DE60120903T2

DE60120903T2 - Hypoallergene Nahrungsmittel zur Induzierung oraler Toleranz gegenüber Sojaproteinen

Info

Publication number: DE60120903T2
Application number: DE60120903T
Authority: DE
Inventors: Rodolphe Fritsche; Lionel Bovetto
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2001-03-01
Publication date: 2007-02-08
Anticipated expiration: 2021-03-02
Also published as: EP1236405B1; ATE330489T1; DE60120903D1; EP1236405A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft eine hypoallergene Formulanahrung zur Prävention einer allergischen Reaktion auf Sojaproteine. Sie betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Sojahydrolysaten, die für eine orale Toleranzinduktion gegenüber Sojaproteinen nützlich sind.
Hintergrund der Erfindung
Während des üblichen Prozesses der Ernährung werden Nahrungsmittelproteine dem Immunsystem über den Darm präsentiert, worauf eine ausbleibende Immunantwort gegenüber den aufgenommenen Nährstoffen folgt. Dieses vitale Phänomen, das als orale Toleranz bezeichnet wird, ist für die große Mehrheit der Menschen wirksam. Wenn die orale Toleranz versagt, kommt es zu einer Nahrungsmittelallergie, die die strikte Vermeidung des betroffenen Lebensmittels erfordert.
Eine gezielte Lebensmittelvermeidung stellt für erwachsene Patienten mit einer Lebensmittelallergie eine schwere Herausforderung dar. Demgemäß wurden auf dem Fachgebiet Versuche unternommen, die Allergenität der oben angegebenen Allergene zu eliminieren, indem man sie durch Hydrolyse in Peptide umwandelt.
Beispielsweise offenbart US 5 039 532 ein hypoallergenes Molkenproteinhydrolysat-Produkt, insbesondere für eine Verwendung in einer Kleinkinder-Formulanahrung, wobei das Molkenmaterial zuerst mit einem proteolytischen Enzym hydrolysiert wird, und dann das enzymatische Hydrolysat einer Wärmebehandlung unterzogen wird, um Proteine zu denaturieren, die nach der ersten Hydrolyse intakt bleiben und Allergene darstellen, wonach das erhitzte Hydrolysat abgekühlt wird. Das abgekühlte wärmebehandelte Hydrolysat wird dann mit einem proteolytischen Enzym hydrolysiert, um ein Hydrolysat zu erhalten, das im Wesentlichen frei von Allergenen proteinischen Ursprungs ist.
Auch JP110009202 stellt ein Verfahren zur Herstellung von Reis mit einem verminderten Allergengehalt bereit, wobei man rohen Reis in eine wässrige Salzlösung gibt, um salzlösliches Protein zu extrahieren, wonach man es einer Protease aus einem Milchsäurebakterium ermöglicht, auf den Reis einzuwirken. Das Verfahren gestattet die wirksame Entfernung von Proteinen, die als Allergene wirken, mit einer hohen Entfernungsrate.
Es wurde ferner gezeigt, dass ein hypoallergenes Molkenproteinhydrolysat-Produkt eine orale Toleranz gegenüber Kuhmilch induzieren kann. Beispielsweise offenbaren EP 0 827 697 und Nutrition Research (1998), Seiten 1335-1341 eine hydrolysierte Molke mit einem DH von 15 bis 20 % und einer verminderten immunologischen Erkennbarkeit. Im Gegensatz dazu offenbart EP 0 629 350 die Verwendung von extensiv hydrolysiertem Molkenprotein (DH > 20), das im Wesentlichen frei von allergenen Proteinen ist, zur Herstellung einer diätetischen Zusammensetzung für die Induktion einer Kuhmilchtoleranz. Später wurden tolerogene Peptide aus Kuhmilchprotein, die eine orale Toleranz gegen Milchproteine induzieren, in WO 00/42863 identifiziert.
Soja ist jedoch als ein Allergen gut bekannt, und hypoallergene Produkte auf der Basis von Soja wurden bereits beschrieben. Beispielsweise wird in SU 1494898 ein getrocknetes Produkt für die Produktion von Kinderlebensmitteln dadurch hergestellt, dass man Sojaprotein in Wasser auflöst, erhitzt, Pankreatin zur Hydrolyse zusetzt und das Hydrolysat zur Weiterverarbeitung abtrennt. Ferner offenbart auch JP 08056600 eine Allergen-Reduzierung bei Soja, indem man Sojabohnen in einer wässrigen Lösung einweicht, die ein gelöstes Protein abbauendes Enzym enthält.
Wie aus dem oben beschriebenen Stand der Technik ersichtlich wird, wurde für moderat bis extensiv hydrolysierte Milchproteine gezeigt, dass sie eine orale Toleranz induzieren. Der primäre Fokus auf dem Fachgebiet bis heute war bei der Behandlung von Allergien, und insbesondere solchen gegen pflanzliche Proteine, darauf gerichtet, Präparate zu finden, die keine allergische Reaktion induzieren, d.h. nicht-allergene Formulierungen bereitzustellen. Es besteht daher weiterhin ein Bedarf nach einer Formulanahrung auf Sojaproteinbasis, die für die Induktion einer oralen Toleranz geeignet wäre, d.h., dass sie es einer Person, die gegenüber Soja allergisch ist, nicht nur ermöglicht, eine allergische Reaktion zu vermeiden, sondern es ihr ermöglicht, unveränderte Sojaprodukte zu konsumieren.
Es ist somit klar, dass auf dem Fachgebiet die Information zur Bereitstellung von Formulanahrungen auf Sojaproteinbasis fehlten, die für die Induktion einer oralen Toleranz geeignet wären. Es ist somit Ziel der vorliegenden Erfindung, Formulanahrungen auf Sojabasis bereitzustellen, die hypoallergen sind, d.h. "die Menge des immunoreaktiven Proteins muss niedriger sein als 1 % der stickstoffhaltigen Substanzen in der Formulanahrung", und die ihr volles Potential zur Induzierung einer oralen Toleranz gegenüber vollständigen Sojaproteinen bewahren. Zusätzlich müssen derartige Formulanahrungen einen guten Nährwert und einen annehmbaren Geschmack aufweisen.
Kurzdarstellung der Erfindung
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt eine hypoallergene Formulanahrung auf Sojabasis zur Induktion einer oralen Toleranz gegenüber Sojaproteinen bei gefährdeten Personen, die ein Sojaproteinhydrolysat mit einem Hydrolysegrad von weniger als 25 % aufweist und eine Antigenität, die im Vergleich mit intakten Sojaproteinen auf über das 100-fache vermindert ist.
Tatsächlich wurde gefunden, dass eine moderate enzymatische Hydrolyse von Sojaproteinen, die Allergenität von Sojahydrolysaten auf über das 100-fache vermindern, während ihre tolerogene Kapazität beibehalten wird.
Vorzugsweise beträgt der Hydrolysegrad des Sojaproteinhydrolysats von 10 bis 20 %.
Ein Hauptvorteil dieser Zusammensetzung besteht darin, dass sie bei gefährdeten Personen eine orale Toleranz gegenüber vollständigen Sojaproteinen induziert, um eine endgültige Sensibilisierung durch Verwendung von nativen Tolerogenen zu vermeiden. Darüber hinaus weist die vorliegende Formulanahrung sowohl hypoallergene als auch tolerogene Eigenschaften auf, so dass sie eine Alternative für hypoallergene Formulanahrungen auf Kuhmilchbasis zur Verminderung einer allergischen Sensibilisierung in "gefährdeten" Babys darstellt, beispielsweise und insbesondere dort, wo Soja ein traditionelles Lebensmittel ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Sojaproteinhydrolysats mit einem Hydrolysegrad von weniger als 25 % und einer mehr als 100-fach verminderten Antigenität zur Herstellung einer hypoallergenen Formulanahrung zur Induzierung einer oralen Toleranz gegenüber Sojaproteinen bei Säugetieren, die im Hinblick auf eine Sojaproteinallergie empfindlich sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung ist der Begriff Toleranz als ein Zustand eines spezifischen immunologischen Nichtansprechens zu verstehen. Sowohl humorale (Antikörper) und zellvermittelte (Lymphozyten...) Wege der Immunreaktionen können durch die Induktion einer Toleranz unterdrückt werden. Ein Zusammenbruch der oralen Toleranz wird als er eigentliche Grund einer Lebensmittelallergie angesehen.
Der Begriff Allergen ist als Protein oder Makropeptid zu verstehen, die in der Lage sind, allergische Reaktionen in Menschen auszulösen, insbesondere in gefährdeten Klein kindern oder Säuglingen. Kleinkinder gelten als "gefährdet" für eine Proteinallergie, wenn entweder ein Elternteil, zwei Elternteile oder ein Geschwisterteil atopisch ist.
Der Begriff "Hydrolysegrad" (DH) bedeutet den Prozentsatz des Stickstoffs in Form von Aminostickstoff im Vergleich zum Gesamtstickstoff. Er ist ein Maß für den Grad, zu dem das Protein hydrolysiert wurde.
Gemäß einem ersten Aspekt werden hypoallergene Formulanahrungen auf Sojabasis für die Induktion einer oralen Toleranz gegenüber Sojaproteinen bei gefährdeten Personen betrachtet.
Die Formulanahrung gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst ein Sojaproteinhydrolysat mit einem Hydrolysegrad von weniger als 25 % und einer auf mehr als das 100-fache verminderten Antigenität, im Vergleich mit intakten Sojaproteinen, während es seine tolerogenen Fähigkeiten beibehält.
Vorzugsweise weist das Sojaproteinhydrolysat einen Hydrolysegrad von 10 % bis 20 % auf.
Gemäß einer Ausführungsform können die hypoallergenen Formulanahrungen beispielsweise eine Kleinkinder-Formulanahrung sein, eine Formulanahrung für Ernährungszwecke oder ein Sojaproteinhydrolysat, das als ein Modul für eine Proteinergänzungsnahrung verwendet wird. Ferner kann sie für die klinische Ernährung eine Formulanahrung auf Sojabasis oder eine reine Sojahydrolysat-Ergänzung sein.
Die Formulanahrung ist vorzugsweise eine enteral verabreichte Formulanahrung; beispielsweise in Form eines Pulvers, eines flüssigen Konzentrats oder eines trinkfertigen Getränks. Sie kann beispielsweise eine Quelle für Stickstoffe, eine Quelle für Kohlenhydrate, eine Quelle für Lipide und Vitamine und Mineralstoffe enthalten.
Vorzugsweise liegt die Stickstoffquelle in Form eines Proteinhydrolysats oder von freien Aminosäuren oder Kombinationen daraus vor. Vorzugsweise sind die Proteinhydrolysate Hydrolysate von Sojaprotein oder eine Peptidmischung, die aus Hydrolysaten von Sojaprotein isoliert wurde. Die Quelle für das diätetische Protein liefert vorzugsweise etwa 5 % bis etwa 30 % der Energie der Formulanahrung; beispielsweise etwa 10 % bis etwa 20 % der Energie. Die restliche Energie der Formulanahrung kann in Form von Kohlenhydraten und Fetten geliefert werden.
Wenn die Formulanahrung eine Fettquelle beinhaltet, liefert die Fettquelle vorzugsweise etwa 5 % bis etwa 55 % der Energie der Formulanahrung; beispielsweise etwa 20 % bis etwa 50 % der Energie. Die Lipide, die die Fettquelle bilden, können irgendein geeignetes Fett oder irgendeine geeignete Fettmischung sein. Pflanzenfette sind besonders geeignet; beispielsweise Palmöl, Kokosnussöl, Safloröl, Sonnenblumenöl, Maisöl, Canolaöl, Lecithine und dergleichen. Tierische Fette wie Milchfette können gewünschtenfalls ebenfalls zugesetzt werden. Die Lipide können mittelkettige Triglyceride einschließen, beispielsweise bis zu etwa 80 Gew.-% der Lipide als mittelkettige Triglyceride.
Wenn die Formulanahrung eine Kohlenhydratquelle einschließt, liefert die Kohlenhydratquelle vorzugsweise etwa 30 % bis etwa 80 % der Energie der Formulanahrung. Es können irgendwelche geeignete Kohlenhydrate verwendet werden, beispielsweise Saccharose, Glucose, Fructose, Maissirupfeststoffe und Maltodextrine und Mischungen daraus.
Ballaststoffe können gewünschtenfalls ebenfalls zugesetzt werden. Es sind zahlreiche Typen von Ballaststoffen erhältlich. Geeignete Quellen für Ballaststoffe schließen u.a. ein Erbsen, Hafer, Peptin, Guargummi und Gummi arabicum. Wenn sie verwendet werden, bilden die Ballaststoffe vorzugsweise bis zu etwa 5 % der Energie der Formulanahrung. Geeignete Vitamine und Mineralstoffe können auf übliche Weise in die Formulanahrung eingeschlossen werden, um die einschlägigen Richtlinien zu erfüllen. Gewünschtenfalls können auch einer oder mehrere Emulgatoren von Lebensmittelqualität in die Formulanahrung inkorporiert werden; beispielsweise Diacethylweinsäureester von Mono-Diglyceriden, Lecithin und Mono- und Di-Glyceride. Auf ähnliche Weise können geeignete Salze und Stabilisatoren vorhanden sein.
Die Formulanahrung kann auf irgendeine geeignete Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann die Formulanahrung dadurch hergestellt werden, dass man die Quelle für das diätetische Protein, die Kohlenhydratquelle und die Lipidquelle in geeigneten Proportionen vermischt. Soweit sie verwendet werden, können die Emulgatoren der Mischung zugegeben werden. Die Vitamine und Mineralstoffe können zu diesem Punkt zugesetzt werden, werden jedoch üblicherweise später zugesetzt, um einen thermischen Abbau zu vermeiden. Alle lipophilen Vitamine, Emulgatoren und dergleichen können vor dem Vermischen in der Fettquelle aufgelöst werden. Wasser, vorzugsweise Wasser, das einer Umkehrosmose unterzogen wurde, kann dann eingemischt werden, um eine flüssige Mischung zu bilden. Die Temperatur des Wassers beträgt geeigneterweise etwa 50 °C bis etwa 80 °C, um eine Dispergierung der Bestandteile zu unterstützen. Kommerziell erhältliche Verflüssiger können verwendet werden, um die flüssige Mischung zu bilden. Die flüssige Mischung wird dann homogenisiert, beispielsweise in zwei Stufen.
Die flüssige Mischung kann dann thermisch behandelt werden, um die Bakterienbelastung zu vermindern. Beispielsweise kann die flüssige Mischung rasch auf eine Temperatur im Bereich von etwa 80 °C bis etwa 150 °C für etwa 5 s bis etwa 5 min erhitzt werden. Das kann durch Dampfinjektion, Autoklaven oder Wärmeaustauscher erfolgen, beispielsweise einen Plattenwärmeaustauscher.
Die flüssige Mischung kann dann auf etwa 60 °C bis etwa 85 °C abgekühlt werden, beispielsweise durch Entspannungskühlung. Die flüssige Mischung kann dann wiederum homogenisiert werden; beispielsweise in zwei Stufen bei etwa 7 MPa bis etwa 40 MPa in der ersten Stufe und etwa 2 MPa bis etwa 14 MPa in der zweiten Stufe. Die homogenisierte Mischung kann dann weiter abgekühlt werden, um alle wärmeempfindlichen Bestandteile zuzusetzen, wie beispielsweise Vitamine und Mineralstoffe. Der pH und der Feststoffgehalt der homogenisierten Mischung können geeigneterweise an diesem Punkt standardisiert werden.
Wenn gewünscht wird, eine pulverförmige Formulanahrung herzustellen, wird die homogenisierte Mischung in eine geeignete Trocknungsapparatur überführt, wie beispielsweise einen Sprühtrockner oder Gefriertrockner, und in ein Pulver umgewandelt. Das Pulver sollte einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als etwa 5 Gew.-% aufweisen.
Wenn gewünscht wird, eine flüssige Formulanahrung herzustellen, wird die homogenisierte Mischung vorzugsweise aseptisch in geeignete Behälter abgefüllt. Das aseptische Befüllen der Behälter kann durchgeführt werden durch Vorerhitzen der homogenisierten Mischung (beispielsweise auf etwa 75 bis 85 °C) und dann Injizieren von Dampf in die homogenisierte Mischung, um die Temperatur auf etwa 140 bis 160 °C zu erhöhen; beispielsweise auf etwa 150 °C. Die homogenisierte Mischung kann dann abgekühlt werden, beispielsweise durch Entspannungskühlung, auf eine Temperatur von 75 bis 85 °C. Die homogenisierte Mischung kann dann homogenisiert werden, weiter auf Raumtemperatur abgekühlt werden, und in Behälter gefüllt werden. Eine geeignete Apparatur zur Durchführung einer aseptischen Abfüllung dieser Art ist kommerziell erhältlich. Die flüssige Formulanahrung kann in der Form einer verfütterungsfertigen Formulanahrung mit einem Feststoffgehalt von etwa 10 bis etwa 14 Gew.-% vorliegen, oder kann in Form eines Konzentrats vorliegen, üblicherweise mit einem Feststoffgehalt von etwa 20 bis etwa 26 Gew.-%. Den flüssigen Formulanahrungen können Aromen zugesetzt werden, so dass die Formulanahrungen in Form von bequemen, trinkfertigen Getränken bereitgestellt werden.
Die Formulanahrung kann zur Prävention einer allergischen Reaktion auf vollständige Sojaproteine verwendet werden. Sie kann an "gefährdete Personen" in einer Menge von etwa 10 bis 150 g pro Tag verfüttert werden. Sie ist beispielsweise insbesondere für Babys, Kleinkinder von 0 bis 12 Monaten oder jüngere Kinder bis zu 10 Jahren bestimmt.
Die hypoallergenen Formulanahrungen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Induzierung einer oralen Toleranz vor liegen. Um eine derartige Formulierung herzustellen, kann man dem Hydrolysat Saccharose oder Verpressungshilfsmittel zusetzen, um Tabletten herzustellen, oder es kann direkt in Kapseln abgefüllt werden. Gemäß einer anderen Ausführungsform ist die hypoallergene Formulanahrung eine ernährungsmäßig vollständige Haustierfutterzusammensetzung. Sie kann in pulverisierter getrockneter Form vorliegen, halbfeucht oder als ein nasses, gekühltes oder bei Raumtemperatur lagerfähiges Haustierfutterprodukt. Sie kann auch eine diätetische Ergänzung für Haustiere oder eine pharmazeutische Zusammensetzung für Haustiere darstellen. Derartige Haustierfutterprodukte können so hergestellt werden, wie es üblich ist. Außer dem Sojaproteinhydrolysat gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Haustierfutterprodukte irgendeine oder mehrere von einer Stärkequelle, einer Proteinquelle und einer Lipidquelle enthalten.
Geeignete Stärkequellen sind beispielsweise Körner oder Hülsenfrüchte, wie beispielsweise Mais, Reis, Weizen, Gerste, Hafer und Mischungen davon. Geeignete Proteinquellen können beispielsweise ausgewählt werden aus irgendeiner tierischen oder pflanzlichen Proteinquelle; beispielsweise niederallergenen Proteinmischungen, Geflügelmehl. Für ältere Tiere ist es bevorzugt, dass die Proteinquelle ein qualitativ hochwertiges Protein enthält. Geeignete Lipidquellen schließen ein Fleischprodukte, tierische Fette und pflanzliche Fette. Ferner können verschiedene andere Bestandteile, beispielsweise Zucker, Salz, Gewürze, Würzmittel, Vitamine, Mineralstoffe, Aromatisierungsmittel, Fette und dergleichen ebenfalls nach Wunsch in das Haustierfutter eingearbeitet werden.
Für getrocknete Haustierfutterprodukte ist ein geeignetes Verfahren die Kochextrusion, obwohl auch ein Backen oder andere geeignete Verfahren verwendet werden können. Wenn es kochextrudiert ist, wird das getrocknete Haustierfutter üblicherweise in Form eines Happens bereitgestellt. Wenn ein Präbiotikum verwendet wird, kann das Präbiotikum vor der Verarbeitung den anderen Bestandteilen des getrockneten Haustierfutters zugemischt werden. Ein geeignetes Verfahren wird in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 850 569 beschrieben, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Wenn ein probiotischer Mikroorganismus verwendet wird, wird der Organismus am besten auf das getrocknete Haustierfutter aufgetragen oder in dieses eingefüllt. Ein geeignetes Verfahren wird beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 862 863, deren Offenbarung durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird.
Bei nassen Futterprodukten können die Verfahren angewandt werden, die beschrieben werden in den US-Patenten 4 781 939 und 5 132 137, um simulierte Fleischprodukte herzustellen. Die Offenbarungen dieser Patente werden durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Andere Verfahrensweisen zur Herstellung von Produkten vom Blocktyp können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise das Kochen in einem Dampfofen. Alternativ können auch Produkte vom Laibtyp dadurch hergestellt werden, dass man ein geeignetes Fleischmaterial emulgiert, um eine Fleischemulsion herzustellen, ein geeignetes Geliermittel zusetzt und die Fleischemulsion erhitzt, bevor man sie in Dosen oder anderen Behältern abfüllt.
Die Menge an Präbiotikum in dem Haustierfutter beträgt vorzugsweise etwa 20 Gew.-%, insbesondere etwas 10 Gew.-%. Beispielsweise kann das Präbiotikum etwa 0,1 bis etwa 5 Gew.-% des Haustierfutters betragen. Für Haustierfutter, die als Präbiotikum Chicoree verwenden, kann der Chicoree so eingearbeitet werden, dass er etwa 0,5 bis etwa 10 Gew.-% der Futtermischung ausmacht, stärker bevorzugt etwa 1 bis etwa 5 Gew.-%.
Wenn ein probiotischer Mikroorganismus verwendet wird, enthält das Haustierfutter vorzugsweise etwa 10⁴ bis etwa 10¹⁰ Zellen des probiotischen Mikroorganismus pro Gramm des Haustierfutters; stärker bevorzugt etwa 10⁶ bis 10⁸ Zellen des probiotischen Mikroorganismus pro Gramm. Das Haustierfutter kann etwa 0,5 bis etwa 20 Gew.-% der Mischung an probiotischem Mikroorganismus enthalten; vorzugsweise etwa 1 bis etwa 6 Gew.-%; beispielsweise etwa 3 bis etwa 6 Gew.-%.
Gewünschtenfalls kann außerdem der Bakterienstamm verkapselt werden; beispielsweise in einer Zuckermatrix, Fettmatrix oder einer Polysaccharidmatrix.
Die Haustierfutterprodukte können andere aktive Mittel, wie beispielsweise langkettige Fettsäuren, enthalten. Geeignete langkettige Fettsäuren schließen ein alpha-Linolsäure, gamma-Linolsäure, Linolsäure, Eicosapentansäure und Docosahexansäure. Fischöle sind eine geeignete Quelle für Eicosapentansäuren und Docosahexansäure. Borretschöl, Öl aus schwarzen Johannisbeeren und Nachtkerzenöl sind geeignete Quellen für gamma-Linolsäure. Safloröle, Sonnenblumenöle, Maisöle sind geeignete Quellen für Linolsäure. Wenn nötig, werden die Haustierfutter mit Mineralstoffen und Vitaminen ergänzt, so dass sie ernährungsmäßig vollständig sind.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Sojaproteinhydrolysats, das zur Induktion einer oralen Toleranz gegenüber Sojaproteinen bei gefährdeten Personen nützlich ist, umfasst die folgenden Stufen:

i) ein proteinisches Material auf Sojabasis wird in warmem Wasser solubilisiert;
ii) es wird einer proteolytischen Hydrolyse unterzogen, bis ein Hydrolysegrad von weniger als 25 % erreicht ist;
iii) wonach es erhitzt wird, um die restliche Enzymaktivität zu desaktivieren.

Das zu behandelnde proteinische Material auf Sojabasis kann irgendeine Zusammensetzung sein, die Sojaproteinmaterial aufweist, und ist beispielsweise insbesondere eine Lösung oder Dispersion von Sojaproteinen, Sojaisolaten, Sojakonzentraten.
Im Allgemeinen kann der Proteingehalt innerhalb des Bereichs von 70 bis 95 Gew.-% variieren, wobei das Ausgangsmaterial jedoch vorzugsweise so proteinreich wie möglich ist.
Das proteinische Material kann in warmem entmineralisiertem Wasser (40 bis 65 °C) und bei 4 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise 10 Gew.-%, solubilisiert werden, und der pH kann auf etwa 2,5 bis 11 eingestellt werden, in Abhängigkeit von der Natur des zu verwendenden proteolytischen Enzyms. Beispielsweise kann im Falle eines proteolytischen Enzyms wie Alcalase der pH auf etwa 7,0 bis 9,0 eingestellt werden.
Dann können Sojaproteine, die in dem proteinischen Material vorhanden sind, mit proteolytischen Enzymen zu Proteinhydrolysaten mit einem Hydrolysegrad (α-Amino/Ntotal) von weniger als 25 %, vorzugsweise von 10 bis 20 %, modifiziert werden.
Die proteolytischen Enzyme können beispielsweise tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein (Alcalase, Pepsin, Chymotrypsin, Trypsin, Darmschleimhautextrakt, Pankreatin, Chymosin, Papain, Bromelain, Ficin), bakterieller oder pilzlicher Herkunft (Serin- und Metallo-Proteasen aus Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Aspergillus orizae, Aspergillus wentii und saure Proteasen aus Aspergillus orizae, Aspergillus wentii, Mucor pusillus, Endothia parasitica) oder eine Kombination daraus.
Während der Hydrolyse beträgt die Konzentration des proteinischen Materials in Lösung oder Suspension vorzugsweise etwa 5 bis 20 Gew.-%, und kann pasteurisiert werden, bevor man die Proteasen zugibt. Das Verhältnis Enzym/Protein kann 0,1 bis 10 % Gewicht/pro Gewicht betragen, und vorzugsweise etwa 1 bis 5 %.
Die Hydrolyse kann bei einer Temperatur von etwa 25 °C bis 65 °C durchgeführt werden, und zwar innerhalb von 30 Minuten bis 10 Stunden, vorzugsweise von 30 Minuten bis 4 Stunden, bei pH Werten im Bereich von 2,5 bis 11, vorzugsweise von 7,0 bis 8,5. Gewünschtenfalls kann der pH der Lösung mit Citronensäure, HCl von Lebensmittelqualität oder NaOH, NH₄OH, KOH, Ca(OH)₂ beispielsweise in einer Konzentration von 2N rein oder vermischt eingestellt und einreguliert werden.
Danach kann das Proteinhydrolysat einer Wärmebehandlung von 0,1 bis 30 min bei einer Temperatur von etwa 70 bis 110 °C unterzogen werden, um restliche Enzyme zu desaktivieren (d.h. Proteasen).
Das Hydrolysat kann außerdem einer zweiten moderaten proteolytischen Hydrolyse wie oben unterzogen werden, um restliche Sojaproteine möglicherweise zu hydrolysieren, dann wiederum einer Enzymdesaktivierung durch Wärmebehandlung, wie oben beschrieben wurde.
Die auf diese Weise erhaltene Proteinhydrolysatlösung kann außerdem durch Zentrifugieren und/oder Mikrofiltration und/oder Ultrafiltration geklärt werden, um unlösliche bzw. intakte Proteine zu entfernen, und die klare Lösung wird gewonnen. Es ist möglich, im industriellen Maßstab unterschiedliche Membrantypen zu verwenden (spiralförmig, rohrförmig, eben, als hohle Fasern), hergestellt mit unterschiedlichen Materialien (Mineralstoffen, Polysulfon, ...) und mit unterschiedlichen Schnittgrenzen zwischen 0,2 bis 2 μm für eine Mikrofiltration und zwischen 1.000 und 100.000 Dalton für eine Ultrafiltration.
Die gewonnene klare Hydrolysatlösung kann gewünschtenfalls durch Verdampfen bis auf einen Feststoffgehalt von 10 bis 50 % konzentriert werden, und zwar für eine nachfolgende Behandlung, oder sie kann sprühgetrocknet werden. Das Hydrolysat kann auch gefriergetrocknet werden.
Dann können gemäß einem weiteren Aspekt ein Sojaproteinhydrolysat mit einem Hydrolysegrad von weniger als 25 % und einer mehr als 100-fach verminderten Antigenität verwendet werden zur Herstellung einer präventiven oder hypoallergenen Formel, die für Säugetiere bestimmt ist, die im Hinblick auf eine Sojaproteinallergie empfindlich sind.
Vorzugsweise wird das Sojahydrolysat gemäß dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt. Es wurde gezeigt, dass eine moderate enzymatische Hydrolyse von Sojaproteinen die Allergenität von Sojahydrolysaten um mehr als das 100-fache vermindert, während ihre tolerogene Kapazität beibehalten wird (vergleiche die Beispiele unten). Tatsächlich wurden unterschiedliche Typen von Sojaproteinisolaten, Sojaproteinhydrolysaten mit moderaten und hohen Hydrolysegraden durch Behandlung mit Alcalase und Pankreatin in einem Pilot-Maßstab (1,2 kg Proteine) hergestellt. Die Elektrophorese, Peptidgrößenverteilung, NH2-N/Ntotal und die Restantigenität, bestimmten die hauptsächlichen physikalisch chemischen Eigenschaften und die Restantigenität von Hydrolysaten. Dann wurde die Induktion einer oralen Toleranz in einem Rattenmodell untersucht, und zwar mit einer ad libitum-Fütterung von Versuchshydrolysaten, gefolgt von einem Sojaproteinreiz und einer Bestimmung von spezifischen IgE zur Bewertung der Immunsuppression. Tatsächlich gestattete beispielsweise eine Alcalase-Behandlung die Erreichung der HA-Domäne mit einem NH2-N/Ntotal von 10 %, und Pankreatin in Verbindung mit Alcalase (NH2-N/Ntotal von 29 %) ermöglichte das Erreichen der therapeutischen Domäne mit einer nicht nachweisbaren Restantigenität.
Das Sojahydrolysat kann dazu verwendet werden, wie oben beschrieben, hypoallergene Formulierungen oder Haustierfutterzusammensetzungen herzustellen. Es liegt in den Formulierungen oder in der Zusammensetzung in einer Menge von wenigstens 5 % Trockenmasse im Falle eines ernährungsmäßig vollständigen Futters vor, und vorzugsweise von 10 bis 30 Trockenmasse. Wenn das Sojahydrolysat als Ergänzung verwendet wird, kann es in einer wirksamen Menge von wenigstens etwa 0,1 %/Gesamtproteingehalt vorhanden sein.
Das Verfahren zur Induzierung einer oralen Toleranz gegen Sojaproteine in einer gefährdeten Person umfasst die Verabreichung einer wirksamen Menge der hypoallergenen Formulierung oder Zusammensetzung, wie oben beschrieben, an die Person.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die kleinste erforderliche Menge wenigstens etwa 0,1 g Sojaproteinhydrolysat pro kg und pro Tag, was 10 % einer täglichen Dosis im Falle einer ausschließlichen Ernährung darstellt.
Für Erwachsene oder Kinder kann nur eine Fraktion oder ein vollständig aktives Sojahydrolysat verabreicht werden.
Die folgenden Beispiele werden nur zur Illustration angeführt und sind in keiner Weise im Sinne einer Beschränkung des Gegenstands der vorliegenden Erfindung auszulegen. Die Prozentangaben erfolgen in Gewicht, es sei denn, es wird etwas anderes angegeben. Den Beispielen geht eine kurze Beschreibung der Figur voraus.
Figur: 1 zeigt die IgE-Suppression durch Sojaisolate und Sojahydrolysate.
Beispiele
Beispiel 1
Material und Verfahren
Enzyme: Alcalase 2,4 stammte von Novo Industries (Dänemark) und Pankreatin 3tNF (1,13 U F.I.P./mg) von LIB (Frankreich).
Das Sojaisolat PRO-FAM 781 von ADM wurde als Rohmaterial zur Hydrolysatherstellung ausgewählt.
Zusammensetzung

* N x 6,25 (%) ADM-Angaben

Herstellung von Sojahydrolysat (1) mit Alcalase 1 % bei pH 7,5
Herstellung von Sojahydrolysat (2) mit Alcalase 10 % und Pankreatin 5 % bei pH 8,0
Analyse
• Gesamtstickstoffbestimmung, Ntotal
Gesamtstickstoff wurde unter Anwendung der Dumas-Arbeitsweise unter Verwendung des Gebrauchsanweisungshandbuchs NA 25 der Reihe Elementaranalyser (REV.W060595mw) von Carlo Erba Instruments Thermo Quest Italia S.pA, Strada Rivoltana, 20090, Rodano MI bestimmt.
• N-NH₂/Ntotal-Bestimmung
Das N-NH2/Ntotal (%) wurde gemessen nach dem TNBS-Verfahren gemäß Adler-Nissen (J. Agric. Food. Chem. 1979, 27:1256-1262).
• Elektrophorese-Phast-System, SDS-PAGE Silberanfärbung
Das wurde durchgeführt nach der Trenntechnik-Akten-Nr. 111 (Ref. 18-1010-63) gemäß dem PhastSystem Anwender Manual (80-1320-15) und unter Verwendung eines PhastGel-Silverkits (Kat. Nr. 17-0617-0,1) von Pharmacia LKB Biotechnology, S 75182 Uppsala, Schweden.
• Peptidanalyse durch HPLC
Hydrolysate wurden mittels Gelfiltrationschromatographie auf einer TSK 2000 SWXL-Säule (Hewlett Packard) charakterisiert, mit einem HP 1050 HPLC-System. Die Detektion erfolgte bei 220 nm mit einem Diodenfelddetektor.
Die Betriebsbedingungen waren wie folgt: Raumtemperatur, Durchflussgeschwindigkei 0,5 ml/min; Lösemittel: 0,1 TFA in Wasser (v/v). Molekulargewichtsmarker wurden in einer 0,5 mg/ml Endkonzentration jeweils hergestellt und wurden separat injiziert.
Proben wurden in einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml in 0,1 % TFA gelöst und durch eine Nylon-Acrodisc 0,22 μm-Membran (Gelman Science) filtriert, bevor sie in die Säule injiziert wurden. Die Molekulargewichtsverteilungen wurden aus der kumulativen Größenverteilung auf der Basis der Peak-Oberfläche ermittelt (%-Fläche gegen LgMW; Gesamtfläche: 100 %).
• ELISA-Inhibition der Sojaantigenität
Die restliche Sojaantigenität wurde durch ELISA-Inhibierung mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-Sojaprotein-Antiserum bestimmt. Die Vertiefungen von Mikrotiterplatten wurden mit 150 μl eines Sojaproteinkonzentrats PP610 bei 50 μg/μl in Carbonat-Bicarbonatpuffer beschichtet und 24 Stunden bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden 4 mal in einem PBS-Tween-Puffer gewaschen, und freie Reaktionsstellen wurden durch Zugabe von 200 μl/Vertiefung durch Fischgelatine (0,5 % in PBS-Tween) blockiert.
Die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) inkubiert und wieder 4 mal in PBS-Tween gewaschen. In getrennten Röhrchen wurden 1 Teil einer Standardsojaproteinverdünnung (PP610) oder einer Testprobe 1 Stunde bei RT mit einem Teil Kaninchen-Anti-Sojaprotein-Antikörper (verdünnt 1:2000) inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 μl dieser Inhibierungsmischung zu den obigen beschichteten und blockierten Mikrotiter-Vertiefungen zugesetzt und 2 Stunden bei RT inkubiert.
Die Platten wurden 4 mal in PBS-Tween gewaschen. Ein Ziegen-Anti-Kaninchen peroxidase-markiertes Konjugat (0,1 ml einer 1:2000-Verdünnung) wird dann zugesetzt, die Platten wurden 1 Stunde bei RT inkubiert und 4-mal in PBS-Tween gewaschen. Das chromogene Substrat (0,1 ml o-Phenylendiamin) wird zugesetzt. Nach 15 Minuten Inkubation wird die optische Dichte bei 492 nm an einem ELISA-Plattenlesegerät abgelesen.
• Bewertung der Sojahydrolysat-Tolerogenität
Die Kapazität von Sojaprodukten zur Induzierung einer oralen Toleranz wurde mit Hilfe eines in vivo-Rattenmodells untersucht. An Gruppen von Sprague-Dawley-Ratten (6 Tiere/Gruppe), die mit einer sojaproteinfreien Diät aufgezogen worden waren, wurden unterschiedliche experimentelle flüssige Sojaproteine/Sojahydrolysate oder Wasser (Kontrolle) ad libitum in ihren Trinkflaschen verabreicht sowie eine feste "sojaproteinfreie" Pelletdiät von den Tagen 1 bis 7 des Experiments. Den Tieren wurden die folgenden Produkte verabreicht:

Gruppe A, Pro-Fam 781 (15 g/l);

Gruppe B, Pro-Fam 781 Alcalase 1 % Hydrolysat (120 g/l);

Gruppe D, Pro-Fam 781 Alcalase 10 % + Pankreatin 5 Hydrolysat (120 g/l);

Gruppe E, H₂O (Kontrolle).
Alle Ratten wurden am Tag 8 durch subkutane Injektion von 4 mg Pro-Fam 646 + 0,1 mg Ovalbumin + 0,2 ml 3 % Al(OH)₃ immunisiert.
Am Tag 21 wurden alle Tiere getötet. Blut wurde abgenommen, und die Sera wurden mittels ELISA, wie vorher beschrieben (Fritsché R, Bonzon M., Int Arch Allergy Appl Immunol 1990; 93:289-93), auf spezifische IgE-Antikörper analysiert (Anti-Soja und Anti-Ovalbumin).
ERGEBNISSE
• Hydrolyse von Sojaproteinosolaten
Beginnend mit Pro-Fam 781 (Tabelle 1), das bereits durch den Lieferanten hydrolysiert war, gestattete es eine Alcalase-Behandlung, die Antigenität bis direkt unter das Niveau zu vermindern, das für eine präventive HA-Formel erforderlich ist (Hydrolysat 1). Hydrolysat 2 wurde erhalten durch Zugabe von Pankreation nach der Alcalase. Eine weitere Verminderung der Antigenität, und das Verhältnis NH2-N/Ntotal steigt erheblich, und die Peptidverteilung zeigt eine Verminderung von großen Peptiden.
Tabelle 1: Kenndaten von Sojaproteinhydrolysaten, die erhalten werden durch Hydrolyse von Sojaisolat Pro-Fam 781 mit niedriger Viskosität, das bereits durch den Lieferanten hydrolysiert worden war.
• Suppression der IgE-Reaktion durch Fütterung von Sojahydrolysat
1 zeigt, dass mit 1 % Alcalase hydrolysierte Sojaproteine in der Lage sind, die spezifische IgE anti-Sojaprotein-Reaktion zu unterdrücken, wenn sie den Tieren für 7 Tage vor dem Reiz verfüttert wurden.
Im Gegensatz dazu, wenn die Sojaproteine stark hydrolysiert wurden, und zwar zuerst durch Alcalase 10 %, gefolgt von Pankreatin 5 %, weist das erhaltene Hydrolysat keinerlei tolerogene Aktivität mehr auf (1 zeigt, dass durch eine vorausgehende Fütterung mit diesem Produkt keine IgE-Suppression erreicht wird).
Als positive Kontrolle induzierte ein intaktes Sojaproteinisolat Pro-Fam 781 die niedrigsten Spiegel an IgE-anti-Soja-Antikörpern, und die negative Kontrolle (H₂O-Gruppe) die höchsten Spiegel. Die IgE-Reaktionen auf das Kontroll-Antigen Ovalbumin unterschieden sich zwischen den Gruppen nicht signifikant.
Das Hydrolysat, das durch Alcalasebehandlung erhalten wurde, weist sowohl eine relativ niedrige Restantigenität auf (6,8 mg Sojaantigen/g Protein), während es eine gute IgE-Suppressoraktivität beibehält (2,5 log5 IgE-Titer, verglichen mit 4,3 log 5 IgE-Titer der Kontrollgruppe).
Die Ergebnisse zeigen, dass eine moderate enzymatische Hydrolyse von Sojaproteinen die Allergenität der Sojahydrolysate um mehr als das 100-fache vermindert, während die tolerogene Kapazität erhalten bleibt.
Beispiel 2: Tolerogene Kleinkinder-Formulanahrung
Die Zusammensetzung für 100 g Pulver enthält 15 Sojahydrolysat, hergestellt nach Beispiel 1, 25 % Fette, 55 % Kohlenhydrate (einschließlich Maltodextrin 37 %, Stärke 6 %, Saccharose 12 %), Spurenmengen von Vitaminen und Oligoelementen, um den täglichen Bedarf zu decken, 2 % Mineralstoffe und 3 % Feuchtigkeit.
13 g dieses Pulvers werden in 100 ml Wasser eingemischt. Die erhaltene Zusammensetzung ist eine Kleinkinder-Formulanahrung, die besonders für ein Kleinkind mit einem Risiko für eine Voll-Sojaprotein-Allergie bestimmt ist.
Beispiel 3: flüssige tolerogene Kleinkind-Formulanahrung
Um eine tolerogene Kleinkind-Formulanahrung zu erhalten, stellen wir die folgende Mischung her, die, pro 100 ml der Formulanahrung enthält 1,6 % Peptide (Sojahydrolysat, hergestellt wie in Beispiel 1), 3,4 % Fett, 7,4 % Kohlenhydrate (einschließlich Maltodextrin, Saccharose, Stärke), Spuren von Vitaminen und Oligoelementen, um den täglichen Bedarf zu decken, 0,3 % Mineralstoffe und 79,9 % Wasser.
Die erhaltene tolerogene Kleinkinder-Formulanahrung ist besonders für ein Kleinkind mit einem Risiko für eine Voll-Sojaprotein-Allergie bestimmt.
Beispiel 4. Haustierfutterzusammensetzung
In eine Ausgangsproduktmischung, die hergestellt wurde aus Mais, einer niederallergenen Proteinmischung Huhn und Kartoffel, Salzen, Vitaminen und Mineralstoffen, werden etwa 0,1 % des gesamten proteinischen Gehalts durch das Sojaproteinhydrolysat gebildet, das wie in Beispiel 1 hergestellt wurde. Das angefeuchtete Einsatzprodukt, das den Vorkonditionierer verläßt, wird dann einem Kochextruder zugeführt und verkleistert. Die verkleisterte Matrix, die den Extruder verläßt, wird durch eine Formdüse gedrückt und extrudiert. Das Extrudat, das den Formdüsenkopf verläßt, wird in Stücke geschnitten, die für das Verfüttern an Hunde geeignet sind, bei etwa 110 °C 20 Minuten getrocknet, und abgekühlt, um Pellets zu bilden. Die erhaltene Wasseraktivität der Pellets beträgt etwa 0,6. Die Pellets werden mit einem Beschichtungssubstrat besprüht, das Talgfett umfasst.
Demgemäß ist das erhaltene trockene Hundefutter besonders bestimmt zur Induzierung einer oralen Toleranz gegen Sojaproteine.

Claims

Hypoallergene Formulanahrung auf Sojabasis zur Induzierung einer oralen Toleranz gegenüber Sojaproteinen bei gefährdeten Personen, die ein Sojaproteinhydrolysat mit einem Hydrolysegrad von weniger als 25 % und einer über das 100-fache verminderten Antigenität, verglichen mit intakten Sojaproteinen, aufweist.
Formulanahrung nach Anspruch 1, wobei der Hydrolysegrad 10 bis 20 % beträgt.
Formulanahrung nach Anspruch 1 oder 2, die in Form einer ernährungsmäßig kompletten Zusammensetzung vorliegt, die eine Menge an Sojaproteinhydrolysat von wenigstens 5 % Trockenfeststoffe, vorzugsweise etwa 10 bis 30 % Trockenfeststoffe, aufweist.
Formulanahrung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die in Form einer Ergänzung vorliegt, die eine wirksame Menge von Sojaproteinhydrolysat von wenigstens etwa 0,1 % des gesamten Proteingehalts der Formulanahrung aufweist.
Verwendung eines Sojaproteinhydrolysats mit einem Hydrolysegrad von weniger als 25 % und einer mehr als das 100-fache verminderten Antigenität im Vergleich mit intakten Sojaproteinen zur Herstellung einer hypoallergenen Formulanahrung zur Induktion einer oralen Toleranz gegenüber Sojaproteinen bei Säugetieren, die bezüglich einer Sojaproteinallergie gefährdet sind.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Sojaproteinhydrolysat in einer ernährungsmäßig kompletten Formulanahrung in einer Menge von wenigstens 5 % Trockenfeststoffe, und vorzugsweise von 10 bis 30 % Trockenfeststoffe, vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Sojaproteinhydrolysat als Ergänzung in einer Menge von wenigstens 0,1 des Gesamtproteingehalts vorliegt.