CN108441490A - 一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征是：将多个带搅拌器的圆柱形容器串联形成自然流动方式，在各容器中放置提前平衡后的凝胶，某一批次待处理血浆存放在第一个容器上方；先定量注入第一个容器中，凝胶搅拌吸附一个单元时间后，再从以一定流量速度放出吸附后的血浆到第二个容器中，与此同时，其它待处理血浆再以相同流量速度流入第一个吸附罐中，即保持第一个容器中的血浆量动态平衡，这时，在第一个容器内血浆的吸附和分离是同时进行的；以此类推，血浆全部通过后，关闭各容器的出口，分别对凝胶进行洗涤、洗脱。这样血浆量不受容器体积限制，易于过程控制并且FⅨ活性回收率较高，无凝胶泄漏和交叉污染的风险。

Description

一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺
技术领域
本发明涉及一种人凝血酶原复合物的制备工艺，属于生物制药领域，尤其涉及一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺。
背景技术
人凝血酶原复合物（Prothrombin Complex Concentrate，PCC）是从健康人混合血浆中分离制备的一种能促进血液凝固的静脉注射血浆蛋白制剂，泛称因子IX浓制剂。PCC主要含有依赖于维生素K的凝血酶原（FⅡ）、稳定因子（FⅦ）、血浆凝血活酶成分（FⅨ）和Stuart-Prower 因子（FⅩ）。PCC中各种凝血因子蛋白的血浆浓度在1~200mg/L之间，它们都属丝氨酸蛋白酶，在血液循环中均以无活性的酶原形式存在。由于这些因子都属于糖蛋白，都在肝脏合成，并由维生素K介导，其理化性质（分子质量、等电点等）极为相似，故在规模化生产中用一般的理化方法很难将其分开，商品PCC几乎都含有上述四种凝血因子。
据世界卫生组织（WHO）和世界血友病联盟（WHF）报告，全球乙型血友病（HB）的发病率约（1.0～1.5）人/10万人，占血友病的15%～20%。目前我国HB患者约为2万人。替代治疗是目前唯一有效地制止HB患者出血的方法。在国内没有高纯的Ⅸ因子浓缩物的情况下，PCC仍然是治疗乙型血友病的主要制品（本申请人在现有PCC的工艺基础上正在积极开发高纯Ⅸ因子制剂）。如果采用为患者定期输注浓缩凝血因子的预防疗法，即使是重度的血友病患者，也可以过上几乎和正常人一样的生活，但目前全世界尚80％患者没有任何替代治疗。血浆制品的产率仅 5％~10％，截止目前国内已有5家血液制品企业获得PCC的生产批件，仅有3家企业有上市的PCC制品。由于PCC的匮乏与昂贵，中国的患者很难承受这种预防疗法，只能在发生出血后输注浓缩凝血因子。故PCC制剂为临床急需、市场短缺的药品之一。
目前，国内外PCC的分离纯化技术主要为批式的离子交换吸附法，即将离子交换树脂加入血浆中（比例为：1~1.5g干胶/L血浆）搅拌吸附一段时间，随后分离出离子交换树脂并转移到层析柱中，经过洗涤和洗脱得到PCC蛋白液。批式吸附法必需是在搅拌罐内进行吸附，由于凝胶机械强度差而易破碎；洗涤和洗脱需转移到层析柱内完成，操作麻烦，劳动强度大，易产生交叉污染且周期较长；血浆处理量受到限制。
现有技术虽然有所进步，但仍然难于脱离传统分离纯化技术，只是在个别工艺进行优化如：
ZL201010534827.2《一种人凝血酶原复合物的制备工艺》，其制备工艺包括对血浆进行吸附、洗涤、洗脱及澄清过滤 ；病毒灭活（S/D 法）；再吸附纯化 ；分装 ；冻干 ；干热灭活 ；该发明采取凝胶直接从血浆吸附人凝血酶原复合物，在提取整个过程只用凝胶层析技术，简化了生产步骤，减少了各种因素对产品生产过程中的污染，同时产品的得率提高 25-30%。此外生产过程中采用 S/D法去除脂包膜病毒及 99.5±0.5℃干热法去除非脂包膜病毒，经过这 2 次病毒灭活步骤显著提高了临床用药的安全性。
ZL 201110030793.8《一种人凝血酶原复合物的生产方法》，其制备工艺包括采用从血浆中直接分离提取，病毒灭活，精制，二次病毒灭活，即得人凝血酶原复合物成品。本发明采用从血浆中直接分离提取，分离条件温和，产品的批间差异小，凝血因子活性稳定，收获率高，且基本没有激活现象发生。病毒灭活工艺采用 S/D 法和干热灭活法相结合的方法，充分保证了产品的病毒安全性。
ZL 201410340403.0《一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法》，其制备工艺包括（1）去除冷沉淀血浆，使用预先经EDTA溶液和枸橼酸钠溶液清洗过的纤维素深层滤板过滤（2）深层过滤后的血浆在固定床上样时经过0.2μm的滤芯膜在线过滤；（3）装填有阴离子交换凝胶Capto DEAE的固定床层析柱使用缓冲液A平衡2~5个柱体积，血浆上样流速为60~ 120cm/h，用缓冲液B洗涤层析柱，用缓冲液C洗脱层析柱，得到PCC制品，按照凝血因子IX计算，PCC的收率可以达到75% ~ 90%，比活性可以达到5.5IU/mg以上。
ZL 201210098844.5《一种高收率人凝血酶原复合物的制备方法》，其制备工艺包括化浆、调整蛋白浓度和 pH 值、凝胶吸附、洗涤、洗脱、稀释调整蛋白浓度和离子强度、S/D病毒灭活、再凝胶吸附、再洗涤、洗脱、超滤、除菌分装、冻干、干热灭活工艺步骤，调整蛋白浓度和 pH 值时，将去除冷沉淀、澄清过滤的血浆用2-8℃ 0.9% 生理盐水调整蛋白浓度至3.0-5.0%，然后用醋酸 - 醋酸钠缓冲液调 pH 值至 6.8-7.2。本发明与现有技术相比，具有工艺简单、安全性高、产品收率高、比活高等特点，产品收率达到45.28±2.26 万 IU( 以IX 因子效价计算 )/ 吨血浆，比活达到 0.87±0.12IU/mg。
由于，PCC除了用于治疗乙型血友病外，还可以用于治疗先天性和获得性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症包括：1、凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ缺乏症；2、抗凝剂过量、维生素K缺乏症；3、因肝病导致的凝血机制紊乱；4、各种原因所致的凝血酶原时间延长而拟作外科手术患者；5、治疗已产生因子Ⅷ抑制物的甲型血友病患者的出血症状。6、逆转香豆素类抗凝剂诱导的出血。随着我国肝炎发病率的增加，以及临床医师对人凝血酶原复合物（PCC）制剂治疗效果的认同，同时PCC在临床上具有广泛的适应症，临床上需求量大，市场前景良好。因此，对PCC的分离纯化技术做进一步探索就显得迫在眉睫，意义重大。
发明内容
为克服现有技术中的缺点，本发明在传统的批式吸附法制备PCC的基础上，创造性地发展为一种流动式吸附的方法制备PCC。该法将血浆和凝胶置于四个带搅拌器的圆柱形容器内，在容器上方以一定速率注入血浆同时在容器下方以一定速率放出吸附后的血浆，即血浆的吸附和分离是同时进行的；血浆全部通过后凝胶无需转移即可进行洗涤、洗脱；相比批式吸附法，流动吸附法处理血浆量不受容器体积限制，易于过程控制并且FⅨ活性回收率较高。
同时对现有技术进一步优化，在国内外PCC的制备工艺中，通常只使用一种离子交换凝胶进行吸附，如DEAE Sephadex A50凝胶。该方法制备出的PCC比活性一般不会高于1.0IU/mg蛋白，纯度相对较低。在S/D法病毒灭活后，本发明采用Capto DEAE离子交换层析，不仅能有效清除S/D试剂，能更有效的去除杂蛋白，提高产品纯度；另外针对临床上使用PCC可能会导致血栓的发生风险，本发明在PCC分装前配制过程中加入肝素钠及抗凝血酶-Ⅲ（AT3），可以大大降低PCC在使用时血栓的发生，提高临床PCC使用的安全性；再则为什么国内血液制品生产企业至少拥有20家，而真正拥有上市PCC制品的仅3家呢。主要问题在于该制品在冻干后再复溶可见异物难以控制，容易导致不合格制品，本发明制品在冷冻干燥过程中，预冻步骤采用快速冻结制品，有利于制品形成细小的晶体，保持制品原有属性，较少预冻机械应力对制品的破坏，提高制品的合格率。
综上分析，本发明的目的是提供一种流动式吸附制备人凝血酶原复合物的工艺，通过采用两步层析法及两步病毒灭活法，制备得到人凝血因子Ⅸ效价为16~24IU/ml，人凝血因子Ⅸ比活性在2.0IU/mg蛋白以上，人凝血因子Ⅸ收得率在50%以上的人凝血酶原复合物。
本发明的目的是这样实现的：以健康人血浆为原料，经低温离心法去除冷沉淀，去冷沉淀血浆经DEAE Sephadex A50 凝胶流动式吸附，洗涤、洗脱步骤得到人凝血酶原复合物（PCC）；再进行超滤脱盐、S/D法病毒灭活、去S/D试剂、Capto DEAE离子交换层析、超滤浓缩透析得到精制PCC；再经稀配、加入适量肝素及AT-Ⅲ、除菌过滤、分装、冷冻干燥、干热灭活（99~100℃，30min）、包装、入库。
本发明是在传统的批式吸附法制备PCC的基础上，发展为一种流动式吸附的方法制备PCC，制备工艺如下：将多个带搅拌器的圆柱形容器串联形成自然流动方式，在各容器中放置提前平衡后的凝胶，某一批次待处理血浆存放在第一个容器上方；
先将部分待处理血浆流动注入第一个容器内，定量后停止注入，凝胶对注入的定量血浆进行搅拌吸附，搅拌吸附一个单元时间后，再从第一个容器下方以一定流量速度放出吸附后的血浆，经第二个容器的上方流入第二个容器中，与此同时，存放在第一个容器上方的其它待处理血浆再以相同流量速度流入第一个吸附罐中，即保持第一个容器中的血浆量动态平衡，这时，在第一个容器内血浆的吸附和分离是同时进行的；
当流入第二个容器的血浆达到定量后，再从第二个容器下方以相同的流量速度流入第三个容器中，保持第二个容器中的血浆量动态平衡；
以此类推，保持之后的各容器中的血浆量动态平衡，在最后一个容器完成血浆凝胶流动式吸附过程；
各容器血浆全部通过后，关闭各容器的出口，分别对凝胶进行洗涤、洗脱；收集洗脱蛋白液①；再进行后续处理；
凝胶用量根据该批次待处理血浆量、容器串联数量、单元时间和流量速度而定，流量速度以保证血浆在各容器中的时间大于等于一个单元时间，流动吸附法处理血浆量不受容器体积限制，凝胶无需转移即能进行洗涤、洗脱，易于过程控制并且FⅨ活性回收率较高，无凝胶泄漏和交叉污染的风险。
在S/D法病毒灭活后，增加Capto DEAE离子交换层析，不仅能有效清除S/D试剂，能更有效的去除杂蛋白，提高产品纯度。针对临床上使用PCC可能会导致血栓的发生，在PCC分装前配制过程中加入肝素钠及AT3，可以大大降低PCC在使用时血栓的发生；制备出人凝血因子Ⅸ效价为16~24IU/ml，人凝血因子Ⅸ比活性在2.0IU/mg蛋白以上，人凝血因子Ⅸ收得率在50%以上的人凝血酶原复合物。
优选方案为：
（1）去冷沉淀血浆的制备
按《中国药典》2015年版三部要求采集，且经复检合格并通过检疫期检疫合格的原料血浆，在预融间，用75%乙醇消毒、再用低于35℃注射用水冲洗尽乙醇后，进行破袋。破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的循环水进行夹层循环融浆；血浆融化后，及时停止热水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，取样送质检进行抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-HBs和微生物限度等检查；经过滤或离心，离心速度控制在4Kg/min/台，出液温度控制在0～4℃，分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产。去除冷沉淀的血浆取样进行蛋白含量、细菌内毒素检测。去冷沉淀血浆用20~30℃的循环水进行夹层循环加热，控制血浆温度在10~20℃。使用乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.0）调节血浆pH值为7.0±0.2
（2）第一次吸附
采用流动式吸附法进行吸附。流动式吸附容器分为四个吸附罐，根据血浆重量分别放置提前平衡后的DEAE Sephadex A50凝胶，凝胶的量为血浆重量的1.0~1.5%，将总凝胶量平均分成四份，分别放入四个吸附罐中；将血浆以一定的流速从灌顶加入第一个吸附罐中，搅拌吸附10~15分钟，再以一定流速从罐底转移至第二个吸附罐中，与此同时，未经吸附的血浆从灌顶以相同流速加入第一个吸附罐中，保持第一个吸附罐中的血浆量动态平衡；以此类推，第2~4个吸附罐分别搅拌吸附10~15分钟，血浆从各吸附罐灌顶流入，并以相同的速度从吸附罐罐底流出，吸附罐中的浆量保持动态平衡，直至所有血浆全部通过并被A50凝胶吸附完成。
（3）第一次洗涤、洗脱
用大约2倍凝胶体积的洗涤液分别洗涤四个吸附罐中的凝胶3~5次，每次搅拌3~5分钟后放干。
用大约1倍凝胶体积的洗脱液分别洗脱四个吸附罐中的凝胶2~3次，每次搅拌不少于10分钟，收集洗脱蛋白液①。
DEAE Sephadex A50凝胶的再生与保存
凝胶使用后，用约1倍凝胶体积的2mol/L氯化钠溶液洗涤一次放干。
加入适量注射用水，搅拌下用2mol/L的醋酸调节凝胶溶液pH值4.0以下，浸泡约10min后放干。
用注射用水洗涤凝胶2次放干。再用0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡凝胶二次后放干，每次约10min，最后用0.1mol/L氢氧化钠溶液保存凝胶或者用20%乙醇溶液长期保存凝胶。凝胶经重生步骤可重复使用。
（4）第一次过滤、超滤
洗脱蛋白液①经0.45μm滤芯过滤。采用10KD的超滤膜将过滤后洗脱蛋白液①预浓缩至起始体积的1/3~1/2。使用3~4倍透析液①对浓缩液进行恒体积透析，使透析出液电导率低于10 ms/cm，收集透析后蛋白液。称重，测量pH、温度。
（5）S/D灭活
按透析后蛋白液体积的1/10，搅拌下缓慢加入S/D溶液，使S/D溶液终浓度含1%的聚山梨酯80和0.3%的磷酸三丁酯。S/D溶液添加结束后，24~26℃保温6h。
（6）第二次过滤、超滤
过滤：蛋白液S/D灭活后，用0.45μm滤芯过滤，收集滤液。
超滤：用10KD超滤膜将滤液用S/D洗涤液恒体积透析3~4倍体积，调节蛋白浓度为1.5%左右，即得PCC上柱蛋白液。
（7）离子交换层析
使用S/D洗涤液平衡层析柱凝胶Capto DEAE，PCC上柱蛋白液上柱层析，线性流速约200cm/h。
洗涤：用S/D洗涤液洗涤柱子直至成基线，线性流速约200cm/h。
洗脱：用洗脱液洗脱，收集紫外吸收峰的洗脱蛋白液②，线性流速约200cm/h。
（8）第三次过滤、超滤
洗脱蛋白液②经0.45μm滤芯过滤。
采用10KD超滤膜将过滤后洗脱蛋白液②预浓缩至1/3~1/2。使用5~7倍透析液②对浓缩液进行恒体积透析，使透析出液电导率低于10 ms/cm，收集蛋白液，即得到人凝血酶原复合物原液。称重，取样检测人凝血因子Ⅸ效价，pH、温度。
（9）配制
根据人凝血酶原复合物原液Ⅸ因子效价检测结果，按制品最终Ⅸ因子效价22~24IU/ml使用透析液②进行配制，使最终制品Ⅸ因子效价不小于20 IU/ml。根据人凝血因子Ⅸ效价添加肝素钠及抗凝血酶-Ⅲ（AT3）。每100IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量为20 IU，AT-Ⅲ含量为4IU。
（10）分装及冻干
用0.2μm滤芯除菌、分装。每瓶分装20 ml（规格为每瓶含人凝血因子Ⅸ400IU）。
分装后的制品应立即冻结，冻干过程制品温度最高不得超过35℃，真空封口。
①制品-40℃以下入柜，保持3小时；
②开真空泵使真空度达到0.1 mbar稳定；
③2小时内隔板升温到-20℃，保持3小时；
④3小时隔板升温到2℃，保持20小时；
⑤4小时隔板升温到35℃，保持8小时；
⑥抽极限真空，保持4小时；
⑦压塞出柜。
（11）干热灭活
采用水浴灭菌柜，进行99~100℃，30 min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜。真空检测，放入待检品库。
其中①平衡液：0.015 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠。用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。②洗涤液：0.22 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠。用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。③洗脱液：2 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠。用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。④透析液：0.01mol/L枸橼酸钠。用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。⑤透析液：0.01mol/L枸橼酸钠+2%甘氨酸+0.06mol/L氯化钠+0.5%盐酸精氨酸，用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。⑥S/D溶液：11%聚山梨酯80+3.3%磷酸三丁酯。⑦S/D洗涤液：0.15 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠，用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2 。
以上百分比处特别说明，其余均为重量百分比。
所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9mL质量浓度为99%冰乙酸和65.6g乙酸钠。
本发明相比现有技术人凝血酶原复合物的制备工艺，创新点在于：
1、本发明是在传统的批式吸附法制备PCC的基础上，发展为一种流动式吸附的方法制备PCC，该法将血浆和凝胶置于四个或多个带搅拌器的圆柱形容器内，在容器上方以一定速率注入血浆同时在容器下方以一定速率放出吸附后的血浆，即血浆的吸附和分离是同时进行的；血浆全部通过后凝胶无需转移即可进行洗涤、洗脱；如专利ZL201010534827.2、ZL201110030793.8、ZL 201210098844.5均为采用批式法吸附PCC，相比批式吸附法，流动吸附法处理血浆量不受容器体积限制，但流动式吸附并不是简单的将大容量分为若干个串联小容量，而是通过流动式吸附产生了出人意料的效果，即易于过程控制并且FⅨ活性回收率较高，操作相对简单，无凝胶泄漏和交叉污染的风险。
2、在S/D法病毒灭活后，采用Capto DEAE离子交换层析，不仅能有效清除S/D试剂，能更有效的去除杂蛋白，提高产品纯度。Capto DEAE凝胶载量大，置换能力强，能在高动态下获得目标蛋白，有效的缩短了工艺周期。如专利ZL 201010534827.2、ZL201110030793.8、ZL 201210098844.5均采用与第一步层析相同的DEAE Sephadex A50凝胶，其目的主要是去除S/D试制，无蛋白纯化效果。专利ZL 201410340403.0为直接采用血浆经Capto DEAE上样，因血浆成分复杂，上样速度、收得率均会受限，且该工艺中无有效的病毒灭活步骤，产品的安全性难以评估。
3、针对临床上使用PCC可能会导致血栓的发生，在PCC分装前配制过程中加入肝素钠及抗凝血酶-Ⅲ（AT3），可以大大降低PCC在使用时血栓的发生。如专利ZL201010534827.2、ZL 201110030793.8、ZL 201210098844.5均只加入肝素，没有加入AT3。AT3是凝血酶等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂，其可以灭活凝血酶，肝素可加速这一反应达千倍以上，而PCC产品中几乎不含AT3，光有肝素的存在对凝血酶的灭活效果并不理想。
4、制品在冷冻干燥过程中，预冻步骤采用-40℃快速冻结制品，有利于制品形成细小的晶体，保持制品原有属性，较少预冻机械应力对制品的破坏；通过试验确定升华温度，大大提高升华效率，较少冻干时间，使得400IU/瓶的制品整个冷冻干燥时间不超过48h。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
图2为本发明流动式吸附罐体设施结构示意图。
图2中，血浆容器1，带搅拌器的圆柱形容器21、22、23、24，DEAE Sephadex A50凝胶31、32、33、34，洗涤洗脱口41、42、43、44。
具体实施方式
本发明通过下面的实施例可以对本发明作进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。
实施例1：以1000升血浆为例，具体制备工艺如下：
（1）去冷沉淀血浆的制备
按《中国药典》2015年版三部要求采集，且经复检合格并通过检疫期检疫合格的原料血浆，在预融间，用75%乙醇消毒、再用低于35℃注射用水冲洗尽乙醇后，进行破袋。破袋后输送到融浆罐，用30～35℃的循环水进行夹层循环融浆；血浆融化后，及时停止热水循环，把血浆温度控制在0～4℃之间，取样送质检进行抗-HIV、HBsAg、抗-HCV、抗-HBs和微生物限度等检查；经过滤或离心，离心速度控制在4Kg/min/台，出液温度控制在0～4℃，分离冷沉淀，冷沉淀用于Ⅷ因子生产。去除冷沉淀的血浆取样进行蛋白含量、细菌内毒素检测，使用调试罐收集1000L。去冷沉淀血浆用20~30℃的循环水进行夹层循环加热，控制血浆温度在10~20℃。使用乙酸-乙酸钠缓冲液（pH4.0）调节血浆pH值为7.0±0.2。
（2）第一次吸附
流动吸附系统包括一个待处理血浆容器及四个带搅拌器圆柱形的吸附罐，待处理血浆容器位于第一个吸附罐上方；第一个吸附罐下方设有第二个吸附罐，以此类推至第四个吸附罐，待处理血浆容器与四个吸附罐串联形成自然流动结构，各个吸附罐中设有DEAESephadex A50凝胶层，各个吸附罐的底部设有洗涤洗脱口。待处理血浆容器下方设有管道及流速控制阀与第一个吸附罐上方设有的进口对应连接，各个吸附罐下方也设有管道及流速控制阀与下一个吸附罐上方设有的进口对应连接，第四个吸附罐下方设有的管道及流速控制阀对外，各流速控制阀流量控制同步。洗涤洗脱口为同一管口并设有开关阀门。
采用流动式吸附法进行吸附。根据血浆重量分别放置提前平衡后的DEAESephadex A50凝胶，凝胶的量为血浆重量的1.0~1.5%，即凝胶的量为15kg，将总凝胶量平均分成四份，分别放入四个吸附罐中。将一部分血浆从灌顶加入第一个吸附罐中，搅拌吸附10~15分钟，再以一定流速从罐底转移至第二个吸附罐中，与此同时，未经吸附的血浆从灌顶以相同流速加入第一个吸附罐中，保持第一个吸附罐中的血浆量恒定。以此类推，第2~4个吸附罐分别搅拌吸附10~15分钟，血浆从灌顶流入，并以相同的速度从罐底流出，罐中的浆量保持恒定，直至所有血浆被A50凝胶吸附完成。
（3）第一次洗涤、洗脱
用大约8L洗涤液分别洗涤四个吸附罐中的凝胶5次，每次搅拌3~5分钟后放干。
用大约4L洗脱液分别洗脱四个吸附罐中的凝胶2次，每次搅拌不少于10分钟，收集洗脱蛋白液①34kg。
（4）第一次过滤、超滤
洗脱蛋白液①经0.45μm滤芯过滤。采用10KD的超滤膜将过滤后洗脱蛋白液①预浓缩至12kg。使用40kg透析液①对浓缩液进行恒体积透析，使透析出液电导率低于10 ms/cm，收集透析后蛋白液12.8kg。称重，测量pH、温度。
（5）S/D灭活
按透析后蛋白液体积的1/10，搅拌下缓慢加入S/D溶液，使S/D溶液终浓度含1%的聚山梨酯80和0.3%的磷酸三丁酯。S/D溶液添加结束后，24~26℃保温6h。
（6）第二次过滤、超滤
过滤：蛋白液S/D灭活后，用0.45μm滤芯过滤，收集滤液。
超滤：用10KD超滤膜将滤液用S/D洗涤液恒体积透析3~4倍体积，调节蛋白浓度为1.5%左右，即得PCC上柱蛋白液45kg。
（7）离子交换层析
使用S/D洗涤液平衡层析柱凝胶Capto DEAE，PCC上柱蛋白液上柱层析，线性流速约200cm/h。
洗涤：用S/D洗涤液洗涤柱子直至成基线，线性流速约200cm/h，用量80kg。
洗脱：用洗脱液洗脱，用量40kg，收集紫外吸收峰的洗脱蛋白液②32kg，线性流速约200cm/h。
（8）第三次过滤、超滤
洗脱蛋白液②经0.45μm滤芯过滤。
采用10KD超滤膜将过滤后洗脱蛋白液②预浓缩至12kg。使用70kg透析液②对浓缩液进行恒体积透析，使透析出液电导率低于10 ms/cm，收集蛋白液，即得到人凝血酶原复合物原液。称重，取样检测人凝血因子Ⅸ效价，pH、温度。
（9）配制
根据人凝血酶原复合物原液Ⅸ因子效价检测结果，按制品最终Ⅸ因子效价22IU/ml使用透析液②进行配制，使最终制品Ⅸ因子效价不小于20 IU/ml。根据人凝血因子Ⅸ效价添加肝素钠及抗凝血酶-Ⅲ（AT3）。加入肝素含量为100000IU，AT3含量为20000IU。
（10）分装及冻干
用0.2μm滤芯除菌、分装。每瓶分装20 ml（规格为每瓶含人凝血因子Ⅸ400IU）。
分装后的制品应立即冻结，冻干过程制品温度最高不得超过35℃，真空封口。
①制品-40℃以下入柜，保持3小时；
②开真空泵使真空度达到0.1 mbar稳定；
③2小时内隔板升温到-20℃，保持3小时；
④3小时隔板升温到2℃，保持20小时；
⑤4小时隔板升温到35℃，保持8小时；
⑥抽极限真空，保持4小时；
⑦压塞出柜。
（11）干热灭活
采用水浴灭菌柜，进行99~100℃，30 min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜。真空检测，放入待检品库。
其中
①平衡液：0.015 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠。用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。
②洗涤液：0.22 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠。用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。
③洗脱液：2 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠。用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。
④透析液：0.01mol/L枸橼酸钠。用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。
⑤透析液：0.01mol/L枸橼酸钠+2%甘氨酸+0.06mol/L氯化钠+0.5%盐酸精氨酸，用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。
⑥S/D溶液：11%聚山梨酯80+3.3%磷酸三丁酯。
⑦S/D洗涤液：0.15 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠，用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2。
以上百分比处特别说明，其余均为重量百分比。
所述pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9mL质量浓度为99%冰乙酸和65.6g乙酸钠。
经本实施例制备的产品与传统批式吸附法制备的人凝血酶原复合物在关键项目的对比分析如下表。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征是制备工艺如下：将多个带搅拌器的圆柱形容器串联形成自然流动方式，在各容器中放置提前平衡后的凝胶，某一批次待处理血浆存放在第一个容器上方；
先将部分待处理血浆流动注入第一个容器内，定量后停止注入，凝胶对注入的定量血浆进行搅拌吸附，搅拌吸附一个单元时间后，再从第一个容器下方以一定流量速度放出吸附后的血浆，经第二个容器的上方流入第二个容器中，与此同时，存放在第一个容器上方的其它待处理血浆再以相同流量速度流入第一个吸附罐中，即保持第一个容器中的血浆量动态平衡，这时，在第一个容器内血浆的吸附和分离是同时进行的；
当流入第二个容器的血浆达到定量后，再从第二个容器下方以相同的流量速度流入第三个容器中，保持第二个容器中的血浆量动态平衡；
以此类推，保持之后的各容器中的血浆量动态平衡，在最后一个容器完成血浆凝胶流动式吸附过程；
各容器血浆全部通过后，关闭各容器的出口，分别对凝胶进行洗涤、洗脱；收集洗脱蛋白液①；再进行后续处理；
凝胶用量根据该批次待处理血浆量、容器串联数量、单元时间和流量速度而定，流量速度以保证血浆在各容器中的时间大于等于一个单元时间。
2.根据权利要求1所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，后续处理过程中，在S/D法病毒灭活后，采用Capto DEAE离子交换层析，能有效清除S/D试剂，能更有效的去除杂蛋白，提高产品纯度；在人凝血酶原复合物（PCC）分装前配制过程中加入肝素钠及AT3，大大降低PCC在使用时血栓的发生；制备出人凝血因子Ⅸ效价为16~24IU/ml，人凝血因子Ⅸ比活性在2.0IU/mg蛋白以上，人凝血因子Ⅸ收得率在50%以上的人凝血酶原复合物。
3.根据权利要求1或2所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，以健康人血浆为原料，经低温离心法去除冷沉淀，去冷沉淀血浆经DEAE Sephadex A50凝胶流动式吸附，洗涤、洗脱步骤得到人凝血酶原复合物（PCC）；再进行超滤脱盐、S/D法病毒灭活、去S/D试剂、Capto DEAE离子交换层析、超滤浓缩透析得到精制人凝血酶原复合物原液；再经稀配、除菌过滤、分装、冷冻干燥、99~100℃干热灭活30min、包装、入库；制备得到人凝血因子Ⅸ效价为16~24IU/ml，比活性在2.0IU/mg蛋白以上，人凝血因子Ⅸ收得率在50%以上的人凝血酶原复合物。
4.根据权利要求3所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，得到人凝血酶原复合物原液后，根据Ⅸ因子效价检测结果，按制品最终Ⅸ因子效价22~24IU/ml使用透析液②进行配制，使最终制品Ⅸ因子效价不小于20 IU/ml；根据人凝血因子Ⅸ效价添加肝素钠及抗凝血酶-Ⅲ（AT3）；每100IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量为20 IU，AT3含量为4IU；得到人凝血酶原复合物稀配液。
5.根据权利要求3所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，制品在冷冻干燥过程中采用如下冻干方法：
①制品-40℃以下入柜，保持5小时；
②开真空泵使真空度达到0.1 mbar稳定；
③2小时内隔板升温到-20℃，保持3小时；
④3小时隔板升温到3℃，保持25小时；
⑤4小时隔板升温到不超过35℃，保持8小时；
⑥1小时使真空到0.05 mbar以下，保持1小时以上；
⑦压塞出柜；
冻干后制品采用水浴灭菌柜，进行99~100℃，30 min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜；真空检测，放入待检品库。
6.根据权利要求3所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，健康人血浆融化后，低温离心，收集去冷沉淀血浆；去冷沉淀血浆用20~30℃的循环水进行夹层循环加热，控制血浆温度在10~20℃；使用pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液调节血浆pH值为7.0±0.2。
7.根据权利要求1或2所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，流动式吸附容器分为四个吸附罐，根据血浆重量分别放置提前平衡后的DEAE SephadexA50凝胶，凝胶的量为血浆重量的1.0~1.5%，将总凝胶量平均分成四份，分别放入四个吸附罐中；将血浆以一定的流速从灌顶加入第一个吸附罐中，搅拌吸附10~15分钟，以此类推，第2~4个吸附罐分别搅拌吸附10~15分钟，直至所有血浆全部通过并被A50凝胶吸附完成。
8.根据权利要求7所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，各吸附罐中吸附后的A50凝胶的洗涤、洗脱，用2倍凝胶体积的洗涤液分别洗涤四个吸附罐中的凝胶3~5次，每次搅拌3~5分钟后放干；用1倍凝胶体积的洗脱液分别洗脱四个吸附罐中的凝胶2~3次，每次搅拌不少于10分钟，收集洗脱蛋白液①。
9.根据权利要求8所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，所述的洗脱蛋白液①经0.45μm滤芯过滤，再采用10KD的超滤膜将过滤后洗脱蛋白液①预浓缩、使用3~4倍透析液①对浓缩液进行恒体积透析，使透析出液电导率低于10 ms/cm，收集透析后蛋白液，经24~26℃S/D灭活6h，再经0.45μm滤芯过滤，用10KD超滤膜将滤液用S/D洗涤液恒体积透析3~4倍体积，调节蛋白浓度为1.5±0.2%，即得PCC上柱蛋白液。
10.根据权利要求9所述的一种流动吸附法制备人凝血酶原复合物的工艺，其特征在于，所述的PCC上柱蛋白液上柱层析，使用S/D洗涤液平衡层析柱凝胶Capto DEAE，PCC上柱蛋白液上柱层析，线性流速约200cm/h；洗涤：用S/D洗涤液洗涤柱子直至成基线，线性流速约200cm/h；洗脱：用洗脱液洗脱，收集紫外吸收峰的洗脱蛋白液②，线性流速约200cm/h；洗脱蛋白液②经0.45μm滤芯过滤；采用10KD超滤膜将过滤后洗脱蛋白液②预浓缩，再使用5~7倍透析液②对浓缩液进行恒体积透析，使透析出液电导率低于10 ms/cm，收集蛋白液，即得到人凝血酶原复合物原液；
人凝血酶原复合物原液根据Ⅸ因子效价检测结果，按制品最终Ⅸ因子效价22~24IU/ml使用透析液②进行配制，使最终制品Ⅸ因子效价不小于20 IU/ml；根据人凝血因子Ⅸ效价添加肝素钠及抗凝血酶-Ⅲ（AT3）；每100IU人凝血因子Ⅸ的肝素含量为20 IU，AT3含量为4IU；得到人凝血酶原复合物稀配液；
人凝血酶原复合物稀配液经用0.2μm滤芯除菌、分装；每瓶分装20 ml，规格为每瓶含人凝血因子Ⅸ400IU；并按下述工艺进行冻干：
①制品-40℃以下入柜，保持5小时；
②开真空泵使真空度达到0.1 mbar稳定；
③2小时内隔板升温到-20℃，保持3小时；
④3小时隔板升温到3℃，保持25小时；
⑤4小时隔板升温到不超过35℃，保持8小时；
⑥1小时使真空到0.05 mbar以下，保持1小时以上；
⑦压塞出柜；
冻干后制品采用水浴灭菌柜，进行99~100℃，30 min干热灭活病毒，降温至35℃以下后出柜；真空检测，放入待检品库；
进一步，所述的洗涤液的配制方法：0.22 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠；用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2；洗脱液的配制方法：2 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠；用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2；
进一步，所述的透析液的配制方法：0.01mol/L枸橼酸钠；用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2；
进一步，所述的S/D洗涤液的配制方法：0.15 mol/L氯化钠+0.01mol/L枸橼酸钠，用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2；透析液的配制方法：0.01mol/L枸橼酸钠+2%甘氨酸+0.06mol/L氯化钠+0.5%盐酸精氨酸，用稀盐酸调节pH值为6.8~7.2；
进一步，所述的pH 4.0醋酸缓冲液是由乙酸钠与冰乙酸组成的水溶液，每升水中添加244.9mL质量浓度为99%冰乙酸和65.6g乙酸钠；
以上百分比除特别说明，其余均为重量百分比。
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