CN104402993A - 一种制备静注人免疫球蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备静注人免疫球蛋白的方法，它包括如下步骤：a、溶解：取Cohn法F Ⅱ沉淀，溶于注射用水中，澄清过滤，调节pH为6.60±0.1，搅匀，调节电导率为1.40±0.05ms/cm，调节温度为0～5℃，搅匀；b、层析：用DEAE Sepharose Fast Flow的层析柱纯化，收集人免疫球蛋白组份液；c、超滤：将步骤b的流穿液超滤并透析，至渗透压低于30mOsmol/kg时，浓缩，浓缩至蛋白浓度4.0％±1％(w/v)，得浓缩液；d、病毒灭活：在浓缩液中添加山梨醇至浓度为(33±1)％(w/v)，调整pH至5.00±0.1，在60℃±0.5℃下恒温10小时，冷却，澄清过滤；e、超滤，透析，配制，即可。本发明方法制备的静注人免疫球蛋白纯度高，Fc段生物学活性高，品质好，IgA等杂质因子含量低，副作用小，得率高，具有良好的市场应用前景。

Description

一种制备静注人免疫球蛋白的方法

技术领域

本发明属于血液制品领域，具体涉及一种制备静注人免疫球蛋白的方法。

背景技术

静注人免疫球蛋白(pH4，以下简称IVIG)是由健康人血浆经低温乙醇蛋白分离法提取的免疫球蛋白组分，经深加工和病毒灭活等步骤精制而成。IVIG具有免疫替代和免疫调节的双重治疗作用，临床使用广泛，在原发性或获得性免疫球蛋白缺陷症、细菌感染、病毒感染、血液系统疾病、川崎病等的治疗中有显著的效果。

为了保证IVIG临床治疗疗效,对其进行严格的质量控制非常重要，欧洲、美国以及我国的药典都对IVIG的质量控制有相应的规定。IVIG的质量控制标准包括以下几点:主要成分应为IgG，其纯度应不低于蛋白总量的95.0％,且IgG亚类应齐全，其含量与正常人血清lgG亚类分布相近；IVIG制品应尽可能不含IgA、IgE等非IgG免疫球蛋白成分，其中，IgA会导致先天性选择性IgA缺乏症出现过敏反应，其含量应当越少越好；保证抗体的生物活性、高滴度以及高效性；此外还应保证制品的病毒安全性。

目前，静注人免疫球蛋白的分离方法基本都采用低温乙醇工艺。1940s，美国哈佛大学的E.J.Cohn教授发明了低温乙醇分离血浆蛋白的工艺，其后，Nistchmann和Kistler等人在Cohn氏低温乙醇法的基础上进行了改进，提出了改良的低温乙醇分离血浆蛋白方法，简化了步骤，缩短了生产周期。然而，目前的低温乙醇工艺制备的免疫球蛋白制剂中IgA的含量相对较高，先天性选择性IgA缺乏症患者输注后易发生不良反应，需要进行改进，如公开号为CN102532307A的专利申请文件中公开的方法，制备得到的人免疫球蛋白制品的IgA含量平均为15.03μg/ml。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的制备静注人免疫球蛋白的方法。

本发明制备静注人免疫球蛋白的方法，它包括如下步骤：

a、溶解：取Cohn法FⅡ沉淀，溶于注射用水中，澄清过滤，调节pH为6.60±0.1，搅匀，调节电导率为1.40±0.05ms/cm，调节温度为0～5.0℃，搅匀；

b、层析：用DEAE Sepharose Fast Flow的层析柱纯化，收集人免疫球蛋白组份液；

c、超滤：将步骤b的人免疫球蛋白组份液超滤并透析，至渗透压低于30mOsmol/kg时，浓缩，浓缩至蛋白浓度4.0％±1％(w/v)，得浓缩液；

d、病毒灭活：在浓缩液中添加山梨醇至浓度为(33±1)％(w/v)，调整pH至5.00±0.1，在60℃±0.5℃下恒温10小时，冷却，澄清过滤；

e、超滤，透析，配制，即可。

步骤a中，所述Cohn法FⅡ沉淀采用如下方法制备：

(1)取Cohn法FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀，与0.01mol/L氯化钠溶液混匀，得离子强度为0.015、蛋白浓度为0.8～1.2％的悬浊液；

(2)第一次低温乙醇沉淀：取步骤(1)的悬浊液，调pH为5.00～5.20，添加乙醇至浓度为15％～18％(v/v)，冷却至温度为-4.0～-6.0℃，测定pH，若pH不在5.00～5.20范围，补调至5.00～5.20，搅拌3h以上，静置3h以上，添加助滤剂，搅拌，压滤，收集FⅠ+Ⅲ上清；其中助滤剂的加入量为FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的2％(w/w)；

(3)第二次低温乙醇沉淀：取FⅠ+Ⅲ上清，调节离子强度至0.05，调pH为7.10～7.40，添加乙醇至浓度23～25％(v/v)，调节温度为-9.0℃～-11.0℃，搅拌3小时，静置3小时以上，添加助滤剂，搅拌，压滤，得FⅡ沉淀；其中助滤剂的加入量为FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的0.5％(w/w)。

步骤(1)中，所述氯化钠溶液的用量为FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的9～12倍(w/w)；；所述混匀是在-1.0～2.0℃条件下混匀。

步骤(2)中，在悬浊液温度为0～-4.0℃条件下添加乙醇；乙醇添加速率低于1L/min。

步骤(2)中，在压滤之前，用淋洗液与助滤剂进行预铺，吹流；其中，淋洗液的用量是FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的2.5倍(v/w)，每1000L淋洗液由如下配比的成分组成：注射用水：821L、NaCl：878g、乙醇(95％)：179L。

步骤(2)或(3)中，所述助滤剂为硅藻土；所述压滤的使用压力为1.0～1.5kg/cm²，出液温度控制在-3.0～-5.0℃。

步骤(3)中，调节pH时，FⅠ+Ⅲ上清的温度维持在-4.0～-6.0℃；添加乙醇时，FⅠ+Ⅲ上清的温度维持在-7.0～-9.0℃，乙醇添加速率低于1L/min。

步骤a中，FⅡ沉淀溶于注射用水时，液温维持在0～5.0℃；澄清过滤时，采用装配了A-80滤芯的ALSOP滤器过滤；出液温度控制在0～5.0℃。

所述步骤b包括如下步骤：

ⅰ、用pH6.6±0.1磷酸盐缓冲液平衡层析柱，调节样品pH为5.00±0.1，上样，流速控制为2.00±0.50L/min，收集流穿液；

ⅱ、上样结束后，用pH6.6±0.1磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液用量为柱体积的1.0～1.5倍，收集洗脱液；

ⅲ、合并步骤ⅰ的流穿液和步骤ⅱ的洗脱液，即为静注人免疫球蛋白组份液。

步骤c中，超滤时，使用压力为2～3kgf/cm²，液温控制在0～5.0℃；所述透析采用的透析液为注射用水。

步骤d中，冷却至温度低于10℃后，采用装配了A-80滤芯的ALSOP滤器进行澄清过滤。

本发明还提供了前述方法制备的静注人免疫球蛋白。

名词解释：

澄清过滤：将液体中的颗粒和悬浮物截留在滤膜上，透出的液体澄清透亮，一般采用孔径0.65um或1um；

预铺：在过滤前，用含过滤剂(如硅藻土)的液体预先过滤一下，在滤板的表面形成滤饼，增加过滤效率；

吹流：过滤结束后，用压缩空气将残留在里面的液体吹出来；

压滤：就是深层过滤，是分离的一种方式，将悬浮液中的固体和液体分离。

离子强度：衡量溶液中存在离子所产生的电场强度的量度。

综上，本发明方法制备的静注人免疫球蛋白纯度高，Fc段生物学活性高，品质好，IgA等杂质因子含量低，副作用小，得率高，具有良好的市场应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1用本发明制备静注人免疫球蛋白的生产方法

1、实验材料

Cohn法组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅱ沉淀(FⅠ+Ⅱ+Ⅱ)，按照《医学生物制品学》(人民卫生出版社)，第二版，1194页记载的低温乙醇沉淀法制备。

2、实验方法

如下方法中，涉及搅拌的步骤，搅拌频率均为70～90rpm/min，搅拌的目的均是使溶液充分混匀。

2.1Cohn法组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅱ沉淀(FⅠ+Ⅱ+Ⅱ沉淀)的确认

2.1.1所使用FⅠ+Ⅱ+Ⅱ沉淀的原生产血浆应符合《中国药典》有关血液制品生产用人血浆规程的规定.

2.1.2操作开始前,确认被指定的FⅠ+Ⅱ+Ⅱ沉淀的批号和重量及有效期。

2.2FⅠ+Ⅱ+Ⅱ的悬浊

2.2.1FⅠ+Ⅱ+Ⅱ沉淀添加到准备好的悬浊用0.01mol/L的氯化钠溶液中，悬浊比例为1kg组份Ⅱ+Ⅱ沉淀配9～12kg的0.01mol/L氯化钠溶液(用注射用水配制0.01mol/L的氯化钠溶液)，至悬浊液的离子强度为0.015，蛋白浓度0.8～1.2％。

2.2.2搅拌3小时以上，使其完全悬浊(取样观察是否完全溶解)。

2.2.3悬浊时，调整循环冷媒，在不致冻的情况下，使液温保持在-1～+2℃。

2.2.4充分搅拌后，从罐的底阀接出悬浊液，检查是否充分悬浊。

2.3FⅠ+Ⅱ的反应(第一次低温乙醇沉淀)

反应的条件pH：5.00～5.20 温度：-4.0～-6.0℃ 乙醇：15～18％离子强度：0.015 蛋白浓度：0.8～1.2％

2.3.1pH调整,取1L悬浊液用pH4.0的醋缓滴定pH至5.00～5.20,根据滴定量计算需添加的试剂量.

2.3.2pH4.0的醋缓添加，以低于50ml/min的速度添加。

2.3.3添加完后，搅拌30分钟以上，测定pH，如果pH不在5.00～5.20范围内，则用醋酸钠缓冲液或1mol/L NaHCO₃补调。

2.3.4确认总液量.

2.3.5乙醇的添加

举例：如控制乙醇浓度为17％，计算公式为：乙醇量(L)＝(2.3.4中的总液量)×17÷(95-17),把计算出的乙醇量，以低于1L/min的速度添加。

2.3.6添加时，用循环冷媒使液温维持在0～-4.0℃，添加完后慢慢冷却，使液温控制到-4.0～-6.0℃。

2.3.7乙醇量的100％添加完后，取出样品，复测pH。

2.3.8此时如果pH不在5.00～5.20内，则用pH4.0醋酸钠缓冲液或1mol/L NaHCO₃补调。

2.3.9pH符合条件时，搅拌3小时，静置3～5小时，过滤前按每100KgFⅠ+Ⅱ+Ⅱ添加2Kg硅藻土，搅拌半小时。

2.4组份Ⅰ+Ⅱ的压滤

2.4.1每100Kg FⅠ+Ⅱ+Ⅱ组装8～10对框架,每个框架组装两枚EKS50或50SP滤板。

2.4.2进行过滤之前，用下列成份的淋洗液添加2kg硅藻土后进行预铺(预过滤)。每100Kg FⅠ+Ⅱ+Ⅱ配250L淋洗液.以下是1000L淋洗液的配制方法举例:

注射用水：821L NaCl：878g乙醇(95％)：179L pH：5.10～5.30液温：-4.0～-6.0℃

2.4.3进行预铺的淋洗液,返回到淋洗液配制罐里循环。进行30分钟循环后，再进行30分钟吹流(用0.2～0.4MPa的洁净压缩空气吹)来收集回收液；把液温调整到-6.0℃，用于压滤后淋洗。

2.4.4搅拌沉淀Ⅰ+Ⅱ，同时进行压滤，通常使用1.0～1.5kg/cm²的压缩空气驱动气动隔膜泵,并且压力不超过2.0kg/cm²，出液温度控制在-3.0～-5.0℃。

2.4.5随时检查过滤的程度，并在过滤结束后，进行30分钟的吹流；吹流完时，再用淋洗液通过一遍来回收有效成份一并收集到上清液中。

2.4.6淋洗液过滤结束后，进行30分钟吹流，测定并记录滤液的温度和液量，进入分离组份Ⅱ操作。

2.4.7组份Ⅰ+Ⅱ的固形物回收后记录重量，然后灭菌废弃。

2.5组份Ⅱ的反应(第二次低温乙醇沉淀)

反应的条件：pH：7.10～7.40 温度：-9.0～-11.0℃ 乙醇：23～25％离子强度：0.05 蛋白浓度：0.5～0.8％

2.5.1以每升Ⅰ+Ⅱ上清滤液添加3mol/L NaCl溶液17ml，调节离子强度为0.05

2.5.2用1mol/L NaHCO₃进行滴定pH调到7.10～7.40(1升1mol/LNaHCO₃配制方法：将84g NaHCO₃，溶解在注射用水里制成1L溶液)。

2.5.3把调制成的1mol/L NaHCO₃的总量以低于0.3L/min速度添加，此时调整循环冷媒，使液温保持-4.0～-6.0℃。

2.5.4添加完后，搅拌30分钟，取样测定pH，如果pH不在7.10～7.40内，则用醋酸钠缓冲液或1mol/L NaHCO₃补调。符合条件后，测定并记录液量和pH。

2.5.5添加乙醇

添加乙醇之前，查看一下添加泵的运行情况。

2.5.6按下述方法，计算出需要添加乙醇的量(使用-15℃以下的95％乙醇)。

举例：如反应液乙醇浓度按25％添加，计算方法为：乙醇量(L)＝滤液3量(L)×(8÷70)+(3mol/L氯化钠量+1mol/L碳酸氢钠量)×(25÷70)，式中8＝25％－17％；70＝95％－25％。

把计算好的乙醇，以低于1L/min速度添加。

2.5.7添加中，使液温保持在-7.0～-9.0℃，用循环冷媒来慢慢冷却，全部添加完后，取出样品，复测pH并记录。

2.5.8把液温调整至-9.0～-11.0℃后，搅拌3小时，静置3～5小时，然后进行组份Ⅱ压滤。

2.6组份Ⅱ压滤

2.6.1所用板框数，通常是100Kg FⅠ+Ⅱ+Ⅱ使用3～5对板框，每对板框组装两枚EKS50或50SP滤板。

过滤时，按100Kg FⅠ+Ⅱ+Ⅱ加0.5Kg硅藻土到反应液中。

2.6.2进行过滤(不搅拌状态)，通常使用压力为1.0～1.5kg/cm²的压缩空气，不可超过2.0kg/cm²，出液温度控制在-7.0～-10.0℃。

2.6.3随时检查过滤进行情况，过滤完后20分钟循环。循环结束后，吹流30分钟。

2.6.4过滤结束的FⅡ沉淀用清洗干净的药用塑料袋包装好，记录批号、重量及有效期，放于-30℃以下冷库保存。

2.7组份Ⅱ的溶解

2.7.1在-30℃冷库里保管的组份Ⅱ中，选取即将使用的组份Ⅱ，确认其重量及有效期和批号，把批号和重量记录在“操作记录书”上。

2.7.2根据下列计算式准备溶解液

冷注射用水(L)＝组份II的重量(kg)×6L/kg。

溶解液收集完成后进行内毒素测试，确认测试结果合格后,用冷媒调整溶解液温度在0～5.0℃。

2.7.3把准备使用的组份Ⅱ添加到溶解液中，添加后，使液温保持0～5.0℃，进行搅拌到组份Ⅱ完全溶解为止。

2.8澄清过滤

2.8.1确认完全溶解后，进行澄清过滤，用装配了ALSOP A-80的过滤器进行过滤，(A-80的组装：把A-80滤芯组装在ALSOP滤器上，先用热注射用水冲洗，再试用一下，确认无异常后放置于2～5℃库冷却后使用)，过滤出液温度控制在0～5.0℃,澄清过滤结束后，用淋洗液(100L透析液)通过一遍来回收有效成分。

2.8.2用0.25mol/L HCl溶液来调整pH6.60±0.1，缓慢添加，以便最大限度地减少蛋白变性，试剂添加完后要充分搅拌30分钟以上再测pH。

2.8.3用5％NaCl或注射用水调整电导率为1.40±0.05ms/cm(检测温度：20℃)。调整完后充分搅拌30分钟以上进行检测。

2.9层析

2.9.1用1.5～2.0倍体积的0.5mol/L NaOH溶液清洗凝胶DEAESepharose Fast Flow的层析柱，流速为1.50±0.50L/min。

2.9.2用1.5～2.0倍体积的pH4.00醋酸缓冲液清洗层析柱。

2.9.3用13～14倍体积的pH6.6±0.1磷酸盐缓冲液平衡层析柱。

2.9.4将调制好的制品上样过层析柱，观察记录仪层析图谱，收集人免疫球蛋白组份，流速控制为2.00±0.50L/min，层析过程中，搅拌状态下滴加0.25mol/L HCl，使制品pH维持在5.00±0.10。

2.9.5制品上柱结束后用pH6.60±0.1磷酸盐缓冲液洗脱，用量为1.0～1.5倍柱床体积，洗液一并打入收集的人免疫球蛋白组份液，记录制品总体积。

2.9.6用1.5～2.0倍柱床体积的含0.3mol/L NaCl的pH4.00醋酸盐缓冲液洗脱层析柱吸附的杂蛋白，后用2mol/L氯化钠溶液清洗,再用1.0～1.5倍柱床体积的0.5mol/L NaOH清洗层析柱。

2.9.7用1.5～2.0倍柱床体积的pH4.00醋酸盐缓冲液清洗层析柱后保存。

2.10超滤

2.10.1将浸渍超滤机的NaOH溶液排放掉，用注射用水充分洗涤至热原合格。

2.10.2准备2.0～5.0℃注射用水做透析液。

2.10.3原液的预浓缩超滤膜使用pellicon 2NMWL 50KD，以投入1㎏组份Ⅱ，浓缩液量为5L为基准，在浓缩过程中，用10％三氯醋酸溶液检查滤液中有无蛋白泄漏。

2.10.4一边超滤，一边添加透析液，此时，用于超滤泵的使用压力为2～3㎏/cm²，在超滤过程中，液温控制在0～5.0℃，每30分钟取一次滤出液测定渗透压。

2.10.5透析至渗透压测定结果低于30mOsmol/kg时，开始浓缩，浓缩至蛋白浓度4.0％±1％，浓缩完成后，用透析液顶出超滤机内残液，清洗超滤机后用0.1mol/L NaOH溶液保存。

2.11病毒灭活

2.11.1病毒灭活是使用山梨醇作为保护剂，添加比例为---浓缩液量：山梨醇＝2:1，添加完山梨醇浓度为33％±1％。添加完后，搅拌30分钟以上，取出样品，确认是否完全溶解。用0.25mol/L NaOH调整pH至5.00±0.10。

2.11.2检查病毒灭活装置有无异常，用热注射用水加入恒温槽内循环，恒温槽和灭活罐的温度调节装置分别设定为60.5℃和59.5℃，且把计时器设定为10小时。把添加了保护剂的液体送到灭活罐后，一边进行搅拌一边用恒温槽内的循环液给灭活罐的夹层循环，使罐内液温保持在60℃±0.5℃。液温达到59.5℃时,检查计时器是否启动并开始计时,确认一下恒温槽内加热器是否工作在控制状态，在60℃±0.5℃下恒温10小时，将病毒灭活。每60分钟确认一次温度，并检查整个系统工作是否正常,到10小时后，确认是否有报警声响，系统停止工作。灭活完之后，放掉灭活罐夹层内的温水，用自来水循环，使罐内液温冷却到30℃，冷却到30℃后，改用循环冷媒冷却到10℃以下。

2.12澄清过滤时，使用ALSOP A-80滤芯，把滤芯组装到滤器上，用热注射用水洗涤，置2.0～5.0℃冷却后使用，过滤时使用的压缩空气为0.5～1.5㎏/cm²，过滤后用压缩空气吹流，把过滤机内的残液完全回收，滤液转移到超滤罐，进入下一工序。

2.13超滤

2.13.1透析液的准备，用注射用水，冷却至0～5.0℃，使用0.45/0.22μm滤芯过滤后用。

2.13.2将澄清过滤后的滤液进行浓缩，使用超滤膜为Pellicon 2NMWAL 50KD，使用前把NaOH浸渍液放掉，并用注射用水彻底冲洗，原液预浓缩(浓缩基准量为组份II(㎏)×3.5L/㎏)后，加入透析液进行超滤，过程中控制制品温度在0～5.0℃，如此进行连续的超滤时，每隔1小时用渗透压计检测一次渗透压浓度。在超滤过程中，随时用10％三氯醋酸溶液检查滤出的废液有无蛋白泄露。当渗透压浓度与透析液接近或相同时，停止超滤，进行最终浓缩工序。浓缩时，用“折射仪”测定浓度，达到8.5％为止。最终浓缩完后，把浓缩液转移到调制罐里，使用过的超滤机，清洗后用0.1mol/LNaOH保存。

2.14最终原液的配制

2.14.1确认转移到配制罐的浓缩液的液量，用折射仪再确认一次浓度，取出样品，测定pH。

2.14.2麦芽糖的配制浓度为30％。以1L浓度为8.5％的浓缩液添加30％麦芽糖0.50L，调整后原液含麦芽糖浓度为10％±1％，蛋白浓度为5.0％以上。

2.14.3pH调整，用0.25mol/L HCl溶液调整pH为4.10±0.30，搅拌30分钟以上检测符合要求后进行除菌过滤。

2.15除菌过滤，在原液罐上，连接1.0μm+0.22μm的滤芯，开始过滤，过滤时使用压缩空气为0.5～0.8㎏/cm²，过滤中随时检查过滤情况，过滤完后给原液罐内加压，使原液罐保持正压状态，然后置于2～5℃库存放。用起泡点测定仪，对使用过的滤芯进行完整性检测试验，确认滤芯无破损。用无菌法取出样品，送交质保部进行半成品检测。

3、产品检验

(1)检测方法

按照《中国药典》(2010年版三部)232～233页静注人免疫球蛋白(IVIG)规定方法分别检测产品纯度、单体+二聚体即分子大小分布、蛋白含量、产品亚类分布等检测指标。

总的收率计算方法：检测蛋白含量×制品体积÷批血浆重量＝Kg(蛋白)/吨血浆

病毒灭活前后蛋白损失率：(灭活前蛋白含量×制品体积－灭活后蛋白含量×制品体积)÷(灭活前蛋白含量×制品体积)×100％

(2)检测结果

检测结果如下表所示：

表1检测结果

由上表可以看出，本发明方法获得的静注人免疫球蛋白纯度高达99.8～99.9％，IgA含量平均值仅9.3μg/ml，远远低于现有技术中报道的同类产品中IgA的含量，即15.03μg/ml(详见公开号为CN102532307A的专利申请文件表1)。同时，平均收率高达6.06Kg/吨血浆。

实验结果说明，本发明方法制备的静注人免疫球蛋白纯度高，IgA含量远远低于现有技术其他方法制备的同类产品，临床安全性更好；同时，本发明方法的收率高。

以下通过检测采用本发明实施例1的方法生产的静注人免疫球蛋白制品的性质的实验例，进一步说明本发明的有益效果：

实验例1本发明静注人免疫球蛋白制品的Fc段检测

1、实验材料

1.1药品本发明静注人免疫球蛋白(5％2.5g/瓶，批号：20130511、20130512、20130513、20130514、20130515、20130516、20130617、20130618、20130619)，Octapharma生物制品有限公司生产静注人免疫球蛋白5％，批号：C141E8532)，静注人免疫球蛋白参考标准品(用于Fc段功能及分子量大小检测)：欧洲药品医疗质量管理局，批号Y0001512。

2、检测方法

制备参考标准品溶液：

a.欧洲参考标准品溶液

用氢氧化钠溶液将参考品pH调节至6.8-7.0，再用牛白蛋白-牛巴比妥缓冲液将参考品IgG浓度稀释至40mg/ml。

b.Octapharma公司IVIG参考标准品

用欧洲参考标准品标定Octapharma公司IVIG样本的Fc段生物学活性，以Octapharma公司批号C141E8532(Fc段生物活性111.1005102％)为标准品，用于本研究中待检IVIG样本Fc段生物学活性的测定。

用氢氧化钠溶液将本发明和Octapharma公司生产IVIG制品的pH调节至6.8-7.0，再用牛白蛋白-牛巴比妥缓冲液将参考品IgG浓度稀释至40mg/ml。

取450μl供试品，加入敏化红细胞悬液500μl，混匀，置37℃水浴中轻摇30min，离心，1000转,10min，4℃，弃上清；用牛白蛋白-牛巴比妥缓冲液1ml反复洗涤红细胞3次，最后一次离心后弃上清，最后向沉淀中加入400μl已预热的牛白蛋白-牛巴比妥缓冲液，充分混匀，2min后再加入已稀释至每1ml含206IU的豚鼠补体，混匀后立即按照紫外-可见分光光度法再波长541nm处测定起始吸光度，之后每隔1min测定1次，在波长541nm处的吸光度与时间的溶血反应动力学曲线即得。当吸光度越过了曲线的内取点后即可停止测量(一般30min内)。分别取参考品即阴性对照，同法操作。按照公式分别计算出本发明IVIG样品、OctapharmaIVIG样品和标准品对照曲线斜率，计算待检IVIG样品Fc段激活补体的功能指数。

3、检测结果

结果如表2所示：

表2静注人免疫球蛋白制品的Fc肽段检测

由表2可以看出，本发明静注人免疫球蛋白的Fc段生物学活性比较高，明显高于国外知名品牌Octapharma同类产品(p<0.05)，且批间差异较小。

实验结果说明，本发明方法生产的静注人免疫球蛋白制品的质量稳定可靠，提示其临床疗效优。

实验例2本发明静注人免疫球蛋白制品的凝血激活物水平检测

1.实验材料

1.1药品本发明静注人免疫球蛋白(批号:2090101、20090102、20090203、20100202、20100916、20101004、20100921、20101221、20101209、20101221、20110615、20110716、20110819、20110614、20110820)，Octapharma生物制品有限公司生产静注人免疫球蛋白(5％，批号:A125A853C、A140B8541、C141E8532；10％，批号:A105C843J、A127A8439C148A843B、B148A8444)

1.2主要试剂与耗材

凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ缺乏血浆：美国太平洋公司；APTT试剂：成都协和生物技术中心；PT试剂：成都协和生物技术中心；玉米胰蛋白酶抑制物(CTI):德国默克Calbiochem公司；FⅪa标准品：德国默克Calbiochem公司；凝血酶荧光多肽底物：瑞士Bachem公司；脑磷脂：美国Roche diagnostics；96孔荧光检测酶标板：丹麦Nunc公司

1.3主要设备

全自动凝血仪：日本Sysmex CA-1500；全自动酶标仪：美国MolecularDevices SpectraMax M2e

2.方法

2.1非活化的部分凝血活酶时间检测法(NAPTT法)：主要用于人血液制品中活化凝血因子的检测。方法详见《中国药典》2010年版三部附录IX O。

2.2凝血因子促凝活性检测(Biggs一期法)：用于定量检测人血液及血液制品中凝血因子促凝活性。按照《中国药典》2010年版三部附录X K(FⅦ:C)、X L(FⅨ:C)、X M(FⅩ:C)及X N(FⅧ:C)检测原理操作；

2.3改良的凝血酶生成时间试验(TGT)：主要用于凝血级联反应中的调节物和激活物检测。该方法为本实验室自主建立。优点：灵敏度高，通过荧光信号强弱，可间接反映凝血酶生成含量变化；②可准确计算凝血酶水平达到峰值的时间(TTP)。

3.结果

3.1NAPTT检测

据文献报道，国外引起血栓事件(venous and artefial thromboemboficevents，TEEs)的特定批次IVIG中NAPTT值均小于150s。

本发明静注人免疫球蛋白的NAPTT值与Octapharma同类产品相当，同时明显高于文献报道国外引起TEEs的厂家特定批次静注人免疫球蛋白的NAPTT值(p<0.05)。结果如表3所示：

表3静注人免疫球蛋白NAPTT时间检测结果

3.2凝血因子含量检测

据文献报道，国外引起TEEs的厂家特定批次IVIG中FXI的含量为0.08-0.10IU/ml。

本发明静注人免疫球蛋白制品中凝血因子Ⅱ(FⅡ)、凝血因子Ⅴ(FⅤ)、凝血因子Ⅶ(FⅦ)、FⅨ、凝血因子Ⅹ(FⅩ)、凝血因子Ⅺ(FⅪ)及凝血因子Ⅻ(FⅫ)含量均低于最低检测限，未检出。Octapharma公司7批静注人免疫球蛋白制品中上述凝血因子含量也均低于最低检测限，未检出。结果如表4所示：

表4静注人免疫球蛋白系列凝血因子促凝活性检测结果

*：低于试剂最低检测限，未检出

3.3TGT检测

据文献报道，国外引起TEEs的厂家特定批次IVIG中FXIa值均高于0.50nmol/L，TTP均低于10min。由表5可以看出，本发明静注人免疫球蛋白制品和Octapharma公司7批静注人免疫球蛋白制品中FXIa含量均低于检测限0.12nmol/L，TTP值大于40min。

结果如表5所示：

表5静注人免疫球蛋白TTP时间和FXIa检测结果

综上，Grundmann、Nuria及Etscheid等报道引起TEEs的特定批次IVIG产品中，TTP均小于10min，FXIa的含量均高于0.50nmol/L，FXI活性为0.08–0.10IU/mL，NAPTT时间均小于160s。

而本发明方法生产的静注人免疫球蛋白制品中TTP均大于30min，FXIa的含量均低于0.50nmol/L,FXI活性均低于0.04IU/mL，NAPTT凝集时间均高于200s，说明本发明方法生产的静注人免疫球蛋白制品中凝血激活物水平较低，与Octapharma公司同类制品质量相当。

实验结果说明，本发明方法生产的静注人免疫球蛋白制品质量可靠，体外致栓性风险率极低，临床应用安全性高。

实验例3本发明静注人免疫球蛋白制品的免疫球蛋白含量检测

1实验材料

1.1检测样品

本发明静注人免疫球蛋白(规格2.5g/50ml，批号：20101234、20100916、20101132、20101229、20101221、20100202)，Octapharma生物制品有限公司生产静注人免疫球蛋白(规格1g/20ml，批号:C127A8439,B148A8444,C148A843B,A105C843J)

1.2主要试剂与耗材

人IgA ELISA试剂盒(lot:7)、人IgD ELISA试剂盒(lot:2Q1)、人IgEELISA试剂盒(lot:8)、人IgG ELISA试剂盒(lot:19)、人IgM ELISA试剂盒(lot:9)均购自美国Immunology Consultants Laboratory公司；人IgG亚型酶标试剂盒(批号：981606A)购自Invitrogen公司。正常质控血浆(批号20111102，购自成都协和生物技术公司)。

1.3主要设备全自动酶标仪Spectra Max M2酶标仪(美国MD公司)

2方法

所有实验均参照相关试剂盒说明书操作

3结果

结果如表6和表7所示：

表6不同厂家IVIG制品的免疫球蛋白含量以及IgG亚型分布

表7泰邦生物与Octapharma生产IVIG制品免疫球蛋白含量T检验结果

由表6和表7可以看出：

1、按照美国药典、欧洲药典、英国药典和中国药典的相关规定，静注人免疫球蛋白制品中IgG含量不低于蛋白总量的95.0％，IgG亚类齐全且比例与正常人血清的IgG亚类分布接近，本发明静注人免疫球蛋白制品符合这一相关规定。与此同时，经统计学分析发现，本发明静注人免疫球蛋白制品质量与Octapharma生物制药公司生产的同类产品相比，IgG含量差异不显著(p>0.05)，IgG亚型比例差异不显著(p>0.05)，提示本发明产品的质量与Octapharma产品质量相当，其临床应用的有效性和安全性均较高。

2、本发明制品中IgA、IgD、IgE杂蛋白的含量均显著低于Octapharma生物制药公司生产的同类产品，提示本发明制品质量在这三个指标上更有优势；在IgM的含量指标上，本发明静注人免疫球蛋白制品质量与Octapharma生物制药公司生产的同类产品相比差异不显著，提示二者在这个指标上质量基本相当。

其中，选择性IgA缺乏症患者注射IVIG时，可因其中存在少量IgA而产生抗IgA的变态反应，因此IVIG制品中IgA含量越低，说明制品临床治疗安全性越高。经研究发现，本发明制品中IgA含量远远低于Octapharma生物制药公司生产的同类产品(p<0.05)，也远远低于现有技术中报道的人免疫球蛋白制品中IgA的含量，即15.03μg/ml(详见公开号为CN102532307A的专利申请文件表1)。

实验结果说明，本发明方法生产的静注人免疫球蛋白制品质量可靠，杂蛋白含量低，尤其是IgA含量低，副作用低，临床应用安全性高。

实验例4本发明人免疫球蛋白制品的Aβ1-40、Aβ1-42检测

1、检测样品：

本发明静注人免疫球蛋白(规格5％，批号:20130405、20130408、20130303)，Octapharma生物制品有限公司生产静注人免疫球蛋白(规格5％，批号:C048A843B、A140B8541)

2、检测方法

多功能酶标仪；洗板机；0.2um过滤膜；人工合成的Aβ；鼠抗人Aβ抗体；生物素偶联的羊抗鼠(抗人)抗体、碱性磷酸酶偶联的抗生物素蛋白；对硝基苯磷酸二钠；牛血清白蛋白。

包被：取96孔酶标板，将检测孔分为2组：测定组每孔加入Aβ1-40(单体或寡聚体)溶液，对照组每孔加入BSA溶液(或Tris缓冲液)。包被过夜。

封闭：用PBS-T洗板3次后，加入封闭液封闭，再次洗板3次。

样品加入：将待测样品用PBS-T-BSA(含1％BSA)进行稀释，样品稀释度的选择是根据实验经验，目前检测的样品从100～2000倍不等。标准曲线样品为鼠抗人Aβ抗体，其浓度梯度分别为250ng/ml，125ng/ml，62.5ng/ml，31.25ng/ml，15.6ng/ml，7.8ng/ml。酶标板测定组和对照组每孔分别加入稀释好的的待测样品或标准曲线样品，37℃孵育1h，洗板3次。

一抗：标准曲线孔和待测样品孔中分别加入生物素偶联的羊抗鼠(抗人)抗体(1:1000倍稀释，稀释液为PBS-T-BSA)，37℃孵育1h，洗板3次。

二抗：所有孔加入碱性磷酸酶偶联的抗生物素蛋白(1:1000倍稀释，稀释液为PBS-T)，37℃孵育1h，洗板3次。

显色与读数：加入发色底物对硝基苯磷酸二钠(PNPP，1:50稀释)，37℃孵育30min，加入1mol/l NaOH终止反应，待读数稳定后用酶标仪在405nm处测定吸光值。

结果计算：以不同稀释度标准曲线样品对应吸光值的对数与浓度的对数作标准曲线，确定标准曲线线性范围以及在线性范围内较好待测样品稀释度。将待测样品测定孔吸光值代入标准曲线计算其浓度值，同时，将各样品的对照孔吸光值代入标准曲线，计算非特异性抗体浓度值。

为得到更准确的检测结果，每个样品检测重复3～4次。

2、检测结果

结果如表8和表9所示：

表8IVIG制品Aβ1-40抗体含量

表9IVIG制品Aβ1-42抗体含量

由表8和表9可以看出：本发明静注人免疫球蛋白制品中Aβ1-40、Aβ1-4抗体含量均显著高于Octapharma公司生产的静注人免疫球蛋白制品(p<0.01)。

实验结果说明，本发明方法生产的静注人免疫球蛋白制品在治疗老年痴呆的疗效较佳。

综上所述，本发明方法制备的静注人免疫球蛋白纯度高，Fc段生物学活性高，Aβ抗体含量较高，IgA等杂蛋白含量低，凝血激活物水平较低，在临床治疗中能体现出较同类产品更好的疗效和安全性，同时，本发明方法的得率高，血浆利用率高，具有良好的市场应用前景。

Claims (10)

1.一种制备静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于：它包括如下步骤：

a、溶解：取Cohn法FⅡ沉淀，溶于注射用水中，澄清过滤，调节pH为6.60±0.1，搅匀，调节电导率为1.40±0.05ms/cm，调节温度为0～5.0℃，搅匀；

b、层析：用DEAE Sepharose Fast Flow的层析柱纯化，收集人免疫球蛋白组份液；

c、超滤：将步骤b得到的人免疫球蛋白组份液超滤并透析，至渗透压低于30mOsmol/kg时，浓缩，浓缩至蛋白浓度为4.0％±1％(w/v)，得浓缩液；

d、病毒灭活：在浓缩液中添加山梨醇至浓度为(33±1)％(w/v)，调整pH至5.00±0.1，在60℃±0.5℃下恒温10小时，冷却，澄清过滤；

e、超滤，透析，配制，即可。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述Cohn法FⅡ沉淀采用如下方法制备：

(1)取Cohn法FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀，与0.01mol/L氯化钠溶液混匀，得离子强度为0.015、蛋白浓度为0.8～1.2％(w/v)的悬浊液；

(2)第一次低温乙醇沉淀：取步骤(1)的悬浊液，调pH为5.00～5.20，添加乙醇至浓度为15％～18％(v/v)，冷却至温度为-4.0～-6.0℃，测定pH，若pH不在5.00～5.20范围，补调至5.00～5.20，搅拌3h，静置3～5h，添加助滤剂，搅拌，压滤，收集FⅠ+Ⅲ上清；其中助滤剂的加入量为FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的2％(w/w)；

(3)第二次低温乙醇沉淀：取FⅠ+Ⅲ上清，调节离子强度至0.05，调pH为7.10～7.40，添加乙醇至浓度23～25％(v/v)，调节温度为-9.0℃～-11.0℃，搅拌3小时，静置3～5小时，添加助滤剂，搅拌，压滤，得FⅡ沉淀；其中助滤剂的加入量为FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的0.5％(w/w)。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述氯化钠溶液的用量为FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的9～12倍(w/w)；所述混匀是在-1.0～2.0℃条件下混匀。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：

步骤(2)中，在悬浊液温度为0～-4.0℃条件下添加乙醇；乙醇添加速率低于1L/min；

步骤(2)中，在压滤之前，用淋洗液与助滤剂进行预铺，吹流；其中，淋洗液的用量是FⅠ+Ⅱ+Ⅲ沉淀的2.5倍(v/w)，每1000L淋洗液由如下配比的成分组成：注射用水：821L、NaCl：878g、浓度为95％的乙醇：179L。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)或(3)中，所述助滤剂为硅藻土；所述压滤的使用压力为1.0～1.5kg/cm²，出液温度控制在-3～-5℃。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，调节pH时，FⅠ+Ⅲ上清的温度维持在-4.0～-6.0℃；添加乙醇时，FⅠ+Ⅲ上清的温度维持在-7.0～-9.0℃，乙醇添加速率低于1L/min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述FⅡ沉淀溶于注射用水时，液温维持在0～5.0℃；澄清过滤时，采用装配了A-80滤芯的ALSOP滤器过滤，出液温度控制在0～5.0℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤b包括如下步骤：

ⅰ、用pH6.6±0.1磷酸盐缓冲液平衡层析柱，调节样品pH为5.00±0.1，上样，流速控制为2.00±0.50L/min，收集流穿液；

ⅱ、上样结束后，用pH6.6±0.1磷酸盐缓冲液洗脱，缓冲液用量为柱体积的1.0～1.5倍，收集洗脱液；

ⅲ、合并步骤ⅰ的流穿液和步骤ⅱ的洗脱液，即为人免疫球蛋白组份液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤c中，超滤时，使用压力为2～3kg/cm²，液温控制在0～5.0℃；所述透析采用的透析液为注射用水；

步骤d中，冷却至温度低于10℃后，采用装配了A-80滤芯的ALSOP滤器进行澄清过滤。

10.权利要求1～9任意一项方法制备的静注人免疫球蛋白。