CN111955648B - 一种检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：包括大豆伴球蛋白致敏性肽段检测和大豆伴球蛋白致敏性消除。本发明提出大豆伴球蛋白的过敏性与其经消化后产生的一种抗酶解肽段的存在有密切关系，并在此基础上，提供一种经碱性蛋白酶低限度水解改性大豆伴球蛋白的方法，该方法下制备的大豆伴球蛋白既具有良好的加工功能性质，同时经体外模拟消化后该抗酶解肽段消除，经免疫印迹实验未检测到致敏性。本发明为低致敏性大豆蛋白开发提供方法和依据。
Description
技术领域
本发明涉及低致敏性大豆蛋白制备技术领域，特别是涉及一种检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法。
背景技术
大豆营养价值高，蛋白质含量丰富。许多食品包括烘焙、谷物、肉类产品，素食食品以及低过敏性婴儿配方奶粉等，都含有大豆蛋白，可提供特定的营养和功能特性如乳化性、凝胶性、持水性、持油性等。但含有大豆的食品易引起过敏反应，包括荨麻疹、胃肠道发炎、呼吸不顺畅甚至死亡。迄今为止，大豆过敏尚无特效疗法，严格避免食用含大豆的食物是过敏患者的最佳选择，但完全避免食用大豆很困难。近些年来，国内外对大豆致敏性及消化性研究的重视度越来越高，这不仅可帮助过敏患者人群解决自身安全问题，也可促进饲养动物(猪、牛、马等)胃肠道得到更好地消化吸收。
食物过敏原的抗原表位包括线性表位(连续性表位)和构象表位(不连续性表位)。降低或消除食物过敏原的本质是破坏其抗原表位，作用过程可分为以下两个方面：第一，可通过破坏过敏原蛋白的高级结构或断裂化学键，使其失去原有构象表位，从而降低其致敏性。第二，可通过断裂过敏原蛋白一级结构中的肽键，降低过敏原相对分子质量，破坏其线性表位，从而降低甚至消除致敏性。当这两种作用过程中的某一种发生，过敏原的抗原表位被破坏，其免疫原性丧失，从而过敏原的致敏性也会受到影响(降低或消失)。目前，国内外常用的大豆脱敏方法主要包括物理法、生物学法、化学法和基因工程法等。
酶解法被认为是降低过敏蛋白致敏性的有效方法，酶水解能够通过断裂分子内的肽键，可将蛋白质分子水解成肽段，从而破坏过敏原蛋白的构象表位甚至线性表位。但酶水解在降低大豆蛋白致敏性的同时，往往伴随着其功能性质尤其是乳化性、凝胶性、起泡性等的减弱或丧失，而这大大限制了大豆蛋白在食品中的应用。热处理是食品加工中常用的工序之一，热加工对降低大豆致敏性有一定的效果，但经食用后仍有致敏性存在，消化道酶水解后肽段存在致敏性可能是重要原因。因此，降低水解物中残余抗酶解肽段的致敏性具有重大意义。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有大豆蛋白除致敏源中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明其中一个目的是，克服现有制备低致敏性大豆蛋白产品的不足，提供一种检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，本发明提供了如下技术方案：一种检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其特征在于：包括大豆伴球蛋白致敏性肽段检测和大豆伴球蛋白致敏性消除。
作为本发明所述检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：检测方法包括加热、消化酶水解、致敏性检测三个步骤，消除方法包括低限度水解、消化酶连续水解、致敏性测定三个步骤。
作为本发明所述检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：包括检测和消除，检测包括如下步骤：
加热：对大豆伴球蛋白溶液进行加热；
水解1：加入胃蛋白酶、胰蛋白酶进行酶水解；
致敏性检测：进行SDS-PAGE和ELISA分析；
消除包括如下步骤：
低限度水解：大豆伴球蛋白溶液中加入碱性蛋白酶进行酶水解得到酶解液；
水解2：对低限度酶解液进行消化酶连续水解处理；
致敏性测定：进行SDS-PAGE、ELISA分析、Western Blot分析。
作为本发明所述检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：加热中，对大豆伴球蛋白进行加热处理的方法为将大豆伴球蛋白与去离子水混合，配制3％～7％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，于70～100℃加热5～40min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存。
作为本发明所述检测大豆蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：加热中，对大豆伴球蛋白进行处理的方法为将大豆伴球蛋白与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，于80℃加热20min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存。
作为本发明所述检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：消化酶水解中，向加热得到的热处理大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH1.5恒定，酶解30～120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；向加热制备所得的热处理大豆伴球蛋白溶液添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH7.0恒定，酶解10～120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
作为本发明所述检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：消化酶水解中，向加热得到的热处理大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH1.5恒定，酶解120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；向加热制备所得的热处理大豆伴球蛋白溶液添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH7.0恒定，酶解60min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
作为本发明所述检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：低限度水解中，将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3～7％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为0.5～2％，酶解过程中维持温度50～65℃和pH 8.0～9.0恒定，酶解10～60min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
作为本发明所述检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：低限度水解中，将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3～7％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为0.5～2％，酶解过程中维持温度55℃和pH 9.0恒定，酶解20min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
作为本发明所述检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法的一种优选方案，其中：根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其中：水解2中制得的酶解液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH1.5恒定，酶解2h后，将pH调节至7.0，添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH7.0恒定，酶解10～120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
本发明提出大豆伴球蛋白的过敏性与其经消化后产生的一种抗酶解肽段的存在有密切关系，并在此基础上，提供一种经碱性蛋白酶低限度水解改性大豆伴球蛋白的方法，该方法下制备的大豆伴球蛋白既具有良好的加工功能性质，同时经体外模拟消化后该抗酶解肽段消除，经免疫印迹实验未检测到致敏性。本发明为低致敏性大豆蛋白开发提供方法和依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例1 70℃加热处理的大豆伴球蛋白酶水解物的SDS-PAGE图谱。
图2为本发明实施例2 80℃加热处理的大豆伴球蛋白酶水解物的SDS-PAGE图谱。
图3为本发明实施例3 90℃加热处理的大豆伴球蛋白酶水解物的SDS-PAGE图谱。
图4为大豆伴球蛋白加热预处理后，经胃蛋白酶水解120min，再经胰蛋白酶分别酶解10～120min的SDS-PAGE图谱。
其中M：SDS-PAGE图谱中的Marker；0：未经处理的大豆伴球蛋白即空白对照组的SDS-PAGE图谱；
图1a中1-3为加热预处理10min后经胃蛋白酶分别酶解30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；1′-3′为加热预处理20min后经胃蛋白酶分别酶解30min、60min、120min的SDS-PAGE；
图1b的1-5：加热预处理10min后，经胰蛋白酶分别酶解10min、20min、30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；1′-5′：加热预处理20min后，经胰蛋白酶分别酶解10min、20min、30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；
图2a的1-3：加热预处理10min后，经胃蛋白酶分别酶解30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；1′-3′：加热预处理20min后，经胃蛋白酶分别酶解30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；
图2b的1-5：加热预处理10min后，经胰蛋白酶分别酶解10min、20min、30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；1′-5′：加热预处理20min后，经胰蛋白酶分别酶解10min、20min、30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；
图3a中的1-3：加热预处理10min后，经胃蛋白酶分别酶解30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；1′-3′：加热预处理20min后，经胃蛋白酶分别酶解30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；
图3b的1-5：加热预处理10min后，经胰蛋白酶分别酶解10min、20min、30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱；1′-5′：加热预处理20min后，经胰蛋白酶分别酶解10min、20min、30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱。
图4的1-5：大豆伴球蛋白加热预处理后，经胃蛋白酶水解120min，再经胰蛋白酶分别酶解10min、20min、30min、60min、120min的SDS-PAGE图谱。
具体实施方式
一种大豆伴球蛋白抗酶解肽段及低检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其特征在于：经碱性蛋白酶低限度水解改性的大豆伴球蛋白，经体外模拟消化后，抗酶解肽段消失，经免疫印迹实验未检测到致敏性；同时该改性大豆伴球蛋白具有良好的加工功能性质。
应用本发明处理的大豆伴球蛋白，当碱性蛋白酶的酶添加量为0.5％、仅水解20min(水解度达到3.5％)时，大豆伴球蛋白的乳化性和乳化稳定性分别提高51.2％、11.0％。同时，经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，SDS-PAGE及免疫印迹实验结果显示上述抗酶解肽段完全消失，竞争ELISA法结果表明其致敏性降低率近100％。
实施例中的测定方法如下：
1、蛋白质含量的测定：半微量凯氏定氮法(GB5009.5-2016)；
2、SDS-PAGE：将大豆伴球蛋白和大豆伴球蛋白酶解液分别用超纯水稀释至蛋白含量0.4％，与等量的蛋白溶解液、溴酚蓝(0.1％)、二硫苏糖醇(0.3％)混合加热(100℃，10min)。配制上层浓缩胶和下层分离胶浓度分别为3％和12.5％。SDS-PAGE凝胶电泳以电压260V、电流13mA运行2h，后将凝胶置于固定液(7％乙酸，40％甲醇)中固定1h，用考马斯亮蓝G-250染色至少2h，最后在去离子水中脱色，直至背景清晰。
3、竞争ELISA法：按照大豆伴球蛋白定量检测试剂盒的使用说明书进行实验。根据试剂盒提供的标曲范围，将待测样品用样品稀释液稀释一定的倍数，于96孔酶标板中加入50μL/孔稀释样，再加入50μL/孔的抗体工作液，轻轻晃匀，37℃温育30min；弃液，加洗涤液300μL/孔，保持10s，洗涤4次，用吸水纸拍干；加入辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗100μL/孔，37℃温育30min；同上洗涤；拍干后，加入混合的显色液每100μL/孔，37℃温育15min，最后加入终止液50μL/孔，轻晃混匀后，立即于酶标仪450/630nm读取OD值，并计算过敏原含量。试剂盒标准曲线如下：Y＝-1.9028X+0.5594，R2为0.9953，其中X表示样品中过敏原浓度(μg/mL)的对数值，结果中的样品过敏原含量以mg/g蛋白来表示，Y表示样品在450nm处的OD值。并以致敏性降低率表示各处理方法去除抗原的效果。致敏性降低率计算公式为：
4、Western Blot：
(1)蛋白样品经SDS-PAGE凝胶电泳运行，同分析方法3；
(2)电转移：蛋白胶不经固定步骤，直接进行电转移处理。首先将PVDF膜浸泡于甲醇中10s-20s，然后在转膜液中将海绵垫、滤纸、PVDF膜、蛋白胶、滤纸、海绵垫按顺序组装在一起，轻压排出气泡，保持PVDF膜位于夹板的正极(白色面)，蛋白胶面位于负极(黑色面)，整个电转装置处于冰浴中，根据转印的蛋白相对分子质量决定电转时间，电转保持恒流220mA。电转完成后可见预染Marker从胶上完全转移到PVDF膜上；
(3)封闭：将转印后的PVDF于5％BSA的TBST溶液(Tris-HCl缓冲液，吐温)中封闭1h；
(4)洗膜：用TBST溶液洗膜10min，洗涤4次；
(5)孵育一抗：用5％BSA的TBST溶液稀释兔血清(300∶1)，将PVDF膜置于稀释液中，4℃过夜；
(6)洗膜：用TBST溶液洗膜10min，洗涤4次；
(7)孵育二抗：用5％BSA的TBST溶液稀释辣根过氧化物酶表标记的羊抗兔IgG(1500∶1)，将PVDF膜置于稀释液中，室温孵育2h；
(8)洗膜：用TBST溶液洗膜10min，洗涤4次；
(9)显影：将试剂盒中的A液和B液以1∶1(v/v)混合于暗盒中，将洗膜后的PVDF膜迅速沥干置于暗盒中20s-30s，取出膜于显影仪上进行显影，直至出现清晰条带。
5、水解度的测定：采用pH-stat法测定大豆伴球蛋白酶解物的水解度(DH)。水解度计算公式为：
式中：
B：水解过程中消耗NaOH溶液的体积(mL)；
Nb：NaOH溶液的浓度(mol/L)；
α：α-氨基解离度(水解条件37℃，pH 7.5时，α-氨基解离度为1.822)；
Mp：蛋白含量(g)；
htot：蛋白中可被水解的肽键数(7.8mmol/g)。
6、乳化性质的测定：用0.05mol/L pH 7.0的PBS溶液将蛋白样品稀释成蛋白浓度为1％，取15mL蛋白稀释液(1％)与5mL大豆油混合，19500g剪切2min后立即从底部取20μL乳液，与5mL 0.1％的SDS溶液混合均匀，以0.1％的SDS溶液为空白样品，在500nm处测定吸光度，记为A0。待乳化液静置10min后，再从底部相同高度处取20μL乳液，采用相同方法测定吸光度，记为A30。乳化活性和乳化稳定性的计算公式如下：
式中：
N：稀释倍数，250；
C：乳状液未形成前蛋白溶液的浓度(g/mL)；
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
实施例1
加热：对大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，分别于70℃加热，加热时间为10min、20min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存。
水解1：向加热后的大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 1.5恒定，酶解时间为30、60、120min，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；在热处理后的大豆伴球蛋白溶液添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解时间为10、20、30、60、120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；
致敏性检测：将水解中各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率。
低限度水解：将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度55℃和pH 9.0恒定，酶解20min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
水解2：向大豆伴球蛋白碱性蛋白酶水解液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 9.0恒定，酶解2h后，将pH调节至7.0，添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解2h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
致敏性测定：对水解中所得各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率，Western Blot分析蛋白水解物的致敏性。通过SDS-PAGE表征的酶解物的水解肽段与致敏性测定结果，检测抗酶解肽段；通过致敏原含量差值与致敏原总量的比例计算即可得到致敏性降低率。改变加热中加热时间和水解中胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解时间得到的致敏性降低数据如表1所示：
表1 70℃下加热不同时间经胃蛋白酶或胰蛋白酶水解后的致敏性
| 加热温度 | 加热时间 | 胃蛋白酶水解时间 | 致敏性降低率 |
| 70℃ | 10min | 30min | 11.44％ |
| 60min | 19.43％ | ||
| 120min | 38.44％ | ||
| 20min | 30min | 12.89％ | |
| 60min | 20.29％ | ||
| 120min | 44.70％ | ||
| 加热温度 | 加热时间 | 胰蛋白酶水解时间 | 致敏性降低率 |
| 70℃ | 10min | 10min | 19.67％ |
| 20min | 25.34％ | ||
| 30min | 27.49％ | ||
| 60min | 34.11％ | ||
| 120min | 39.23％ | ||
| 20min | 10min | 20.23％ | |
| 20min | 27.46％ | ||
| 30min | 30.88％ | ||
| 60min | 37.98％ | ||
| 120min | 40.69％ |
根据表1可得，水解过程中加热时间上的改变和胃蛋白酶、胰蛋白酶的水解时间上的变化均会导致致敏性变化。
加热时间20min时，经胃蛋白酶水解后致敏性降低率显著高于加热10min的数据，胃蛋白酶的优选加热时间为20min；胃蛋白酶的水解时间为120min时，相较30min、60min，有着明显的致敏性降低的效果，胃蛋白酶优选的水解时间为120min。
加热时间20min时，经胰蛋白酶水解后致敏性降低率显著高于加热10min的数据，胰蛋白酶的优选加热时间为20min；使用胰蛋白酶的水解时间为120min时，相较10min、20min、30min、60min，有着明显的致敏性降低的效果，胰蛋白酶优选的水解时间为120min。
实施例2
加热：对大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，分别于80℃加热，加热时间为10min、20min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存。
水解1：向加热后的大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 1.5恒定，酶解时间为30、60、120min，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；在热处理后的大豆伴球蛋白溶液添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解时间为10、20、30、60、120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；
致敏性检测：将水解中各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率。
低限度水解：将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度55℃和pH 9.0恒定，酶解20min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
水解2：向大豆伴球蛋白碱性蛋白酶水解液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 9.0恒定，酶解2h后，将pH调节至7.0，添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解2h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
致敏性测定：对水解中所得各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率，Western Blot分析蛋白水解物的致敏性。通过SDS-PAGE表征的酶解物的水解肽段与致敏性测定结果，检测抗酶解肽段；通过致敏原含量差值与致敏原总量的比例计算即可得到致敏性降低率。改变加热中加热时间和水解中胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解时间得到的致敏性降低数据如表2所示：
表2 80℃加热不同时间经胃蛋白酶或胰蛋白酶水解后的致敏性
| 加热温度 | 加热时间 | 胃蛋白酶水解时间 | 致敏性降低率 |
| 80℃ | 10min | 30min | 20.42％ |
| 60min | 38.44％ | ||
| 120min | 50.60％ | ||
| 20min | 30min | 23.77％ | |
| 60min | 41.29％ | ||
| 120min | 54.70％ | ||
| 加热温度 | 加热时间 | 胰蛋白酶水解时间 | 致敏性降低率 |
| 80℃ | 10min | 10min | 42.50％ |
| 20min | 78.55％ | ||
| 30min | 63.20％ | ||
| 60min | 61.30％ | ||
| 120min | 58.21％ | ||
| 20min | 10min | 43.54％ | |
| 20min | 79.99％ | ||
| 30min | 65.80％ | ||
| 60min | 62.00％ | ||
| 120min | 58.70％ |
根据表2可得，水解过程中加热时间上的改变和胃蛋白酶、胰蛋白酶的水解时间上的变化均会导致致敏性变化。
加热时间20min时，经胃蛋白酶水解后致敏性降低率显著高于加热10min的数据，胃蛋白酶的优选加热时间为20min；胃蛋白酶的水解时间为120min时，相较30min、60min，有着明显的致敏性降低的效果，胃蛋白酶优选的水解时间为120min。
加热时间20min时，经胰蛋白酶水解后致敏性降低率略微高于加热10min的数据，胰蛋白酶的优选加热时间为20min；使用胰蛋白酶的水解时间为20min时，相较10min、30min、60min、120min，有着明显的致敏性降低的效果，胰蛋白酶优选的水解时间为20min。
实施例3
加热：对大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，分别于90℃加热，加热时间为10min、20min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存。
水解1：向加热后的大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 1.5恒定，酶解时间为30、60、120min，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；在热处理后的大豆伴球蛋白溶液添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解时间为10、20、30、60、120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；
致敏性检测：将水解中各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率。
低限度水解：将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度55℃和pH 9.0恒定，酶解20min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
水解2：向大豆伴球蛋白碱性蛋白酶水解液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 9.0恒定，酶解2h后，将pH调节至7.0，添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解2h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
对水解中所得各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率，Western Blot分析蛋白水解物的致敏性。通过SDS-PAGE表征的酶解物的水解肽段与致敏性测定结果，检测抗酶解肽段；通过致敏原含量差值与致敏原总量的比例计算即可得到致敏性降低率。改变加热中加热时间和水解中胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解时间得到的致敏性降低数据如表3所示：
表3 90℃加热不同时间经胃蛋白酶或胰蛋白酶水解后的致敏性
| 加热温度 | 加热时间 | 胃蛋白酶水解时间 | 致敏性降低率 |
| 90℃ | 10min | 30min | 19.33％ |
| 60min | 21.33％ | ||
| 120min | 13.44％ | ||
| 20min | 30min | 22.47％ | |
| 60min | 14.72％ | ||
| 120min | 12.11％ | ||
| 加热温度 | 加热时间 | 胰蛋白酶水解时间 | 致敏性降低率 |
| 90℃ | 10min | 10min | 69.30％ |
| 20min | 69.70％ | ||
| 30min | 70.10％ | ||
| 60min | 67.30％ | ||
| 120min | 65.44％ | ||
| 20min | 10min | 70.20％ | |
| 20min | 70.44％ | ||
| 30min | 70.32％ | ||
| 60min | 71.22％ | ||
| 120min | 70.77％ |
根据表3可得，水解过程中加热时间上的改变和胃蛋白酶、胰蛋白酶的水解时间上变化均会导致致敏性变化。
经胃蛋白酶水解处理后导致的致敏性降低的数据在加热温度90℃时较为紊乱，其中优选的实施为加热时间20min时，胃蛋白酶处理30min。
加热时间20min时，经胰蛋白酶水解后其致敏性降低率略微高于加热10min的数据，胰蛋白酶的优选加热时间为20min；使用胰蛋白酶的水解时间为60min时，相较胰蛋白酶水解时间为10min、20min、30min、120min的水解结果，有着明显的致敏性降低的效果，胰蛋白酶优选的水解时间为60min。
根据表1、表2、表3中的数据可得，优选的胃蛋白酶的条件为80℃，加热20min，胃蛋白酶水解120min；优选的胰蛋白酶条件为80℃加热20min，胰蛋白酶水解20min，胃蛋白酶和胰蛋白酶精选的加热温度和加热时间设置相同即胃蛋白酶和胰蛋白酶的优选处理加热条件设置相同。
根据表1、表2、表3中的数据可见，在所考察的加热条件及胃蛋白酶或胰蛋白酶不同的水解时间下，所得大豆伴球蛋白水解物的致敏性虽有不同程度的降低，但依然具有较高的致敏性；且SDS-PAGE结果发现，这些水解物中均存在电泳谱图中位置在20kDa-25kDa处的抗酶解肽段(具体如附图1、图2、图3红色框出位置)，致敏性测定结果表明该肽段具有较高的致敏性。同时，大豆伴球蛋白加热预处理后，经胃蛋白酶水解120min，再经胰蛋白酶水解10～120min后，仍存在抗酶解肽段(如图4中Lane A指示)，且发现该抗酶解肽段是引起致敏性的主要肽段。
实施例4
超声处理：对大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，分别于超声400w和600w的功率处理15min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存。
水解1：向加热后的大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 1.5恒定，酶解120min后，将pH调节至7.0，添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH7.0恒定，酶解120min，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；
致敏性检测：将水解中各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率。
低限度水解：将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度55℃和pH 9.0恒定，酶解20min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
水解2：向大豆伴球蛋白碱性蛋白酶水解液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 9.0恒定，酶解2h后，将pH调节至7.0，添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解2h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
致敏性测定：对水解中所得各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率，Western Blot分析过敏蛋白的致敏性。
对水解中所得各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率，Western Blot分析蛋白水解物的致敏性。通过SDS-PAGE表征的酶解物的水解肽段与致敏性测定结果，检测抗酶解肽段；通过致敏原含量差值与致敏原总量的比例计算即可得到致敏性降低率。改变加热中加热时间和水解中胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解时间得到的致敏性降低数据如表4所示：
表4不同超声处理后再经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后的致敏性
| 超声处理 | 超声条件 | 致敏性降低率 | 再经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解 | 致敏性降低率 |
| 400W，15min | 11.77％ | 60min | 66.35％ | |
| 120min | 71.49％ | |||
| 600W，15min | 10.77％ | 60min | 56.50％ | |
| 120min | 50.44％ |
根据表4可得，超声处理后的致敏性降低率低于加热处理，预选的处理方式为加热处理。经胃蛋白酶和胰蛋白酶连续水解后依然具有较高的致敏性；且根据SDS-PAGE结果显示，此部分水解物均存在电泳谱图中位置在20kDa-25kDa处的抗酶解肽段，该肽段具有较高的致敏性。本实施例中超声处理及后续手段对于致敏性的降低效果较小。
实施例5
加热：对大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，分别于80℃加热20min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存。
水解1：向加热后的大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 1.5恒定，酶解120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；或在热处理后的大豆伴球蛋白溶液添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解20min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；
致敏性检测：将水解中各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率。
低限度水解：将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为0.5％或2％，酶解过程中维持温度55℃和pH 9.0恒定，酶解时间为10、20、30、40、50min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
水解2：向大豆伴球蛋白碱性蛋白酶水解液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 9.0恒定，酶解2h后，将pH调节至7.0，添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH 7.0恒定，酶解2h后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
致敏性测定：对水解中所得各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率，Western Blot分析过敏蛋白的致敏性。
对水解中所得各酶解液进行致敏性测定，SDS-PAGE分析致敏蛋白水解情况，ELISA分析过敏原含量残留率，Western Blot分析蛋白水解物的致敏性。通过SDS-PAGE表征的酶解物的水解肽段与致敏性测定结果，检测抗酶解肽段；通过致敏原含量差值与致敏原总量的比例计算即可得到致敏性降低率。改变加热中加热时间和水解中胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解时间得到的致敏性降低数据如表5所示：
表5不同低限度水解条件及经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后的致敏性
根据表5可得，采用碱性蛋白酶进行低限度水解对于消除致敏性有着促进的作用，加酶量为2％时，消除效果明显好于0.5％，优选的加酶量为2％，水解时间为20min时，得到的致敏性降低率最高，优选的水解时间为20min，此时的致敏性降低率为99.63％，降敏效果极为优秀。
优选的低限度水解条件为，当碱性蛋白酶的酶添加量为0.5％、仅水解20min(水解度达到3.5％)时，大豆伴球蛋白的乳化性和乳化稳定性分别提高51.2％、11.0％，同时，经胃蛋白酶和胰蛋白酶水解后，SDS-PAGE结果显示上述抗酶解肽段完全消失，竞争ELISA法结果表明其致敏性降低率近100％，Western Blot结果显示无蛋白条带显示致敏性。在达到良好的致敏性消除效果的基础上，通过乳化性和乳化稳定性数据可以得出对于大分子蛋白质的结构有着保留和维持的作用，相较常见的将所有蛋白质分子转化为小肽的酶法降低致敏性的方式相比，有着保持大分子蛋白质结构且耗能较低、用时较短的优点。
结合表4和表5中的数据可得，超声处理结合胃蛋白酶和胰蛋白酶处理对于致敏性的降低作用低于碱性蛋白酶处理结合胃蛋白酶和胰蛋白酶处理对于致敏性的降低作用，我方发明中提出的碱性蛋白酶结合胃蛋白酶和胰蛋白酶处理之后的降低致敏性的方法相较其他方法如超声处理配合后续的蛋白酶处理之外有着方法上的优选性。
本发明提出了一种致敏性抗酶解肽段的发现及消除方法，通过加酶量、酶解时间、蛋白酶种类、预处理方式、热处理温度和时间的选择，精选出处理参数，优选的降敏效果达到99.63％，有着优良的降敏效果的同时还保留了蛋白质大分子的结构和性质。除此之外，还有着分离出致敏性抗酶解肽段的作用，便于后续的研究和工业生产使用，致敏性抗酶解肽段的消除方法也是制备低致敏性大豆伴球蛋白乃至低致敏性大豆蛋白的基础，在当今追求健康饮食使用大豆蛋白代替传统肉类蛋白的背景下有着极为重要的推广大豆蛋白的作用。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.一种检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其特征在于：包括大豆伴球蛋白致敏性肽段检测和大豆伴球蛋白致敏性消除；
所述检测方法包括加热、消化酶水解、致敏性检测三个步骤，所述消除方法包括低限度水解、消化酶连续水解、致敏性测定三个步骤；
所述检测中包括如下步骤：
加热：对大豆伴球蛋白溶液进行加热；
水解1：加入胃蛋白酶、胰蛋白酶进行酶水解；
致敏性检测：进行SDS-PAGE和ELISA分析；
所述消除中包括如下步骤：
低限度水解：大豆伴球蛋白溶液中加入碱性蛋白酶进行酶水解得到酶解液；
水解2：对低限度酶解液进行消化酶连续水解处理；
致敏性测定：进行SDS-PAGE、ELISA分析、WesternBlot分析；
所述加热中，对大豆伴球蛋白进行加热处理的方法为将大豆伴球蛋白与去离子水混合，配制3％～7％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，于70～100℃加热5～40min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存；
所述消化酶水解中，向加热得到的热处理大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH1.5恒定，酶解30～120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；向加热制备所得的热处理大豆伴球蛋白溶液添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH7.0恒定，酶解10～120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；
所述低限度水解中，将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3～7％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为0.5～2％，酶解过程中维持温度50～65℃和pH8.0～9.0恒定，酶解10～60min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
2.根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其特征在于：所述加热中，对大豆伴球蛋白进行处理的方法为将大豆伴球蛋白与去离子水混合，配制3％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，于80℃加热20min，加热完毕后置于冰水浴中迅速冷却，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其特征在于：所述消化酶水解中，向加热得到的热处理大豆伴球蛋白溶液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH1.5恒定，酶解120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min；向加热制备所得的热处理大豆伴球蛋白溶液添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH7.0恒定，酶解60min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
4.根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其特征在于：所述低限度水解中，将大豆伴球蛋白粉末与去离子水混合，配制3～7％(w/w)的大豆伴球蛋白溶液，添加碱性蛋白酶，加酶量E/S为0.5～2％，酶解过程中维持温度55℃和pH9.0恒定，酶解20min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
5.根据权利要求1所述的检测大豆伴球蛋白致敏性肽段及消除大豆伴球蛋白致敏性方法，其特征在于：所述水解2中制得的酶解液中添加胃蛋白酶，加酶量E/S为2％，酶解过程中维持温度37℃和pH1.5恒定，酶解2h后，将pH调节至7.0，添加胰蛋白酶，加酶量E/S为2％(w/w)，酶解过程中维持温度37℃和pH7.0恒定，酶解10～120min后，将pH调节至中性，沸水浴灭酶10min。
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