DE69100965T2 - Verfahren zur Herstellung von Kappa-Casein-Glykomakropeptide. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Kappa-Casein-Glykomakropeptide.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von -Casein-Glykomakropeptid (im nachstehenden CGMP genannt).
- CGMP ist ein sialyliertes Makropeptid, das durch Einwirkung von Lab oder Pepsin auf -Casein der Milch von Säugetieren entsteht.
- Es ist ein Verfahren zur Herstellung von CGMP auf Laborebene bekannt, das darin besteht, daß ein von Milch stammender Rohstoff, wie beispielsweise ein saures Casein oder ein durch Lab hydrolysiertes Caseinat oder eine entmineralisierte und von Milchzucker befreite Süßmolke, mit Trichloressigsäure behandelt wird, so daß die Proteine ausgefällt werden, und daß dann der Über stand gewonnen und dialysiert wird und das Dialysat schließlich getrocknet wird. Ein solches Verfahren ist nicht industriell durchführbar.
- Gemäß EP-A-291.264 kann CGMP industriell durch Hydrolyse von saurem Casein oder Natrium- oder Calcium-Caseinat durch Lab hergestellt werden, was zur Koagulierung von Para- -Casein führt. Dann wird der Überstand zur Ausfällung des Calcium- Phosphocaseinats auf pH 4-5 angesäuert. Nach Abtrennung des Niederschlags wird die Lösung neutralisiert, dann durch Umkehrosmose entmineralisiert und schließlich konzentriert und getrocknet.
- Gemäß FR-A-2.288.477 können Glykoproteine und Sialinsäure industriell aus Käsemolke durch Ausflockung der Molkeproteine, Gewinnung des Überstands und anschließende Ultrafiltration des Überstands mit Membranen mit einem Trennbereich von etwa 15.000 Dalton hergestellt werden, die ein Retentat erzeugen, das die Sialin-Glykoproteine enthält, aus denen man die Sialinsäure durch Hydrolyse mit Schwefelsäure, Neutralisierung mit Bariumhydroxyd, Abtrennung des Bariumsulfat-Niederschlags und anschließend Isolierung der Sialinsäuren des Überstands durch Ionenaustausch erhält.
- Die obengenannten industriellen Verfahren gestatten nicht die Herstellung von CGMP mit der Reinheit, die für die Anwendung als infektionshemmendes Mittel gewünscht wird, d.h. ein Mittel, das wenig Proteine, Milchzucker und Restmineralien und den wesentlichen Teil der Sialinsäuren enthält.
- Ziel der Erfindung ist die industrielle Herstellung von CGMP mit den obengenannten Eigenschaften.
- Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zur Herstellung von -Casein-Glykomakropeptid, bei welchem die Proteine eines mit Proteinen angereicherten, teilweise von Milchzucker befreiten Molkeprodukts ausgeflockt werden, was zu einem Niederschlag und zu einem ersten Überstand führt, der erste Überstand gewonnen und dann ultrafiltriert wird, was zu einem Retentat führt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das Ethanol in einer Menge von 5 bis 25 %, bezogen auf das Volumen des Retentats, beigegeben wird.
- Zur Durchführung des Verfahrens kann man von einem Molkeprodukt, beispielsweise von Süßmolke ausgehen, die nach Abtrennung des durch Lab koagulierten Caseins erhalten wurde, konzentriert und teilweise von Milchzucker befreit wurde. Man kann auch ein solches Molkekonzentrat verwenden, das beispielsweise durch Elektrodialyse und/oder Ionenaustausch und/oder Umkehrosmose demineralisiert wurde. Vorzugsweise kann man ein stark von Milchzucker befreites Süßmolkeproteinkonzentrat verwenden, das durch Ultrafiltration und anschließende Diafiltration (Ultrafiltration mit Waschen) erhalten wird. Diese Rohstoffe können im flüssigen Zustand oder in Pulverform vorliegen, in welchein Fall man sie zum Zweck ihrer späteren Behandlung in vorzugsweise entmineralisiertem Wasser in Dispersion bringt. Diese Rohstoffe können von der Milch von Wiederkäuern wie Kühen, Ziegen, Schafen oder Büffeln stammen.
- Die Ausflockung der Molkeproteine erfordert ihre gründliche Denaturierung (über 90 %). man erreicht sie durch eine Wärmebehandlung bei 80 bis 100ºC in 10 bis 30 Minuten, wobei die niedrigste Temperatur der längsten Zeit und umgekehrt entspricht, und zwar beispielsweise 90ºC in 20 Minuten. Der pH-Wert während der Wärmebehandlung beträgt 4 bis 7, vorzugsweise etwa 6. Vorzugsweise gibt man CaCl&sub2; mit einem pH von etwa 6 in einer solchen Menge bei, daß die Konzentration an freien Calciumionen größer als 5 mM ist, uin die Aggregation der Serumproteine und ihre Unlöslichkeit während der Wärmebehandlung zu begünstigen.
- Nach Ausflockung bildet sich ein Gel, das vorzugsweise mit entmineralisiertem Wasser verdünnt wird. Man kühlt dann die erhaltene Suspension und stellt ihren pH-Wert durch Säuerung init einer wässrigen Lösung einer organischen Säure oder einer Mineralsäure, beispielsweise Salzsäure, auf etwa 4,5 ein. Es bildet sich ein Niederschlag der denaturierten Proteine, den man vom Überstand durch jedes geeignete Trennverfahren, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren, abtrennen kann.
- Anschließend nimmt man eine Ultrafiltration des Überstands durch Durchgang durch Membranen vor, deren Nennschnittbereich 5.000 bis 20.000 Dalton beträgt. Die verwendbaren Membranen können organisch oder mineralisch sein. Die Ultrafiltration findet vorzugsweise statt, bis etwa auf die Hälfte des Anfangsvolumens konzentriert wurde, und dann wird eine Diafiltration vorgenommen, d.h. eine Beigabe von vorzugsweise entmineralisiertem Wasser mit konstantem Volumen, d.h. der Durchsatz des in das Modul eintretenden Wassers wird auf den Durchsatz des austretenden Permeats eingestellt. Das Ziel der Ultrafiltration und der Diafiltration ist die Verringerung des Gehalts des Retentats an Mineralien.
- Aus dem Retentat extrahiert man das CGMP durch Beigabe von vorzugsweise reinem Ethanol. Dieser wesentliche Schritt gestattet eine selektive Anreicherung der Lösung mit CGMP, indem fast alle löslichen Restproteine ausgefällt werden. Die beigegebene Menge hängt von dem Gehalt der Lösung an Proteinen ab. Eine zu geringe Menge führt nur zu einer partiellen Ausfällung der Proteine und beeinflußt infolgedessen die Reinheit des CGMP negativ. Eine zu große Beigabe von Ethanol bringt ferner die Gefahr mit sich, daß die Ausfällung von Nichtprotein-Stickstoff-Verbindungen wie CGMP verursacht wird, was die Ausbeute beeinträchtigt. Eine Beigabe von 5 bis 25 % Alkohol, bezogen auf das Volumen der Lösung, ergibt befriedigende Ergebnisse. Der pH-Wert der Lösung muß 4 bis 5 sein und vorzugsweise auf 4,5 eingestellt sein, um zu einer optimalen Ausfällung der Proteine zu führen. Er wird durch Beigabe einer wässrigen Lösung einer organischen oder mineralischen Säure, vorzugsweise Salzsäure eingestellt.
- Nach Filtration und anschließender Konzentration beispielsweise durch Eindampfen wird das Konzentrat beispielsweise durch Zerstäubung oder Lyophilisierung getrocknet.
- Ggf. kann desialyliertes CGMP durch enzymatische Hydrolyse oder vorzugsweise Säurehydrolyse aus dem vorhergehenden CGMP hergestellt werden. Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Bei diesen beziehen sich die Prozentsätze und Anteile, sofern nichts anderes angegeben wird, auf das Gewicht. Der Gesamtstickstoff (NT) wird durch die Kjeldahl- Methode und der Nichtprotein-Stickstoff (NPN) wird nach Ausfällung der Proteine mit Trichloressigsäure (TCA) bestimmt. Die Proteinen werden als (NT-NPN) x 6,38 erhalten. Bei der gebräuchlichen Ausfällung von CGMP im Labormaßstab durch Ausfällung der Serumproteine durch TCA reinigt man den Überstand durch Dialyse und dann Chromatographie auf einem Sephadex - Gel. Die die Sialinsäuren enthaltenden Fraktionen bilden einen homogenen Peak, und ihre Gewinnung führt zu reinem CGMP, das im Fall eines von Kuhmilch stammenden CGMP im Durchschnitt 13 % Sialinsäuren enthält. Man kann also die Reinheit der verschiedenen CGMP's auf der Basis ihres auf die obenangegebene Weise erhaltenen Gehalts an Sialinsäuren, ausgedrückt in Prozent des reinen, von Kuhmilch stammenden CGMP's berechnen. Um nachzuprüfen, ob diese Reinheitsprozentsätze auch der Realität entsprechen, isoliert man reines CGMP bei jeden Präparat durch die gebräuchliche Methode. In jedem Fall führt die Gewinnung der sialylierten Fraktionen zu einem Produkt, das nach Lyophilisierung mehr als 10 % Sialinsäuren enthält (Vergleichsbeispiel, letzte Zeile der nachstehenden Tabelle). Zur Bestimmung des Restmilchzuckergehalts nimmt man eine Chromatographie auf Gel Sephadex G-50 mit Eluierung mit einer wässrigen Essigsäurelösung von 100 mM vor.
- Man dispergiert 20 kg Kuhmolkeproteinkonzentrat (WPC) in 180 kg entmineralisiertem Wasser. Das Konzentrat hat die folgende Zusammensetzung: Proteine Milchzucker Mineralien Lipide CGMP Wasser Ergänzung auf 100
- Man gibt der Dispersion 300 g CaCl&sub2;.2H&sub2;O bei und stellt ihren pH-Wert mit einer wässrigen 8 %-igen HCl-Lösung auf 6 ein. Man überträgt die Dispersion in einen Behälter mit doppelter Wandung, der mit Rühreinrichtungen versehen ist und zuvor auf 90ºC erhitzt wurde, und hält ihn unter leichtem Rühren 20 Minuten auf dieser Temperatur. Es bildet sich ein Gel, das man mit 40 kg entmineralisiertem Wasser verdünnt. Nach Abkühlung auf 25ºC und Säuerung auf pH 4,5 durch Beigabe einer wässrigen HCl-Lösung pumpt man die Dispersion in eine Zentrifuge, die sich mit 9.000 U/min dreht. Man gewinnt einen ersten Überstand, der 3,5 % Trockenmassen enthält, und einen Rückstand. Man dispergiert anschließend den Rückstand in 20 kg Wasser, das durch eine wässrige 18 %-ige HCl-Lösung auf pH 4,5 angesäuert wurde, und zentrifugiert diese mit 9.000 U/min., was einen zweiten Überstand ergibt, der 5,1 % Trockenmasse enthält. Nach Mischung der beiden Überstände ultrafiltriert man das Gemisch bis auf die Hälfte seines Volumens bei einer konstanten Temperatur von 35ºC mit Hilfe eines Moduls mit einer Fläche von 4 m² aus Membranen mit einem Trennbereich von 20.000 Dalton, das mit einem Behälter für die Rückleitung des Retentats mit einem Eingangsdruck von 7 b und mit einem konstanten Permeationsdurchsatz von 120 l/h in 75 Minuten ausgerüstet ist.
- Das austretende Permeat hat einen Trockensubstanzgehalt von 0,5 % und enthält Sialinsäuren, die 2 % des in die Vorrichtung eintretenden Gemisches darstellen. Anschließend leitet man 125 kg entmineralisiertes Wasser in die Vorrichtung ein, indem das abgeführte Permeat allmählich kompensiert wird, so daß man mit konstantem Volumen arbeitet. Nach dieser Waschung beendet man die Ultrafiltration, so daß das Rententatvolumen im Rückleitungsbehälter auf 23 l reduziert wird, d.h. 29 kg, die 16,5 % Trockenmasse enthalten. Man treibt die im toten Volumen des Moduls enthaltene Flüssigkeit aus und spült das Modul dann mit entmineralisiertem Wasser. Diese Flüssigkeit und das Spülwasser stellen 19 kg zusätzliches Retentat dar, das 7,9 % Trockensubstanz enthält. Das Gesamtretentat entspricht 48 kg mit 13,2 % Trockensubstanzen. Nach Verdünnung des Retentats auf 100 kg mit entmineralisiertem Wasser, Beigabe von 16,5 l reinem Ethanol und Einstellung des pH auf 4,5 mit einer wässrigen HCl-Lösung hält man das Gemisch 30 Minuten unter leichtem Rühren. Es bildet sich ein Niederschlag, der gefiltert wird. Man erhält 110 l Filtrat, das in einem Verdampfer auf 28 l konzentriert wird, und trocknet es dann durch Lyophilisierung. Die erhaltenen 290 g CGMP enthalten 10,9 % Gesamtsialinsäuren und 8,4 % Proteine.
- Zum Vergleich stellt man CGMP her:
- I. Gemäß der EP-A-291.264.
- II. Ähnlich wie in der FR-A-2.288.477 beschrieben wird, jedoch ohne Hydrolyse der Sialinsäuren, und zwar indem man wie in Beispiel I vorgeht, jedoch ohne die Ausfällung der Restmolkeproteine mit Ethanol vorzunehmen.
- III. Durch Ausfällung der Serumproteine mit Trichloressigsäure aus dem in Beispiel I als Rohstoff dienenden Molkeproteinenkonzentrat und anschließende Reinigung auf einer Kolonne mit Sephadex G50 -Gel, (TCA/G-50).
- Die Analyseergebnisse der erhaltenen Produkte sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt: Zusammensetzung (%) Gemäß Bsp. 1 Ausgangs-WPC Gesamtstickstoff Nichtprotein-Stickstoff Proteine TCA-lösliche Sialinsäuren Lactose Mineralien Reinheit des CGMP Gehalt an Sialinsäuren einer mit TCA/G50 gereinigten Probe (gebräuchliche Labormethode) Erklärung: --: nicht bestimmt.
- Diese Ergebnisse zeigen, daß das gemäß der Erfindung hergestellte CGMP durch einen Gehalt an Mineralien < 5 %, einen Proteingehalt < 10 %, einen Gehalt an Sialinsäuren > 10 % und eine Reinheit von 84 % gekennzeichnet ist. Die aus Industrieverfahren erhaltenen Produkte führen dagegen zu einer Reinheit von 40 % (I) und sogar 15 % (II).
- Die von dem CGMP getragenen Sialinsäuren sind immer mit Disaccharid verbunden, das den inneren Teil seiner Glykanketten bildet, und zwar die Sequenz GAlβ 1-> 3 GalNAcα1-> Ser/Thr. Eine Desialylierung des CGMP gestattet also den Übergang von einem Produkt, das Sialinsäuren aufweist und bei dem der größte Teil der Galaktosereste maskiert ist, auf ein Produkt, das β -Galaktoside an Endstellen aufweist, also andere Eigenschaften besitzt.
- Um zu dem desialylierten CGMP zu gelangen, löst man das CGMP von Beispiel I in einem Anteil von 5 Gewichts/Volumenprozent in einer. wässrigen H&sub2;SO&sub4;-Lösung von 25 mM. Nach Einstellung des pH auf 2 durch Beigabe einer wässrigen H&sub2;SO&sub4;-Lösung erhitzt man die Lösung auf 80ºC und hält sie 2 h unter leichtem Rühren auf dieser Temperatur. Nach gründlicher Dialyse der Lösung gegen reines Wasser mit Hilfe einer Membran mit einem Schnittbereich von 6.000 bis 8.000 Dalton wird das Produkt durch Lyophilisierung getrocknet. Es hat folgende Merkmale:
- Sialinsäuren < 1%
- Galaktose 5%
- N-Acetylgalaktosamin 6,2 %
- Die Monosaccharide werden nach Hydrolyse und Derivatisierung durch Gaschromatographie identifiziert und dosiert.
Claims (9)
1. Verfahren zur Herstellung von -Casein-Glykomakropeptid,
bei welchem die Proteine eines mit Proteinen angereicherten,
teilweise von Milchzucker befreiten Molkeprodukts ausgeflockt
werden, was zu einem Niederschlag und zu einem ersten
Überstand führt, der erste Überstand gewonnen und dann
ultrafiltriert wird, was zu einem Retentat führt, dadurch
gekennzeichnet, daß das Retentat mit Ethanol behandelt wird,
was einen Niederschlag und einen zweiten Überstand erzeugt,
der zweite Überstand gewonnen und getrocknet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Ethanol in einer Menge von 5 bis 25 %, bezogen auf das
Volumen des Retentats, beigegeben wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der
pH-Wert des Mediums nach Beigabe des Ethanols durch Beigabe
einer wässrigen Lösung einer Säure auf 4-5 eingestellt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Molkeproteine durch Wärmebehandlung des Molkeprodukts mit 80
bis 100ºC bei pH 4-7 während 10 bis 30 min ausgeflockt
werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die
Molkeproteine unter Anwesenheit von Calciumionen ausgeflockt
werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
nach Ausflockung der Molkeproteine die erhaltene Suspension
gekühlt wird und ihr pH durch Beigabe einer Säure auf etwa
4,5 eingestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der
erste Überstand auf Membranen, deren Nennschnittbereich 5'000
bis 20'000 Dalton beträgt, bis auf etwa die Hälfte des
eingesetzten Volumens ultraf iltriert wird und dann
diafiltriert wird, um seinen Gehalt an Mineralien zu
verringern.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der
getrocknete zweite Überstand desialyliert und dann durch
Enzym- oder Säurehydrolyse wieder gelöst wird.
9. Ggf. desialyliertes -Casein-Glykomakropeptid, das durch
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8
hergestellt werden kann.
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