DE3877733T2

DE3877733T2 - Verfahren zur herstellung eines molkeeiweisshydrolysates und eines hypoallergenen nahrungsmittels.

Info

Publication number: DE3877733T2
Application number: DE8888120032T
Authority: DE
Inventors: Rolf Jost; Niklaus Meister; Julio Cesar Monti
Original assignee: Nestle SA
Current assignee: Nestle SA
Priority date: 1987-12-23
Filing date: 1988-12-01
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2008-12-02
Also published as: ES2053690T3; JPH022319A; EP0321603A1; PT89325A; PT89325B; AU613684B2; CA1334064C; MX169602B; ZA889280B; JPH0677504B2; US5039532A; AU2659688A; PH26140A; DE3877733D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Nahrungsmitteln mit reduzierter Allergenität.
Es ist bekannt, daß die Phänomene von Allergien gegen Kuhmilch und gegen Milchprodukte, die an die Bedürfnisse eines Kleinkindes angepaßt sind, und welche Milchprodukte Kuhmilch enthalten, darauf zurückzuführen sind, daß die aus dem Milchserum (der Molke) stammenden Eiweißstoffe der Kuhmilch sich von den Muttermilchproteinen unterscheiden und Allergene darstellen können. Unter diesen sind die erkannten Hauptallergene vorwiegend alpha-Laktalbumin (aLA) und beta-Laktoglobulin (bLG), und zu einem geringern Teil die Immunglo -buline (insbesondere das IgG) sowie das Serumalbumin (BSA).
Man hat versucht, deren Allergenität dadurch zu eliminieren, daß man sie durch Hydrolyse in Peptide umgewandelt hat.
Gemäß der US-PS Nr. 4 293 571 stellt man ein Proteinhydrolysat durch Hydrolyse mit Pankreas-Enzymen her, man koaguliert die nicht hydrolysierten Eiweißstoffe durch eine Wärmebehandlung, und dann unterwirft man das Hydrolysat einer Ultrafiltration, um die restlichen koagulierten Eiweißstoffe und die Makropeptide, welche Allergene darstellen können, zu eliminieren.
Es ist auch, z. B. gemäß Blatt und Kollegen, Anal. Biochem. 22: 161-165, oder gemäß der EP-A- Nr. 22 019 vorgeschlagen worden, die Hydrolyse der Molke- Eiweißstoffe direkt in einer Ultrafiltrationsanlage durchzuführen und die Peptide nach Maßgabe ihrer Bildung zu sammeln. In einem solchen mit einer Membran ausgestatteten Reaktor verbleiben die nicht-hydrolysierten Eiweißstoffe in dem Retentat, welches im Kreislauf zum Hydrolysenabteil rückgeführt wird, um erneut hydrolysiert zu werden. Es zeigt sich, daß es in der Praxis selbst unter diesen Bedingungen nicht möglich ist, alle Milchserumsproteine vollständig zu hydrolysieren. So sammelt sich z. B. das Serumalbumin in dem Hydrolysenreaktor an. Die verschieden Arten von Immunoglobulinen widerstehen ebenfalls einer Hydrolyse durch die Pankreas-Enzyme, und sie spalten sich nur teilweise. Die großen Fragmente oder Makropeptide, die durch Hydrolyse des Rinder-Kolostrum-Immunglobulins (IgG) durch Trypsin oder Papain erhalten werden, behalten die IgG-Allergenität im wesentlichen bei.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß es bekannt ist, daß es nicht ausreicht, das aLA und das bLG abzubauen, weil das BSA und das IgG für den Menschen Allergene darstellen und als solche beschrieben worden sind. Mit den bekannten physikalischen Trennmethoden gehen die kleinen Eiweißstoffe von hohem Nährwert verloren.
Die EP-A-87247 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinhydrolysats von annehmbarer organoleptischer Qualität, ohne bitteres Peptid, für die Verpflegung im Krankenhaus, unter Verwendung eines kombinierten Enzym- Systems auf der Basis eines Gemisches einer aus Pilzen stammenden Protease und von Pankreatin, welches System zu einer raschen Hydrolyse von Eialbumin oder von Soja-Protein führt. Findet die Hydrolyse in zwei Stufen statt, dann ist eine Zwischenwärmebehandlung vorgesehen, deren Ziel die Inaktivierung des ersten Enzyms ist, damit dasselbe nicht das zweite Enzym verdaut. Am Ende der Behandlung bleiben beträchtliche Mengen nicht-hydrolysierter Proteine zurück, welche Allergene sein können.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung eines Eiweißhydrolysates aus tierischer Milch, welches praktisch frei von Allergenen ist, die aus Eiweißstoffen stammen, und bei welchem Verfahren ein Molkeprodukt enzymatisch hydrolysiert wird.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Eiweißhydrolysates aus tierischer Milch, bei welchem ein Molkeprodukt in zwei getrennten Hydrolyseschritten enzymatisch hydrolysiert wird und das Enzym thermisch inaktiviert wird.
Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Hydrolyseschritte mit einem unter Trypsin, Chymotrypsin, einem Gemisch aus Trypsin und Chymotrypsin, und Pankreatin ausgewählten proteolytischen Enzym erfolgen und daß das Hydrolysat der ersten Hydrolyse in wäßringer Lösung bei 80 bis 100º C während 3 bis 10 Minuten bei einem pH-Wert von 6 bis 8 thermisch behandelt wird, um die nach der ersten Hydrolyse intakt gebliebenen Eiweißstoffe zu denaturieren und sie so für die zweite Hydrolyse empfindlich zu machen, sodaß nach der zweiten Hydrolyse das Hydrolysat von Allergenen wie Eiweißstoffen, Eiweißstoffragmenten oder von Makropeptiden mit Molekulargewichten über ungefähr 10.000 praktisch frei ist.
Ein entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß es nicht notwendig ist, auf eine Entfernung der resentlichen Eiweißstoffe von hohem Nährwert durch physikalische Abtrennung zurückzugreifen.
Das erhaltene Hydrolysat ist besonders für die Ernährung von Kleinkindern bestimmt, bei denen die Risken einer Allergie oder einer erworbenen Allergie bestehen.
Im Rahmen der vorliegenden Unterlagen ist unter dem Ausdruck "Allergen" ein "Eiweißstoff (Protein) oder Makropeptid zu verstehen, welcher bzw. welches befähigt ist, bei Subjekten, insbesondere bei empfindlichen Kleinkindern oder Säuglingen, allergisch Reaktionen auszulösen." Es wird angenommen, daß ein Hydrolysat oder ein Nahrungsmittel, welches ein solches Hydrolysat enthält, dann hypoallergen ist, wenn man mit den üblichen Analysenmethoden, wie z. B. durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), durch Polyacrylamid- Gel-Elektrophorese (SDS- PAGE) oder - falls es mit diesen Methoden nicht mehr möglich ist, Protein- oder Makropeptid-Antigene nachzuweisen - durch immunologische Verfahren, z. B. durch Doppelimmundiffusion (ID), dar Vorliegen von Proteinen oder von großen Fragmenten oder Makropeptiden eines Molekulargewichtes von mehr als etwa 10.000 nicht mehr nachweisen kann.
Zur Durchführung des vorliegenden Verfahrens kann man von irgendeinem enzymatischen Hydrolysat aus einem Molke-Ausgangsmaterial, welches Milchserum-Proteine enthält, ausgehen. Dieses Ausgangsmaterial kann ein aus der Käserei stammendes Milchserum, insbesondere ein süßes Milchserum, wie z. B. jenes sein, welches durch Koagulieren des Caseins mit Labferment gewonnen wird, es kann ein saures Milchserum sein, welches durch Koagulieren des Caseins mit einer Säure oder mit säurebildenden Gärungserregern gewonnen worden ist, oder es kann auch ein gemischtes Milchserum sein, welches durch eine Koagulation mit Säure und mit Labferment gewonnen worden ist.
Dieses Ausgangsmaterial kann ein Milchserum sein, welches durch Ionenaustausch und/oder durch Elektrodialyse entmineralisiert worden ist. Es kann ein Konzentrat aus Milchserumproteinen sein, aus denen die Laktose mehr oder weniger entfernt worden ist, und welches z. B. durch Ultrafiltration mit gegebenenfalls anschließender Dialyse erhalten worden ist. Das Ausgangsmaterial kann auch noch eine Kombination der vorstehenden Ausgangsmaterialien und von Laktose sein. Es kann in der Form einer echten oder kolloidalen, wässerigen Lösung oder eines Pulvers vorliegen. Im letztgenannten Fall löst man das Pulver unter Bildung einer wässerigen Lösung in vorzugsweise entmineralisiertem Wasser auf. Das Ausgangsmaterial wird einer enzymatischen Hydrolyse unterworfen, und zwar mit proteolytischen Enzymen, welche im Gemisch vorliegen oder gereinigt sind, und welche im basischen und neutralen Bereich aktiv sind, wie z. B. in an sich bekannter Weise mit Trypsin, Chymotrypsin oder Pankreatin.
Die vorhergehende Hydrolyse kann während einer relativ kurzen Zeit von vorzugsweise 5 bis 35 min, z. B. 10 min, und mit einer geringen Enzymmenge, z. B. mit 10 % der für die Hydrolysen eingesetzten Gesamtmenge, durchgeführt werden, wodurch man Enzym sparen kann. Die Hydrolyse ist dann eine teilweise. Diese Hydrolyse kann in einem Reaktor, oder als Variante hievon in einem Rohr, stattfinden.
Für den Fall, daß das für die Hydrolyse bestimmte Substrat dazu neigt, während der Wärmebehandlung zu koagulieren, kann man vorsehen, zu dem Substrat einen Komplexbildner, wie z. B. Calcium- oder Magnesiumcitrat, zuzugeben, wie dies z. B. in der US-PS Nr. 4 748 034 angegeben ist.
Erfindungsgemäß wird das Hydrolysat einer Wärmebehandlung bei 80 bis 100º C während 3 bis 10 min und bei einem pH-Wert von 6 bis 6 unterworfen. Es versteht sich von selbst, daß die Dauer und die Temperatur miteinander verknüpft sind, wobei die untere Grenze für die Temperatur der Obergrenze für die Dauer entspricht, und umgekehrt. Es hat sich erwiesen, daß in industriellen Wärmeaustauschern eine Temperatur von etwa 90º C und eine Verweildauer von etwa 5 min ausreichen, um die Denaturierung der untergeordneten Proteine zu bewirken. Es hat sich in der Tat gezeigt, daß eine solche Denaturierung diese Proteine für den späteren enzymatischen Abbau zugänglich macht. Man sollte erhwähnen, daß das Enzym durch die Wärmebehandlung inaktiviert wird.
Anschließend kühlt man das Hydrolysat auf 40 bis 60º C, vorzugsweise auf etwa 55º C, ab, was die optimale Temperatur für die hydrolytische Aktivität ist, und man stellt den pH-Wert vorzugsweise durch Zugabe einer wässerigen Lösung einer Base auf etwa 7,5 ein.
Die Bedingungen der zweiten Hydrolyse können variieren. Gemäß einer ersten Ausführungsform führt man die zweite Hydrolyse diskontinuierlich, nämlich chargenweise in einem mit einem Thermostaten versehenen Reaktionsbehälter durch. Nachdem man das proteolytische Enzym, welches aus Trypsin, Chymotrypsin, Pankreatin und einem Gemisch von Trypsin und Chymotrypsin ausgewählt ist, in wässeriger Lösung zugesetzt hat, führt man die Hydrolyse während 60 bis 180 min durch.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform, welche bevorzugt wird, findet die zweite Hydrolyse kontinuierlich, während 1 bis 60 min, und vorzugsweise während 2 bis 20 min, in einem den Reaktor darstellenden Rohr unter turbulenten Bedingungen statt. Bei dieser Variante richtet sich die unter Berücksichtigung der Durchsatzmenge an dem zu hydrolysierenden Produkt erforderliche Reaktionszeit nach der Länge des Rohres. Demzufolge muß das Enzym am Einlaß in die Verweilstrecke durch Pumpen kontinuierlich zugeführt werden. Die sich daraus ergebenden Bedingungen einer starken Verwirbelung bewirken einen raschen und intensiven Kontakt zwischen dem Enzym und dem Substrat.
Egal, welche Ausführungsform für die zweite Hydrolyse gewählt wird, stets wird das Hydrolyseprodukt einer Wärmebehandlung unterworfen, welche die Inaktivierung des Enzyms bewirkt. Diese Wärmebehandlung besteht in einem Vorerwärmen des Hydrolysates auf eine Temperatur von höher als oder gleich 75º C und dem Halten des Hydrolysates auf dieser Temperatur von vorzugsweise 75 bis 85º C während etwa 5 min, um eine Selbstverdauung des Enzyms zu begünstigen; und vorteilhafterweise folgt auf diese Behandlung eines Sterilisierung, welche vorzugsweise bei einer ultrahohen Temperatur, z. B. von 125 bis 135º C, während 2 bis 3 min vorgenommen wird, und zwar durch Einführen von Dampf oder in einem Wärmeaustauscher.
Das Hydrolysat kann anschließend im Hinblick auf eine Verwendung zu einem späteren Zeitpunkt getrocknet werden, z. B. durch Zerstäuben oder durch Gefriertrocknen, oder es kann das Hydrolysat auch später behandelt werden. In diesem letztgenannten Fall kann die Inaktivierung des Enzyms während der späteren Behandlung durchgeführt werden.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Hydrolysat kann zahlreichen Nahrungsmittelpräparationen für den Diätgebrauch, insbesondere für die Diät von Kleinkindern oder von Rekonvaleszenten, oder licht resorbierbaren Nahrungsmitteln für den Gebrauch durch Personen, die an Allergien leiden, einverleibt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Nahrungsmittels, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß zu dem Hydrolysat Kohlehydrate, Mineralsalze und Fette in flüssigem Zustand, welche gegebenenfalls fettlösliche Vitamine enthalten, zugefügt werden, und daß man zu dem Hydrolysat gegebenenfalls eine wäßrige Lösung zusetzt, die wasserlösliche Vitamine und Spurenelemente enthält, und daß das Hydrolysat anschließend getrocknet wird.
Man kann durch Gefriertrocknen, oder vorzugsweise durch Zerstäuben trocknen.
Als Variante kann man das Enzym durch Sterilisieren bei ultrahoher Temperatur inaktivieren, wonach man das Produkt in flüssigem Zustand verpackt, statt es zu trocknen.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich die Teile und Prozentsätze in diesen Beispielen auf das Gewicht.
In diesen Beispielen sind die nachstehenden Analysenverfahren ausersehen, um damit das Fehlen von restlichen Proteinen oder Makropeptiden nach der zweiten Hydrolyse nachzuweisen.
I/SDS-PAGE, gemäß Laemmli, U.K. 1970, Nature 227:680 ff., unter den nachstehend angeführten besonderen Bedingungen: Parameter Sammelgelschicht Trenngel gesamtes Acrylamid (%), Vernetzungsmittel (%), Natriumdodecylsulfat (SDS,%) ergänzt auf 100 % durch Zugabe von destilliertem Wasser Abmessungen der Gelschichten auf den Platten (mm) Probe (ug, berechnet als Gesamtstickstoff, NT) Stromstärke (mA/Platte) Elektrophorese-Farbmarker: Coomassie-Brilliant Blau G-250 Elektrophorese-Pufferlösung: 0,025 M Tris, 0,19 M Glycin, 0,1 % SDS;
Herstellung der Proben: Man dispergiert die Proben in einer wässerigen Pufferlösung, welche 1 % SDS und Dithiothreit als Reduktionsmittel enthält. Man erhitzt rasch bis auf 100º C. Anschließend führt man die Alkylierung durch Iodacetamid in einer wässerigen 2M-Tris-Pufferlösung vom pH 8 durch (18 mg in 0,1 ml Pufferlösung). In gewissen Fällen läßt man absichtlich die Reduktion und die Alkylierung weg, umd die Proteine im nicht-reduzierten Zustand nachzuweisen.
Empfindlichkeit: Nach diesem Verfahren lassen sich etwa 0,1 ug der Proteine BSA, aLA und bLG nachweisen. Wegen des diffusen Charakters der Banden ist die Nachweisgrenze für die H- und L-Ketten der IgG und der intakten (nicht-reduzierten) IgG höher.
II/ID, gemäß Ouchterlony, o, Acta. Pathol. Microbiol. Scand. 26:507, unter den nachstehend angeführten, spezifischen Versuchsbedingungen:
Parameter Bedingungen
Wässerige Agarlösung 1,5 %ig (Gew./Vol.), Ager des Typus I von Calbiochem, in einer Kochsalzlösung eines Phosphatpuffers vom pH 7,2
Agargele Auf Fixierfilm (Produkt LKB Nr. 1850-102)
Durchmesser der Öffnungen (mm) 3
Anfärben der gewaschenen Gele Coomassie-Brilliant Blau R-250 in einer Lösung aus Ethanol/Wasser/Essigsäure (45/45/10, %:Vol./Vol.)
Entfärben Coomassie-Brilliant Blau R-250 in einer Lösung aus Ethanol/Wasser/Essigsäure (45/45/10, %:Vol./Vol.)
Verfahren: Die unverdünnte Probe besteht aus einer physiologischen Kochsalzlösung von 100 mg/ml. Man bildet aufeinanderfolgende Verdünnungen im Verhältnis von 2:1 aus, und man füllt die aufeinanderfolgenden Öffnungen, einerseits mit der Probe und andererseits mit spezifischen Kaninchenseren, welche jeweils Anti-bLG-, Anti-aLA-, Anti-BSA- bzw. Anti-IgG-Antikörper in einer Konzentration von 1/16 der Anfangskonzentration der Probe enthalten. Der Nachweis des Proteins entspricht der Antigen-Antikörper-Präzipitationsreaktion. Bemerkt sei, daß der erste Titer (ausgedrückt als Bruch der Anfangskonzentration) einem Fehlen der Reaktion entspricht.
Empfindlichkeit des Verfahrens: Die Grenzkonzentration für den Nachweis von ALA und bLG liegt bei 20 ug/ml (Volumen der Probe 10 ul), und jene von BSA und IgG liegt bei 40 ug/ml.
III/HPLC: Gemäß Diosady, L.L. et al., 1980, Milchwissenschaft 35: 671; und Bican, P. et al., 1982, Milchwissenschaft 37:592.
Durch eine Analyse auf einer TSK 3000-SW-Säule wird das Fehlen eines Peaks für das BSA und das IgG nach der zweiten Hydrolyse durch Vergleichmit den intakten Proteinen unter den nachstehenden Bedingungen bestätigt.
Lösungsmittel: Pufferlösung, 0,05 M Tris-HCl, 4 M Guanidin, pH, 6,8
Probe: 1 mg des Hydrolysates oder Proteins (Kontrolle)
Detektion: 280 nm, Durchsatz 1 ml/min
Temperatur der Säule: 20º C
Bedingung eines isokratischen Gradienten.

Beispiel 1

Man dispergiert 24 g eines Pulvers aus saurer, entmineralisierter Molke (DWP) unter Rühren in entmineralisiertem Wasser, und man erhitzt langsam bis zum Auflösen. Die so erhaltene Lösung hat ein Volumen von 80 ml und einen Gehalt an Trockensubstanz von 30 %.
Das eingesetzte Pulver aus entmineralisierter Molke hat die folgende Zusammensetzung: Proteine(N x 6,38) Fette Laktose Asche Feuchtigkeit
Man bringt die Lösung in einen mit einem Thermostaten auf 55º C gehaltenen Doppelwandreaktor ein. Man erhöht den pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer 20 %igen (Gew./Vol.) wässerigen Dispersion von Ca(OH)&sub2; auf 8.
Dann fügt man 30 mg Schweine-Trypsin der Stärke von 1500 Einheiten/mb (Pharmakopöe der USA, USP) hinzu. Man beobachtet eine rasche Abnahme des pH-Wertes (wegen des Beginns der Hydrolyse), welche Abnahme man bei einem pH-Wert von 7,5 unter Verwendung einer wässerigen 1N KOH-Lösung stoppt, und man hält den pH-Wert auf diesem Wert mit einem pH-Staten durch automatischen Ausgleich mit Hilfe einer wässerigen 1N KOH-Lösung. Die Reaktion schreitet während 4h bei 55º C fort, wonach man keine durch Titration nachweisbare Reaktion mehr beobachtet.
Man trennt das Hydrolysat in vier gleich Portionen auf:
1a: Man fügt zu 20 ml des Hydrolysates eine wässerige Lösung hinzu, welche 6 mg Soja-Trypsin-Inhibitor (STI) enthält, um die Wirkung des Trypsins zu blockieren, wonach man die Lösung durch Gefriertrocknung trocknet.
1b: Man erhitzt 20 ml des Hydrolysates während 1 min auf 70º C, und man hält das Hydrolysat während 5 min auf dieser Temperatur.
1c: Man erhitzt 20 ml des Hydrolysates während 2,5 min auf 80º C, und man hält das Hydrolysat während 5 min auf dieser Temperatur.
1d: Man erhitzt den Rest des Hydrolysates während 4 min auf 90º C, und man hält das Hydrolysat während 5 min auf dieser Temperatur.
Man kühlt die Hydrolysate 1b, 1c und 1d rasch auf 55º C ab, und dann führt man sie getrennt in die Reaktoren ein. In jeden Reaktor bringt man 30 mg des vorstehenden Trypsins ein, und dann läßt man die Reaktion während 1 h bei 55º C und bei einem pH-Wert von 7,5 fortschreiten, wonach man keine durch Titration nachweisbare Reaktion mehr beobachtet. Dann gibt man zu jedem der Hydrolysate 6 mg STI zu, und man trocknet dieselben getrennt durch Gefriertrocknen. Die so erhaltenen Hydrolysate werden mit 1e, 1f bzw. 1g bezeichnet.
Die Ergebnisse der Analyse durch Elektrophorese (SDS-PAGE) und durch Doppelimmundiffusion (ID) hinsichtlich der Titer an Rinderserumalbumin (BSA) und Immunglobulin G (IgG) sind in der nachstehenden tabelle 1 angeführt. Tabelle 1 Proben durch SDS-PAGE durch ID Legende: +++ ≥1 ug in 10 ug Nt + ≥0,1 ug in 10 ug Nt 0 nicht nachweisbar, < 0,1 ug in 10 ug Nt

Ergebnisse:

Während die Titer durch ID für eine wässerige Lösung von 100 mg/ml des eingesetzten, entmineralisierten Molkepulvers die folgenden sind:
aLA: 1/256 - 1/512
bLG: 1/512 - 1/1024
BSA: 1/8 - 1/32 und
IgG: 1/8 - 1/64
läßt sich das Vorliegen von alpha-Laktalbumin (aLA) und von beta-Laktoglobulin (bLG) mit SDS-PAGE und ID in keiner der Proben nachweisen.
Die Hydrolyse reicht nicht aus, um die aus den Proteinen BSA und IgG (1a) bestehenden Allergene zum Verschwinden zu bringen.
Selbst wenn das Hydrolysat wärmebehandelt wird, genügt dies nicht, um das BSA zu eliminieren (1b, 1c, 1d).
Um ein Hydrolysat von reduzierter Allergenität zu erhalten, bedarf es einer entsprechenden Wärmebehandlung, auf welche eine zweite Hydrolyse folgt (1f, 1g).

Beispiel 2

Man dispergiert 150 g eines Konzentrates aus Milchserumproteinen, welche durch Ultrafiltration von süßer Molke (WPC) erhalten worden sind, in 1 Liter entmineralisiertem Wasser von 50º C in einem mit einem Thermostaten auf 50º C gehaltenen Doppelwandreaktor.
Das eingesetzte Konzentrat von Milchserumproteinen hat die folgende Zusammensetzung: Proteine (N x 6.38) Fette Laktose Asche Feuchtigkeit
Man erhöht den Anfangs-pH-Wert durch Zugabe einer 20 %igen (Gew./Vol.) wässerigen Dispersion von Ca(OH)&sub2; von 6,6 auf 7,9. Man regelt den pH-Staten derart, daß der pH-Wert durch automatischen Ausgleich mit einer wässerigen Lösung von 2N KOH auf 7,3 gehalten wird.
Man fügt 7,5 g von aus dem Pankreas stammendem Trypsin einer Stärke von 3 Anson-Einheiten (AU)/g hinzu, um die Hydrolyse einzuleiten, und man fährt mit der Reaktion während 4 h bei 50º C fort. Anschließend erhitzt man das Hydrolysat auf 90º C durch Einführen von Dampf, und man hält das Hydrolysat während 5 min auf dieser Temperatur. Nach dem Abkühlen auf 55º C stellt man den pH-Wert durch automatischen Ausgleich mit einer wässerigen 2N KOH-Lösung wieder auf 7,3 ein. Dann führt man 2 g Schweine-Trypsin (Stärke 6 AU/g) ein, um die zweite Hydrolyse einzuleiten, welche man während 2 h mit automatischem Ausgleich des pH-Wertes durchführt. Anschließend wird das Hydrolysat während 10 min bei 90º C wärmebehandelt, wonach es rasch abgekühlt und durch Lyophilisieren getrocknet wird.
Um die Hydrolyse zu verfolgen, entnimmt man in den verschiedenen Stadien der Hydrolyse Proben von 1 ml, zu welchen man jedesmal 6 mg STI hinzufügt, und welche man rasch einfriert und durch Lyophilisieren trocknet.
Die Ergebnisse aufgrund einer ID-Analyse sind in der nachstehenden Tabelle 2 angeführt. Tabelle 2 Probe Stadium der Hydrolyse/Dauer (min) Wärmebehandlung nach dem 1.Stadium, Temperatur (ºC)/Dauer (min) Wärmebehandlung nach dem 2.Stadium, Temperatur (ºC)/ Dauer (min) Fortsetzung der Tabelle 2 Probe ID1)-Titer von: Kontrolle = Ausgangs-WPC Legende: - Fehlen einer Wärmebehandlung;1) Anfangskonzentration vor der Verdünnung: 25 mg an Trockensubstanz/ml;
Man bringt die vorstehende Dispersion in einem mit einem Thermostaten auf 55ºC gehaltenen Doppelwandreaktor ein. Die Dispersion weist einen Gehalt an Trockensubstanz von 30,1 % und einen pH-Wert von 6,4 auf. Man erhöht den pH-Wert durch Zugabe einer wässerigen 20 %igen Ca(OH)&sub2;-Dispersion auf 7,8. Dann fügt man 1 kg Schweine-Trypsin (Stärke 6 AU/g, Verhältnis zwischen der Aktivität des Trypsins und jener des Chymotrypsins ist gleich 15:1 bis 20:1, gemäß USP) hinzu, welches in einer wässerigen Lösung von 0,01 M HCl von 5-10ºC dispergiert ist, um die Hydrolyse einzuleiten. Man stoppt anschließend den raschen anfänglichen Abfall des pH-Wertes, und man hält denselben mit einem pH-Staten durch automatischen Ausgleich mit Hilfe einer wässerigen 2N KOH- Lösung auf 7,3.
Die Hydrolyse wird bei 55º C und bei einem pH-Wert von 7,3 während 3 h durchgeführt, wonach man den pH-Wert durch Einstellen des pH-Staten auf den neuen Wert auf 7,6 erhöht. Anschließend führt man das Hydrolysat durch einen Platten-Wärmeaustauscher, um dasselbe rasch auf 90º C zu erhitzen, und von dort in eine Verweilstrecke (Durchsatz 7,5 l/min, Volumen der Strecke 40 l, Verweilzeit 5 min), und dann in einen zweiten Platten-Wärmeaustauscher, wo das Hydrolysat auf 55º C abgekühlt wird.
Dann pumpt man das Hydrolysat mit einem Durchsatz von 7,5 l/min mit Hilfe eines T-Ventils in eine Verweilstrecke mit einem Durchmesser von 0,025 m und einem Volumen von 150 l, was einer Verweilzeit von 20 min über die gesamte Länge entspricht. Man pumpt auch 1 kg Trypsin (die gleich Dispersion wie oben) in den Strom des Hydrolysates, und zwar mit einem Durchsatz von 6 l/h und mit Hilfe des T-Ventils am Einlaß der Verweilstrecke. Die Verweilstrecke ist in Abschnitte unterteilt, welche fortschreitende Verweilzeiten von 40 s bis 20 min ermöglichen. Man entnimmt eine Hydrolysatprobe von einigen ml am Beginn der Strecke (ohne Verweilzeit), wonach man diese Proben, für jede Verweilzeit, sofort mit der entsprechenden Menge an STI behandelt und einfriert. Nach einem Vorerwärmen auf 80º C, mit einer Verweilzeit von 5 min, pumpt man den Rest des Hydrolysates (welches einer Verweilzeit von 20 min unterworfen worden ist) in einen bei Ultrahochtemperatur arbeitenden Sterilisator, wo das Hydrolysat während 2 min auf 125º C erhitzt wird, um das Enzym zu inaktivieren und das Hydrolysat zu sterilisieren. Nachdem man das Hydrolysat abgekühlt hat, trocknet man dasselbe durch Zerstäuben.
Das erhaltene Pulver hat die folgende Zusammensetzung: Peptide Laktose Asche Fette Feuchtigkeit
Der Hydrolysengrad, nämlich Stickstoff x 100/Gesamtstickstoff (Nt), beträgt 18 %, und der Nt beträgt 3,56 %.
Durch SDS-PAGE-Analyse wird das Fehlen von Proteinbanden in Produktchargen von 139 ug (5 ug Nt) und von 500 ug (18 ug Nt) bestätigt. Insbesondere beobachtet man keine Bande, welche dem BSA, den H- und L-Ketten der IgG, dem aLA oder dem bLG entspricht. Man sieht eine gefärbte, diffuse Bande, welche auf große Peptide zurückzuführen ist, und welche nahe beim Anodenende des Gels angeordnet ist.
Bei der ID-Analyse sieht man mit Anti-BSA-, Anti-IgG-, Anti-bLG- und Anti-aLA- Seren und ausgehend von einer Probe mit einem Gehalt an Trockensubstanz von 100 mg/ml vor dem Verdünnen keine Präzipitationslinie.
Die nachstehende Tabelle 3 zeigt den Einfluß der Verweilzeit anläßlich der zweiten Hydrolyse, auf das BSA im speziellen. Tabelle 3 ID1)-Titer Probe Dauer der Verweilzeit (s) durch SDS-PAGE (Charge von 500 ug) (Kontrolle ohne Hydrolyse) (mit abschließender Wärmebehandlung von 125ºC/2 min) Legende: 1) Die Anfangskonzentration vor dem Verdünnen beträge 100 mg an Trockensubstanz/ml.

Ergebnisse

SDS-PAGE: Man beobachtet eine rasche Abnahme in der Stärke der BSA-Bande nach bereits 40 s. Nach 2 min ist die Bande praktisch nicht mehr nachweisbar. Im Vergleich zu aufeinanderfolgenden Verdünnungen von reinem BSA ist die Grenze der Empfindlichkeit des Verfahrens für Chargen von 50 ng erreicht. Es läßt sich beweisen, daß die Endkonzentration an dem BSA in dem Hydrolysat nach 20 min Verweilzeit kleiner als 0,01 %, ausgedrückt als Trockensubstanz, im Vergleich zu einer geschätzten Anfangskonzentration von 1,8 bis 2,2% ist.
ID: Ein Titer von Null oder 1 wird nach 6 min Verweilzeit erreicht. man sieht, daß die Hydrolyse der nach der ersten Hydrolyse intakt gebliebenen Proteine relativ rasch vor sich geht.

Beispiel 4

Man verfährt wie im Beispiel 3, jedoch mit der Ausnahme, daß die für die zweite Hydrolyse zugesetzte Enzymmenge nur halb so groß ist (was 75 % der im Beispiel 3 verwendeten Gesamtenzymmenge für die 1. und 2. Hydrolyse darstellt). Die Analyse auf BSA gemäß ID zeigt einen Titer von 0 bis 1 nach einer Verweilzeit von 10 min. Demzufolge kann die eingesetzte Enzymmenge verringert werden, wenn die Verweilzeit bei der zweiten Hydrolyse zunimmt.

Beispiel 5

Man verfährt wie im Beispiel 3, jedoch mit der Ausnahme, daß die Dauer der ersten Hydrolyse 2 h beträgt, und daß die zweite Hydrolyse während 2 h bei einem konstanten pH-Wert von 7,3 in einem Reaktor durchgeführt wird. Die Analysen auf BSA gemäß SDS-PAGE und ID zeigen das Verschwinden des Proteins in dem Hydrolysat.

Beispiel 6

Man setzt das gleich Ausgangsmaterial wie im Beispiel 3, und in der gleichen Menge, betreffend die DWP, die WCP und das Wasser ein, und man bringt die Dispersion in einen mit einem Thermostaten auf 55º C eingestellten Doppelwandreaktor ein, wonach man zu der Dispersion 200 g Trypsin zugibt. Man führt die Hydrolyse während 10 min durch, wobei man den Abfall des pH-Wertes durch Zugabe von 2N KOH ausgleicht.
Man führt das Hydrolysat anschließend in einen Plattenwärmeaustauscher ein, in welchem das Hydrolysat während 5 min auf 90º C erhitzt wird; wonach man das Hydrolysat auf 55º C abkühlt.
Anschließend bringt man das teilweise hydrolysierte und wärmebehandelte Produkt in den mit einem Thermostaten auf 55º C eingestellten Reaktor ein, und man gibt 1,8 kg Trypsin zu, welches in einer wässerigen 0,01 M HCl-Lösung dispergiert ist. Man gleicht den Abfall des pH-Wertes durch Zugabe von 2N KOH aus.
Nach einer 3-Stündigen Hydrolyse führt man die Inaktivierung und die Selbstverdauung des Enzyms durch, indem man das Hydrolysat während 5 min auf 80º C erhitzt. Anschließend sterilisiert man das Hydrolysat bei 125º C während 2 min.

Beispiel 7

Man verfährt wie im Beispiel 6, jedoch mit der Ausnahme, daß man die erste Hydrolyse in einer Verweilstrecke während 10 min durchführt. Die Wärmebehandlung findet anschließend in dem Wärmeaustauscher bei 90º C während 5 min statt. Die zweite Hydrolyse findet wie im Beispiel 6 in dem Reaktor statt, und die nachfolgenden Arbeitsgänge laufen wie im Beispiel 6 ab.

Beispiel 8

Man verfährt wie im Beispiel 3 bis zur Vollendung der zweiten Hydrolyse. Dann fügt man zu dem Hydrolysat eine äquivalente Menge einer Lösung von Maltose- Dextrin und von Stärke mit einem Gehalt an Trockensubstanz von 50 % hinzu, zu welcher man zuvor Mineralsalze hinzugefügt hat, welche in entmineralisiertem Wasser von 60º C in einem mit einem Thermostaten versehenen Behälter aufgelöst sind. Anschließend erhitzt man das Gemisch mit einem Platten-Wärmeaustauscher auf 75º C, wonach man in das Gemisch Fette einbringt, welche aus Palm-Olein, Kokosnußöl, Safloröl, Lecithin und fettlöslichen Vitaminen zusammengesetzt sind, wobei die Fette zuvor bei 65 ºC geschmolzen worden sind und 10 % des vorstehenden Gemisches ausmachen. Nach einem Vorerhitzen auf 80º C mit einer Verweilzeit von 5 min sterilisiert man anschließend die erhaltene Flüssigkeit bei 125º C während 2 min durch direktes Einführen von Dampf, man kühlt die Flüssigkeit auf 70º C durch Entspannung in einem Expansionsgefäß ab, man homogenisiert die Flüssigkeit in zwei Stufen, nämlich zunächst bei 200 bar und dann bei 50 bar, man kühlt dieselbe mit Hilfe eines Platten-Wärmeaustauschers auf 10º C ab, dann brings man die Flüssigkeit in einem Behälter für die Zwischenlagerung ein, und man fügt zu derselben eine 10 %ige Zitronensäurelösung in entmineralisiertem Wasser, wasserlösliche Vitamine, Spurenelemente und Taurin hinzu. Schließlich erhitzt man das Gemisch auf 75º C, man homogenisiert dasselbe durch einen Durchgang bei 165 bis 170 bar, und man trocknet das Gemisch durch Zerstäubung.
Das Pulver hat die folgende Zusammensetzung: Peptide Fette Kohlenhydrate davon Laktose Maltose-Dextrin Stärke Mineralstoffe Vitamine und Spurenelemente Feuchtigkeit Spuren

Beispiel 9

Man verfährt wie im Beispiel 8, jedoch mit der Ausnahme, daß man die Flüssigkeit nach der zweiten Homogenisierung bei 125º C während 2 min sterilisiert, daß man dieselbe auf 10º C abkühlt, und daß man sie aseptisch in Behälter abfüllt.
Die Flüssigkeit hat die folgende Zusammensetzung: Peptide Fette Kohlenhydrate davon Laktose Maltose-Dextrin Stärke Mineralstoffe Vitamine und Spurenelemente Wasser Spuren

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Eiweißhydrolysates aus tierischer Milch, worin ein Molkeprodukt in zwei getrennten Hydrolyseschritten enzymatisch hydrolysiert wird und das Enzym thermisch inaktiviert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Hydrolyseschritte mit einem unter Trypsin, Chymotrypsin, einem Gemisch aus Trypsin und Chymotrypsin, und Pankreatin ausgewählten proteolytischen Enzym erfolgen und daß das Hydrolysat der ersten Hydrolyse in wäßriger Lösung bei 80 bis 100ºC während 3 bis 10 Minuten bei einem pH-Wert von 6 bis 8 thermisch behandelt wird, um die nach der ersten Hydrolyse intakt gebliebenen Eiweißstoffe zu denaturieren und sie so für die zweite Hydrolyse empfindlich zu machen, sodaß nach der zweiten Hydrolyse das Hydrolysat von Allergenen wie Eiweißstoffen, Eiweißstofffragmenten oder von Makropeptiden mit Molekulargewichten über ungefähr 10.000 befreit ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das verwendete Molkeprodukt unter Molke, demineralisierter Molke, den Konzentraten von demineralisierter Molke und von deren Gemischen, gegebenenfalls mit Laktose, ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Hydrolyse diskontinuierlich in einem Reaktor während 60 bis 180 Minuten stattfindet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Hydrolyse kontinuierlich in einem Rohr unter turbulenten Bedingungen während 1 bis 60 Minuten, vorzugsweise während 2 bis 20 Minuten, stattfindet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym durch vorhergehendes Erhitzen des Hydrolysates auf eine Temperatur von 75 bis 85ºC und Halten des Hydrolysates bei dieser Temperatur während ungefähr 5 Minuten und anschließendes Sterilisieren inaktiviert wird.

6. Hydrolysat, erhalten durch Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5.

7. Verfahren zur Herstellung eines hypoallergenen Nahrungsmittels, dadurch gekennzeichnet, daß zu dem nach Anspruch 1 erhaltenen Hydrolysat Kohlehydrate, Mineralsalze und Fettmaterialien im flüssigen Zustand, welche gegebenenfalls fettlösliche Vitamine beinhalten, zugefügt werden, dazu gegebenenfalls eine wäßrige Lösung,die wasserlösliche Vitamine und Spurenelemente enthält, zugegeben und anschließend getrocknet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das verwendete Hydrolysat ein Enzym enthält, welches nicht inaktiviert ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym bei der Herstellung des Nahrungsmittels thermisch inaktiviert wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym durch vorhergehendes Erhitzen auf 75 bis 85ºC während ungefähr 5 Minuten, anschließend durch Sterilisation bei sehr hoher Temperatur inaktiviert wird und daß das Produkt im flüssigen Zustand keimfrei konditioniert wird, anstelle es zu trocknen.

10. Hypoallergenes Nahrungsmittel, erhalten durch Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 9.

11. Verwendung eines Hydrolysates nach Anspruch 6 zur Herstellung von für Diätzwecke vorgesehenen Nahrungsmittelzubereitungen.