CN102586376A - 一种蛋清抗氧化肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蛋清抗氧化肽的制作方法。主要以鸡蛋蛋清粉为原料，经热变性、酶解、超滤、离子交换、凝胶过滤、真空浓缩干燥等工艺分离纯化得到高活性的蛋清抗氧化肽。本方法用碱性蛋白酶将鸡蛋清酶解，分离得到低分子量、具高抗氧化活性的蛋清酶解肽，除降低蛋白的抗原性，改善其功能特性，且更利于吸收外，该产品还可抑制和清除自由基，调整和改善生理功能，可应用于研制预防和治疗慢性疾病药物。为提高蛋清蛋白附加值、鸡蛋深加工及应用开辟新途径，市场开发前景广阔。

Description

一种蛋清抗氧化肽及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋清抗氧化肽及其制备方法。

背景技术

中国是世界上最大蛋品生产和消费国，2005年全国城镇居民家庭年消费鲜鸡蛋11.14公斤/人，大大超过世界平均水平。鸡蛋不仅营养丰富，且含大量具抗菌、抗病毒、抗癌症、调节免疫等多种生理活性物质。如溶菌酶、抗生物素蛋白、卵铁传递蛋白、特异性免疫球蛋白(IgY)和卵磷脂等备受关注，对人类健康起着非常重要的作用。有些已产业化并在医学、营养保健和功能食品等方面具有广泛的应用前景。

随着禽蛋产量大幅度增长，蛋品加工深度与技术含量不断提高。到目前为止，主要有三种蛋清深加工方法，即传统理化加工法、微生物发酵法以及蛋白酶体外酶解法。鸡蛋清经蛋白酶适宜酶解后，除可在一定程度上改善其功能特性和降低过敏原性蛋白的抗原性外，还可产生一些具有特殊生物学活性的小肽。国内外学者关于蛋清蛋白酶解产物抗肿瘤、抗高血压、免疫调节等研究取得显著成果。而对蛋清酶解产物抗氧化性的研究相对较少，更缺乏系统性。

发明内容

本发明以蛋清粉为原料，采用现代生物技术，以鸡蛋清蛋白为原料，研究鸡蛋清酶解产物的抗氧化性，采用超滤、离子交换和凝胶过滤等分离手段分离制备出了具抗氧化活性的生物活性肽-蛋清抗氧化肽，并对其抗氧化活性进行综合评价。

本发明的一方面在于，蛋清抗氧化肽的制备方法的技术方案包括如下步骤：

①蛋清酶解液制备

将蛋清粉溶于磷酸盐缓冲液中配制成蛋清液，蛋清液热变性后冷却；再按10000U/g蛋白的比例向上述蛋清液中加入碱性蛋白酶，并用磷酸盐缓冲液稀释上述蛋清液浓度至8～12mg/mL，置于45～55℃反应4～6h；再于沸水浴中灭酶，离心取上清液，即为蛋清酶解液；

其中，上述磷酸盐缓冲液为0.05mol/L、pH8.0；

②超滤

超滤分离步骤①获得的蛋清酶解液，收集分子量＜3k Da的组分，浓缩；

③DEAE-52离子柱层析

由步骤②获得的产物，经DEAE-52离子柱层析，依次以0.00、0.02、0.05、0.10、0.20mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，根据280nm处的吸光值图谱，分别收集洗脱下来的各蛋白峰对应的组分，收集以0.02mol/L NaCl溶液作为洗脱液的蛋白峰，浓缩；

④Sephadex G-25凝胶柱层析

步骤③所得的产物，经Sephadex G-25凝胶柱层析，洗脱液为蒸馏水，根据280nm处的吸光值图谱，分别收集洗脱下来的各蛋白峰对应的组分，其中平均分子量为273Da的蛋白峰为蛋清抗氧化肽。

具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的蛋清液，是由蛋清粉溶于0.05mol/L、pH8.0磷酸盐缓冲液中配制成浓度为80～150mg/mL。

具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的热变性的条件为，于80～90℃变性25～35min。

具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的沸水灭酶的时间为5～15min。

具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的离心条件为3500～4500r/min离心10～20min。

具体的，在上述的制备方法中，步骤①所述的冷却温度为45～55℃。

具体的，在上述的制备方法中，步骤②所述的超滤为：在0.3MPa条件下，用分子量为3kDa超滤膜超滤。

具体的，在上述的制备方法中，步骤②所述的浓缩为：真空浓缩至浓度为8～12mg/mL。

具体的，在上述的制备方法中，步骤③所述的浓缩为：真空浓缩至浓度为3～6mg/mL。

本发明的另外一方面在于，利用上述的制备方法制备得到的蛋清抗氧化肽。

本发明突出效果为：采用酶解、超滤、离子交换和凝胶过滤等生物技术手段，制备高活性的蛋清抗氧化肽，工艺技术路线合理。将蛋清粉水解为多肽物质，研究其抗氧化性，并经过超滤、离子交换和凝胶过滤分离手段得到较纯的具抗氧化活性的多肽，同时降低蛋白的抗原性，改善其功能特性，而且更利于吸收。该产品还可抑制和清除自由基，调整和改善生理功能，可应用于研制预防和治疗慢性疾病药物。为提高蛋清蛋白附加值、鸡蛋深加工及应用开辟新途径，市场前景广阔。

附图说明

图1DEAE-52离子交换层析分离HEW-2洗脱图谱；

图2DEAE-52分离各组分的超氧阴离子清除能力；

图3Sephadex G-25凝胶色谱分离HEW-2-2洗脱图谱；

图4Sephadex G-25分离各组分的超氧阴离子清除能力；

图5蛋清抗氧化肽分离纯化薄层层析图，其中，1-未纯化蛋清酶解液HEW；2-经3kDa超滤膜分离后抗氧化组分HEW-2；3-经DEAE-52离子交换层析后抗氧化组分HEW-2-2；4-经Sephadex G-25凝胶过滤层析后抗氧化组分HEW-2-2-3。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明实施例中所涉及的各试剂，如无特殊说明，均属于常规试剂，可从商业途径获得。

0.05mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液：(磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲溶液)50.0mL 0.2mol/LKH₂PO₄溶液加入46.80mL 0.2mol/L NaOH，定容至200mL。

蛋清粉、碱性蛋白酶：蛋清粉购自大连韩伟食品有限公司，碱性蛋白酶购自无锡酶制剂厂；

实施例1

1.蛋清酶解液制备

蛋清粉和碱性蛋白酶分别溶于磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH8.0)中备用，初始浓度均为100mg/mL。蛋清液85℃，变性30min，冷至50℃，分别测定蛋清液的蛋白含量及碱性蛋白酶的酶活性，然后按照10000U/g蛋白的比例加入酶液，用上述磷酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH8.0)控制蛋清液终浓度为10mg/mL，50℃反应5h，沸水灭酶10min，4000r/min离心15min，取上清液，即为蛋清酶解液，用HEW(Hydrolysates from Egg White)表示。

2.超滤

用3kDa超滤膜分离蛋清酶解液，在0.3MPa下将蛋清酶解液分离成＞3kDa的截留液HEW-1和＜3kDa的透过液HEW-2，测定两部分抗氧化性，浓缩备用。

超滤组分抗氧化性测定。用3kDa超滤膜将HEW分成HEW-1和HEW-2两部分。在5mg/mL相同浓度下，HEW、HEW-1和HEW-2的超氧阴离子清除率分别为12.75％、8.41％、15.94％。由此看出，HEW-2比HEW具更强的超氧阴离子清除能力。文献也表明，分子量＜3kDa多肽的抗氧化性更为理想。

超滤分离出具较强抗氧化性组分HEW-2，经过真空浓缩至10mg/mL，再经DEAE-52离子柱层析分离。

3.DEAE-52离子交换层析

超滤分离出强抗氧化活性的部分经DEAE-52离子交换层析(40×200mm)，洗脱液依次为0.00、0.02、0.05、0.10、0.20mol/L NaCl水溶液，进行梯度洗脱。上样浓度10mg/mL，上样体积5mL，洗脱速度80mL/h，部分收集器每管收集4mL，检测收集液280nm处吸光度和抗氧化性，判断抗氧化肽分离效果，将各组分合并浓缩，备用。

由图1可知，HEW-2经DEAE-52离子交换层析分离，不同盐浓度洗脱液梯度洗脱得到5个蛋白峰，分别为HEW-2-1(蒸馏水洗脱峰)、HEW-2-2(0.02mol/mL NaCl洗脱峰)、HEW-2-3(0.05mol/mLNaCl洗脱峰)、HEW-2-4(0.10mol/mL NaCl洗脱峰)和HEW-2-5(0.20mol/mLNaCl洗脱峰)。

各分离组分对超氧阴离子的清除率如图2所示，在0.5mg/mL浓度时，HEW-2-1无清除活性，HEW-2-2清除率为2.08％，HEW-2-3清除率为1.19％，HEW-2-4清除率为0.30％，HEW-2-5清除率为0.60％。可见，组分HEW-2-2对超氧阴离子清除能力最强。

重复上述步骤，制备大量HEW-2-2组分，真空浓缩至5mg/mL，再经Sephadex G-25凝胶色谱分离。

4.Sephadex G-25凝胶色谱

DEAE-52离子交换层析分离得具较强抗氧化性组分经Sephadex G-25凝胶色谱柱(13×440mm)进一步分离，洗脱液为蒸馏水，组分HEW-2-2的上样浓度5mg/mL，上样体积为1mL，洗脱速度40mL/h，部分收集器每管收集1mL，检测收集液在280nm处的吸光值和抗氧化性来判断抗氧化肽分离效果，将各组分合并浓缩，备用。

由图3可知，HEW-2-2经Sephadex G-25凝胶层析分离获得3个组分，根据凝胶层析分离原理，先流出的蛋白峰比后流出的蛋白峰分子量大，因此三个蛋白峰平均分子量由大到小的顺序依次为：HEW-2-2-1＞HEW-2-2-2＞HEW-2-2-3。各组分对超氧阴离子的清除率如图4所示，在0.5mg/mL蛋白浓度下，HEW-2-2-1的清除率为0.59％，HEW-2-2-2的清除率为1.20％，HEW-2-2-3清除率最高，达到2.41％，是HEW-2-2-1的4.1倍。从峰面积上看，HEW-2-2-3的含量也最多。可见，经Sephadex G-25凝胶色谱分离能得到活性较强的蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3。由此可见，分子量＜3kDa的蛋清酶解多肽，经逐步分离得到抗氧化性较强的多肽，其分子量相对较小。

5.薄层层析鉴定鸡蛋清抗氧化肽纯度

薄层层析时用硅胶板作支持物，正丁醇∶冰醋酸∶水(3∶1∶1)作展开剂，其中加入0.4％茚三酮。层析后在85℃显色15min。

由薄层层析图5可看出，未经纯化的鸡蛋清酶解液是各种肽和氨基酸的混合物，各组分别迁移率不同，故经染色剂染色后连成一片(图5中的1)；经超滤分离后，从薄层层析结果(图5中的2)可以看出减少了很多条带，说明已经除去大量杂蛋白；经DEAE-52纤维素离子交换层析分离得到的强抗氧化组分HEW-2-2，薄层层析染色后呈现3个点(图5中的3)，初步确定其由3个组分组成；最后经Sephadex G-25凝胶色谱分离出蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3，在薄层层析中呈现单一点(图5中的4)，说明蛋清抗氧化肽已基本上得到纯化，且通过凝胶色谱估测其相对分子量约为273Da。

由表1所示鸡蛋清酶解液经过逐步分离纯化，对超氧阴离子IC₅₀由33.41mg/mL降低到5.63mg/mL，最终纯化倍数达到5.63，分离得到薄层层析纯度的蛋清抗氧化肽HEW-2-2-3，其对超氧阴离子IC₅₀为5.63mg/mL，蛋白回收率为13.42％。

表1鸡蛋清抗氧化肽的分离纯化

纯化步骤	超氧阴离子IC50/(mg/mL)	纯化倍数	蛋白回收率/％
				鸡蛋清酶解液	33.41	1.00	100.0
超滤	18.03	1.85	58.4

DEAE-52离子交换层析	13.32	2.51	25.04
				Sephadex G-25凝胶色谱	5.63	5.93	13.42

6.超氧阴离子清除率测定：

邻苯三酚自氧化法：邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，自氧化过程中产生O₂ ^-·，O₂ ^-·加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色的中间产物，中间产物的积累在滞后30～45s与时间成良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢，有色物质在420nm处有强烈的光吸收。由于自氧化速度依赖于O₂ ^-·的浓度，清除O₂ ^-·则抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而评价清除O₂ ^-·的能力。

操作过程：按表2加入缓冲液和水(样品管加入0.50mL样品)，于25℃保持20min，加入25℃预热的邻苯三酚(空白用0.01mol/LHCl代替)，迅速摇匀，分别测定0.0、0.5、1.0、1.5、2.0min时420nm处的吸光值。用后一时刻减前一时刻，除以0.5min，得到变化率。连续算出3个变化率，取其平均值即为自氧化率(ΔA)。平行三次。

超氧阴离子清除率计算公式：

式中：ΔA₀---未添加样品的邻苯三酚自氧化率(nm/min)；

      ΔA_n---添加n小时酶解液的邻苯三酚自氧化率(nm/min)；

        R_n---n小时酶解液的清除率(％)；

        R_m---同一酶解反应的最高清除率(％)。

表2邻苯三酚自氧化法测定

7.数据统计与分析

由Origin7.5软件处理数据，分析标准偏差并绘图。用SPSS12.0软件分析样品超氧阴离子清除率，得到分离样品对超氧阴离子的半抑制浓度，用IC₅₀(mg/mL)表示。

Claims (10)

1.一种蛋清抗氧化肽的制备方法，其特征在于其方法包括：

①蛋清酶解液制备

将蛋清粉溶于磷酸盐缓冲液中配制成蛋清液，蛋清液热变性后冷却；再按10000U/g蛋白的比例向上述蛋清液中加入碱性蛋白酶，并用磷酸盐缓冲液稀释上述蛋清液浓度至8～12mg/mL，置于45～55℃反应4～6h；再于沸水浴中灭酶，离心取上清液，即为蛋清酶解液；

其中，上述磷酸盐缓冲液为0.05mol/L、pH8.0；

②超滤

超滤分离步骤①获得的蛋清酶解液，收集分子量＜3k Da的组分，浓缩；

③DEAE-52离子柱层析

由步骤②获得的产物，经DEAE-52离子柱层析，依次以0.00、0.02、0.05、0.10、0.20mol/LNaCl溶液进行梯度洗脱，根据280nm处的吸光值图谱，分别收集洗脱下来的各蛋白峰对应的组分，收集以0.02mol/L NaCl溶液作为洗脱液的蛋白峰，浓缩；

④Sephadex G-25凝胶柱层析

步骤③所得的产物，经Sephadex G-25凝胶柱层析，洗脱液为蒸馏水，根据280nm处的吸光值图谱，分别收集洗脱下来的各蛋白峰对应的组分，其中平均分子量为273Da的蛋白峰为蛋清抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的蛋清液，由蛋清粉溶于0.05mol/L、pH8.0磷酸盐缓冲液中配制成浓度为80～150mg/mL。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的热变性的条件为，于80～90℃变性25～35min。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的沸水灭酶的时间为5～15min。

5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的离心条件为3500～4500r/min离心10～20min。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤①所述的冷却温度为45～55℃。

7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于步骤②所述的超滤为：在0.3MPa条件下，用分子量为3kDa超滤膜超滤。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤②所述的浓缩为：真空浓缩至浓度为8～12mg/mL。

9.根据权利要求1或8所述的制备方法，其特征在于步骤③所述的浓缩为：真空浓缩至浓度为3～6mg/mL。

10.如权利要求1所述的制备方法制备出的蛋清抗氧化肽。

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