Calciums. Caseinphosphopeptide hemmen auch Kariesschäden, indem sie helfen, Zahnschmelz zu recalcifieren, und deren Anwendung in der Behandlung zahnmedizinischer Krankheiten wird gefördert. Die einzelnen Caseine erzeugen unterschiedliche Phosphopeptide, von denen einige bereits Anwendungen als diätetische Ergänzungsstoffe und Medikamente wegen ihrer Fähigkeit Fe, Zn und Cu zu binden gefunden haben, und die Verwendbarkeit der gereinigten Caseinfraktionen, die hier beschrieben werden, erleichtert ihre Zubereitung.
Einige Caseinpeptide mit antibiotischen Eigenschaften wurden in der Milch identifiziert, einschließlich Casosidin I aus α_s2-Casein und Isracidin aus α_s1-Casein B. Isracidin verhindert effektiv Mastitis bei Schafen und bei Ziegen, und es gibt beträchtliches Potential für weitere Entwicklungen spezifischer Antibiotika dieser Art.
Verschiedene Peptide aus den Caseinen hemmen Angiotensin-konvertierendes Enzym und wirken folglich den Blutdruck verringernd. Von diesen bioaktiven Peptiden ist eines ein Fragment von α_s1-casein (α_s1-Casokinin-5) und zwei werden vom β-Casein (β-Casokinin-7 und antihypertonisches Peptid) erhalten.
Es hat sich auch hergestellt, dass Caseinfragmente das Immunsystem und die damit in Verbindung stehenden Zellproliferationsantworten beeinflussen. Von diesen bioaktiven Peptiden, wurde für ein Tripeptid von κ-Casein und ein Peptid von β-Casein gezeigt, dass diese die Zellproliferatoin von peripheren Blutlymphozyten erhöhen.
Einige Peptide der Caseine haben antithrombotische Eigenschaften und wirken durch das Blockieren der spezifischen Rezeptoren der Blutplättchen während der Blutgerinnung. Diese Peptide schließen das Glykomakropeptid und zwei kleinere Fragmente des κ-Caseins ein, gegeben als Casoplatelin und Thrombinhemmendes Peptid.
Verschiedene Studien haben gezeigt, dass einige Fragmente der Caseine, die opioidalen Peptide, Morphiumähnliche Eigenschaften haben. Der Hauptbestandteil der opioidalen Peptide sind Fragmente von β-casein, aber sie können auch durch Pepsinhydrolyse aus α_s1-Casein erhalten werden. Die β-Casomorphine sind gegen Verdauungsenzyme beständig und bei Erwachsenen ist ihr physiologischer Einfluss auf den Gastrointestinaltrakt beschränkt, mit wichtigen Wirkungen auf die Darmpassagenzeit (intestinal transit time), Aminosäureaufnahme und Wasserhaushalt. Bei Neugeborenen jedoch können β-Casomorphine in den Blutstrom eintreten und Ausgeglichenheit und den Schlaf bei Kindern fördern. Einige Peptide, opioidale Antagonisten, bilden den β-Casomorphinen entgegenwirkende Effekte aus, und wirken durch Unterdrücken der Aktivität von Enkephalin. Drei von diesen, die Casoxins, sind Peptide des κ-Caseins. Das Caseinmakropeptid des κ-Caseins hat auch einen direkten Einfluss auf den gastrointestinalen Trakt und hemmt die gastrische Säuresekretion. Die Rolle der bioaktiven Peptide aus Caseinen ist ein sich erweiternder Bereich der Forschung, besonders nun da es ein besseres Verständnis der biologischen Vorgänge auf molekularer Ebene gibt. Die Herstellung der gereinigten Caseine durch das vorliegende Verfahren erleichtert die Produktion der verschiedenen Peptide in reiner Form.
Das neue Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht, dass Casein fraktioniert wird, um Material von bisher unerreichbarer Reinheit zu deutlich verringerten Kosten und frei von potenziell gefährlichen Reagenzien zu liefern. Insbesondere ermöglicht die vorliegende Erfindung zum ersten Mal die Herstellung von Material, das stark an κ-Casein angereichert ist.

Claims

Methode zum Erhalten gereinigter Proteinfraktionen aus Milch, umfassend die Schritte des: i) Erhöhens des pH-Werts der Milch auf einen pH-Wert von etwa 11; ii) Zusetzens von Calciumchlorid zum selektiven Ausfällen der Fraktionen; iii) Reduzierens des pH-Werts; und iv) Trennen der Fraktionen.
Methode nach Anspruch 1, wobei die Fraktionen α_s-, β- und κ-Casein sind.
Methode nach Anspruch 1 bis 2, wobei die Fraktionen durch Zentrifugieren getrennt werden.
Methode nach Anspruch 1 bis 2, wobei die Fraktionen durch Filtrieren getrennt werden.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Milch Magermilch ist.
Methode nach Anspruch 3, wobei das Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit durchgeführt wird.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des Weiteren umfassend den Schritt des Durchführens der Ausfällung bei saurem pH-Wert der überstehenden durch Zentrifugieren oder Filtrieren erhaltenen Flüssigkeit, um eine stark an κ-Casein angereicherte Fraktion zu erhalten.
Methode nach Anspruch 7, wobei der pH-Wert 3,8 beträgt.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, außerdem umfassend die Schritte des erneuten Lösens der α_s- und β-Caseinkomponenten in Wasser und Durchführens der wiederholten selektiven isoelektrischen Ausfällung bei einem sauren pH-Wert und niedriger Temperatur, um eine Fraktion zu erhalten, die hauptsächlich α_s-Casein enthält.
Methode nach Anspruch 9, wobei das Wasser einen pH-Wert von 7,0 und 20 °C aufweist.
Methode nach Anspruch 9 und 10, wobei die Lösung der α_s- und β-Caseine nach dem erneuten Lösen in Wasser gekühlt und auf einen sauren pH-Wert eingestellt wird.
Methode nach Anspruch 11, wobei die Lösung der α_s- und β-Caseine auf 2 °C gekühlt und auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt wird.
Methode nach den Ansprüchen 9 bis 12, wobei das Verfahren des erneuten Lösens und erneuten Ausfällens unter Erzeugung einer Fraktion, die hauptsächlich α_s-Casein enthält und einer Fraktion, die hauptsächlich β-Casein enthält, wiederholt wird.
Methode nach Anspruch 13, wobei die überstehende Flüssigkeit, die durch die selektive isoelektrische Ausfällung erhalten wird, erwärmt und durch saure Ausfällung behandelt wird, um die Fraktion zu gewinnen, die hauptsächlich β-Casein enthält.
Methode nach Anspruch 14, wobei die überstehende Flüssigkeit auf 35 °C erwärmt wird.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert der Milch durch Zusetzen einer alkalischen Lösung erhöht und durch Zusetzen einer sauren Lösung reduziert wird.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert der Milch durch Zusetzen von Natriumhydroxid erhöht wird.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Temperatur der Milch auf das Zusetzen der alkalischen Lösung 30 °C beträgt.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach dem Schritt des Erhöhens des pH-Werts der Milch man die Lösung für eine Zeitspanne von bis zu 5 Minuten stehen lässt.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Endkonzentration des Calciumchlorids in der Lösung 0,059 M beträgt.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert durch Zusetzen einer oder mehrerer Mineralsäuren reduziert wird.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, außerdem umfassend den Schritt des Erhöhens des pH-Werts der stark mit κ-Casein angereicherten Fraktion und das Durchführen der Ultrafiltrierung zum Trennen des niedermolekularen Materials von den Caseinen, Molkeproteinen und Caseinmakropeptid in der Milch.
Methode nach Anspruch 22, wobei der pH-Wert auf einen neutralen Wert angehoben wird.
Methode nach Anspruch 22 bis 23, wobei das Ultrafiltrieren unter Anwendung einer Membran mit einer Porengröße von weniger als 25 kD aber mehr als 12 kD durchgeführt wird.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche, außerdem umfassend den Schritt des Reduzierens des pH-Werts der stark mit κ-Casein angereicherten Fraktion und das Durchführen der Ultrafiltrierung zum Trennen des Molkeproteins von dem Caseinmakropeptid.
Methode nach Anspruch 25, wobei der pH-Wert auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 reduziert wird.
Methode nach den Ansprüchen 25 bis 26, wobei die Ultrafiltrierung unter Anwendung einer Membran mit einer Porengröße von mehr als 7 kD jedoch weniger als 20 kD durchgeführt wird.
Methode zum Erhalten gereinigter Proteinfraktionen aus einer Lösung von Natriumcaseinat umfassend die Schritte des: i) Erhöhens des pH-Werts der Natriumcaseinatlösung auf einen pH-Wert von etwa 11; ii) Zusetzens von Calciumchlorid zum selektiven Ausfällen der Fraktionen; iii) Reduzierens des pH-Werts; und iv) Trennen der Fraktionen.
Methode nach Anspruch 28, wobei die Fraktionen α_s-, β- und κ-Caseine sind.
Methode nach den Ansprüchen 28 bis 29, wobei die Fraktionen durch Zentrifugieren getrennt werden.
Methode nach den Ansprüchen 28 bis 30, wobei die Fraktionen durch Filtrieren getrennt werden.
Methode nach Anspruch 31, wobei das Zentrifugieren bei geringer Geschwindigkeit durchführt wird.
Methode nach den Ansprüchen 28 bis 32, außerdem umfassend den Schritt des Durchführens der Ausfällung bei saurem pH-Wert der überstehenden durch Zentrifugieren oder Filtrieren erhaltenen Flüssigkeit, um eine stark an κ-Casein angereicherte Fraktion zu erhalten.
Methode nach Anspruch 33, wobei der pH-Wert 3,8 beträgt.
Methode nach den Ansprüchen 28 bis 34, wobei die mit κ-Casein angereicherte Fraktion selektiv aus Ethanol ausgefällt wird, um sie noch weiter an κ-Casein anzureichern.
Methode nach Anspruch 35, wobei die stark mit κ-Casein angereicherte Fraktion erneut in Wasser bei einem pH-Wert von 7 gelöst, erneut bei einem pH-Wert von 4,6 ausgefällt und dann selektiv aus 50 % Ethanol bei einem pH-Wert von 7 und bei 25 °C unter Zusetzen einer kleinen Menge 2 NaCl in 50 % Ethanol ausgefällt wird.
Methode nach den Ansprüchen 28 bis 36, des Weiteren umfassend die Schritte des erneuten Lösens der α_s- und β-Caseinkomponenten in Wasser und Durchführens der wiederholten selektiven isoelektrischen Ausfällung bei einem sauren pH-Wert und niedriger Temperatur, um eine Fraktion zu erhalten, die hauptsächlich α_s-Casein enthält.
Methode nach Anspruch 37, wobei das Wasser einen pH-Wert von 7,0 und 20 °C aufweist.
Methode nach den Ansprüchen 37 bis 38, wobei die Lösung von α_s- und β-Casein auf 2 °C gekühlt und auf einen sauren pH-Wert eingestellt wird.
Methode nach Anspruch 39, wobei die Lösung von α_s- und β-Casein auf 2 °C gekühlt und auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt wird.
Methode nach den Ansprüchen 37 bis 39, wobei die überstehende Flüssigkeit, die durch die selektive isoelektrische Ausfällung erhalten wird, erwärmt und durch saure Ausfällung behandelt wird, um die Fraktion zu gewinnen, die hauptsächlich β-Casein enthält.
Methode nach den Ansprüchen 37 bis 41, wobei das Verfahren des erneuten Lösens und erneuten Ausfällens unter Erzeugung einer Fraktion, die hauptsächlich α_s-Casein enthält und einer Fraktion, die hauptsächlich β-Casein enthält, wiederholt wird.
Methode nach einem der Ansprüche 28 bis 42, wobei der pH-Wert der Natriumcaseinatlösung durch Zusetzen einer alkalischen Lösung erhöht und durch Zusetzen einer saueren Lösung reduziert wird.
Methode nach einem der vorhergehenden Ansprüche 28 bis 43, wobei der pH-Wert der Natriumcaseinatlösung durch Zusetzen von Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 11 erhöht wird.
Methode nach einem der Ansprüche 28 bis 44, wobei die Temperatur der Natriumcaseinatlösung nach Zusetzen der alkalischen Lösung 30 °C beträgt.
Methode wie in einem der Ansprüche 28 bis 45 beschrieben, wobei nach dem Schritt des Erhöhens des pH-Werts der Natriumcaseinatlösung man die Lösung für eine Zeitspane von bis zu 5 Minuten stehen lässt.
Methode nach einem der Ansprüche 28 bis 46, wobei die Endkonzentration an Calciumchlorid in der alkalischen Natriumcaseinatlösung 0,071 M beträgt.
Methode nach einem der Ansprüche 28 bis 47, wobei der pH-Wert durch Zusetzen einer oder mehrerer Mineralsäuren auf einen pH-Wert von 7,0 reduziert wird.
Methode nach einem der Ansprüche 28 bis 48, außerdem umfassend den Schritt des Erhöhens des pH-Werts der stark mit κ-Casein angereicherten Fraktion und des Durchführens der Ultrafiltrierung zum Trennen des niedermolekularen Materials von den Caseinen, Molkeproteinen und Caseinmakropeptid in der Natriumcaseinatlösung.
Methode nach Anspruch 49, wobei der pH-Wert auf einen neutralen Wert angehoben wird.
Methode nach den Ansprüchen 49 bis 50, wobei das Ultrafiltrieren unter Anwendung einer Membran mit einer Porengröße von weniger als 25 kD aber mehr als 12 kD durchgeführt wird.
Methode nach einem der Ansprüche 28 bis 51, außerdem umfassend den Schritt des Reduzierens des pH-Werts der stark mit κ-Casein angereicherten Fraktion und das Durchführen der Ultrafiltrierung zum Trennen des Molkeproteins von dem Caseinmakropeptid.
Methode nach Anspruch 52, wobei der pH-Wert auf einen pH-Wert zwischen 4 und 5 reduziert wird.
Methode nach den Ansprüchen 52 bis 53, wobei das Ultrafiltrieren unter Anwendung einer Membran mit einer Porengröße von mehr als 7 kD aber weniger als 20 kD durchgeführt wird.