CN106072071B

CN106072071B - 一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法

Info

Publication number: CN106072071B
Application number: CN201610416692.7A
Authority: CN
Inventors: 李振兴; 袁方舟; 米娜莎; 林洪; 吕良涛
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2016-06-15
Filing date: 2016-06-15
Publication date: 2019-10-01
Anticipated expiration: 2036-06-15
Also published as: CN106072071A

Abstract

本发明提出一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：A，刀额新对虾原肌球蛋白的纯化；B，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液稀释成浓度为1‑4mg/ml的原肌球蛋白；向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶，该酶的添加量为8‑15U/g蛋白；或者向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖，其中酶的添加量为8‑15U/g蛋白，氨基葡萄糖与蛋白的质量比为1:1；将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为25‑40℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，在4℃下透析24h，得到低敏性原肌球蛋白。本发明能有效降低虾类食品中主要过敏原原肌球蛋白的活性。

Description

一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法。

背景技术

刀额新对虾俗称泥虾、麻虾、花虎虾、虎虾、砂虾、红爪虾、卢虾，商业上称基围虾，是最常见和深受人们喜爱的一种水产食品，然而，其也是引起食源性过敏反应性疾病的常见食品之一。近年来国内外有关食源性虾过敏的报道屡见不鲜。食物过敏反应的临床表现包括呼吸系统、胃肠道系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉和骨骼等不同形式的临床症状，如荨麻疹、疱疹样皮炎、口腔过敏综合症、肠病综合症、哮喘及过敏性鼻炎等。严重的食物过敏可导致过敏性休克，现已成为过敏反应中危及生命的主要原因。现已证实从海虾中分离出的原肌球蛋白（TM）是虾的主要过敏原，分子量为36kDa，占煮后虾粗提液可溶性蛋白的20％，含糖约2.9％。

建立虾类食品过敏原的改性方法已成为当务之急。从食品工业角度出发，Maillard反应是在蛋白质的氨基和还原糖的羰基之间发生的一系列非常复杂的非酶褐变反应，该反应形成的新化合物可通过屏蔽抗原表位来改变蛋白的过敏性，同时，它还能影响食品的风味、颜色、质地以及营养等品质。美拉德改性方法不需要提供特殊装置，且不添加任何化学试剂，因此在低敏性蛋白制品生产中相对简单、安全。

但是在美拉德反应中，存在反应速率过慢、不易控制、产生不期望的颜色、营养价值下降、生成有毒化合物等问题。

转谷氨酰胺酶（TG酶）交联是蛋白质食品改性的研究热点之一。对于蛋白质底物，TG酶可以催化谷氨酰胺残基与赖氨酸残基中的ε-氨基发生反应，产生γ-谷氨酰基-ε-赖氨酸侧链肽，导致蛋白质交联；TG酶还可以将赖氨酸残基替换为伯胺类物质，从而在蛋白质底物上导入胺类化合物——这两种反应竞争发生。如果所导入的胺类化合物是一个氨基糖，就产生蛋白质的糖基化反应。该酶促反应催化蛋白质分子发生聚合，改善蛋白质的功能特性，而将含有伯胺基的氨基葡萄糖共价交联至大豆蛋白、酪蛋白等常见食品蛋白后，发现糖基化蛋白质的溶解性、乳化性质、流变学性质等都有较大改善。相比于非酶褐变，酶促糖基化反应时间短、反应条件温和，产物的性质变化显著，不存在美拉德反应途径中所存在的那些副反应。另外，蛋白质分子发生交联可使原先暴露在表面的过敏原表位包埋入蛋白质分子内部而消除其致敏性，该方法已被应用于低致敏性花生和牛奶、大豆等食品的开发；然而，目前还没有将转谷氨酰胺酶交联应用于海虾，改善其过敏原的报道，同时目前也没有报道过通过酶促糖基化反应从而改善海虾过敏原的报道。

因此，如能解决对于具有较大市场份额的刀额新对虾的引起过敏的问题，对于保证刀额新对虾产品以及其深加工产品的安全性、扩大其市场普及和提高水产品的利用价值都极其重要。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提出一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法。其是通过以下技术方案实现的：

一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，包括如下步骤：A，刀额新对虾原肌球蛋白的纯化；B，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液稀释成浓度为1-4mg/ml的原肌球蛋白；向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶，该酶的添加量为8-15U/g蛋白；或者向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖，其中酶的添加量为8-15U/g蛋白，氨基葡萄糖与蛋白的质量比为1:1；将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为25-40℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为150-200rpm，反应时间为5-8h，反应完成将其进行冷却后，在4℃下透析24h，以除去未发生反应的游离氨基葡萄糖，得到透析液为低敏性原肌球蛋白。透析结束后，透析过程结束后透析袋内的溶液即为处理后的原肌球蛋白。

优选的，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液稀释成浓度为2mg/ml的原肌球蛋白。

优选的，所述步骤B中，向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶，该酶的添加量为10U/g蛋白；或者向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖，其中酶的添加量为10U/g蛋白，氨基葡萄糖与蛋白的质量比为1:1；

优选的，所述步骤B中将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为37℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为180rpm，反应时间为6h，反应完成将其进行冷却后，4℃下透析24h后，得到低敏性原肌球蛋白。

优选的，所述步骤B中将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为25℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为180rpm，反应时间为6h，反应完成将其进行冷却后，4℃下透析24h后，得到低敏性原肌球蛋白。

优选的，所述步骤B中将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为37℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为160rpm，反应时间为7.5h，反应完成将其进行冷却后，4℃下透析24h后，得到低敏性原肌球蛋白。

优选的，所述步骤A中刀额新对虾原肌球蛋白的纯化步骤为：（1）将新鲜的刀额新对虾去头，去壳，去肠线，蒸馏水洗净后称重，得虾肉；（2）取虾肉与肌原纤维提取液混合匀浆，其中虾肉与肌原纤维提取液的质量体积比为1：1，将混合物离心，4000 r/min，15 min，取沉淀，重复5次；（3）将经步骤（2）得到的沉淀置于95%冷乙醇中反复抽提三次，其中，沉淀与冷乙醇的质量体积比为1：2，4000 r/min离心15 min，再得沉淀；再将沉淀置于乙醚中反复抽提三次，该沉淀与冷乙醇的质量体积比为 1：2，4000 r/min离心15 min，再得沉淀；于通风橱中将沉淀过夜风干；（4）将经步骤（3）得到的沉淀浸于原肌球蛋白抽提液中，沉淀与原肌球蛋白抽提液的质量体积比为1：10，匀浆，在4℃冰箱中抽提24h后，6000 r/min离心30min，取上清液；（5）将上清液用30%的硫酸铵沉淀后，3000 r/min离心20min，并将离心后的沉淀用30%硫酸铵溶液再清洗2次后，3000r/min离心20min，取沉淀溶解在10 mM的PBS缓冲液中，得蛋白溶液；（6）将蛋白溶液置于透析袋中，于10 mM的PBS缓冲液中透析24h；（7）透析结束后，将蛋白溶液置于沸水浴中加热10 min，快速冷却至室温后，9000 r/min离心30min，除去沉淀的变性蛋白，上清液即得纯化后的虾原肌球蛋白。

优选的，述步骤A中刀额新对虾原肌球蛋白纯化步骤中所需溶液的配方为：肌原纤维提取液配方：称取1.49 g KCl，0.1 g KHCO₃，0.0154 g DTT，加超纯水定容至1000 mL，4℃保存；原肌球蛋白抽提液配方：74.5 g KCl，0.5 g NaN₃，加超纯水定容至1000 mL ，并将其pH调为7.5，4℃保存；

优选的，所述步骤B 中，所述PBS缓冲液中添加10mM的DTT。

本发明相对于现有技术所具有的优点为：

1.本发明通过酶促法以及酶促反应和糖基化处理结合的方式，有效的降低了刀额新对虾的主要过敏原原肌球蛋白的活性，为今后的制备低敏性的虾制品提供有力的保证。

2.本发明首次利用转谷氨酰胺酶，其催化虾肉内部蛋白质分子之间或之内的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺残基的水解，可有效增强虾肉蛋白的凝胶性能，并为日后改良虾肉品质的质地结构和口感提供支持。

3.本发明首次利用转谷氨酰胺酶与氨基葡萄糖相结合，即酶促糖基化反应对刀额新对虾的过敏原进行了处理，由于糖基化处理引入了亲水性的糖，可提升蛋白质的溶解性、热稳定性及乳化性、流变学性质等，进而对相关食品的口感、质地和外观有很好的改善作用，可为日后改良虾肉品质的质地结构和口感提供支持。

4.本发明运用了酶促糖基化这一定向酶促介导的方式，与非酶褐变相比，该反应时间较短且反应条件温和，避免了美拉德反应中反应速率较低的问题，而且不会使蛋白质和氨基糖中的营养成分遭到破坏，也不会产生各种复杂甚至有害的副产物。这有望在食品加工中得到进一步的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同条件处理下原肌球蛋白的SDS-PAGE分析；

图2为利用间接ELISA法检测原肌球蛋白的过敏原活性；

图3为利用免疫印迹法检测原肌球蛋白的过敏原活性；

以上附图中，A为25℃恒温培养得到各处理及对照的测定或检测结果，B代表37℃恒温培养得到的各处理及对照的测定或检测结果；1为未经处理的原肌球蛋白；2为经TG酶处理的蛋白；3经氨基葡萄糖处理的蛋白；4为经TG酶和氨基葡萄糖处理的蛋白；M为蛋白质分子量标准。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

一、降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法的实施例

实施例一，

酶促降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白，包括以下步骤：

A，刀额新对虾原肌球蛋白的纯化；

B，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液（含有10mM的DTT）稀释成浓度为2mg/ml的原肌球蛋白；向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶，该酶的添加量为10U/g蛋白；将添加转谷氨酰胺酶的蛋白放置于温度为37℃或25℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为180rpm，反应时间为6h，反应完成将其进行冷却后，在4℃下透析24h，得到经TG酶处理的原肌球蛋白。

实施例二、酶促降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白，

包括以下步骤：

A，刀额新对虾原肌球蛋白的纯化；

B，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液（含有10mM的DTT）稀释成浓度为2mg/ml的原肌球蛋白；向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶，该酶的添加量为12U/g蛋白；将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白放置于温度为37℃或30℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为160rpm，反应时间为7.5h，反应完成将其进行冷却后，在4℃下透析24h，得到经TG酶处理的原肌球蛋白。

实施例三、酶促糖基化降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白，

包括以下步骤：

A，刀额新对虾原肌球蛋白的纯化；

B，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液（含有10mM的DTT）稀释成浓度为2mg/ml的原肌球蛋白；向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖，其中酶的添加量为10U/g蛋白，氨基葡萄糖与蛋白的质量比为1:1；将添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为37℃或25℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为180pm，反应时间为6h，反应完成将其进行冷却后，在4℃下透析24h，得到经TG酶和氨基葡萄糖酶促糖基化处理后的原肌球蛋白。

本发明中的反应温度是在TG酶的最适反应温度区间内，可以相对抑制其竞争反应非酶褐变的发生，其中，5-8h的反应时间使氨基葡萄糖能有足够的时间与蛋白质进行糖基化交联，从而提升酶促糖基化产物的得率。

本发明中，原肌球蛋白与氨基葡萄糖的质量比为1：1是为了保证蛋白质酰基受体（氨基糖）远高于酰基供体（蛋白），从而保证反应的进行。

另外，糖基导入量随酶量的增加而增加，在10 U/g蛋白时糖基导入最多，酶添加量继续增加，糖基导入量反而下降。这是因为反应体系存在蛋白自身交联与氨基葡萄糖导入两个竞争发生的反应，酶添加量过高会导致原肌球蛋白迅速交联从而造成空间位阻，从而减少了氨基葡萄糖与蛋白底物结合位点接触的机会。

实施例四、酶促糖基化降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白，

包括以下步骤：

A，刀额新对虾原肌球蛋白的纯化；

B，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液（含有10mM的DTT）稀释成浓度为2mg/ml的原肌球蛋白；向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖，其中酶的添加量为15U/g蛋白，氨基葡萄糖与蛋白的质量比为1:1；将添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为37℃或25℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为180pm，反应时间为6h，反应完成将其进行冷却后，在4℃下透析24h，得到经TG酶和氨基葡萄糖处理的原肌球蛋白。

对于实施例1-4来说，本发明中的刀额新对虾原肌球蛋白可通过以下方法制备而成，步骤为：

（1）将新鲜的刀额新对虾去头，去壳，去肠线，蒸馏水洗净后称重，得虾肉；

（2）取虾肉与肌原纤维提取液混合匀浆，其中虾肉与肌原纤维提取液的质量体积比为1：1，将混合物离心，4000 r/min，15 min，取沉淀，重复5次；

（3）将经步骤（2）得到的沉淀置于95%冷乙醇中反复抽提三次，其中，沉淀与冷乙醇的质量体积比为1：2，4000 r/min离心15 min，再得沉淀；再将沉淀置于乙醚中反复抽提三次，该沉淀与冷乙醇的质量体积比为 1：2，4000 r/min离心15 min，再得沉淀；于通风橱中将沉淀过夜风干；

（4）将经步骤（3）得到的沉淀浸于原肌球蛋白抽提液中，沉淀与原肌球蛋白抽提液的质量体积比为1：10，匀浆，在4℃冰箱中抽提24h后，6000 r/min离心30min，取上清液；

（5）将上清液用30%的硫酸铵沉淀后，3000 r/min离心20min，并将离心后的沉淀用30%硫酸铵溶液再清洗2次后，3000r/min离心20min，取沉淀溶解在10 mM的PBS缓冲液中，得蛋白溶液；

（6）将蛋白溶液置于透析袋中，于10 mM的PBS缓冲液中透析24h；

（7）透析结束后，将蛋白溶液置于沸水浴中加热10 min，快速冷却至室温后，9000r/min离心30min，除去沉淀的变性蛋白，上清液即得纯化后的虾原肌球蛋白。

为了研究虾过敏原的检测与控制，必须首先获得高纯度的过敏原组分，它可以更为细致地了解虾过敏原的生化特征及各种加工过程中对其致敏性的影响提供实验材料，从而有助于低过敏或无过敏的虾制品以及虾过敏原的检测。本发明的纯化方法简单，且可得到纯化效果好的原肌球蛋白。

本发明中各溶液配方为：

10mM PBS缓冲液配方：14.5gNa₂HPO_4·12H₂O，1.0 g KH₂PO₄，1.0 gKCl，40.0 gNaCl，加超纯水定容至5000 mL，并将其pH调为7.5，4℃保存。

在弱酸性（pH<7.0）条件下，可能是由于氨基葡萄糖中氨基被质子化，糖基导入量较少；在中性或弱碱性（pH值为7.0~7.5）条件下，氨基葡萄糖的氨基以-NH₂形式存在，其反应活性增加，pH值为7.5时，糖基导入量为最大。但在碱性（pH>7.5）条件下，TG酶活力受限，氨基葡萄糖的导入量降低。

肌原纤维提取液配方：称取1.49 g KCl，0.1 g KHCO₃，0.0154 g DTT，加超纯水定容至1000 mL，4℃保存。

原肌球蛋白抽提液配方：74.5 g KCl，0.5 g NaN₃，加超纯水定容至1000 mL，并将其pH调为7.5，4℃保存。

二、SDS-PAGE法分析不同处理的原肌球蛋白组分变化

2.1. 供试材料：

样品1：实施例一的经TG酶处理的原肌球蛋白；

样品2：实施例三的经TG酶和氨基葡萄糖处理的原肌球蛋白；

样品3：仅经氨基葡萄糖处理的原肌球蛋白：其是通过以下步骤制备得到的：A：刀额新对虾原肌球蛋白的纯化；B，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液（含有10mM的DTT）稀释成浓度为2mg/ml的原肌球蛋白；向稀释后的蛋白中加入氨基葡萄糖，氨基葡萄糖与蛋白的质量比为1:1；将氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为37℃或25℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为180pm，反应时间为6h，反应完成将其进行冷却后，在4℃下透析24h，得到经氨基葡萄糖处理的原肌球蛋白；其中原肌球蛋白的纯化步骤与上述步骤一致。

对照样品：纯化后的原肌球蛋白。

2.2. SDS-PAGE法分析不同方法处理后的TM组分变化

电泳分离胶浓度为15%(w/v)，浓缩胶浓度为5%(w/v)。将上述各样品与上样缓冲液混合热变性后，每泳道上样5 μg。染色、脱色完毕后用凝胶成像仪拍摄成像，收集图像。

2.3.对反应进行SDS-PAGE评价：

从SDS-PAGE中的蛋白条带来看，图1所示，仅经糖基化反应没有产生大分子量的蛋白，因此条带3几乎与1一致。条带2、4中，在35.0 kDa附近处，原肌球蛋白的条带明显变细，并且整个泳道发生了弥散现象，说明在TG酶的作用下，TM发生了交联，在70kDa、140 kDa附近生成了大分子量的聚合物。另外，与25℃的反应温度相比，37℃由于更接近TG酶的最适反应温度，因此酶促反应更为剧烈，从电泳的结果来看，条带弥散现象更为严重，35.0 kDa附近的TM条带变得更细，而在分离胶的最上端产生了由非二硫键形成的大分子交联物质。

三、产品致敏性检测

3.1. 抗刀额新对虾原肌球蛋白多克隆抗体的制备：

采用皮下多点注射的方式对兔子进行免疫，免疫试剂为纯化后的原肌球蛋白。抗原免疫所需的剂量为每只兔子 1 mg/ml，频率为 2 周/次，同时检测抗体效价，持续 8 周共免疫 4 次。取动脉血，凝血后离心，取上清的血清，-20℃下冻存备用。

3.2. 待检样品中虾原肌球蛋白过敏原活性的检测：

①.间接酶联免疫吸附法：在96孔酶标板上每孔包被100 μL不同方法处理后的TM蛋白样品，4°C孵育过夜后，用PBST洗板三次，然后用1%BSA封闭非特异性结合位点，37°C 孵育1.5 h。然后洗板三次，制备的兔抗虾多克隆抗体作为一抗，每孔加入100 μL，37℃孵育1.5 h。洗板三次后用HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗，每孔加入100 μL，37℃孵育1 h。洗板三次后每孔加入100 μL TMB显色液，在37°C 培养箱中避光孵育 20 min ，孵育结束后，用2M的硫酸终止反应。用酶标仪读取450 nm下的吸光值。

②免疫印迹法：将不同蛋白样品按照2.2中的方法进行SDS-PAGE电泳后，恒流100mA转印1h，将凝胶上的蛋白条带全部转印到活化的PVDF膜上。用5%脱脂奶粉-PBST溶液37°C封闭2h，然后用PBST洗膜三次，每次5 min。以3.1制备的兔抗虾多克隆抗体作为一抗，室温下孵育过夜，洗膜六次，每次5 min。二抗为HRP标记的羊抗兔抗体，37°C培养箱中孵育1.5h，洗膜三次，每次5 min。然后使用ECL显色液进行显色，孵育2 min，曝光4.0 ms，在凝胶成像仪下拍照，收集最佳曝光下的清晰图像。

3.对过敏原活性进行间接ELISA评价：

通过间接ELISA法来定量分析TM免疫活性与兔抗虾多克隆抗体的结合能力，从而评价使用酶促交联及酶促糖基化方法处理对刀额新对虾原肌球蛋白过敏原的影响。结果如图2所示。从图中结果可以看出，在25℃或者37℃下进行反应后，酶促交联、非酶褐变、酶促糖基化三种处理手法均使TM与IgG的免疫结合能力有显著性的下降（P<0.05）。而温度的提升可以同时增加酶促反应和非酶褐变的反应速度，因此与25℃相比，37℃下免疫活性降低效果更为明显。

对免疫活性下降率进行比较，酶促糖基化>酶促交联>非酶褐变，这也进一步说明在本反应体系中，美拉德反应发生情况不明显，酶促交联作用以及酶促糖基化作用能有效改变蛋白的性状从而掩盖了抗原表位。其中，TG酶介导的定向酶促糖基化技术，针对TM抗原表位上的谷氨酰胺残基（Q位点）进行专一性糖基化修饰，从而使表位氨基酸再修饰后不再是抗原决定簇，或者修饰后产生的表位氨基酸抗原活性比较弱，导致TM过敏性消减。而实验结果可证实，相比于其竞争反应酶促交联和非酶褐变，这一修饰方法对原肌球蛋白的IgG结合能力更有显著性的降低作用。

4.对过敏原活性进行免疫印迹评价

通过免疫印迹实验（Western blot）测定酶促糖基化修饰TM后免疫结合能力的变化（图3）。与对照组相比，IgG结果显示非酶褐变实验组几乎没有发生变化。而对于酶促交联和酶促糖基化实验组，在35.0 kDa附近的阳性条带明显变浅，说明原肌球蛋白与IgG结合能力随着酶促反应的进行而减弱，在37℃的实验条件下此现象更为明显。这些现象与电泳结果一致。这说明蛋白质交联作用和糖基的导入可以使TM的免疫原性降低。与此同时，两种酶促反应使TM交联生成大分子的聚集体，这些聚集体的阳性条带也可以被IgG识别，但是交联TM的条带颜色较浅，这都说明其免疫原性要弱于未处理的TM样品。

图3中，酶促交联和酶促糖基化实验组的免疫印迹图几无差异，酶促糖基化组的印记条带颜色要略弱一些，这主要是由免疫印迹实验很强的灵敏度导致的。结合间接ELISA的结果，我们可以说明氨基葡萄糖的导入对表位氨基酸的修饰更具有显著性的作用，从而降低抗原活性。

综上，TG酶介导的蛋白质交联和氨基葡萄糖酶促糖基化反应均可以使原肌球蛋白的致敏性下降。两者相比，酶促糖基化手段降低蛋白免疫原性的效果更好，考虑到其对功能性质的影响，因而更具有应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A，刀额新对虾原肌球蛋白的纯化；

(1)将新鲜的刀额新对虾去头，去壳，去肠线，蒸馏水洗净后称重，得虾肉；

(2)取虾肉与肌原纤维提取液混合匀浆，其中虾肉与肌原纤维提取液的质量体积比为1：1，将混合物离心，4000r/min，15min，取沉淀，重复5次；

(3)将经步骤(2)得到的沉淀置于95％冷乙醇中反复抽提三次，其中，沉淀与冷乙醇的质量体积比为1：2，4000r/min离心15min，再得沉淀；再将沉淀置于乙醚中反复抽提三次，该沉淀与冷乙醇的质量体积比为1：2，4000r/min离心15min，再得沉淀；于通风橱中将沉淀过夜风干；

(4)将经步骤(3)得到的沉淀浸于原肌球蛋白抽提液中，沉淀与原肌球蛋白抽提液的质量体积比为1：10，匀浆，在4℃冰箱中抽提24h后，6000r/min离心30min，取上清液；

(5)将上清液用30％的硫酸铵沉淀后，3000r/min离心20min，并将离心后的沉淀用30％硫酸铵溶液再清洗2次后，3000r/min离心20min，取沉淀溶解在10mM的PBS缓冲液中，得蛋白溶液；

(6)将蛋白溶液置于透析袋中，于10mM的PBS缓冲液中透析24h；

(7)透析结束后，将蛋白溶液置于沸水浴中加热10min，快速冷却至室温后，9000r/min离心30min，除去沉淀的变性蛋白，上清液即得纯化后的虾原肌球蛋白；

B，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液稀释成浓度为1-4mg/ml的原肌球蛋白；

向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶，该酶的添加量为8-15U/g蛋白；或者向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖，其中酶的添加量为8-15U/g蛋白，氨基葡萄糖与蛋白的质量比为1:1；

将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为25-40℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为150-200rpm，反应时间为5-8h，反应完成将其进行冷却后，在4℃下透析24h，以除去未发生反应的游离氨基葡萄糖，得到透析液为低敏性原肌球蛋白；

所述肌原纤维提取液配方：称取1.49gKCl，0.1gKHCO₃，0.0154gDTT，加超纯水定容至1000mL，4℃保存；

所述原肌球蛋白抽提液配方：74.5gKCl，0.5gNaN₃，加超纯水定容至1000mL，并将其pH调为7.5，4℃保存。

2.根据权利要求1所述的一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，将步骤A得到的原肌球蛋白用10mM的PBS缓冲液稀释成浓度为2mg/ml的原肌球蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤B中，向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶，该酶的添加量为10U/g蛋白；或者向稀释后的蛋白中加入转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖，其中酶的添加量为10U/g蛋白，氨基葡萄糖与蛋白的质量比为1:1。

4.根据权利要求3所述的一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤B中将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为37℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为180rpm，反应时间为6h，反应完成将其进行冷却后，4℃下透析24h后，得到低敏性原肌球蛋白。

5.根据权利要求3所述的一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤B中将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为25℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为180rpm，反应时间为6h，反应完成将其进行冷却后，4℃下透析24h后，得到低敏性原肌球蛋白。

6.根据权利要求3所述的一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤B中将仅添加转谷氨酰胺酶的蛋白以及添加转谷氨酰胺酶和氨基葡萄糖的蛋白均放置于温度为37℃的恒温培养箱内进行振荡孵育，转速为160rpm，反应时间为7.5h，反应完成将其进行冷却后，4℃下透析24h后，得到低敏性原肌球蛋白。

7.根据权利要求1所述的一种降低刀额新对虾过敏原原肌球蛋白的方法，其特征在于，所述步骤B中，PBS缓冲液中添加了10mM的DTT。