CN102031282B - 即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法 - Google Patents

即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102031282B
CN102031282B CN2010105503757A CN201010550375A CN102031282B CN 102031282 B CN102031282 B CN 102031282B CN 2010105503757 A CN2010105503757 A CN 2010105503757A CN 201010550375 A CN201010550375 A CN 201010550375A CN 102031282 B CN102031282 B CN 102031282B
Authority
CN
China
Prior art keywords
salmonella
specificity
ppm
peptone
zero
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2010105503757A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102031282A (zh
Inventor
许学斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTRE
Original Assignee
SHANGHAI DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTRE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTRE filed Critical SHANGHAI DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTRE
Priority to CN2010105503757A priority Critical patent/CN102031282B/zh
Publication of CN102031282A publication Critical patent/CN102031282A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102031282B publication Critical patent/CN102031282B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及肠道病原菌中沙门菌的特异性酶-底物表型和血清分型同步进行的鉴定方法，主要解决现有沙门菌鉴定步骤繁复且成本较高、抗原诱导或培养材料不统一导致的血清鉴定结果偏倚、报告时间拖沓筛等技术难题。即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒，包括：1）沙门菌特异性酶-底物筛选培养基，2）针对沙门菌特异性“O”相抗原生长的选择性培养基，3）针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基。本发明利用酶-反应底物产生的典型菌落形态和同时针对沙门菌“O”“H”抗原进行培养从而利于沙门菌血清型鉴定。

Description

即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法
技术领域
本发明涉及肠道病原菌中沙门菌的特异性酶-底物表型和血清分型同步进行的鉴定方法，特别涉及利用酶-反应底物产生的典型菌落形态和同时针对沙门菌“O”“H”抗原进行培养从而利于沙门菌血清型鉴定的组合的试剂盒和使用方法。
背景技术
现阶段使用的沙门菌生化表型和血清表型鉴定的方法要求繁琐、敏感性和特异性低，对疑似菌落鉴定所用自动化生化反应试剂材料的费用昂贵。中国专利申请200810047994.7公开了“一种同时快速检测沙门菌和志贺菌的方法”，该发明属于食源性致病菌的快速检测技术，具体说是一种对沙门菌和志贺菌同时进行检测的环介导等温DNA扩增（LOOP-MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION，LAMP）检测方法。包括由样品处理试剂、LAMP反应试剂、BST DNA聚合酶的大片段、琼脂糖、溴酚蓝上样缓冲溶液、溴化乙锭溶液组成的试剂的配制，以及扩增产物的检测和沉淀产生的检测程序。其步骤是：首先设计特异性引物；其次是提取样品DNA；第三是配制反应体系。该法较之目前采用的传统细菌培养方法、免疫检测方法和其它分子生物学方法具有操作简单、快速且灵敏特异的优点。可应用于食品和其它样品中沙门菌和志贺菌的同时快速检测。但是该方法筛选病原菌还存在一定局限性，即筛选到的阳性结果可能无法通过细菌学方法分离到；也可能因为存在死菌而获得假阳性结果；另外，需设计特异性引物及提取DNA步骤较为复杂，筛选结果判断还不够直观。本发明是基于利用沙门菌特异性酶-底物反应产生的典型菌落形态和同时针对沙门菌“O”“H”抗原进行培养从而利于沙门菌血清型鉴定的试剂盒和筛选方法，较之现阶段使用的传统分离平板和鉴定技术单纯依赖生化鉴定为主的方法更具有综合成本低、操作简单、快速、无需依赖特殊仪器且有特异性、准确性及阳性预期值高的优点，而且能大大简化传统的沙门菌血清分型的流程，缩短鉴定时间，有利于血清分型方法的标准化流程的建立和应用。适用临床医疗、出入境检验检疫、畜牧兽医、食品卫生、疾病预防控制及相关实验室开展沙门菌血清型的双相抗原的同步鉴定和沙门菌特异性酶-底物反应鉴定。更在原理设计、操作人员与实验室要求方面和分子生物学方法有本质的区别，且使用针对性更强，所以与中国专利申请200810047994.7不存在相似性与可比性。
发明内容
本发明的目的是公开一种即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法。主要解决现有沙门菌鉴定步骤繁复且成本较高、抗原诱导或培养材料不统一导致的血清鉴定结果偏倚、报告时间拖沓筛等技术难题。本发明用1种同时预制有沙门菌特异性酶-底物、沙门菌特异性“O”相抗原生长、特异性“H”相抗原生长的选择性培养基的组合平板，使用一步接种-培养法达到能同时观察沙门菌特异性酶-低物反应并同时进行双相抗原的血清型鉴定，达到对沙门菌简易鉴定、快速分型的效果。
本发明的技术方案为：即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒，包括：
沙门菌特异性酶-底物筛选培养基：成分：琼脂17.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠5.0g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸盐250mg，磺胺吡啶0.5g，蒸馏水1000ml。沙门菌特异性酶-底物筛选培养基的配制：取琼脂粉17.0克、胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉3.0g、氯化钠5.0g置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于4mlTris.HCl（pH8.0），称取辛酸盐250mg溶解于4ml蒸馏水中，再称取磺胺吡啶0.5g溶解于2ml0.01摩尔浓度NaOH中，待加热培养基冷却至50℃一并加入后混匀，调整pH至7.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。倾注1ml于专用无菌一次性平板的“B”位置，备用。
针对沙门菌特异性“O”相抗原生长的选择性培养基：成分：胰化酪蛋白胨12.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.5g，淀粉1.0g，氯化钠5.0g，琼脂14.0g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.1±0.1（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后倾注6ml于专用无菌一次性平板的“C”位置，备用。
针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基：成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，去氧胆酸盐0.3g，琼脂6.0g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅压力15分钟（121℃）灭菌后倾注6ml于专用无菌一次性平板的“A”位置，备用。
本发明的有益效果是：改进传统的沙门菌抗原诱导的血清鉴定流程，使用标准化的配方培养基对沙门菌的两相抗原进行针对性的培养，有利于减少操作者个体和不同品牌的沙门菌分型血清之间的随机误差，缩短鉴定报告时间，并创造性的将沙门菌特异性酶-底物培养基整合进去，达到同时对酶生化表型和双相血清同步进行的鉴定效果，避免了肠杆菌科中生化特征和抗原性与沙门菌特别涉及利用酶-反应底物产生的典型菌落形态和同时针对沙门菌“O”、“H”抗原进行培养从而利于沙门菌血清型鉴定的组合的试剂盒和使用方法。主要解决现有沙门菌鉴定步骤繁复且成本较高、抗原诱导或培养材料不统一导致的血清鉴定结果偏倚、报告时间拖沓筛等技术难题，达到对沙门菌简易鉴定、快速分型的效果。同时，操作过程简便也极大提高了单位时间的工作效率，使操作者更易掌握和接受，减少试验过程中人为因素造成的个体差异。
附图说明
图1为本发明试剂盒结构示意图
图中：1-针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基；2-沙门菌特异性酶-底物筛选培养基；3-针对沙门菌特异性“O”相抗原生长的选择性培养基。
具体实施方式
参照附图1，无菌一次性平板为环形容器，分成外环和内环，内环有S形隔断。即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒，包括：
沙门菌特异性酶-底物筛选培养基2：成分：琼脂17.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠5.0g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸盐250mg，磺胺吡啶0.5g，蒸馏水1000ml。沙门菌特异性酶-底物筛选培养基的配制：取琼脂粉17.0克、胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉3.0g、氯化钠5.0g置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于4mlTris.HCl（pH8.0），称取辛酸盐250mg溶解于4ml蒸馏水中，再称取磺胺吡啶0.5g溶解于2ml0.01摩尔浓度NaOH中，待加热培养基冷却至50℃一并加入后混匀，调整pH至7.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。倾注1ml于专用无菌一次性平板的内环S形隔断一侧“B”位置，备用。
针对沙门菌特异性“O”相抗原生长的选择性培养基3：成分：胰化酪蛋白胨12.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.5g，淀粉1.0g，氯化钠5.0g，琼脂14.0g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.1±0.1（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅15分钟（121℃）灭菌后倾注6ml于上述专用无菌一次性平板的内环S形隔断另一侧“C”位置，备用。
针对沙门菌特异性“H” 相抗原生长的选择性培养基1：成分：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，去氧胆酸盐0.3g，琼脂6.0g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2（按冷却至25℃后测量值为标准）。经15磅压力15分钟（121℃）灭菌后倾注6ml于上述专用无菌一次性平板的外环内“A”位置，备用。
即用型多功能沙门菌鉴定平板使用方法：
疑似沙门菌培养物分别接种于即用型多功能沙门菌鉴定平板“A”、“B”、“C”三个区域，36℃培养18-24h后，所有的沙门菌（包括伤寒沙门菌与非伤寒沙门菌）在B区域均呈现为中等大小、湿润、边缘光滑的酒红色菌落；C区域为白色培养物；A区域为蔓延生长培养物，如果连续3代（次）培养未见蔓延生长者考虑报告为沙门菌某一单相菌变种。
血清分型鉴定方法：挑取C区域的培养物进行“O”相因子血清的玻片凝集反应鉴定特异性O抗原；挑取A区域的边缘培养物进行“H”因子相血清的玻片凝集反应鉴定特异性H1和H2抗原。根据抗原鉴定的结果报告沙门菌分型结果。根据上海市疾病预防控制中心微生物实验室许学斌等使用来自临床腹泻株、食品株和环境株共计1078株沙门菌，分别比较使用即用型多功能沙门菌鉴定平板和传统手工配置平板的H相位诱导方法的分型结果：99%的菌株经过即用型多功能沙门菌鉴定平板培养3代后均能得到明确的血清型结果；而传统方法前3代培养仅能得到83%的血清型结果。见表1。
表1 即用型多功能沙门菌鉴定平板和传统方法鉴定沙门菌（1078株）结果比较
Figure 2010105503757100002DEST_PATH_IMAGE001
传统方法经过5代培养以后仍有51株没有鉴定出血清型，需要继续进行诱导。

Claims (2)

1.即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒，其特征是包括：
1）、沙门菌特异性酶-底物筛选培养基：琼脂17.0g，胰化酪蛋白胨10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸出物3.0g，氯化钠5.0g，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg，辛酸盐250mg，磺胺吡啶0.5g，蒸馏水1000ml；
2）、针对沙门菌特异性“O” 相抗原生长的选择性培养基：胰化酪蛋白胨12.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.5g，淀粉1.0g，氯化钠5.0g，琼脂14.0g，蒸馏水1000ml；
3）、针对沙门菌特异性“H” 相抗原生长的选择性培养基：胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，去氧胆酸盐0.3g，琼脂6.0g，蒸馏水1000ml。
2.即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒的制备方法，其特征是：包括以下步骤
1）、沙门菌特异性酶-底物筛选培养基制备：取琼脂粉17.0克、胰化酪蛋白胨10.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉3.0g、氯化钠5.0g置990ml蒸馏水中加热溶解煮沸2次后，称取5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于4mlTris.HCl，pH8.0；称取辛酸盐250mg溶解于4ml蒸馏水中，再称取磺胺吡啶0.5g溶解于2ml0.01摩尔浓度NaOH中，待加热培养基冷却至50℃一并加入后混匀，调整pH至7.2，按冷却至25℃后测量值为标准，倾注1ml于专用无菌一次性平板的内环S形隔断一侧备用；
2）、针对沙门菌特异性“O”相抗原生长的选择性培养基制备：将胰化酪蛋白胨12.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.5g，淀粉1.0g，氯化钠5.0g，琼脂14.0g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.1±0.1，经加热加压灭菌后倾注6ml于上述专用无菌一次性平板的内环S形隔断另一侧备用；
3）、针对沙门菌特异性“H”相抗原生长的选择性培养基制备：将胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3.0g，氯化钠5.0g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖2.5g，去氧胆酸盐0.3g，琼脂6.0g，蒸馏水1000ml，加热溶解后矫正pH至7.3±0.2，经加热加压灭菌后倾注6ml于上述专用无菌一次性平板的外环内备用。
CN2010105503757A 2010-11-19 2010-11-19 即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法 Expired - Fee Related CN102031282B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010105503757A CN102031282B (zh) 2010-11-19 2010-11-19 即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2010105503757A CN102031282B (zh) 2010-11-19 2010-11-19 即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102031282A CN102031282A (zh) 2011-04-27
CN102031282B true CN102031282B (zh) 2012-07-25

Family

ID=43884734

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010105503757A Expired - Fee Related CN102031282B (zh) 2010-11-19 2010-11-19 即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102031282B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102796801A (zh) * 2012-08-01 2012-11-28 上海市疾病预防控制中心 沙门菌分离、鉴定的试剂盒、制备和应用
CN106226536B (zh) * 2016-08-01 2017-11-10 福建省产品质量检验研究院 一种沙门氏菌h抗原的位相变异试验方法
CN109679862A (zh) * 2018-12-10 2019-04-26 赵嘉咏 一种沙门菌h抗原诱导组合物、软琼脂及其制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101186891A (zh) * 2007-12-21 2008-05-28 广东环凯微生物科技有限公司 沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101186891A (zh) * 2007-12-21 2008-05-28 广东环凯微生物科技有限公司 沙门氏菌显色培养基、检测试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
nenbrücher, er al..A comparison of standard cultural methods for the detection of foodborne Salmonella species including three new chromogenic plating media.《International Journal of Food Microbiology》.2008,第123卷61-66.
Vanessa Sch&ouml
Vanessa Schönenbrücher, er al..A comparison of standard cultural methods for the detection of foodborne Salmonella species including three new chromogenic plating media.《International Journal of Food Microbiology》.2008,第123卷61-66. *
句立言 等.大肠菌群检测技术研究进展.《中国初级卫生保健》.2008,第22卷(第5期),55-56. *
许学斌 等.沙门菌检测方法的优化.《检验医学》.2007,第22卷(第6期),677-680. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102031282A (zh) 2011-04-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102102124B (zh) 伤寒、副伤寒沙门菌多重荧光pcr检测试剂盒
US20230183817A1 (en) Crispr-based assay for detecting pathogens in samples
CN106190998B (zh) 一种提高淀粉分支酶活力的方法
CN103243166B (zh) 一种葡萄霜霉病菌的快速分子检测方法与应用
CN106520923B (zh) 同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒及方法
CN102031282B (zh) 即用型沙门菌鉴定平板的试剂盒、制备及使用方法
CN103421898A (zh) 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌三重实时荧光pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法
CN104232784A (zh) 一种牛肉中三种主要致病菌多重pcr检测方法
WO2020136595A1 (en) Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method
CN103276103A (zh) 检测猪流行性腹泻病毒的rt-lamp核酸试纸条试剂盒及应用
CN108048582A (zh) 一种利用lamp引物组定量快速检测原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌方法
JP2011509680A5 (zh)
CN103305623A (zh) 二种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒
CN104152546A (zh) 一种同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的试剂盒和方法
EP1733048A4 (en) DETECTION OF NEISSERIA GONORRHOEAE
CN101748206B (zh) 小麦条锈菌与叶锈菌的复合pcr检测鉴定试剂盒
CN102676653A (zh) 一种双重TaqMan探针荧光RT-PCR检测O1群和O139群霍乱弧菌的非诊断性方法
CN110079622A (zh) 基于lamp法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒
CN102747148A (zh) 副溶血性弧菌检测用引物组及方法
CN109811073A (zh) 双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
CN110004145A (zh) 一种sgRNA、敲除载体、KLF4基因的敲除方法及其应用
CN102827930B (zh) 建立幽门螺杆菌核酸指纹图谱的方法及其产品
CN103060431A (zh) 基于16S rDNA的细菌核酸指纹特征谱的制备方法及其用途
CN106282392A (zh) 一种肠炎沙门氏菌pcr检测引物、检测试剂盒及检测方法
CN106148483A (zh) 检测大肠杆菌细胞dna的引物及方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120725

Termination date: 20211119