CN102746393A

CN102746393A - 一种酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法

Info

Publication number: CN102746393A
Application number: CN2011101015922A
Authority: CN
Inventors: 王艳萍; 赵运星
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2011-04-22
Publication date: 2012-10-24

Abstract

本发明涉及一种分离纯化酪蛋白糖巨肽的方法，采用絮凝剂去除酪蛋白糖巨肽生产中的杂蛋白等的方法。本发明提供的去除酪蛋白糖巨肽中杂蛋白的方法简单，使用范围广。能在较宽的pH条件起到去除杂蛋白等的目的。较宽的作用条件，简便的操作过程即降低了其在产品中的步骤，节约成本，给酪蛋白糖巨肽的工业化生产带来好处。

Description

一种酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法，尤其是一种利用絮凝法移除杂蛋白等的方法

技术背景

通常可溶性的多肽含有较多的糖链，被称为“糖巨肽”，酪蛋白来源的此类肽都统称为酪蛋白糖巨肽(Casein Glycomacropeptide，简称CGMP)，是一种由凝乳酶或胃蛋白酶水解酪蛋白后得到的。CGMP具有多种生物学活性，例如促进双歧杆菌增殖、抑制胃酸分泌、抑制病原体包括病毒和细菌等粘附至细胞、抑制霍乱等的毒素与受体的结合、调理肠道微生物、抑制血小板凝集、降血压，并且具有高度的溶解性和热稳定性、以及良好的乳化性和凝胶性等等。

目前关于CGMP的制备一直是人们关注的话题，很多方法被尝试用来制备和生产CGMP，但大多数方法并不能应用于工业化生产中。Tanimoto(1991年)用高温长时间热处理的方法使多余的杂蛋白变性、沉淀来生产糖巨肽。但这种方法由于需要高温长时间处理，消耗能量较多。Etzel(2001年)利用层析法浓缩脱盐分离纯化CGMP。但分离材料价格昂贵，生产效率不高。Tanimoto等人利用基于膜分离的超滤方法来分离纯化CGMP，但是膜分离技术在制备CGMP时也存在不足之处，如膜的清洗需要消耗大量的能量和水，同时对于目标溶液中杂蛋白等含量较多时，其分离效果和膜的污染等问题更加突出。

发明内容

本发明的目的在于提供一种絮凝法分离纯化酪蛋白糖巨肽的方法，本方法能够较好的去除目标溶液中的杂蛋白等物质，为酪蛋白糖巨肽的分离纯化提供新的有效的方法，能够应用于酪蛋白糖巨肽的工业化生产中。

本发明实现目的的技术方案如下：

1、本发明中由絮凝剂去除目标溶液中的杂蛋白等物质，絮凝后目标溶液比较澄清，絮凝时间较短。。

2、本发明中分离纯化的酪蛋白糖巨肽的要求比较简单，要求的目标溶液中的pH条件比较宽，和其他方法相比，减少了调节目标溶液pH等过程。此外絮凝剂的用量比较低，蛋白移除率在85％以上，酪蛋白糖巨肽损失在25％以下。较高的蛋白移除和较低的酪蛋白糖巨肽损失充分证明了本发明分离纯化酪蛋白糖巨肽的方法具有较好的纯化效果。较少的操作过程即降低了其在生产中的周期，节约成本，给酪蛋白糖巨肽的工业化生产带来好处。

附图说明

图1为本发明分离纯化中酪蛋白糖巨肽杂蛋白絮凝效果图；

图2为本发明分离纯化中酪蛋白糖巨肽杂蛋白移除率结果图；

图3为本发明分离纯化絮凝后含酪蛋白糖巨肽鉴定结果图；

图4为本发明分离纯化絮凝后酪蛋白糖巨肽损失率结果图。

其中图1中，从左到右分别为：阴性空白对照，添加硫酸铝，添加硫酸铝钾，添加壳聚糖后絮凝效果图。其中图3为唾液酸检测结果图，从左到右依次为，酶解液，硫酸铝絮凝后上清，硫酸铝钾絮凝后上清，壳聚糖絮凝后上清，标品，阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。

实例1酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法，步骤如下：

(1)配置2～10％的酪蛋白水溶液1L，调整其pH为酶解的pH，30-45℃水浴保温，加入酶溶液，立即计时，过程中用酸度计监测并保持反应液的pH不变，反应一定时间后得到酶解液；

(2)向步骤(1)中得到的酶解液添加絮凝剂硫酸铝钾溶液并搅拌，使酶解液中絮凝剂的浓度为2～5g/L，静置60min；

(3)离心收集上清液，旋转蒸发浓缩，冻干收集得到酪蛋白糖巨肽粗品，冷冻保存。

实例2酪蛋白糖巨肽的制备方法，步骤如下：

(2)向步骤(1)中得到的酶解液添加絮凝剂壳聚糖溶液并搅拌，使酶解液中絮凝剂的浓度为2～5g/L，静置60min；

说明：1、发明中应用到的：酪蛋白的来源(甘肃干酪素总厂购买)2、制备方法中使用的絮凝剂不是特制产品，可以从任何絮凝剂生产公司购买。

为验证本发明中絮凝剂在酪蛋白糖巨肽分离纯化中的效果，特进行如下验证试验：

验证试验1：絮凝前后酪蛋白糖巨肽的鉴定及损失量鉴定试验

参见张惟杰，糖复合物生化研究技术，pp.455-456中所述的间苯二酚-盐酸法进行酪蛋白糖巨肽的特性组分-唾液酸鉴定，以唾液酸含量的变化来表征酪蛋白糖巨肽的变化。具体试验如下：2％间苯二酚溶液，0.1mol/l硫酸铜的水溶液0.25ml，浓盐酸80mL，加水至100ml混均置室温，4h后储于4℃，此工作液呈黄色或绿色；分别取絮凝前后溶液2ml，加间苯二酚试剂工作液2ml；试管加盖于100℃沸水浴15min，快速冷却；加醋酸正丁醇酯-正丁醇(85∶14)4ml，振荡提取后在37℃下水浴15min，取上层有机相，测定其在580nm波长下的吸光度；以水为阴性对照，以CGMP标准品(CGMP-10，丹麦Arla食品公司)为阳性对照，结果见图1，图2。

图1中五只试管由左到右分别为絮凝前、硫酸铝钾絮凝、硫酸铝絮凝、壳聚糖絮凝、CGMP标准品、水，CGMP中唾液酸经间苯二酚-盐酸法检测，上层有机相显为蓝紫色，此为唾液酸特征颜色，并且絮凝后样品与CGMP标准品所显颜色一致，说明絮凝后上清液中含有CGMP。同时絮凝后样品和絮凝前样品所显颜色差别不大，说明絮凝前后样品中CGMP的含量变化不大。

验证试验2：絮凝前后目标溶液中的絮凝效果及蛋白含量的变化鉴定

取10mL目标溶液，添加一定浓度的絮凝剂，搅拌使絮凝剂分散均匀，静置30min，其絮凝效果见图3。

参见栾雨时，包永明，生物工程实验技术手册(2005版)pp.111-121中考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量。具体试验如下：考马斯亮蓝G-250染液，100mg考马斯亮蓝G-250，50mL(95％)乙醇，100mL 85％(w/v)磷酸，加水至1000mL室温混匀备用。取样品液1mL于试管内，再加入G-250染色液5mL混匀，测其595nm下的吸光值。结果见图4。

试验结果表明本发明中絮凝剂在酪蛋白糖巨肽的分离纯化中能过起到较好的絮凝效果。

Claims

1.一种酪蛋白糖巨肽分离纯化方法，其特征在于：在分离纯化CGMP中，利用絮凝剂去除杂蛋白等。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于：利用絮凝剂来移除杂蛋白等。

3.根据权利要求1所述的絮凝剂，其特征包括：絮凝剂：硫酸铝，硫酸铝钾，壳聚糖，海藻酸钠等。

4.根据权利要求3所述的絮凝剂，其特征包括：利用任意一种絮凝剂或任意比例絮凝剂的复配，进行杂蛋白等的絮凝移除。

5.一种去权利要求1所述的酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法，其特征在于：制备步骤如下：

(1)含CGMP的目标溶液，调整pH为3～10，加入絮凝剂，使絮凝剂的浓度为0.1～15mg/mL。搅拌均匀，20～40℃静置20～120min。

(2)离心收集上清液旋转蒸发浓缩，冻干收集得到酪蛋白糖巨肽粗品；

6.根据权利要求5所述的酪蛋白糖巨肽的分离纯化方法，其特征在于：所述絮凝剂的添加量在0.1～15mg/mL。