JPH04225999A - κ−カゼイノ−グリコマクロペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本方法はκ−カゼイノ−グリコマ
クロペプチド（以下ＣＧＭＰと云う）の製造方法に関す
る。ＣＧＭＰは哺乳動物乳から得たκ−カゼインにレン
ネット又はペプシンを作用させて得られるシアル化マク
ロペプチドである。

【０００２】

【従来の技術】ＣＧＭＰの１つの周知の実験室的製造方
法では、例えば酸カゼイン又はレンネットによって加水
分解されたカゼイネート又は脱塩したラクトースを含ま
ない甘性ホエーのような乳起源の出発物質をトリクロロ
酢酸で処理して、蛋白質を沈殿させ、ついで上澄液を回
収して透析し、最後に透析液を乾燥するものである。然
しこの方法は工業的な方法ではない。

【０００３】ＥＰＡ第２９１２６４号明細書によれば、
酸カゼイン、ナトリウムカゼイネートまたはカルシウム
カゼイネートをレンネットにより加水分解し、パラ−κ
−カゼインを凝固することによって、ＣＧＭＰは工業的
規模で生産することができる。次に上澄液をｐＨ４−５
に酸性化してカルシウムホスホカゼイネートを沈殿する
。 沈殿物を分離後、溶液を中性化し、逆浸透によって脱塩
し、最後に濃縮し、そして乾燥する。

【０００４】ＦＲＡ第２　　２８８　　４７７号明細書
によれば、チーズの製造から生ずるホエーから、ホエー
蛋白質を凝集し、上澄液を回収し、回収した上澄液を約
１５０００ダルトンの分画域値を有する膜を使用して限
外濾過を行い、シアロ−グリコプロテインを含有する保
留液を得、その保留液を硫酸で加水分解してシアル酸を
得、水酸化バリウムで中和し、沈殿した硫酸バリウムを
分離し、その上澄液からイオン交換によりシアル酸を単
離してグリコプロテインおよびシアル酸を工業的に製造
することができる。感染予防剤として使用するのに望ま
しい純度を有する、即ち蛋白質、ラクトースおよび残留
無機質を殆んど含有せず、かつ最大量のシアル酸を含有
するＣＧＭＰを供する方法は、上記の工業的な方法には
１つも無い。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明によって取り扱
う問題は上記の特性を有するＣＧＭＰを工業的規模で製
造することである。本発明はラクトースを一部除き、濃
縮したホエー生成物の蛋白質を凝集させ、その結果沈殿
物と第１上澄液を得、第１上澄液を回収し、限外濾過で
濃縮して保留液を得る、κ−カゼイノ−グリコマクロペ
プチドの製造方法に関する。本発明の方法は上記の保留
液をエタノールで処理して沈殿物と第２上澄液を得、第
２上澄液を回収し、ついで乾燥することを特徴とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の方法はホエー生
成物、例えばレンネットで凝固したカゼインを分離した
後濃縮し、ラクトースを部分的に除いた甘性ホエーを出
発原料として使用して行うことができる。例えば電気透
析および／又はイオン交換および／又は逆浸透によって
脱塩した、類似のホエー濃縮物も使用することができる
。ラクトースを強度に除去した、限外濾過ついで透析濾
過（洗浄を伴う限外濾過）によって得た甘性ホエー蛋白
質の濃縮物を使用するのが好ましい。これ等の出発物質
は液体の形態か又は粉末の形態であり、後者の場合には
その後の処理のために脱塩した水の中に分散するのが好
ましい。これらの出発物質は勿論牛、山羊、羊または水
牛のような反芻動物の乳から得る。

【０００７】ホエー蛋白質の凝集は蛋白質の強度の変性
（９０％以上）を前提とする。それは８０℃から１００
℃で１０分から３０分の熱処理によって、温度が低い場
合には長時間、あるいはその逆の条件で、例えば９０℃
で２０分間の熱処理によって行われる。熱処理中のｐＨ
値は４から７であり、６の水準が望ましい。ＣａＣｌ２
　は約６のｐＨで遊離のカルシウムイオンの濃度を５ｍ
Ｍ以上にするような量で添加し、ホエー蛋白質の凝集と
熱処理中のそれ等の不溶性を増加するのが好ましい。

【０００８】凝集の後ゲルが形成され、ついで好ましく
は脱塩水で希釈する。次に得たサスペンションを冷却し
、そして有機酸又は無機酸の水溶液、例えば塩酸の水溶
液で酸性化することによってｐＨ値を約４．５に調節す
る。変性したホエー蛋白質の沈殿が形成され、適当な分
離方法、例えば濾過又は遠心分離によって上澄液から分
離することができる。

【０００９】次に上澄液を５，０００から２０，０００
ダルトンの分画力を有する膜に通して限外濾過を行う。 本発明の目的に適した膜は有機質又は無機質である。限
外濾過工程は最初の容量の約半分に濃縮される迄継続す
るのが好ましい。続いて透析濾過を行う。即ち水、好ま
しくは脱塩水を一定容量になるよう添加する。即ちモジ
ュールに入る水の流速をモジュールから流出する透過液
の流速に合わせる。限外濾過と透析濾過の目的は保留液
中の無機質の含量を減ずることである。

【００１０】ＣＧＭＰは保留液からエタノール、好まし
くは無水エタノールを添加して抽出する。この基本的な
工程は残留可溶性蛋白質の殆ど全てを沈殿させて、ＣＧ
ＭＰを有する溶液を選択的に濃厚化することができる。 添加量は溶液中の蛋白質の濃度による。エタノールの添
加量がかなり少ない場合、蛋白質は一部沈殿するに過ぎ
ないから、ＣＧＭＰの純度に悪影響を及ぼす。他方多量
のエタノールを添加すると、ＣＧＭＰのような非蛋白態
窒素含有化合物の沈殿を助長し、収量の損失を生ずる恐
れがある。溶液の容量を基準として５から２５％のアル
コールの添加は満足すべき結果を示す。溶液のｐＨは４
から５にすべきであり、ｐＨ４．５に調節して蛋白質の
最適な沈殿を確実に得るのが好ましい。ｐＨは有機酸又
は無機酸、好ましくは適当な塩酸水溶液を添加して調節
する。 濾過および濃縮、例えば蒸発による濃縮の後、濃縮液を
例えば噴霧乾燥又は凍結乾燥によって乾燥する。脱シア
ル化ＣＧＭＰは任意に酵素により又は好ましくは酸によ
り加水分解して、前記のＣＧＭＰから調製することがで
きる。

【００１１】本発明を次例により説明する。例中、部お
よびパーセントは別に指示しない限り重量基準とする。 全窒素（ＴＮ）は蛋白質をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で
沈殿させた後に、非蛋白態窒素（ＮＰＮ）としてケルダ
ール法により測定する。蛋白質は（ＴＮ−ＮＰＮ）×６
．３８として得られる。ホエー蛋白質をＴＣＡで沈殿さ
せる実験室規模における通常のＣＧＭＰの製法において
は、上澄液を透析、ついでセファデックス（登録商標）
ゲルでクロマトグラフィ処理して精製する。シアル酸を
含有する画分は均一なピークを示し、それ等の回収液は
純粋なＣＧＭＰを供し、それはウシ起源のＣＧＭＰの場
合、平均１３％のシアル酸を含有する。

【００１２】従って、種々のＣＧＭＰの純度は上記の方
法で得たシアル酸の含量から計算し、純粋のウシ由来Ｃ
ＧＭＰについて％で示すことができる。これ等の純度率
が実際に事実と一致することを証明するために、純粋な
ＣＧＭＰを各調製品について、常法により単離する。各
々の場合、シアル化画分を回収して、凍結乾燥後１０％
以上のシアル酸を含有する生成物が入手できる（比較例
、表の最後の行）。残留ラクトース含量は溶離液として
１００ｍＭの酢酸水溶液を使用してセファデックスＧ−
５０（登録商標）ゲルのクロマトグラフィにより定量す
る。

【００１３】例１ ２０ｋｇのウシのホエー蛋白質濃縮物（ＷＰＣ）を１８
０ｋｇの脱塩水に分散させる。濃縮物は次の組成：を有
する。３００ｇのＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏを分散液に
添加し、ｐＨを１８％のＨＣｌ水溶液でｐＨ６に調節す
る。 分散液を前もって９０℃に加熱した二重壁の攪拌タンク
に移し、静かに攪拌しながらその温度に２０分間保持す
る。ゲルが形成され、４０ｋｇの脱塩水で希釈する。２
５℃に冷却し、ＨＣｌ水溶液の添加によりｐＨ４．５に
酸性化した後、分散液を９，０００ｒ．ｐ．ｍ．で回転
する遠心分離機にポンプで送る。３．５％の固形物を含
有する第１上澄液と残留液を回収する。次に残留液を１
８％のＨＣｌ水溶液でｐＨ４．５に酸性化した２０ｋｇ
の水に分散し、生成された分散液を９，０００ｒ．ｐ．
ｍ．で遠心分離し、５．１％の固形物を含有する第２上
澄液を得る。２つの上澄液を混合した後、混合物を、モ
ジュールにて３５℃の一定温度で７５分間その容量の半
分まで濾過する。即ち、モジュールは２０，０００ダル
トンの分画力をもつ、表面積が４ｍ２　の膜を有し、保
留液の再循環用タンクを備え、７バールの入口圧力であ
り、１２０リットル／時の一定した透過速度を有する。 モジュールから流出する透過液は０．５％の固形物含量
を有し、モジュールに入る混合物の２％に相当するシア
ル酸を含有する。次に１２５ｋｇの脱塩水をモジュール
中に導入し、除去した透過液を一定容量の操作に付する
ように徐々に補正する。洗浄後限外濾過を終了し、循環
タンクの保留液の容量は２３リットル、１６．５％の固
形物を含有する。即ち２９ｋｇに減少する。モジュール
の自容積内に含まれる液体を除去し、モジュールを脱塩
水で洗浄する。この液体と洗浄水は７．９％の固形物を
含有する１９ｋｇの付加的保留液になる。全保留液は４
８ｋｇに相当し、１３．２％の固形物を含有する。保留
液を脱塩水で１００ｋｇに希釈し、１６．５リットルの
無水エタノールを添加し、そしてＨＣｌ水溶液でｐＨを
４．５に調節した後、混合物を３０分間静かに攪拌する
。沈殿物が形成され、ついでそれを濾過する。１１０リ
ットルの濾液を得、ついで蒸発装置内で２８リットルに
濃縮し、そして凍結乾燥する。得た２９０ｇのＣＧＭＰ
は１０．９％全シアル酸と８．４％の蛋白質を含有する
。

【００１４】比較例 比較のために、ＣＧＭＰを調製する。即ち、Ｉ．　　Ｅ
ＰＡ第２９１　　２６４号明細書によって、ＩＩ．　　
　ＦＲＡ第２　　２８８　　４７７号明細書に記載の方
法と同様に、然しシアル酸を加水分解せず、即ち例１の
方法に従うがエタノールで残留ホエー蛋白質を沈殿しな
い方法によって、 ＩＩＩ．　　例１と同様な出発物質を使用したホエー蛋
白質濃縮液から、トリクロロ酢酸によりホエー蛋白質を
沈殿し、続いてセファデックス　　Ｇ５０（登録商標）
ゲル（ＴＣＡ／Ｇ−５０）のカラムで精製して、ＣＧＭ
Ｐを調製する。 生成物の分析結果を下記の表１に示す。

【００１５】

【表１】 組成　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＣＧＭＰ　
　　　　　　　　　　　　　　出発（％）　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ　　　　
ＩＩ　　　　　　　ＩＩＩ　　　　　　例１　　　　　
　ＷＰＣ　全窒素　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　−−　　　　　　１２．１　　　　　１
０．０９　　　　１０．０８　　　　１２．２５非蛋白
態窒素　　　　　　　　　　　　　　　　　　−−　　
　　　　　１．４６　　　　１０．０９　　　　　８．
７６　　　　　０．８１蛋白質　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　−−　　　　　　６７．６
　　　　　　０　　　　　　　　８．４　　　　　７３
　ＴＣＡ−可溶性シアル酸　　　　　　　　　５．２　
　　　　１．９　　　　　１３　　　　　　　１０．９
　　　　　　０．７　ラクトース　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　−−　　　　　　　１．３　　　
　　　０　　　　　　　　３．３　　　　　　７．８　
無機質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１１　　　　　　　２　　　　　　　−−　　　　
　　　　２　　　　　　　　２．８　ＣＧＭＰの純度　
　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　１５
　　　　　　１００　　　　　　　８４　　　　　　　
　５　ＴＣＡ／Ｇ５０によって精製　　　　−−　　　
　　　１３．４　　　　　１３　　　　　　　１１．８
　　　　　１２．８　した試料のシアル酸組成物 （通常の実験室的方法） 凡例：　　−−：測定せず

【００１６】本発明により製造したＣＧＭＰは、５％未
満の無機質含量、１０％未満の蛋白質含量、１０％以上
のシアル酸含量および８４％の純度を特徴とすることを
、上記結果は示している。対照的に、工業的方法により
得た生成物は４０％（Ｉ）および１５％（ＩＩ）の純度
である。

【００１７】例２ ＣＧＭＰに存在するシアル酸は常にジサッカライドに結
合し、そのグリカン鎖、即ち配列Ｇａｌβ１→３Ｇａｌ
ＮＡｃα１→Ｓｅｒ／Ｔｈｒの内側部分を形成する。従
って、ＣＧＭＰを脱シアル化すると、シアル酸が露出し
た生成物が得られ、大部分のガラクトース残基はマスク
され、末端のβ−ガラクトシドが露出する生成物に転換
されるので、各種性質を示す。脱シアル化ＣＧＭＰを得
るために、例１のＣＧＭＰを２５ｍＭのＨ２　ＳＯ４　
水溶液に、５重量／容量％の割合で溶解する。Ｈ２　Ｓ
Ｏ４　水溶液を添加してｐＨを２に調節した後、溶液を
８０℃に加熱し、その温度で２時間静かに攪拌する。６
，０００−８，０００ダルトンの分画力をもつ膜によっ
て、その溶液を純水に対し強度に透析した後、生成物を
凍結乾燥する。その特徴は次の通りである。 　　　　　　シアル酸　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　＜１％　　　　　　ガ
ラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５％　　　　　　Ｎ−アセチルガラク
トサミン　　　　　　　　　　　　　　６．２％加水分
解し、誘導化した後、ガスクロマトグラフィにより単糖
を同定し、検出する。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ラクトースを部分的に除いた蛋白質に
   濃縮したホエー生成物の蛋白質を凝集させ、その結果沈
   殿物と第１上澄液を得、第１上澄液を回収し、ついで限
   外濾過で処理して保留液を得る、κ−カゼイノ−グリコ
   マクロペプチドの製造方法において、保留液をエタノー
   ルで処理して沈殿物と第２上澄液を得、第２上澄液を回
   収し、ついで乾燥することを特徴とする、上記マクロペ
   プチドの製造方法。
2. 【請求項２】　　保留液の容量を基準としてエタノール
   を５から２５％加える、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】　　エタノールの添加後、媒質のｐＨを酸
   の水溶液の添加によって４−５に調節する、請求項１記
   載の方法。
4. 【請求項４】　　ホエー生成物を８０−１００℃／ｐＨ
   ４−７において１０から３０分間熱処理して、ホエー蛋
   白質を凝集する、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】　　ホエー蛋白質をカルシウムイオンの存
   在下で凝集する、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】　　ホエー蛋白質の凝集後、得られたサス
   ペンションを冷却し、そのｐＨを酸の添加により約４．
   ５に調節する、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】　　第１上澄液を５，０００から２０，０
   ００ダルトンの分画力を有する膜で限外濾過し、使用し
   た容量の約半分に濃縮し、ついで透析濾過して無機質含
   量を減ずる、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】　　第２上澄液を加水分解して脱シアル化
   する、請求項１記載の方法。