CN105973969A - 食品低致敏加工方式的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
食品低致敏加工方式的筛选方法,是将食品蛋白以不同方式经过熟制加工后,提取蛋白,与体外模拟消化液混合后,以SDS‑PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物,根据耐酶解条带的多少判断不同加工方式下食品的致敏性,筛选出获得低致敏食品的加工方式。本发明的筛选方法不经过复杂的过敏原检测手段,利用食品是否耐模拟胃液消化来反应其潜在致敏性,结合生活实际,确定食品低致敏熟制加工方式,操作简单,结果显著,且可信度高,重复性强。
Description
技术领域
本发明涉及食品的低致敏性加工方法,属于食品加工领域。
背景技术
食品过敏指的是人体免疫系统对食品中的某种物质产生了免疫反应,包括抗体的释放,而这些抗体又引起人体内某些化学物质释放,例如组胺会引起皮肤发痒、流鼻涕、咳嗽、呼吸困难,甚至导致死亡(张瑞灏等,中国检验检疫,2009,3:22)。除牛奶、蛋类以及坚果等常见的陆地食物过敏原外,鱼类等水产品过敏原同样占据了非常大的比重。
采用一定的加工方式,可在过敏食物被食用前改变其中过敏原表位的特性,从而降低某些食物的致敏性。但是,加工处理对不同食物过敏原的影响存在很大差异,如热处理可以破坏蔷薇科果实的致敏性,也能部分影响大豆、坚果、猕猴桃、鸡蛋、虾等过敏原的稳定性[郑礼娜,林洪,等.不同热加工方式对刀额新对虾过敏原活性的影响.水产学报,2011,35(2):466-471.],而牛奶、花生等致敏食物的热稳定性却很好[Tong P,Gao J Y,et al.Food Chemistry,2012,131(2):603-610.Cabanillas B,Maleki S J,et al.Food Chemistry,2012,132(1):360-366.];高压处理能够有效地降低乳清蛋白的致敏性及消化稳定性[Chicón R,Belloque J,et al.Int Dairy J,2008,18(4):367–376.];牛乳中的过敏原α-乳白蛋白与葡萄糖反应后,美拉德反应能明显降低其免疫活性[Bu G,Lu J,et al.J Sci FoodAgric,2009,89(14)2428–2434.8]。Astwood等人发现食品中的大部分过敏原具有含量高、在体内胃液酸性环境中很难被胃蛋白酶水解(Astwood J.D.,et al.NatureBiotechnology 1996,14:1269),该发现说明过敏原与耐胃液消化蛋白质具有一定的相关性。所以采用模拟胃液消化来评价不同加工方式对食物过敏性的影响,具有一定的实用价值,可为进一步开发低致敏性制品尤其是水产制品提供理论参考。
发明内容
为解决现有技术中没有快速有效的评估加工低致敏食品的方法,本发明拟提供一种食品低致敏加工方式的筛选方法,判断不同的熟制加工方式下食品的致敏性,筛选出获得低致敏食品的加工方式。
为了实现上述目的,本发明提供一种食品低致敏加工方式的筛选方法,是将食品蛋白以不同方式经过熟制加工后,提取蛋白,与体外模拟消化液混合后,以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物,根据耐酶解条带的多少判断不同加工方式下食品的致敏性,筛选出获得低致敏食品的加工方式。
本发明食品加工方式的筛选方法不经过复杂的过敏原检测手段,利用食品是否耐模拟胃液消化来反应其潜在致敏性,结合生活实际,确定食品低致敏熟制加工方式,操作简单,结果显著,且可信度高,重复性强。
附图说明
图1是大黄鱼蛋白质(未加工)的模拟胃液消化产物的SDS-PAGE电泳图;
图2是大黄鱼蛋白质(蒸)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图3是大黄鱼蛋白质(煮)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图4是大黄鱼蛋白质(烤)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图5是带鱼蛋白质(未加工)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图6是带鱼蛋白质(蒸)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图7是带鱼蛋白质(煮)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图8是带鱼蛋白质(烤)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图9是金鲳鱼蛋白质(未加工)经过不同时间的体外模拟胃液酶解SDS-PAGE电泳图;
图10是金鲳鱼蛋白质(蒸)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图11是金鲳鱼蛋白质(煮)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图;
图12是金鲳鱼蛋白质(烤)经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
本发明所述的食品低致敏加工方式的筛选方法,是将食品蛋白以不同方式经过熟制加工后,提取蛋白,与体外模拟消化液混合后,以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物,根据耐酶解条带的多少判断不同加工方式下食品的致敏性,筛选出获得低致敏食品的加工方式。
本发明所述的食品低致敏加工方式的筛选方法实施的重要基础之一,是依赖于耐酶解条带与食品过敏原的相关性。现有技术的众多研究表明,过敏原与耐酶解胃液消化蛋白质具有一定的相关性,据此,有关于过敏原与耐酶解条带的关系,可根据如下实验步骤进行验证:将食品蛋白与体外模拟消化液混合后,以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物;选取耐酶解条带进行胶内酶解,所得肽段采用液相色谱-质谱联用鉴定分析,并结合蛋白质数据库和过敏原数据库,确定致敏蛋白质种类及其过敏性。
以大黄鱼为例,将其蛋白样品与体外模拟消化液混合后,进行体外模拟消化液混合后,可确定其耐酶解条带为47kD,42kD和12kD条带,对三种耐酶解条带进行胶内酶解,采用液相色谱-质谱联用进行分析,结合蛋白质数据库进行鉴定。三种条带的结果分别为:(1)大黄鱼中烯醇化酶,与已知武昌鱼(Megalobramaamblycephala)中过敏原烯醇化酶同源性为95%(Identities410/433(95%),E value0.0),说明该蛋白质过敏性较高;(2)大黄鱼中肌酸激酶M与已知武昌鱼中过敏原肌酸激酶同源性为89%(Identities 335/377(89%),Evalue0.0),说明该蛋白质过敏性较高;(3)大黄鱼中原肌球蛋白α-1与已知过敏原pen a 1同源性为55%(Identities 145/265(55%),E value2e-75)。该蛋白与pen a 1三个已鉴定的表位都有超过6个连续的氨基酸序列相同,分别为:AADESER,AEEADRKY和FAERSV,说明该蛋白质过敏性较高。
在其他鱼类蛋白的实验中也得出类似的结果,由以上结果显示,食品过敏原与其耐酶解胃液消化蛋白质具有一定的相关性,在实际应用中,可依照耐酶解蛋白的结果判断食品的过敏原及致敏性。
在上述本发明所述的食品低致敏加工方式的筛选方法中,所述的体外模拟消化液是体外模拟胃液或体外模拟肠液。在食品蛋白与体外模拟消化液混合过程中,优选控制体外模拟消化液中的酶与食品蛋白的质量比是1:40~60。作为更进一步的优选,所述的体外模拟消化液是含有胃蛋白酶的体外模拟胃液,胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50。
在上述筛选方法中,作为优选,所述食品蛋白是鱼源性食品蛋白。
在上述筛选方法中,所述的食品蛋白是采用等电点沉淀法、缓冲盐提取法或有机溶剂提取法从食物样品中提取,并经冷冻干燥处理的混合蛋白样品。
在上述筛选方法中,所述的熟制加工包括蒸、煮、烤和/或高压处理。
为使本领域技术人员更容易理解本发明,上述筛选方法更为具体的操作步骤如下:
(1)将食品蛋白以蒸、煮、烤或高压处理等方式加工后,采用等电点沉淀法、缓冲盐提取法或有机溶剂提取法从加工后的食物样品中提取蛋白;
(2)将步骤(1)中提取的蛋白与含有胃蛋白酶的体外模拟胃液混合,使胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50;
(3)消化反应在37℃条件下震荡进行,分别在消化反应0、5、15、30、60、90和120分钟,进行SDS-PAGE电泳分析;
(4)根据步骤(3)的结果,确定电泳结果的耐酶解条带的数量,由此筛选出获得低致敏食品的最佳加工方式。
以下结合技术方案和附图详细叙述本发明的具体实施方式。
实施例1
本实施例是针对大黄鱼中耐酶解条带与过敏原对应关系的实验。
1、大黄花鱼蛋白质的提取
取洗净的大黄鱼肌肉300g,用搅拌机将大黄花鱼肌肉绞碎,再用均质机将绞碎的鱼肉进行均质,加入7倍体积的水后,用盐酸将PH值调至2.4左右,使蛋白质大部分溶解,在5000r/min条件下,离心15min,收集上清液。再用氢氧化钠溶液将上清液的pH值调至4.75左右,使蛋白质沉淀,在5000r/min下,离心15min,收集蛋白质沉淀,将其冷冻干燥以备用。
2.体外模拟胃液消化
模拟胃液:称取0.1gNaCl于50ml蒸馏水中,用HCl调pH至1.2,加入胃蛋白酶,使胃蛋白酶的质量浓度为150ug/ml。
同样方法制备对照溶液,与模拟胃液区别在于仅不含胃蛋白酶。
取离心管,其中一支加入模拟胃液,另一支加入同体积对照溶液,分别设置平行样品。在37℃条件下预热15分钟后,将所提取的大黄花鱼蛋白质加入上述离心管中混合均匀,使胃蛋白酶与大黄鱼蛋白的质量比例为1:50,总反应体系为1ml。消化反应在37℃条件下震荡进行,分别在消化反应0、2、10、30、60、90和120分钟时取出100ul反应液于离心管中,迅速与30ul 200mM Na2CO3溶液混合均匀,使其达到碱性,终止反应,并迅速放入冰柜中。其中0分钟样品是将含有胃蛋白酶的模拟胃液先与Na2CO3中和终止反应,再加入同等量的大黄鱼蛋白。
3.SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量及抗酶解性能
采用12.5%的分离胶对步骤2不同时间点取样的消化后产物进行分析,结果如附图1所示。
根据附图1可见:模拟胃液酶解120min后,仍然存在47kD,42kD和12kD条带的蛋白质。在0min时,42kD条带存在,47kD和12kD条带不存在。47kD,42kD和12kD三条条带的蛋白质在120min以内随着酶解时间的增加浓度逐渐增加,这几个条带是相对耐酶解的蛋白质或肽段。由此可见大黄鱼肌肉中耐酶解蛋白质是分子量为47kD,42kD和12kD的蛋白质。
对上述确定的大黄鱼的耐酶解蛋白质条带进行胶内酶解,采用液相色谱-质谱联用进行分析,结合蛋白质数据库进行鉴定。参数条件包括:纳升级高效液相色谱-串联质谱分析在LTQ-Orbitrap(Thermo,SandyJose,SA)质谱系统中进行。其中,液相色谱C18AQ(3μm,12cm)分流后的流速约为200nl/min;离子传输毛细管的温度设置为200℃,电喷雾电压设置为1.8kV。采用数据依赖模式(data-dependent mode,DDA)进行数据采集,每个循环包括1个MS全扫描和10个MS/MS质谱扫描,MS全扫描在Orbitrap中采集,扫描范围为400-2000Da,分辨率为60000.二级质谱采集在LTQ中进行,采用CID碎裂方式,归一化碰撞能量为35%。所收集的质谱文件通过Maxquant(version 1.3.0.5)在蛋白质库中进行检索。结果如表1所示:
表1.大黄鱼蛋白质耐酶解条带通用液相色谱-质谱联用鉴定结果
采用NCBI/blast数据库将鉴定到的大黄鱼蛋白质与已知过敏原或表位序列进行比对,得到如下结果:
1.大黄鱼中烯醇化酶与已知武昌鱼(Megalobramaamblycephala)中过敏原烯醇化酶同源性为95%(Identities 410/433(95%),E value0.0),说明该蛋白质过敏性较高。
2.大黄鱼中肌酸激酶M与已知武昌鱼中过敏原肌酸激酶同源性为89%(Identities 335/377(89%),E value0.0),说明该蛋白质过敏性较高。
3.大黄鱼中原肌球蛋白α-1与已知过敏原pen a 1同源性为55%(Identities145/265(55%),E value2e-75)。该蛋白与pen a 1三个已鉴定的表位都有超过6个连续的氨基酸序列相同,分别为:AADESER,AEEADRKY和FAERSV,说明该蛋白质过敏性较高。
4.大黄鱼中小清蛋白与鲤鱼已知过敏原小清蛋白质同源性为79%(Identities 84/107(79%),E value1e-51)。该蛋白与Gad c1已鉴定的1个表位(AGDSDGDGK,Elsay,Apold,1983)氨基酸序列完全一致相同。与scoj 1过敏原表位中8个连续氨基酸序列(FFKACGLS)一致说明该蛋白质过敏性较高。
由实施例1的实验结果可知,食品过敏原与其耐酶解胃液消化蛋白质的相关性很大,在实际应用中,可依照耐酶解蛋白的结果判断食品的过敏原及致敏性。
以下实施例分别为大黄鱼、带鱼、金鲳鱼低致敏加工方式的筛选方法实例。
实施例2
将新鲜大黄鱼去头、尾、鳞和内脏。取带皮背部白肉30g/袋,4袋白肉分别做原样、蒸、煮和烘烤处理。总共4组鱼肉样本。
原样处理:将30g鱼肉用冰蒸馏水洗净,沥干,绞碎后装入保鲜袋于-20℃冰箱备用。
蒸样处理:将洗净的30g鱼肉放入沸水蒸锅中,自放入起计时15min后,绞碎后装入保鲜袋于-20℃冰箱备用。
煮样处理:将洗净30g鱼肉放入沸水锅中,自放入起计时15min后,用漏勺捞起,绞碎后装入保鲜袋于-20℃冰箱备用。
烘烤处理:将洗净30g鱼肉放入锡箔纸中包好,在烘箱102℃条件下烘烤2h,取出绞碎后装入保鲜袋于-20℃冰箱备用。
将4组鱼肉样品采用等电点提取法,即:匀浆、均质—制备可溶性蛋白液—等电点析出蛋白质—冻干的步骤提取所需的4组蛋白质样品。
体外模拟胃液消化
将4组通过等电点法提取的鱼肉蛋白质样品,按照体外模拟消化实验的方法进行模拟人体胃液消化,实验的反应时间更改为0、5、15、30、60、90、120min共7组时间平行条件。
SDS-PAGE凝胶电泳方法,按照样品制备—制胶—电泳—染色—脱色—分析的步骤,将制备好的蛋白质样液进行SDS-PAGE凝胶电泳实验。
图2~图4分别为大黄鱼蛋白质经蒸、煮、烤加工方式处理后经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图,未加工的大黄鱼蛋白质的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图见附图1,其各种处理方式下蛋白质条带对比如表2所示。
表2大黄鱼各处理方式蛋白质条带对比
从表2中我们可以得出:以过敏原的耐酶解性为依据,三种加工方式都使大黄鱼的蛋白质得到了一定程度的降解,蛋白质条带明显减少,尤其是大分子的蛋白质,但均在体外消化试验2h后,仍存在部分耐酶解的蛋白质。仅从剩余蛋白质条带的种类分析,对于大黄鱼,烤和煮的加工方式优于蒸。
实施例3
采用新鲜带鱼为研究对象,具体处理步骤同实施例2。
图5~图8分别为带鱼蛋白质在未加工、经蒸、煮、烤加工方式处理后经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图,其各种处理方式下蛋白质条带对比如表3所示。
表3带鱼各处理方式蛋白质条带对比
从表3中我们可以得出:以过敏原的耐酶解性为依据,三种加工方式蒸、煮和烘烤的差别不大,虽然三种加工方式均使带鱼的蛋白质得到了一定程度的降解,蛋白质条带明显减少,尤其是大分子的蛋白质,但部分条带在体外消化试验2h后,仍存在,说明其耐酶解性质稳定。仅从剩余蛋白质条带的种类分析,对于带鱼,三种加工方式对耐酶解蛋白质的影响程度相似。
实施例4
采用新鲜金鲳鱼为研究对象,具体处理步骤同实施例2。
图9~图12分别为金鲳鱼蛋白质在未加工、经蒸、煮、烤加工方式处理后经过不同时间的体外模拟胃液酶解后SDS-PAGE电泳图,其各种处理方式下蛋白质条带对比如表4所示。
表4金鲳鱼鱼各处理方式蛋白质条带对比
从表4中我们可以得出:以过敏原的耐酶解性为依据,三种加工方式都使金鲳鱼的蛋白质得到了一定程度的降解,其蛋白质条带明显减少,尤其是大分子的蛋白质,但均在体外消化试验2h后,仍存在部分耐酶解的蛋白质。仅从剩余蛋白质条带的种类分析,对于金鲳鱼而言,烤和蒸的加工方式优于煮。
Claims (8)
1.食品低致敏加工方式的筛选方法,是将食品蛋白以不同方式经过熟制加工后,提取蛋白,与体外模拟消化液混合后,以SDS-PAGE电泳分析不同消化时间条件下的消化产物,根据耐酶解条带的多少判断不同加工方式下食品的致敏性,筛选出获得低致敏食品的加工方式。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的体外模拟消化液是体外模拟胃液或体外模拟肠液。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的体外模拟消化液中的酶与食品蛋白的质量比是1:40~60。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的体外模拟消化液是含有胃蛋白酶的体外模拟胃液,胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述食品蛋白是鱼源性食品蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的食品蛋白是采用等电点沉淀法、缓冲盐提取法或有机溶剂提取法从食物样品中提取,并经冷冻干燥处理的混合蛋白样品。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的熟制加工包括蒸、煮、烤和/或高压处理。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述筛选方法包括如下步骤:
(1)将食品蛋白以蒸、煮、烤或高压处理等方式加工后,采用等电点沉淀法、缓冲盐提取法或有机溶剂提取法从加工后的食物样品中提取蛋白;
(2)将步骤(1)中提取的蛋白与含有胃蛋白酶的体外模拟胃液混合,使胃蛋白酶与食品蛋白的质量比是1:50;
(3)消化反应在37℃条件下震荡进行,分别在消化反应0、5、15、30、60、90和120分钟,进行SDS-PAGE电泳分析;
(4)根据步骤(3)的结果,确定电泳结果的耐酶解条带的数量,由此筛选出获得低致敏食品的最佳加工方式。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160928 |