CN115989846B - 一种曲拉酪蛋白分级制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种曲拉酪蛋白分级制备方法,将曲拉磨成粉后加到较低温度、较高浓度的乙醇水溶液(液体1)中,搅拌后部分酪蛋白会溶解到溶液1中,对体系进行固液分离后,收集溶解的酪蛋白,干燥后该部分酪蛋白的纯度、色泽、溶解度和灰分含量均可达到市售一级酪蛋白的标准。将未溶解的部分加到比液体1温度高且乙醇浓度低的乙醇水溶液中(液体2),搅拌后又有部分酪蛋白溶出。以此类推得到的前3种酪蛋白质量指标均高于市售二级酪蛋白标准。本发明所述方法只需在中性条件即可实现,无需高pH值、高温处理条件,实现了曲拉酪蛋白的分级制备,解决了现有曲拉酪蛋白得率低,溶解性低,杂质含量高、色泽暗黄,以及氧化酸败味明显等问题。
Description
技术领域
本发明属于食品加工技术领域,特别涉及一种曲拉酪蛋白分级制备方法。
背景技术
由于高原地区交通条件落后,牦牛乳无法被及时加工,牧民只能无奈地将牦牛乳脱脂、蒸煮、自然发酵风干而制成干制品“曲拉”。曲拉中酪蛋白的含量可达60%,经过分离提取后的曲拉酪蛋白可作为食品原料使用。然而当前以曲拉为原料生产酪蛋白的工艺和技术有待改进,主要体现在获得的酪蛋白得率低、溶解性低、色泽暗黄、灰分、乳糖、变性乳清蛋白等含量高、氧化酸败味明显,经过pH9以上的碱处理后,蛋白易水解等。
目前,利用曲拉制备酪蛋白均是将曲拉溶液的pH值调节至碱性范围, 后利用等电点沉淀法将酪蛋白沉淀下来,但是制备过程中难以将其他杂质彻底去除:其中曲拉中含有的乳清蛋白是变性状态,等电点与酪蛋白接近,因此酸沉淀过程中乳清蛋白必然随着酪蛋白共同沉淀;曲拉中的钙离子、磷酸根磷离子会随着酪蛋白沉淀而被部分包裹其中,难以去除;曲拉中的乳糖会在碱性环境中更易与酪蛋白发生美拉德反应而使产品由白色变为黄褐色;其中的残存的脂肪在碱性环境中更容易氧化,产生氧化酸败味道,且会与乳糖共同加速酪蛋白的交联,降低曲拉酪蛋白的溶解性。因此在碱性环境下(pH>7.5)得到的曲拉酪蛋白质量(色泽、杂质含量、酪蛋白含量、风味、溶解性等)难以达到鲜乳酪蛋白的标准。
中国专利“CN108567045A”公布了一种以曲拉为原料梯度pH值分级生产干酪素的方法和系统,但该方法操作繁琐,蛋白质回收率低。此外,该方法获得的第一目标酪蛋白中的灰分含量超过2.8%、色泽暗黄;第二及第三目标酪蛋白中的灰分含量超过3.4%,色泽棕黄,产品呈氧化酸败味。这些均无法达到工业一级酪蛋白的标准。
因此,以曲拉为原料制备酪蛋白的工艺需要进一步改进。
发明内容
针对现有技术存在的曲拉酪蛋白得率低,溶解性低,杂质(灰分、乳糖、变性乳清蛋白等)含量高、色泽暗黄,以及氧化酸败味明显等问题,本发明的目的在于进一步提高曲拉酪蛋白品质,提供一种曲拉酪蛋白分级制备方法,其中获得的第一目标酪蛋白,在色泽、溶解度、灰分含量各方面均达到市售一级酪蛋白的标准。
利用曲拉制备酪蛋白时,采用现有的梯度pH值分级法生产酪蛋白(pH值依次为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0),不仅存在操作繁琐、蛋白质回收率低、溶解性差的问题,更值得注意到是,现有梯度pH值分级法获得的第一目标酪蛋白中的灰分含量超过2.8%、色泽暗黄,灰分、乳糖、变性乳清蛋白等含量高;第二及第三目标酪蛋白中的灰分含量超过3.4%,色泽棕黄,产品呈氧化酸败味;均无法达到工业一级酪蛋白的标准。因此,发明人对此进行了研究,发现在高pH值、高温处理条件下容易引起蛋白质水解而导致分子量降低,甚至产生苦味。基于此,发明人进一步探究以曲拉为原料生产高品质酪蛋白的新方法,惊讶的发现曲拉中的酪蛋白性质存在差异,导致其在不同的温度和不同浓度乙醇水溶液条件下具有不同的溶解性,通过固液分离和梯度分级处理,可获得纯度、色泽、溶解度和灰分含量均可达到市售一级标准的干酪素。
有鉴于此,发明人提供了本发明的如下方案。
本发明的第一方面提供了一种曲拉酪蛋白分级制备方法,包括以下步骤:
(1)第一目标酪蛋白的获得:
S11,将曲拉磨成粉后,将曲拉粉加到温度低、浓度高的乙醇水溶液中,搅拌后部分酪蛋白溶解到所述温度低、浓度高的乙醇水溶液中,溶液经离心处理后得到第一上清液和第一沉淀;
S12,向所述第一上清液中加水、并调整pH值至4.0,通过等电点沉淀后,离心取沉淀物,沉淀物烘干至恒重,即得到纯度92%以上的第一目标酪蛋白。
(2)第二目标酪蛋白的获得:
S21,将所述第一沉淀加到相比步骤(1)温度高、浓度低的乙醇水溶液中,搅拌后部分酪蛋白溶解到所述温度高、浓度低的乙醇水溶液中,溶液经离心处理后得到第二上清液和第二沉淀;
S22,向所述第二上清液中加水、并调整pH值至4.0,通过等电点沉淀后,离心取沉淀物,沉淀物烘干至恒重,即得到第二目标酪蛋白。
(3)第三目标酪蛋白的获得:
S31,将所述第二沉淀加到相比步骤(2)温度更高、浓度更低的乙醇水溶液中,搅拌后酪蛋白溶解到乙醇水溶液中,溶液经离心处理后得到第三上清液和第三沉淀;
S32,向所述第三上清液中加水、并调整pH值至4.0,通过等电点沉淀后,离心取沉淀物,沉淀物烘干至恒重,即得到第三目标酪蛋白;
S33,将所述第三沉淀加到相比步骤S31乙醇水溶液温度更高、浓度更低的乙醇水溶液中,搅拌后酪蛋白溶解到乙醇水溶液中,溶液经离心处理后得到第四上清液和第四沉淀;
S34,向所述第四上清液中加水、并调整pH值至4.0,通过等电点沉淀后,离心取沉淀物,沉淀物烘干至恒重,即得到第三目标酪蛋白。
(4)乳清蛋白基料的获得:
将所述第四沉淀烘干至恒重,即得到乳清蛋白含量超过70%的乳清蛋白基料。
进一步的,其中步骤(1)-(3)中使用的乙醇水溶液中含有30~80 mmol L-1磷酸三钠;优选的,所述的乙醇溶液中含有50mmolL-1的磷酸三钠。
进一步的,步骤(1)中,所述温度低、浓度高的乙醇水溶液为40℃~50℃、pH 7.0、体积浓度60%~65%的乙醇水溶液;步骤(2)中,所述温度高、浓度低的乙醇水溶液为52℃~58℃,pH 7.0、体积浓度50%~55%的乙醇水溶液;步骤(3)S31中乙醇水溶液为60℃~70℃,pH 7.0、体积浓度35%~45%的乙醇水溶液;步骤(3)S33中乙醇水溶液为70℃~76℃,pH 7.0、体积浓度10%~15%的乙醇水溶液。
进一步的,步骤(1)~(3)中,向固体中添加乙醇水溶液时,固液比均控制在1:4~1:20,最优为1:10。
进一步的,步骤(1)~(3)的S11、S21、S31和S33中,进行搅拌及离心处理时,需维持体系的pH为7.0,温度与各步骤溶解用乙醇水溶液的温度不变。
进一步的,步骤(1)~(3)的S12、S22、S32和S34中,向各上清液中加水的体积均为上清液体积的1~10倍,最优地为3倍。
进一步的,步骤(1)的S11中,所述离心处理的条件为2000g,5min;此外步骤(1)~(3)中,所述离心处理及离心取沉淀的条件均为2000g,10min。
本发明的第二方面提供了一种高品质曲拉酪蛋白,由上述制备方法制备得到的第一目标酪蛋白。
进一步的,所述第一目标酪蛋白纯度高于92%,溶解度为100%,色泽为白色至奶油色,灰分含量低于1.6%。
本发明相比现有技术的有益效果为:
1、本发明所述的曲拉酪蛋白分级制备方法,无需高pH值、高温处理条件,在适当温度及浓度条件下,以乙醇水溶液为溶剂、在一定时间的搅拌下,曲拉中部分酪蛋白会溶解到乙醇水溶液中,再经固液分离、干燥处理后获得的第一目标酪蛋白的纯度达到92%、且其中无乳清蛋白,溶解度为100%,色泽为白色至奶油色,灰分含量低于1.6%,各项指标均达到市售一级酪蛋白的标准;
2、本发明所述的曲拉酪蛋白分级制备方法中,在分离获得第一目标酪蛋白后未溶解的部分(即所述第一沉淀),提高乙醇水溶液的温度、降低其浓度,搅拌后又有部分酪蛋白溶出,而后再次进一步提高乙醇水溶液的温度、降低其浓度,利用其溶解沉淀,获得的第二、第三目标酪蛋白中均无乳清蛋白,且酪蛋白质量指标(溶解度、色泽、灰分和脂肪含量等)均高于市售二级酪蛋白标准,实现了曲拉酪蛋白的分级制备。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明实施例1曲拉分级提取酪蛋白和乳清蛋白流程图。
具体实施方式
在以下实施例中,在没有特别说明的情况下,涉及到的原料和实验仪器均为市售品。
原料,见表1。
表1
实验仪器,见表2。
表2
以下实施例中,涉及到的性能的测试方法如下:
(1)蛋白质含量的测定。
采用凯氏定氮GB 5009.5的方法,对牦牛乳曲拉样品进行测定。
(2)灰分含量的测定。
采用GB 5425-85 的方法,对牦牛乳曲拉样品的灰分含量进行测定。
(3)色泽质量的测定。
将粉末样品装入色差计样品盒中,以色差仪检测出的亮度值L*、红度值a*、黄度值b*的大小作为色泽质量的评价指标。其中,L*代表亮度,a*代表红绿色度,正值代表红度,负值代表绿度。b*代表黄蓝度,正值代表黄度,负值代表蓝度。样品的亮度值越高,红度值和黄度值越低代表酪蛋白的色泽品质越好。
(4)αs1-、 αs2-、β-、κ-CN和乳清蛋白含量的测定。
用3mL缓冲液对500 μL的待测溶液(10mg/mL)进行稀释。该缓冲液的组成为:100mmol L-1Tris,8 mol L-1 尿素,13 g/L 柠檬酸钠和0.3% (v/v) β-巯基乙醇,用盐酸调节pH至7.0。对样品溶液和酪蛋白的标准溶剂进行离心,以除去杂质,离心参数为12000 转,10min,室温(约25 ℃)。流动相溶剂A的组成为含0.1% (v/v) 三氟乙酸(TFA)的超纯水溶液,溶剂B的组成为含0.1% (v/v)三氟乙酸的乙腈溶液。设置流动相的流速为0.8 ml min-1,梯度洗脱的浓度为B溶剂的浓度在50分钟的时间内从30.0%增加至50.0%。待测液的进样量为20 μl,设置检测用的波长为220 nm。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明中,“第一上清液”、“第二上清液”、“第三上清液”、“第四上清液”;“第一沉淀”、“第二沉淀”、“第三沉淀”、“第四沉淀”;“第一料液”中的“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于便于在描述上区分不同步骤中的混合、固液分离等操作。
实施例1:
本实施例提供了一种曲拉酪蛋白分级制备方法,如图1所示流程,所示方法包括以下步骤:
(1)第一目标酪蛋白的获得:
将曲拉磨成粉后,按照曲拉粉:溶剂质量比1:10的量加到温度为50℃、pH 7.0的65%乙醇水溶液中(含50mmol L-1磷酸三钠,下述所有乙醇水溶液均含50mmol L-1磷酸三钠),磁力搅拌10分钟后,调节pH至7.0,继续磁力搅拌20分钟,期间维持体系的pH和温度分别为7.0和50℃。将体系于50℃条件下离心(2000g,5min)得到第一上清液和第一沉淀。
向第一上清液中加3倍于上清液的去离子水,用2mol/L盐酸将体系的pH值调节至4.0,这里加水的作用是稀释乙醇,再通过加酸调节pH至酪蛋白的等电点后便于酪蛋白沉淀。另外需要说明的是,虽然牦牛乳酪蛋白的等电点在4.6左右,但是实验发现当pH降至4.6时,形成的凝块太松散,酪蛋白无法100%沉淀,而继续调节pH至4.0时,酪蛋白凝块致密,才能使其100%沉淀下来。体系的pH值调节至4.0之后,离心(2000g,10min)取沉淀,将样品于烘干至恒重得到第一目标酪蛋白CS1-1。
(2)第二目标酪蛋白的获得:
将所述第一沉淀加到温度为58℃,pH7.0的55%乙醇水溶液中,58℃条件下离心得到第二上清液和第二沉淀。向第二上清液中加3倍于上清液的去离子水,加酸将体系的pH值调节至4.0后,离心(2000g,10min)取沉淀,将样品于烘干至恒重得到第二目标酪蛋白CS1-2。
(3)第三目标酪蛋白的获得:
将所述第二沉淀加到温度为66℃,pH7.0的45%乙醇水溶液中,66℃条件下离心得到第三上清液和第三沉淀。向第三上清液中加3倍于上清液的去离子水,加酸将体系的pH值调节至4.0后,离心(2000g,10min)取沉淀,将样品于烘干至恒重得到第三目标酪蛋白CS1-3。
将所述第三沉淀加到温度为74℃,pH7.0的15%乙醇水溶液中,74℃条件下离心得到第四上清液和第四沉淀。第四沉淀烘干至恒重得到第四目标蛋白,其中乳清蛋白含量超过70%,可作为高含量乳清蛋白基料使用WP1。
实施例2-3:
本实施例采取实施例1所述曲拉酪蛋白分级制备方法,不同的是,按照表3中的条件进行各级目标酪蛋白的提取。
表3 三个步骤乙醇浓度和温度的条件设置
对比例1
本对比例利用梯度pH值分级生产干酪素的方法和系统,以曲拉为原料进行酪蛋白提取,具体方法为:
(1)在装有蒸馏水的溶解缸中加入曲拉原料,料液比1:20(V/V),室温下浸泡10min,得到第一料液;
(2)用4mol/L的氢氧化钠溶液调节第一料液pH值至6.0时停止加碱,搅拌1h,溶解过程中不断调节第一料液的pH值至6.0;
(3)将步骤(2)所得到的混合液在4500g的转速下离心20min,用纱布过滤除去脂肪,得到上清液和沉淀物;
(4)用1.0mol/L HCl溶液将上清液pH值调节至4.4~4.6,并将所得到的混合液在4500g的转速下离心5min;
(5)分别用蒸馏水和丙酮洗涤步骤(4)所得到的沉淀两次,以便得到pH6.0干酪素;
(6)将沉淀物返回至步骤(1)重复进行步骤(1)~(5)六轮,其中,步骤(2)中第一料液的pH值依次为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0,以便分别得到pH7.0干酪素、pH8.0干酪素、pH9.0干酪素、pH10.0干酪素、pH11.0干酪素、pH12.0干酪素;以及
(7)将获得的干酪素进行真空冷冻干燥,温度为-50℃,压强为10~50Pa,时间为48h。
表4 对比例1中各组分的各指标
对比例2
1)为探究乙醇温度、浓度对曲拉酪蛋白提取效果的影响,本对比例采取实施例1所述曲拉酪蛋白分级制备方法,不同的是,按照表5中的条件进行所述第一目标酪蛋白的提取。
表5
2)为探究乙醇温度、浓度对曲拉酪蛋白提取效果的影响,本对比例采取实施例1所述曲拉酪蛋白分级制备方法,不同的是,按照表6中的条件进行所述第二目标酪蛋白的提取。
表6
3)为探究乙醇温度、浓度对曲拉酪蛋白提取效果的影响,本对比例采取实施例1所述曲拉酪蛋白分级制备方法,不同的是,按照表7中的条件进行所述第三目标酪蛋白的提取。
表7
4)为探究乙醇水溶液中磷酸三钠对曲拉酪蛋白提取效果的影响,本对比例采取实施例1所述曲拉酪蛋白分级制备方法制备第一、二、三目标酪蛋白CS16-1、CS16-2和CS16-3,不同的是,乙醇水溶液中不额外添加磷酸三钠。
测试例
分别采用上述检测方法,检测以上实施例和对比例获得的各级目标酪蛋白的溶解度、灰分含量、色泽、得率,结果如下表8所示。
表8 对比例和实施例中个各指标对比结果
注:CSxx-n的编号为CSxx为实验批次编号,n为目标蛋白的编号,例如,CS8-2为第8批次实验获得第二目标酪蛋白对应的实验条件。
可以看出本申请实施例1-3中获得的第一、第二、第三目标酪蛋白色泽、灰分含量、乳清蛋白含量达到市售鲜乳酪蛋白的标准,其中三种目标蛋白质量总和占原料曲拉中酪蛋白质量的60%以上,显著优于对比例1。
由表8的对比结果可以看出,讲过实验验证,分三步的提取方法中,只有在实施例1-3所述的温度、浓度范围内,即步骤(1)中,所述温度低、浓度高的乙醇水溶液为40℃~50℃、pH 7.0、体积浓度60%~65%的乙醇水溶液;步骤(2)中,所述温度高、浓度低的乙醇水溶液为52℃~58℃,pH 7.0、体积浓度50%~55%的乙醇水溶液;步骤(3)S31中乙醇水溶液为60℃~70℃,pH 7.0、体积浓度35%~45%的乙醇水溶液;步骤(3)S33中乙醇水溶液为70℃~76℃,pH7.0、体积浓度10%~15%的乙醇水溶液的三步提取下获得的酪蛋白超过市售酪蛋白标准或者与市售酪蛋白标准相当。其他条件下并未达到类似的效果,如在乙醇水溶液浓度较高,但温度较低时(CS4-1),得到的第一酪蛋白质量总和仅占原料曲拉中酪蛋白质量的4%以下; 而在浓度较低而温度较高时(CS7-1)得到的第一酪蛋白质量总和仅占原料曲拉中酪蛋白质量的5%以下; 远达不到提取要求。此外,乙醇溶液中若无磷酸三钠,导致无法实现酪蛋白的梯度分离。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种曲拉酪蛋白分级制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)第一目标酪蛋白的获得:
S11,将曲拉磨成粉后,将曲拉粉加到温度低、浓度高的乙醇水溶液中,搅拌后部分酪蛋白溶解到所述温度低、浓度高的乙醇水溶液中,溶液经离心处理后得到第一上清液和第一沉淀;
S12,向所述第一上清液中加水、并调整pH值至4.0,通过等电点沉淀后,离心取沉淀物,沉淀物烘干至恒重,即得到纯度92%以上的第一目标酪蛋白;
(2)第二目标酪蛋白的获得:
S21,将所述第一沉淀加到相比步骤(1)温度高、浓度低的乙醇水溶液中,搅拌后部分酪蛋白溶解到所述温度高、浓度低的乙醇水溶液中,溶液经离心处理后得到第二上清液和第二沉淀;
S22,向所述第二上清液中加水、并调整pH值至4.0,通过等电点沉淀后,离心取沉淀物,沉淀物烘干至恒重,即得到第二目标酪蛋白;
(3)第三目标酪蛋白的获得:
S31,将所述第二沉淀加到相比步骤(2)温度更高、浓度更低的乙醇水溶液中,搅拌后酪蛋白溶解到乙醇水溶液中,溶液经离心处理后得到第三上清液和第三沉淀;
S32,向所述第三上清液中加水、并调整pH值至4.0,通过等电点沉淀后,离心取沉淀物,沉淀物烘干至恒重,即得到第三目标酪蛋白;
S33,将所述第三沉淀加到相比步骤S31乙醇水溶液温度更高、浓度更低的乙醇水溶液中,搅拌后酪蛋白溶解到乙醇水溶液中,溶液经离心处理后得到第四上清液和第四沉淀;
(4)乳清蛋白基料的获得:
将所述第四沉淀烘干至恒重,即得到乳清蛋白含量超过70%的乳清蛋白基料;
其中,步骤(1)中,所述温度低、浓度高的乙醇水溶液为40℃~50℃、pH 7.0、体积浓度60%~65%的乙醇水溶液;步骤(2)中,所述温度高、浓度低的乙醇水溶液为52℃~58℃,pH7.0、体积浓度50%~55%的乙醇水溶液;步骤(3)S31中乙醇水溶液为60℃~70℃,pH 7.0、体积浓度35%~45%的乙醇水溶液;步骤(3)S33中乙醇水溶液为70℃~76℃,pH 7.0、体积浓度10%~15%的乙醇水溶液;
其中步骤(1)-(3)中使用的乙醇水溶液中含有50 mmol L-1磷酸三钠。
2.根据权利要求1所述的曲拉酪蛋白分级制备方法,其特征在于,步骤(1)~(3)中,向固体中添加乙醇水溶液时,固液比均控制在1:4~1:20。
3.根据权利要求1所述的曲拉酪蛋白分级制备方法,其特征在于,步骤(1)~(3)的S11、S21、S31和S33中,进行搅拌及离心处理时,需维持体系的pH、温度与各步骤溶解用乙醇水溶液的温度不变。
4.根据权利要求1所述的曲拉酪蛋白分级制备方法,其特征在于,步骤(1)~(3)的S12、S22、S32中,向各上清液中加水的体积均为上清液体积的1~10倍。
5.根据权利要求1所述的曲拉酪蛋白分级制备方法,其特征在于,步骤(1)的S11中,所述离心处理的条件为1500-2500g,3-8min;此外步骤(2)~(3)中,所述离心处理及离心取沉淀的条件均为1500-2500g,8-15min。
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- 2023-03-21 CN CN202310272677.XA patent/CN115989846B/zh active Active
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