EP3439490A1 - Techno-funktionelle pflanzenprotein-fraktion aus leguminosen oder ölsaaten - Google Patents

Techno-funktionelle pflanzenprotein-fraktion aus leguminosen oder ölsaaten

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EP3439490A1
EP3439490A1 EP17719814.0A EP17719814A EP3439490A1 EP 3439490 A1 EP3439490 A1 EP 3439490A1 EP 17719814 A EP17719814 A EP 17719814A EP 3439490 A1 EP3439490 A1 EP 3439490A1
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EP
European Patent Office
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protein fraction
protein
fraction
water
vegetable
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17719814.0A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Isabel MURANYI
Claudia Pickardt
Daniela SUSSMANN
Pia MEINLSCHMIDT
Peter Eisner
Ute SCHWEIGGERT-WEISZ
Arne KEITZEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
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Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP3439490A1 publication Critical patent/EP3439490A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A23J1/14—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds
    • A23J1/148—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from leguminous or other vegetable seeds; from press-cake or oil-bearing seeds by treatment involving enzymes or microorganisms
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    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the invention relates to a vegetable protein fraction from legumes or oilseeds containing one or more
  • Vegetable proteins are becoming increasingly popular among consumers. Today, a variety of different plant proteins from legumes, oilseeds or cereals are already being used in foods as texturizing agents
  • Components used They are used to stabilize emulsions, foams or the formation of gels or are added to foods or beverages for enrichment with proteins as the most readily soluble component.
  • Hydrolysis of plant proteins is a known method of altering the properties of proteins such as techno-functionality (e.g., protein solubility,
  • Emulgier Dam, foaming or the allergenicity of the preparations. Described are protein hydrolysates based on vegetable proteins and based on whey proteins.
  • Protein fractions primarily the permeate, obtained in a downstream process by ultrafiltration and / or soluble and insoluble proteins by a separation.
  • further processing steps follow, such as a subsequent drying process (e.g., freeze-drying) of the products.
  • Hydrolysis is carried out under optimal pH and temperature conditions with the help of at least two proteases to a degree of hydrolysis of 15-35% without pH regulation and the enzymes after a hydrolysis of> 14 hours by a
  • Heat treatment inactivated are used.
  • further processing steps such as spray drying for concentration and drying of the products follow. However it does not address the techno-functional properties and immunoreactivity. Due to the high
  • the degree of hydrolysis, the long treatment time when using Alcalase and the subsequent ultrafiltration can be assumed that the techno-functional properties such as the emulsifying capacity, the foam stability and the
  • the whey protein is previously recovered by an acid precipitation from casein.
  • a cut-off of> 10,000 Da, preferably> 50,000 Da is set in the separation by means of ultrafiltration by selecting the membranes.
  • EP0421309 describes a process for producing a whey protein hydrolyzate and combinations thereof with soy protein or casein. Prior to enzymatic hydrolysis, large proteins (> 50,000 Da) are separated by ultrafiltration. Subsequent to the enzymatic hydrolysis with the aid of an enzyme combination is a
  • EP1236405 describes a process for producing hypo-allergenic, soy-based products whose antigenicity is reduced by a factor of 100 (inhibition ELISA). In this case, a moderate degree of hydrolysis of ⁇ 25%, preferably between 10-20%, is desired. It is possible to use either single enzymes of a microbial or plant origin or one Combination of these can be used. The enzyme to substrate ratio ⁇ (E / S) is between 0.1-10%, and the hydrolysis takes place between 0.5-10 hours. When an enzyme combination is used as a two-step process, there must always be one between enzyme addition
  • the resulting hydrolyzate can optionally be separated by ultrafiltration or separation of insoluble proteins.
  • the techno-functional and sensory properties of the products are not reported. However, it can be expected that the use of higher E / S ratios and the use of Alcalase will again result in degraded techno-functionality of the products. In addition, it is known that Alcalase treatment leads to high bitterness, which in turn is consumer acceptance
  • EP1512328 For the hydrolysis of a "soy paste" with 10-20% soy protein, a fungal protease or a combination is used as a one-step process of fungal proteases possessing both endo and exoproteolytic activities, where Corolase PN-L (Aspergillus sojae) and Flavourzyme 500L (Aspergillus oryzae) listed. After a treatment time of 0.5-5 hours, the enzymes are inactivated by a thermal step and the soluble and insoluble protein fraction separated by centrifugation and then dried. About Immunreak ⁇ tivity or Allergenicity is not reported, and only the soluble protein fraction with its high functionality is emphasized, the insoluble (modified) proteins or the mixed protein fraction are not further described.
  • EP0406598A1 describes a method of reducing the Bitterness of enzymatically hydrolysed proteins.
  • protein hydrolysates are subjected to a subsequent fermentation for up to 30 hours at a constant pH value in order to attenuate the bitterness.
  • the literature also describes that the fermentation has a negative influence on the emulsifying properties of legume proteins.
  • the example of lupine proteins was described in P. Eisner, "Extractive fractionation of Legume seed "habilitation 2014, Technical University of Kunststoff, shown that the emulsifying ⁇ capacity g drops / at Lupinenproteinisolaten of 510 mL to values of 385-230 mg / L, for the recovery of functional food ingredients the example of the Lupine when the protein with Lb. perolens, Pc pentosaceus, Lb. plantarum or Lc. paracasei.
  • the emulsification capacity of 660 mL / g dropped to values between 475-483 mL / g
  • the protein solubility at pH 7 dropped from 44.0% to values between 16.5- 18.2% when the protein was incubated with Lb. helveticus was fermented for 24 and 48 hours.
  • a person skilled in the art who would like to provide a highly functional protein preparation with good emulsifying properties would therefore try to avoid fermentation as a processing step.
  • enzyme combinations are very often used for the treatment of proteins.
  • hydrolysates e.g. obtained by ultrafiltration a low molecular weight fraction whose immunoreactivity is described as reduced.
  • the separated small molecule fragments hardly emulsify, form stable foams and often have a very bitter and almost repulsive taste.
  • the object of the present invention is a plant protein fraction and a method for producing the vegetable protein fraction from proteins of legumes (eg soybean, pea, lupine, bean, chickpea, lentil or peanut) or oilseeds (eg sunflower, rape, Camelina or flax) which has a reduced immunoreactivity
  • legumes eg soybean, pea, lupine, bean, chickpea, lentil or peanut
  • oilseeds eg sunflower, rape, Camelina or flax
  • the protein fractions produced should in particular have a light color and good emulsifying properties, taste almost neutral, and in particular have a low bitterness and barely perceptible beany taste.
  • the method used for this should be cost-effective and show a high yield, since in the prior art often only small fractions of the proteins from the raw materials are recyclable, resulting in very high costs.
  • a protein fraction from legumes or oilseeds is understood below to mean a mixture of different proteins from seeds of legumes or oilseeds which do not differ from the protein composition (quantitative ratio). proteins) from the corresponding plant seeds
  • peptide strands may contain separated peptide strands.
  • Protein fraction of comminuted plant seeds in a fractionation step hereinafter also referred to as first fractionation step
  • thermally hydrolyzed protein fraction preferably after the addition of microorganisms (at least 10 8 CFU per gram of protein, more preferably> 10 9 cfu per gram of protein, advantageously ⁇ 10 10 cfu per gram of protein; CFU: colony ⁇ forming unit) and in the presence of glucose or a other easy to ferment carbohydrate, f) pressure and / or shear treatment of the hydrous
  • step e by centrifugation or membrane filtration with a suitable cut-off after (optional) fermentation (step e)) or without fermentation after hydrolysis (step c))
  • the separation by size can be carried out, for example, by various filtration methods, e.g. Membrane filtration (e.g., filtration, microfiltration, ultrafiltration), sedimentation separation by methods utilizing inertia, e.g.
  • a solvent-based separation can take place.
  • the seeds or a mechanically pretreated fraction of the seeds (referred to below as the raw material) are brought into contact with polar or nonpolar solvents, whereby one protein fraction enters the solvent and another protein fraction remains in the raw material.
  • solvent can be used, for example, water, acidified water, critical C02, ethanol, water-ethanol mixtures and hexane. At least one of the protein fractions (first or second protein fraction) is then subjected to the process described under b) -h).
  • the water-containing ⁇ (plant) according to the invention obtained by the process according to protein fraction can carry out the process steps mentioned in the moist state directly in
  • the process steps of hydrolysis, fermentation, pressure ⁇ treatment, heating, pressure and / or shear stress and filtration / centrifugation can be used according to the invention more than once in different orders to further improve the sensory and functional properties.
  • the fermentation follows the
  • Enzyme treatment and the pressure and / or shear treatment of the fermentation wherein the heating steps are at any positions in this order, i. also between fermentation and enzyme treatment and / or between pressure and / or
  • the pressure and / or shear treatment specified under f) is carried out in the process according to the invention at a pressure above 2 * 10 5 Pa (2 bar), advantageously above 5 * 10 5 Pa (5 bar), particularly advantageously at a pressure above of 150 * 10 5 Pa (150 bar). It shows up in Try increasing the pressure to a maximum pressure of 1000 * 10 5 Pa (1000 bar) to obtain the
  • Protein functionality should not be exceeded, and simultaneous shearing (for example with the aid of a homogenizer) the solubility and usually also the emulsifying properties of the water-containing protein fraction can be improved.
  • step h In order to verify the effectiveness of the filtration / centrifugation in step h), in the case of one in the process
  • Microorganisms are used. If successful
  • Separation method are preferably found in the residue more than 50% by mass of the originally introduced for the fermentation microorganisms DNA and in the supernatant less than 20 mass%.
  • crushed legume seeds or oilseeds used in the method according to the invention are crushed legume seeds or oilseeds used in the method according to the invention.
  • Particles or pieces of seeds which are modified by a mechanical process e.g., mill, roller mill, or the like
  • a mechanical process e.g., mill, roller mill, or the like
  • microorganisms come from the groups lactic acid bacteria (Lb. perolens), yeasts (e.g.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • fungal cultures e.g., Rhizopus oryzae, Actinomucor elegans.
  • Protein fraction also change the immunoreactivity in the course of fermentation another, although the same
  • Microorganisms are used. Therefore, it should be ensured that after adding the water until the
  • the mass ratio of water to protein as possible higher than 1: 1, better higher than 8: 1, particularly advantageously higher than 16: 1.
  • a drying step should take place only after the pressure / shear treatment according to the invention.
  • the treated by enzymatic and / or fermentative methods proteins from the mentioned raw materials should be readily dispersible in water or at least in water, so that the enzymatic treatment can be controlled through ⁇ .
  • the process is carried out particularly advantageously if at least 35% of the protein constituents are dissolved at pH 7 or are present in a stable dispersion.
  • the raw materials are mixed with water, dissolved or dispersed and added the enzymes in appropriate concentrations.
  • Stable dispersion means the proportion of dispersed particles of a dispersion which, after a sedimentation time of 10 minutes, are still in the supernatant above a separated sediment.
  • the solvent for separating the first protein fraction may consist of or consist of water or aqueous solutions
  • Soy protein after extraction and isoelectric precipitation at a value of about 2 is to be reduced to values below 1, and simultaneously to generate attractive flavor notes in the protein ⁇ fraction.
  • treated fermentation is preferably carried out with lactic acid bacteria ⁇ , then the protein fraction at a pressure of about 2 ⁇ 10 5 Pa (2 bar) and then
  • Microbial load in the protein fraction also other sensory effects can be achieved by thermally induced reactions, which have a positive effect on consumer acceptance.
  • ⁇ protein fraction is heated more than 1 time to values above 80 ° C during treatment advantageous, particularly advantageously more than 3 times.
  • Emulsifying capacity results when, after hydrolysis and (optional) fermentation, a separation step is carried out by size or solubility or sedimentation, e.g. a centrifugation or filtration. It shows that the protein fraction in the sediment in comparison to the protein fraction in the supernatant after centrifugation despite similar
  • Permeate protein fractions after ultrafiltration Again, the retentate fraction is better suited as an emulsifier, but produces stronger allergic reactions in prick tests in human skin.
  • Processes according to the invention obtained protein fractions are the retentate fraction or sediment fraction and the permeate fraction or supernatant fraction.
  • the protein fraction according to the invention contains more than
  • the protein fraction according to the invention may consist of one or a mixture of several partial fractions of the respective entirety of
  • Proteins consist of the raw materials mentioned.
  • the protein fraction after fermentation has a proportion of biomass from microorganisms which
  • Dry matter content based on the dry matter content of the protein fraction greater than 0.05 mass%, better greater than 0.5 mass%, particularly advantageously greater than 1 mass%. It turns out that an enrichment of biomass
  • Lactic acid bacteria up to a proportion of 1 mass%
  • Microorganism dry matter the protein fraction as Sensory is increasingly appealing. At higher concentrations the popularity decreases again.
  • the protein fraction according to the invention preferably consists of a proportion of protein which is soluble at pH 7 and of a proportion of protein which is insoluble at pH 7.
  • the soluble fraction of the protein fraction surprisingly has a narrow molecular weight distribution.
  • the molecular sizes are more than 30% less than 25 kDa, preferably more than 50%, particularly preferably more than 90%. Therefore, the properties of the proteins of the soluble portion are very uniform. It would thus be possible to separate the soluble fraction at pH 7 from the insoluble one and use both protein fractions separately.
  • the soluble fraction there are a variety of
  • Production is the protein fraction according to the invention only by the permeate or supernatant fraction or through the
  • Retentate or sediment fraction is formed and then has a molecular weight distribution, wherein the molecule sizes are either more than 50% less than 25 kDa, preferably more than 70%, more preferably more than 90%, or less than 60% the molecular sizes are less than 25 kDa, preferably less than 50%, more preferably less than 20%.
  • the protein fraction according to the invention advantageously has a foam activity (based on a starting solution) of greater than 1000%, preferably greater than 1500%, particularly preferably greater than 2000%.
  • the emulsifying capacity is preferably> 200 ml oil / g protein, particularly advantageously> 500 ml oil / g protein and preferably - after sufficient pressure and shear treatment - a solubility of> 25% at pH 7.
  • this value is above 70, preferably above 80, particularly advantageously above 90.
  • the color of the protein fraction thus falls according to the invention very bright and ranges depending on predominantly contained
  • the protein fraction advantageously contains a proportion of aroma components derived from the fermentation, such as diacetyl or other metabolites of the fermentative
  • the immunoreactivity of the product according to the invention is reduced by at least 50%, better by> 80%, compared to a native protein from the same plant. This value is determined by the evaluation of a Western Blot.
  • Protein fractions from plant proteins with the following
  • Protein solubility at pH 4 Protein solubility at pH 4
  • Standardized Food Protein Solubility Procedure Journal of Food Science 50: 1715-1718 is greater than 5%, preferably greater than 20%
  • the protein solubility determined according to Morr et al. 1985 is preferably greater than 25%, preferably greater than 50%. Typically, the protein solubility is in the range of> 35-90%.
  • the emulsifying capacity determined by the conductance measurement method, amounts to at least 200 ml oil / g, preferably at least 500 ml oil / g.
  • the water binding determined by the AACC determination method, is at least 2 ml / g, preferably at least 3 ml / g.
  • the oil binding determined by the fat binding method, is at least 1 ml / g, preferably at least 2 ml / g.
  • the foam activity is at least 1000%.
  • Foam density is in the range of 30 to 220 g / 1.
  • the foam stability is at least 2%, preferably at least 50%.
  • the protein fraction is in the
  • Protein fraction are such that, when incorporated into food and feed, essentially no significant change of the species-specific, as determined by conventional statistical methods, is made
  • Protein fraction are such that, when incorporated into food and feed, essentially no significant change of the species-specific, as determined by conventional statistical methods, is made
  • Aroma change which is caused in a food preparation by the use of the protein fraction, compared to the food preparation without the protein fraction is limited to such an extent that a trained examiner a deviation of any of the above taste or aroma features on a
  • the protein fraction according to the invention may therefore have one or more of the above techno-functional and sensory properties.
  • the protein fraction according to the invention is preferably used as a food ingredient. Since, in addition to the improved functionality and sensor technology, the immunoreactivity of the protein fraction according to the invention is markedly reduced, the protein fraction from a raw material (for example soya or sunflower) or mixtures of different raw materials may advantageously be hypoallergenic or allergen-reduced
  • Protein ingredient used in food Protein ingredient used in food.
  • Textile effects e.g., stabilization of emulsions
  • Textile effects can be further reduced, as compared to previously available protein ingredients on the market
  • extruded wet or dry protein products such as herbal meat alternatives from cooking extrusion or herbal dry extrudates.
  • a soy protein fraction was obtained which was extracted by aqueous extraction at pH 8 from ground and water-extracted soybeans and concentrated with a precipitate at the isoelectric point. The resulting suspension was neutralized and taken to a Protein: water ratio adjusted to 1:20. Afterwards, the following process steps were carried out:
  • the protein fraction obtained has an almost white
  • Protein fraction is used for the following determination methods:
  • the protein content is defined as the content calculated from the determination of nitrogen (N) and its multiplication by a factor of 6.25.
  • the protein content is z. B. in percent based on the dry mass (TS) indicated.
  • - Color The perceptible color is defined by CIE-L * a * b * -
  • the L * axis indicates the brightness, where black is 0 and white has the value 100, the a * -axis describes the green or red part and the b * -axis the blue part or yellow part.
  • Protein solubility (at pH 7 or pH 4):
  • Protein solubility is determined by Morr's assay method (Morr et al., "A Collaborative Study on Developing a Standardized Food Protein Solubility Procedure", Journal of Food Science 50: 1715-1718).
  • the protein fraction is suspended to a mass volume fraction of 1:25 to 1:50 (w / v) (ie 1-2 g of the protein fraction to 50 ml of solution) in a 0.1 M NaCl solution at room temperature and using held for about 60 min at a pH of pH 7 (or pH 4) and stirred at about 200 U / mm and the insoluble sediment then centrifuged for 15 min at 20,000 xg of 0.1 M HCl or NaOH solution ,
  • the protein solubility is e.g. in percent, where a protein solubility ⁇ X "6 means that x% of the protein present in the protein fraction is recovered in the clarified supernatant when the said method is used.
  • the water binding capacity is defined by means of determination methods (here called AACC determination method) as indicated in: American Association of Cereal Chemists, "Approved Methods of the AACC". 10th ed., AACC. St. Paul, MN, 2000; Method 56-20. "Hydration capacity of pregelatinized cereal products”.
  • the water binding capacity is z. In ml / g, i. E. Milliliters of bound water per gram
  • Protein fraction is determined by the weight of the water-saturated according to the AACC determination method
  • the oil-binding capacity is determined by means of determination methods (here Fat binding method), as indicated in: Ludwig I. et al. , "A Micrometer for Determining Fat Binding Capacity". Food / Food, 33 (1), 99.
  • the oil-binding capacity is given in ml / g, ie
  • Milliliters of bound oil per gram of protein fraction is prepared according to o. Determination method measured as volume of oil-binding sediment after mixing 1.5 g protein fraction with 15 ml corn oil for 1 minute and centrifuging at 700 g for 15 minutes at 200 ° C.
  • the emulsifying capacity is determined by means of determination method (here called conductivity measurement method) in which a 1% suspension of the protein fraction of 100 ml, pH 7, corn oil is added until the phase inversion of the oil-in-water emulsion.
  • the emulsifying capacity is defined as the maximum oil absorption capacity of this suspension, determined by the spontaneous decrease in the conductivity of the suspension
  • Phase inversion (A.A., A., et al., "New Processing of Lupine Protein Isolates and Functional Properties.” Food / Food 45: 393-395) and is used e.g. expressed in ml of oil / g, d. H.
  • the foam activity is given in percent, measured as the volume increase of a 5% protein solution, pH 7
  • Hobart 50N standard food processor (5 liter steel kettle) with whisk (wire brush).
  • the foam density is given in g / 1, d. H. Mass of the
  • Foam per unit volume is measured after adding a 5% protein solution, pH 7, from 8 min to level 3 (591 rpm) in a Hobart 50N standard food processor
  • the foam stability is given in percent, measured as the remaining volume of 100 ml of foam within one hour after loading a 5% protein solution, pH 7, 8 min at level 3 (591 rpm) in a Hobart 50N standard food processor (steel kettle with 5 liters content) with whisk (wire brush).
  • Yellowness concentration is defined by determination method as indicated in: Sathe SK et al. .
  • the molecular weight distribution is by means of
  • the degree of hydrolysis is defined by means of determination methods (here called DH value analysis), as indicated in: Nielsen P.M. et al. , "Improved method for determining the protein-protein degree of hydrolysis.” Journal of Food Science
  • the immunoreactivity is by means of determination methods (Sandwich ELISA and Western Blot) as defined: Meinlschmidt P. et al. , "Immunoreactivity, sensory and physicochemical properties of fermented soy protein isolates", Food Chemistry 205: 229-238.
  • the quantification of the microorganisms can be carried out by microscopic methods or by quantification of the DNA strands contained in the protein fraction
  • the quantification of the DNA strands is carried out with a molecular biological method, which under the
  • Examples of taste or aroma impressions to be tested are:
  • Peppers or green peas are Peppers or green peas
  • the panel was previously using a sensory input

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Pflanzenprotein-Fraktion aus Leguminosen oder Ölsaaten für den Einsatz in Lebensmitteln oder in Futtermitteln sowie ein Verfahren zur Herstellung der Pflanzenprotein-Fraktion. Bei dem Verfahren wird aus zerkleinerten Leguminosensamen oder Ölsaaten mit Hilfe eines Lösemittels eine erste Proteinfraktion abgetrennt wird, wobei eine zweite Proteinfraktion zurück bleibt, und eine durch diesen Fraktionierungsschritt direkt oder nach Zugabe von Wasser erhaltene wasserhaltige Proteinfraktion einer ein- oder mehrmaligen Behandlung mit Enzymen, einer ein- oder mehrmaligen Erhitzung auf eine Temperatur > 70 °C, optional einer ein- oder mehrmaligen Fermentation und einer ein- oder mehrmaligen Druck- und/oder Scherbehandlung unterzogen. Die mit dem Verfahren hergestellte Pflanzenprotein-Fraktion weist eine reduzierte Immunreaktivität auf und verfügt über gute techno-funktionelle und organoleptische Eigenschaften.

Description

Techno-funktionelle Pflanzenprotein-Fraktion aus Leguminosen oder Ölsaaten
Anwendungsgebiet
Die Erfindung betrifft eine Pflanzenprotein-Fraktion aus Leguminosen oder Ölsaaten, die eine oder mehrere
Teilfraktionen von Proteinen einer oder mehrerer Spezies von Leguminosen oder einer oder mehrerer Spezies von Ölsaaten enthält, für den Einsatz in Lebensmitteln oder in
Futtermitteln sowie ein Verfahren zur Herstellung der
Pflanzenprotein-Fraktion.
Stand der Technik
Pflanzliche Proteine erfreuen sich bei den Konsumenten zunehmender Beliebtheit. Heute kommt in Lebensmitteln bereits eine Vielzahl unterschiedlicher pflanzlicher Proteine aus Leguminosen, Ölsaaten oder Getreide als texturgebende
Komponenten zum Einsatz. Sie dienen der Stabilisierung von Emulsionen, Schäumen oder der Ausbildung von Gelen oder werden als meist gut lösliche Komponente Lebensmitteln oder Getränken zur Anreicherung mit Proteinen zugesetzt. Die
Vielzahl der am Markt verfügbaren Proteinpräparate zeigt aber erhebliche Defizite bei techno-funktionellen Eigenschaften, vor allem bei der Emulgierkapazität , der Löslichkeit oder der Gelbildungseigenschaften. Ein weiterer Nachteil von pflanzlichen Proteinen ist der Umstand, dass viele Konsumenten eine starke Immunantwort oder sogar eine allergische Reaktion beim Verzehr pflanzlicher Proteine z.B. aus Soja, Erdnuss oder Lupine zeigen, was einen breiten Einsatz dieser Zutaten bisher erschwert. Auch die sensorischen Eigenschaften vieler pflanzlicher Proteine entsprechen nicht den Wünschen der Konsumenten. Viele Pflanzensamen zeigen aufgrund von enthaltenen sekundären Pflanzenstoffen oder Lipidoxidations- produkten unerwünschte Geschmacks- und Aromaprofile. So werden viele Präparate aus Soja, Erbse oder Lupine als bitter, bohnig, grasig oder grün beschrieben. Aus diesem Grund werden in der Forschung vermehrt
Anstrengungen unternommen, mit Hilfe von neuen Verfahren die Pflanzenproteine so zu verändern, dass sowohl ihre
sensorischen als auch ihre techno-funktionellen und
immunreaktiven Eigenschaften den Wünschen der Verbraucher entsprechen. Allerdings ist es bislang nicht gelungen, alle genannten Attribute gleichermaßen zu verbessern. Vielmehr geht eine Reduktion der Immunreaktivität meist einher mit der Verschlechterung der sensorischen Eigenschaften oder mit der Abnahme der Emulgier- oder Schäumungseigenschaften . Im
Folgenden wird der Stand der Technik der Modifikation von Proteinen kurz vorgestellt und gezeigt, welche Schwächen bislang noch bestehen. Die Methoden zur Bestimmung der dabei genannten funktionellen Eigenschaften werden im hinteren Teil dieser Anmeldung beschrieben.
Die Hydrolyse von pflanzlichen Proteinen ist ein bekanntes Verfahren zu Veränderung der Eigenschaften von Proteinen wie der Techno-Funktionalität (z.B. Proteinlöslichkeit ,
Emulgierwirkung, Schaumbildung) oder auch der Allergenität der Präparate. Beschrieben sind Protein-Hydrolysate auf Basis pflanzlicher Proteine und auf Basis von Molkenproteinen.
Hierfür wird beispielsweise eine Proteindispersion durch den Einsatz von einzelnen Enzymen oder Enzymkombinationen
hydrolysiert und die Enzyme durch eine Hitzebehandlung inaktiviert. Anschließend werden unterschiedliche
Proteinfraktionen, primär das Permeat, in einem Downstream- Prozess durch eine Ultrafiltration und/oder lösliche und unlösliche Proteine durch eine Separation gewonnen. Optional folgen weitere Verarbeitungsschritte wie ein anschließender Trocknungsprozess (z.B. Gefriertrocknung) der Produkte.
In den Druckschriften JP11178512, JP2001211851, KR20090119204 und CN101974589 wird die Behandlung von pflanzlichen
Proteinen und Molkenproteinen mit einzelnen Enzymen
beschrieben, jedoch weisen die hergestellten Hydrolysate Nachteile in ihren sensorischen oder techno-funktionellen Eigenschaften auf. Des Weiteren ist die Senkung der
Allergenität durch den Einsatz von einer Protease meist nicht ausreichend, um allergische Reaktionen wirkungsvoll zu unterdrücken. Darüber hinaus sind die sensorischen
Eigenschaften nach der Hydrolyse mit einer Protease,
besonders eine hohe Bitterkeit, negativ zu bewerten.
Für pflanzliche Proteine wie z.B. aus Soja, Reis, Sesam, Raps, Ackerbohne oder Erbse wurden ähnliche Verfahren in der W09215696 und der W09215697 beschrieben. Dabei wird das pflanzliche Protein, Proteinkonzentrat oder -isolat mit einem Proteingehalt von mind. 65% mit Wasser zu einer Slurry mit einem Proteingehalt von 7-20% verarbeitet. Vor der Hydrolyse wird die Slurry auf >60 °C erhitzt. Die enzymatische
Hydrolyse wird unter optimalen pH- und Temperatur-Bedingungen mit Hilfe von mind. zwei Proteasen bis zu einem Hydrolysegrad von 15 - 35% ohne pH-Regulierung durchgeführt und die Enzyme nach einer Hydrolysedauer von >14 Std. durch eine
Hitzebehandlung inaktiviert. Zum Einsatz kommen bspw.
Alcalase (Bacillus licheniformis ) und/oder Neutrase (Bacillus subtilis) , wobei die Hydrolyse als zweistufiger Prozess durchgeführt wird. Anschließend wird das hydrolysierte
Protein als Permeat durch eine Ultrafiltration mit einem cut- off von >5.000 Da (Da: Dalton) gewonnen. Optional folgen weitere Verarbeitungsschritte wie die Sprühtrocknung zur Aufkonzentrierung und Trocknung der Produkte. Jedoch wird nicht auf die techno-funktionellen Eigenschaften und die Immunreaktivität eingegangen. Aufgrund des hohen
Hydrolysegrades, der langen Behandlungsdauer bei Einsatz von Alcalase und der nachfolgenden Ultrafiltration ist davon auszugehen, dass die techno-funktionellen Eigenschaften wie die Emulgierkapazität , die Schaumstabilität und die
Gelbildung im Vergleich zu unbehandelten Proteinen deutlich schlechter sind. So haben die Erfinder der vorliegenden
Erfindung versucht, die Verfahren der W09215696 und der
W09215697 zu wiederholen und haben dabei festgestellt, dass die Emulgierkapazität im Vergleich zu einem unbehandelten Protein um rund 30-50% reduziert ist.
In der WO9324020 wird ein Molkenprotein-Hydrolysat mit guten organoleptischen Eigenschaften und einer geringen
Allergenität beschrieben. Zusätzlich zu den in der W09215696 und der W09215697 erwähnten Schritten wird das Molkenprotein zuvor durch eine saure Fällung aus Casein gewonnen. Zudem wird bei der Separation mittels Ultrafiltration durch Auswahl der Membranen ein cut-off von >10.000 Da, bevorzugt >50.000 Da eingestellt. Durch dieses Verfahren werden Molkenproteine mit einer geringen Allergenität erhalten. Aufgrund der
Tatsache, dass bei diesem Verfahren eine Enzymkombination bestehend aus Alcalase und Neutrase eingesetzt wird, sind die techno-funktionellen Eigenschaften wie die Emulgier- und
Schaumbildungseigenschaft nach der Behandlung sehr schlecht.
In der EP0421309 wird ein Verfahren zur Herstellung eines Molkenprotein-Hydrolysates und Kombinationen aus diesem mit Sojaprotein oder Casein beschrieben. Vor der enzymatischen Hydrolyse werden große Proteine (>50.000 Da) mit Hilfe der Ultrafiltration abgetrennt. Anschließend an die enzymatische Hydrolyse mit Hilfe einer Enzymkombination wird eine
Ultrafiltration mit einem cut-off von 1.500-15.000 Da
eingesetzt, um ein niedermolekulares Permeat zu erhalten. Durch den Einsatz der beschriebenen Enzymkombination,
Vorhydrolyse mit Pepsin und anschließender Hydrolyse mit Trypsin-Chymotrypsin-Elastase 2, kann jedoch davon
ausgegangen werden, dass die sensorischen und die techno- funktionellen Eigenschaften deutlich verschlechtert sind.
Die EP1236405 beschreibt einen Prozess zur Herstellung hypo- allergener, sojabasierter Produkte, deren Antigenität um den Faktor 100 reduziert ist ( Inhibition-ELISA) . Hierbei wird ein moderater Hydrolysegrad von <25%, vorzugsweise zwischen 10- 20%, angestrebt. Es können sowohl einzelne Enzyme mikrobiel- len als auch pflanzlichen Ursprungs verwendet oder eine Kombination aus diesen eingesetzt werden. Das Enzym-zu¬ Substrat Verhältnis (E/S) liegt zwischen 0,1-10% und die Hydrolyse findet zwischen 0,5-10 Stunden statt. Wenn eine Enzymkombination - als zwei-stufiger Prozess durchgeführt - eingesetzt wird, muss zwischen der Enzymzugabe immer ein
Inaktivierungsschritt des jeweiligen Enzymes erfolgen. Nach einem finalen Inaktivierungsschritt kann das entstandene Hydrolysat optional durch Ultrafiltration oder Separation von unlöslichen Proteinen getrennt werden. Über die techno- funktionellen sowie sensorischen Eigenschaften der Produkte wird nicht berichtet. Es kann jedoch davon ausgegangen werden, dass die Verwendung von höheren E/S-Verhältnissen und der Einsatz von Alcalase abermals zu einer verschlechterten Techno-Funktionalität der Produkte kommt. Zudem ist bekannt, dass eine Alcalase-Behandlung zu einer hohen Bitterkeit führt, was wiederum die Akzeptanz bei den Konsumenten
verringert .
Ein Verfahren zur Herstellung löslicher Sojaproteine mit hoher Funktionalität und geringer Bitterkeit wird in der
EP1512328 beschrieben. Für die Hydrolyse einer „Sojapaste" mit 10-20% Sojaprotein, wird eine Pilz-Protease oder eine Kombination als einstufiger Prozess aus Pilz-Proteasen, die sowohl endo- als auch exoproteolytische Aktivitäten besitzen, eingesetzt. Hier werden Corolase PN-L (Aspergillus sojae) und Flavourzyme 500L (Aspergillus oryzae) aufgeführt. Nach einer Behandlungsdauer von 0,5-5 Stunden werden die Enzyme durch einen thermischen Schritt inaktiviert und die lösliche und unlösliche Proteinfraktion mittels Zentrifugation voneinander getrennt und anschließend getrocknet. Über die Immunreak¬ tivität bzw. Allergenität wird nicht berichtet. Zudem wird nur die lösliche Proteinfraktion mit ihrer hohen Funktionalität hervorgehoben. Die unlöslichen (modifizierten) Proteine oder die gemischte Proteinfraktion werden nicht weiter beschrieben.
Die EP0406598A1 beschreibt ein Verfahren zur Reduktion der Bitterkeit von enzymatisch hydrolysierten Proteinen. Hierbei werden Proteinhydrolysate einer anschließenden Fermentation bis zu 30 Stunden bei konstantem pH-Wert zur Abschwächung der Bitterkeit unterzogen. Der Herstellungsprozess sowie die physikochemischen Eigenschaften des Ausgangsrohstoffes
(Protein Hydrolysat) für die Fermentation werden nicht beschrieben. Nach der Inaktivierung der Enzyme bei 65-80°C und anschließender Kühlung, können die „entbitterten" Proben entweder direkt im Lebensmittel verarbeitet oder zuvor getrocknet werden. Da jedoch bekannt ist, dass sich sowohl die enzymatische Hydrolyse als auch die Fermentation negativ auf die techno-funktionellen Eigenschaften ausüben können und diese nicht beschrieben werden, ist anzunehmen, dass die techno-funktionellen Eigenschaften deutlich verschlechtert wurden. Alle kommerziell erhältlichen Hydrolysate weisen bislang eine sehr schlechte Techno-Funktionalität im Sinne der Emulgier- und Gelbildungseigenschaften auf, weshalb auch hier angenommen werden kann, dass diese für den Einsatz im Lebensmittel essentiellen Eigenschaften deutlich
verschlechtert wurden.
Am Beispiel von Sojaproteinen konnte von P. Meinlschmidt et al . (2017), "High pressure processing assisted enzymatic hydrolysis - An innovative approach for the reduction of soy immunoreactivity", Innovative Food Science & Emerging
Technologies: 40, 58-57, gezeigt werden, dass eine Hochdruck¬ unterstützte enzymatische Hydrolyse von Soj aproteinisolaten sowohl die techno-funktionellen als auch die sensorischen Eigenschaften nicht verbessert. Aus diesem Grund würde ein Fachmann keine Druckbehandlung in Kombination mit Enzymen zur Herstellung funktioneller und gut schmeckender Sojaproteine heranziehen .
In der Literatur ist zudem beschrieben, dass die Fermentation einen negativen Einfluss auf die Emulgiereigenschaften von Leguminosenproteinen hat. Am Beispiel von Lupinenproteinen wurde in P. Eisner, „Extraktive Fraktionierung von Leguminosensamen zur Gewinnung von funktionellen Lebensmittelzutaten am Beispiel der Lupine", Habilitation, 2014, Technische Universität München, gezeigt, dass die Emulgier¬ kapazität bei Lupinenproteinisolaten von 510 mL/g auf Werte zwischen 385 und 230 mg/L abfällt, wenn das Protein mit Lb. perolens, Pc. pentosaceus, Lb. plantarum oder Lc. paracasei fermentiert wird.
Ebenfalls zeigten in P. Meinlschmidt et al . , "Immuno- reactivity, sensory and physicochemical properties of
fermented soy protein isolate", Food Chemistry 205: 229-238, weitere Versuchsreihen am Beispiel von Sojaproteinen, dass eine Fermentation mit unterschiedlichen Mikroorganismen
(Milchsäurebakterien, Schimmelpilze, Hefezellen) zu einer Minderung der techno-funktionellen Eigenschaften, insbesondere der Emulgierkapazität und der Proteinlöslichkeit bei neutralem pH-Wert, führt. Hierbei fiel die Emulgierkapazität von 660 mL/g auf Werte zwischen 475-483 mL/g ab, die Proteinlöslichkeit bei pH 7 fiel von 44,0% auf Werte zwischen 16,5- 18,2% ab, wenn das Protein mit Lb. helveticus für 24 und 48 Stunden fermentiert wurde. Ein Fachmann, der ein hochfunk- tionelles Proteinpräparat mit guten Emulgiereigenschaften bereitstellen möchte, würde daher versuchen, eine Fermentation als Verarbeitungsschritt unbedingt zu vermeiden.
Nach Stand der Technik kommen zur Behandlung von Proteinen somit sehr häufig Enzymkombinationen zum Einsatz. Aus den dabei entstehenden Hydrolysaten wird z.B. durch eine Ultrafiltration eine niedermolekulare Fraktion erhalten, deren Immunreaktivität als reduziert beschrieben wird. Dabei zeigt sich aber eine deutliche Verschlechterung der Funktionalität, da die abgetrennten kleinen Molekülbruchstücke kaum noch emulgieren, keine stabilen Schäume ausbilden und vielfach auch einen sehr bitteren und nahezu abstoßenden Geschmack aufweisen.
Es ist bislang nicht bekannt, ob und wie aus Leguminosen und Ölsaaten Proteinpräparate hergestellt werden können, die vergleichbar gute techno-funktionelle Eigenschaften
hinsichtlich der Stabilisierung von Emulsionen und Schäumen und der Ausbildung von Gelen aufweisen wie die entsprechenden unbehandelten Proteine, dabei organoleptisch ansprechend sind und gleichzeitig eine reduzierte Allergenität bzw. IgE- Immunreaktivitat aufweisen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Pflanzenprotein-Fraktion sowie ein Verfahren zur Herstellung der Pflanzenprotein-Fraktion aus Proteinen von Leguminosen (z.B. Soja, Erbse, Lupine, Bohne, Kichererbse, Linse oder Erdnuss) oder Ölsaaten (z.B. Sonnenblume, Raps, Camelina oder Lein) anzugeben, die eine reduzierte Immunreaktivität
aufweist und dabei gleichzeitig über gute techno-funktionelle und organoleptische Eigenschaften verfügt. Die hergestellten Proteinfraktionen sollten insbesondere eine helle Farbe und gute Emulgiereigenschaften zeigen, nahezu neutral schmecken, dabei besonders eine geringe Bitterkeit und einen kaum wahrnehmbaren bohnigen Geschmack aufweisen. Zudem sollte das hierfür genutzte Verfahren kostengünstig sein und eine hohe Ausbeute zeigen, da nach Stand der Technik vielfach nur kleine Fraktionen der Proteine aus den Rohstoffen verwertbar sind, was zu sehr hohen Kosten führt.
Darstellung der Erfindung
Die Aufgabe wird mit dem Verfahren und der Pflanzenprotein- Fraktion gemäß den Patentansprüchen 1 und 16, 18 und 20 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens und der Pflanzenprotein-Fraktion sind Gegenstand der abhängigen
Patentansprüche oder lassen sich der nachfolgenden
Beschreibung sowie dem Ausführungsbeispiel entnehmen.
Unter einer Proteinfraktion aus Leguminosen oder Ölsaaten wird im Folgenden eine Mischung unterschiedlicher Proteine aus Samen von Leguminosen oder Ölsaaten verstanden, die nicht der Proteinzusammensetzung (Mengenverhältnis unterschied- licher Proteine) aus den entsprechenden Pflanzensamen
entspricht, sondern eine davon abweichende Proteinzusammensetzung aufweist, bei der insbesondere ein oder mehrere der in den Samen enthaltenen Proteine nicht mehr oder nur noch in Spuren enthalten sind und die auch aus den Proteinen
abgetrennte Peptidstränge enthalten kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist durch folgende Schritte ausgehend von zerkleinerten Leguminosensamen oder Ölsaaten gekennzeichnet :
a) Mechanische Abtrennung einer ersten Proteinfraktion oder Abtrennung einer ersten Proteinfraktion mit Hilfe eines Lösemittels oder Kombination aus mechanischer und
lösemittelbasierter Abtrennung von einer zweiten
Proteinfraktion der zerkleinerten Pflanzensamen in einem Fraktionierungsschritt , im Folgenden auch als erster Fraktionierungsschritt bezeichnet,
b) optional, falls im ersten Fraktionierungsschritt kein
Wasser als Lösemittel zum Einsatz kommt: Zusatz von
Wasser zu der ersten oder zweiten Proteinfraktion unter Bildung einer wasserhaltigen Proteinfraktion,
c) Hydrolyse der wasserhaltigen Proteinfraktion mittels
Säure, Lauge und/oder Hitze, oder durch Behandlung mit Enzymen, vorzugsweise mit Proteasen oder Peptidasen, besonders vorteilhaft mit Enzymkombinationen bestehend aus mind. einer Endo- und mind. einer Exopeptidase, durchgeführt als ein- oder zweistufiger Prozess,
d) ein- oder mehrmalige Erhitzung der wasserhaltigen
Proteinfraktion bei einer Temperatur über 70 °C,
vorteilhaft über 80°C, besonders vorteilhaft über 90°C, e) optional: Fermentation der enzymatisch, chemisch oder
thermisch hydrolysierten Proteinfraktion, vorzugsweise nach Zugabe von Mikroorganismen (mindestens 108 kbE pro Gramm Protein, besser > 109 kbE pro Gramm Protein, vorteilhaft ^ 1010 kbE pro Gramm Protein; KbE: Kolonie¬ bildende Einheit) und unter Anwesenheit von Glukose oder einem anderen einfach zu fermentierendem Kohlenhydrat, f) Druck- und/oder Scherbehandlung der wasserhaltigen
Proteinfraktion, besonders vorteilhaft nach der
(optionalen) Fermentation und nach der Erhitzung.
g) Optional: Reduktion des Wassergehalts der wasserhaltigen Proteinfraktion durch ein Membranverfahren oder ein destillatives Verfahren zu Erhöhung des Trockensubstanzgehaltes auf einen Wert <12 Mass-%, vorteilhaft <15 Mass- % Trockensubstanz. Die erfindungsgemäße, nach den obigen Schritten a) -g) erhaltene Proteinfraktion zeichnet sich durch hervorragende technofunktionelle und sensorische Eigenschaften aus.
Überraschenderweise zeigte sich, dass ein weiterer Schritt h) Trennung der (modifizierten) wasserhaltigen Protein- fraktion nach Größe oder Sedimentierbarkeit , bspw.
mittels Zentrifugation oder Membranfiltration mit einem geeigneten Cut-off, der nach der (optionalen) Fermentation (Schritt e) ) bzw. - ohne Fermentation - nach der Hydrolyse (Schritt c) )
durchgeführt wird, einen deutlichen Effekt auf das allergene Potential der durch diesen Trennungsschritt erhaltenen neuen Fraktionen (Sediment- bzw. Retentatfraktion sowie Überstandsbzw. Permeatfraktion) aufweist. Die Trennung nach Größe kann beispielsweise durch verschiedene Filtrationsverfahren erfolgen wie z.B. Membranfiltration (z.B. Filter, Mikro-, Ultrafiltration) , die Trennung nach Sedimentierbarkeit durch Verfahren, die die Massenträgheit ausnutzen wie z.B.
Zentrifuge, Dekanter, Separatoren. Die Trennung wird
vorzugsweise so durchgeführt, dass in einer der aus dieser Trennung resultierenden Fraktionen eine Molekulargewichtsverteilung erhalten wird, bei der Molekülgrößen vorzugsweise entweder zu mehr als 50% kleiner als 25 kDa sind, bevorzugt zu mehr als 70%, besonders vorteilhaft zu mehr als 90%
(Überstands- bzw. Permeatfraktion) , oder weniger als 60% kleiner als 25 kDa sind, bevorzugt weniger als 50%, besonders bevorzugt weniger als 20% (Sediment- bzw. Retentatfraktion) . Besonders gute Proteineigenschaften werden erhalten, wenn die Trennung bei Schritt h) mittels Membranfiltration mit einem Cut-off durchgeführt wird, der kleiner 30kDa, vorteilhaft <6kDa besonders vorteilhaft <3kDa ist.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Trennung der
Proteinfraktion nach Größe bzw. Sedimentierbarkeit in
Kombination mit der Scherbeanspruchung vor oder nach der Scherbeanspruchung erfolgt.
Die unter a) beschriebene mechanische und/oder lösemittel¬ basierte Abtrennung einer Proteinfraktion ist für das
erfindungsgemäße Verfahren von großer Bedeutung. Die
mechanische Abtrennung kann beispielsweise folgendermaßen durchgeführt werden: Die Pflanzensamen werden zerkleinert und dann mittels Siebung und/oder Sichtung in größere und
kleinere bzw. leichtere oder schwerere Partikel aufgetrennt. Mit einer oder beiden Partikel-Fraktion/en wird dann der unter b) -h) beschriebene Prozess durchlaufen.
Alternativ oder in Kombination zur mechanischen Abtrennung kann eine lösemittelbasierte Abtrennung erfolgen. Die Samen oder eine mechanisch vorbehandelte Fraktion der Samen (im folgenden Rohstoff genannt) werden mit polaren oder unpolaren Lösemitteln in Kontakt gebracht, wodurch eine Proteinfraktion in das Lösemittel gelangt und eine andere Proteinfraktion im Rohstoff verbleibt. Als Lösemittel zum Einsatz kommen können dabei z.B. Wasser, mit Säure versetztes Wasser, über¬ kritisches C02, Ethanol, Wasser-Ethanol-Mischungen und Hexan. Mindestens eine der Proteinfraktionen (erste oder zweite Proteinfraktion) wird dann dem unter b) -h) beschriebenen Prozess unterzogen.
Die erfindungsgemäße, mit dem Verfahren erhaltene wasser¬ haltige ( Pflanzen- ) Proteinfraktion kann nach Durchführung der genannten Verfahrensschritte im feuchten Zustand direkt in
Lebensmitteln oder Futtermitteln als Proteinzutat zum Einsatz kommen. Unter der erfindungsgemäßen Proteinfraktionen werden dabei - wie auch im Folgenden - sowohl die nach den Schritten a) -g) erhaltene Proteinfraktion als auch die nach den
Schritten a) -h) erhaltenen Proteinfraktionen (Sediment- bzw. Retentatfraktion sowie Überstands- bzw. Permeatfraktion) angesehen.
Es ist jedoch vorteilhaft, die erfindungsgemäße Protein¬ fraktion vor einer Anwendung zu trocknen. Hierfür sollte vorteilhaft eine Sprüh-, Wirbelschicht- oder Walzentrocknung zum Einsatz kommen, möglich ist auch eine Trocknung im
Vakuum. Eine Gefriertrocknung sollte möglichst vermieden werden, da sich in Versuchen gezeigt hat, dass gefriergetrocknete Proteinfraktionen schlechtere Eigenschaften zeigen als Proteinfraktionen aus der Sprühtrocknung.
Die Verfahrensschritte der Hydrolyse, Fermentation, Druck¬ behandlung, Erhitzung, Druck- und/oder Scherbeanspruchung und Filtration/Zentrifugation können erfindungsgemäß mehr als einmal in unterschiedlicher Reihenfolge eingesetzt werden, um die sensorischen und funktionellen Eigenschaften weiter zu verbessern. Vorzugsweise folgt die Fermentation der
Enzymbehandlung und die Druck- und/oder Scherbehandlung der Fermentation, wobei die Erhitzungsschritte an beliebigen Stellen dieser Reihenfolge, d.h. auch zwischen Fermentation und Enzymbehandlung und/oder zwischen Druck- und/oder
Scherbehandlung und Fermentation, durchgeführt werden können. In Versuchen zeigten sich besonders gute Ergebnisse bei drei Erhitzungsschritten auf eine Temperatur von über 80 °C. Bei dieser Verfahrenskombination konnte neben der Verbesserung der Technofunktionalität und Sensorik auch die Immunreak¬ tivität deutlich gesenkt werden.
Die unter f) angegebene Druck- und/oder Scherbehandlung ist beim erfindungsgemäßen Verfahren bei einem Druck oberhalb von 2*105 Pa (2 bar) durchzuführen, vorteilhaft oberhalb von 5*105 Pa (5 bar) , besonders vorteilhaft bei einem Druck oberhalb von 150*105 Pa (150 bar) . Es zeigt sich in Versuchen, dass bei zunehmendem Druck bis zu einem maximalen Druck von 1000*105 Pa (1000 bar), der zum Erhalt der
Proteinfunktionalität nicht überschritten werden sollte, und gleichzeitiger Scherung (z.B. mit Hilfe eines Homogenisators) die Löslichkeit und meist auch die Emulgiereigenschaften der wasserhaltigen Proteinfraktion verbessert werden können.
Zur Überprüfung der Wirksamkeit der Filtration/Zentrifugation bei Schritt h) kann im Falle einer bei dem Verfahren
durchgeführten Fermentation der Anteil der abgetrennten
Mikroorganismen herangezogen werden. Bei erfolgreichem
Trennverfahren werden vorzugsweise im Rückstand mehr als 50 Mass-% der ursprünglich für die Fermentation eingebrachten Mikroorganismen DNA gefunden und im Überstand weniger als 20 Mass-%.
Unter zerkleinerten Leguminosensamen oder Ölsaaten, die im erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen, werden
Partikel oder Stücke von Samen verstanden, die mit einem mechanischen Verfahren (z.B. Mühle, Walzenstuhl o.ä.) derart verändert werden, dass sie nach der Behandlung ihre
natürliche Form nicht mehr aufweisen.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren finden die meisten
Verfahrensschritte in wässriger Umgebung statt. Der Umgang mit dem eingesetzten Wasser ist für den Erfolg des Verfahrens wichtig. Wenn z.B. im ersten Fraktionierungsschritt Wasser als Lösemittel zum Einsatz kommt, sollte angestrebt werden, dass vor der Fermentation dieses Wasser nicht durch ein
Trocknungsverfahren wieder aus der Proteinfraktion abgetrennt wird. In Versuchen hat sich gezeigt, dass die Fermentation einer zuvor getrockneten Proteinfraktion zu schlechteren Eigenschaften der Emulgierkapazität und Wasserlöslichkeit führt, als wenn die in Wasser befindliche Proteinfraktion ohne Trocknung direkt fermentativ behandelt wird und die Proteine während des gesamten Vorgangs von Wasser umgeben sind. Die Fermentation wird dabei erfindungsgemäß mit Hilfe von Mikroorgansimen im aeroben oder anaeroben Milieu
durchgeführt. Vorzugsweise kommen Mikroorganismen aus den Gruppen Milchsäurebakterien (Lb. perolens) , Hefen (z.B.
Saccharomyces cerevisiae) oder Pilzkulturen (z.B. Rhizopus oryzae, Actinomucor elegans) zum Einsatz.
Überraschenderweise ist ohne vorherige Trocknung der
Proteinfraktion auch die Veränderung der Immunreaktivität im Verlauf der Fermentation eine andere, obwohl dieselben
Mikroorganismen zum Einsatz kommen. Daher sollte darauf geachtet werden, dass nach Zugabe des Wassers bis zum
Abschluss der Fermentation das Massenverhältnis von Wasser zu Protein möglichst höher als 1:1, besser höher als 8:1, besonders vorteilhaft höher als 16:1 liegt. Ein Trocknungs- schritt sollte erst im Anschluss an die erfindungsgemäße Druck-/Scherbehandlung erfolgen.
Die mittels enzymatischer und/oder fermentativer Verfahren behandelten Proteine aus den genannten Rohstoffen sollten wasserlöslich oder zumindest in Wasser gut dispergierbar sein, damit die enzymatische Behandlung kontrolliert durch¬ geführt werden kann. Besonders vorteilhaft wird das Verfahren durchgeführt, wenn mindestens 35% der Proteinbestandteile bei pH 7 gelöst oder stabil dispergiert vorliegen. Hierfür werden die Rohstoffe mit Wasser vermengt, gelöst bzw. dispergiert und die Enzyme in entsprechenden Konzentrationen zugegeben. Unter stabil dispergiert wird der Anteil der dispergierten Partikel einer Dispersion verstanden, der sich nach einer Sedimentationsdauer von 10 Minuten noch im Überstand über einem abgetrennten Sediment befinden.
Das Lösemittel zur Abtrennung der ersten Proteinfraktion kann aus Wasser oder wässrigen Lösungen bestehen oder aus
organischen Lösemitteln wie Ethanol, Hexan, überkritischem CO2 oder dergleichen oder aus Mischungen von organischen Lösemitteln mit Wasser. Überraschenderweise zeigt sich, dass durch diesen ersten Fraktionierungsschritt sowohl Einfluss auf die Immun¬ reaktivität als auch auf die Sensorik und Techno¬ funktionalität der ersten und der zweiten Proteinfraktion genommen werden kann. So kann zum Beispiel bei Soja, wenn die Immunreaktion von Patienten auf den Kunitz-Trypsin-Inhibitor besonders stark ausfällt, durch wässriges Abtrennen einer ersten Fraktion, die große Teile des Kunitz-Trypsin- Inhibitors enthält, das immunreaktive Potential der zweiten Proteinfraktion reduziert werden, wohingegen mit einem derartigen Trennschritt die emulgierenden Eigenschaften der zweiten Proteinfraktion erhöht werden können.
Bei Arbeiten mit Lupine zeigt sich, dass bei Abtrennen einer gut löslichen Proteinfraktion mittels Lösemittel auch andere Komponenten, die z.B. einen Bittereindruck oder Adstringenz hervorrufen, reduziert werden können. So können durch diesen Fraktionierungsschritt die Adstringenz und der Bittereindruck in der zweiten Fraktion reduziert und gleichzeitig die spezifische Immunreaktivität verändert werden. Die nach der ersten Extraktion im Raffinat verbleibende zweite Fraktion des Lupinenproteins wird anteilig mehr alpha- und beta- Conglutin enthalten als die Ausgangssaat und zeigt
verbesserte emulgierende Eigenschaften als die erste.
In Untersuchungen mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Sojaproteinen zeigt sich zudem, dass sich Speicherproteine, die in hohen Konzentrationen in der Sojabohne enthalten sind, wie die Glycinin- und Conglycinin-Fraktionen, für das vorge- schlagene Verfahren besonders gut eignen. Diese Fraktionen werden im Stand der Technik von anderen Sojaproteinfraktionen vielfach abgetrennt, da diese eine besonders hohe Immunreak¬ tivität zeigen. Da diese Fraktionen den größten Anteil der Proteine in der Sojabohne ausmachen, ist der erfindungsgemäße Prozess sehr wirtschaftlich durchführbar, da ein sehr großer Anteil der Speicherproteine genutzt werden kann, was mit einem niedrigen spezifischen Rohstoffeinsätz einhergeht. Durch Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es
möglich, die Bitterkeit (von einem geschulten Panel in einer Skala von 1 bis 10 bewertet) , die bei einem nativen
Sojaprotein nach Extraktion und isoelektrischer Fällung bei einem Wert von über 2 liegt, auf Werte unter 1 zu reduzieren und gleichzeitig ansprechende Aromanoten in der Protein¬ fraktion zu generieren.
Das Verfahren ist besonders vorteilhaft, wenn die mechanische Druck- und Scherbeanspruchung und damit Zerkleinerung von
Proteinaggregaten nach der Fermentation erfolgt. Durch diesen Behandlungsschritt wird das Mundgefühl der Proteinfraktion, die nach der Fermentation vielfach als rau und sandig
beschrieben wird, als weicher und angenehmer beschrieben.
Vorteilhafte techno-funktionelle Eigenschaften bei gleich¬ zeitig deutlicher Reduktion der Immunreaktivität ergeben sich, wenn nach dem ersten Fraktionierungsschritt mit der wasserhaltigen Proteinfraktion eine 2-stufige enzymatische Hydrolyse mittels Endo- und Exopeptidasen erfolgt,
anschließend eine Fermentation vorzugsweise mit Milchsäure¬ bakterien erfolgt, dann die Proteinfraktion mit einem Druck von über 2*105 Pa (2 bar) behandelt und anschließend
vorzugsweise im Sprühtrockner getrocknet wird, wobei im
Verlauf des Prozesses wenigstens 2 Erhitzungsschritte über 85°C durchgeführt werden. Durch diese Verfahrenskombination wird die Proteinlöslichkeit bei pH 7 auf Werte von zum Teil über 50% erhöht bei gleichzeitiger Minimierung der
Immunreaktivität und Reduktion der Bitterkeit. Vor allem die Reduktion des Bittereindrucks ist überraschend, da bisher eine Steigerung der Löslichkeit von Proteinpräparaten durch enzymatische Hydrolyse immer mit einem Anstieg der Bitterkeit beschrieben wurde (vgl. Seo et al . , „Evaluation of bitterness in enzymatic hydrolysates of soy protein isolate by taste dilution analysis", Journal of Food Science, 73(1), 2008, S. 41-46) . Da vielfach eine hohe Druckbelastung aus wirtschaftlichen oder energetischen Überlegungen nicht erwünscht ist, können auch einfachere Verfahren zu einem guten erfindungsgemäßen Produkt führen. So zeigt sich, dass auch bei niedrigen
Drücken nahe am Umgebungsdruck zufrieden-stellende Ergebnisse erzielt werden, wenn eine intensive Scherbeanspruchung sichergestellt ist. Diese kann beispielsweise an schnell durchströmten Spalten auftreten, an beweglichen Kanten, an den Kontaktstellen von Rührwerken in Flüssigkeiten oder auch in leistungsstarken Pumpen. In Versuchen zeigte sich, dass eine erfindungsgemäße Scherbeanspruchung dann erreicht wird, wenn Scherraten auftreten, die größer 10s-1, vorteilhaft größer 100s-1, besonders vorteilhaft größer 500s-1 sind. In einigen Anwendungen kann es vorteilhaft sein, eine
Erhitzung der entsprechenden Proteinfraktion auf über 90 °C durchzuführen, besser sogar auf Temperaturen über 100 °C. Hierbei können neben einer weitgehenden Reduktion der
Keimbelastung in der Proteinfraktion auch weitere sensorische Effekte durch thermisch induzierte Reaktionen erzielt werden, die sich positiv auf die Verbraucherakzeptanz auswirken.
Ähnlich positive Effekte können bei mehreren Erhitzungs¬ schritten erzielt werden. Vorteilhaft wird die Protein¬ fraktion im Verlauf der Behandlung mehr als 1-mal auf Werte über 80°C erhitzt, besonders vorteilhaft mehr als 3-mal.
Besondere Vorteile hinsichtlich ausgewählter techno- funktioneller Eigenschaften wie z.B. Löslichkeit oder
Emulgierkapazität ergeben sich, wenn nach der Hydrolyse und (optionalen) Fermentation ein Trennschritt nach Größe oder Löslichkeit bzw. Sedimentierbarkeit erfolgt, wie z.B. eine Zentrifugation oder Filtration. Dabei zeigt sich, dass die Proteinfraktion im Sediment im Vergleich zur Proteinfraktion im Überstand nach der Zentrifugation trotz ähnlicher
sensorischer Eigenschaften große Unterschiede in der
Funktionalität und Immunreaktivität aufweisen. Während die Proteinfraktion im Sediment deutlich bessere Eigenschaften als Emulgator aufweist als die Proteinfraktion im Überstand, erzeugt sie in Prick-Tests bei entsprechenden Allergikern eine stärkere allergische Reaktion als die Proteinfraktion des Überstands. Ähnliches gilt für die Retentat- und
Permeatproteinfraktionen nach der Ultrafiltration. Auch hier ist die Retentatfraktion besser als Emulgator geeignet, erzeugt aber stärkere allergische Reaktionen in Prick-Tests in der menschlichen Haut. Die bei Einbeziehung des Trennungsschrittes h) in das
Verfahren erhaltenen erfindungsgemäßen Proteinfraktionen sind die Retentatfraktion oder Sedimentfraktion und die Permeat- fraktion oder Überstandsfraktion. Die erfindungsgemäße Proteinfraktion enthält mehr als
25 Mass-% Protein, bevorzugt mehr als 60 Mass-%, besonders vorteilhaft über 90 Mass-%. Sie ist dadurch gekennzeichnet, dass eine oder mehrere Teilfraktionen der Proteine einer oder mehrerer Spezies von Leguminosen oder einer oder mehrerer Spezies von Ölsaaten enthalten sind. Dabei sind unter dem Begriff Leguminosen Samen von Soja, Erbsen, Lupinen,
Kichererbsen, Linsen, Bohnen, Ackerbohnen und Erdnuss zu verstehen und unter dem Begriff Ölsaaten Samen von
Sonnenblumen, Raps, Camelina und Lein. Die erfindungsgemäße Proteinfraktion kann aus einer oder aus einer Mischung von mehreren Teilfraktionen der jeweiligen Gesamtheit der
Proteine aus den genannten Rohstoffen bestehen.
Erfindungsgemäß weist die Proteinfraktion nach Fermentation einen Anteil an Biomasse aus Mikroorgansimen auf, die
vorteilhaft inaktiviert vorliegen. Dieser Anteil ist im
Trockensubstanzgehalt bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Proteinfraktion größer als 0,05 Mass-%, besser größer als 0,5 Mass-%, besonders vorteilhaft größer als 1 Mass-%. Es zeigt sich, dass eine Anreicherung der Biomasse aus
Milchsäurebakterien bis zu einem Anteil von 1 Mass% an
Mikroorganismen-Trockenmasse die Proteinfraktion als sensorisch zunehmend ansprechend empfunden wird. Bei höheren Konzentrationen nimmt die Beliebtheit wieder ab.
Die erfindungsgemäße Proteinfraktion besteht vorzugsweise aus einem Anteil an Protein, das bei pH 7 löslich ist und aus einem Anteil an Protein, das bei pH 7 unlöslich ist. Der lösliche Anteil der Proteinfraktion weist überraschenderweise eine enge Molekulargewichtsverteilung auf. Die Molekülgrößen sind dabei zu mehr als 30% kleiner als 25 kDa, bevorzugt zu mehr als 50%, besonders bevorzugt zu mehr als 90%. Daher sind die Eigenschaften der Proteine des löslichen Anteils sehr einheitlich. Es wäre somit möglich, die lösliche Fraktion bei einem pH-Wert von 7 von der unlöslichen zu trennen und beide Proteinfraktionen getrennt voneinander einzusetzen. Besonders für die lösliche Fraktion gibt es eine Vielzahl von
Applikationsmöglichkeiten in Lebensmitteln, wie z.B. ein Einsatz in Getränken oder Gelen.
Bei Einbeziehung des Trennungsschrittes h) bei der
Herstellung wird die erfindungsgemäße Proteinfraktion nur durch die Permeat- bzw. Überstandsfraktion oder durch die
Retentat- bzw. Sedimentfraktion gebildet und weist dann eine Molekulargewichtsverteilung auf, bei der Molekülgrößen entweder zu mehr als 50% kleiner als 25 kDa sind, bevorzugt zu mehr als 70%, besonders vorteilhaft zu mehr als 90%, oder bei der weniger als 60% der Molekülgrößen kleiner als 25 kDa sind, bevorzugt weniger als 50%, besonders bevorzugt weniger als 20%.
Die erfindungsgemäße Proteinfraktion weist vorteilhaft eine Schaumaktivität (bezogen auf eine Ausgangslösung) von größer als 1000%, bevorzugt größer 1500%, besonders bevorzugt größer als 2000% auf. Die Emulgierkapazität beträgt vorzugsweise >200 ml Öl/g Protein, besonders vorteilhaft >500 ml Öl/g Protein und hat vorzugsweise - nach ausreichender Druck- und Scherbehandlung - eine Löslichkeit von >25% bei pH 7.
Zur Steigerung der Verbraucherakzeptanz weist die für die Applikation im Lebensmittel zum Einsatz kommende Proteinfraktion neben ansprechenden Eigenschaften in Bezug auf Aroma und Geschmack auch eine ausgeprägte Helligkeit auf. Diese wird in der für die Farbcharakterisierung zum Einsatz kommenden L*a*b-Bestimmung durch den L-Wert angegeben. Bei der erfindungsgemäßen Proteinfraktion liegt dieser Wert über 70, bevorzugt über 80, besonders vorteilhaft über 90.
Die Farbe der Proteinfraktion fällt damit erfindungsgemäß sehr hell aus und reicht je nach überwiegend enthaltenem
Rohstoff von Weiß über cremefarben, hellgrau, hellgelb oder hellorange. Folgendes sind typische Werte für L*, a* und b*
L* >= 80, -5 < a* < +5, -5 < b* < +20; vorteilhaft
L* >= 85, -3 < a* < +3, - 2 < b* < +15; besonders vorteilhaft L* >= 90, -1 < a* < +1, 0 < b* < +10.
Zudem enthält die Proteinfraktion vorteilhaft einen Anteil von Aromakomponenten, die aus der Fermentation stammen, wie z.B Diacetyl oder andere Metaboliten der fermentativen
Behandlung .
Die Immunreaktivität des erfindungsgemäßen Produktes ist im Vergleich zu einem nativen Protein aus derselben Pflanze um mindestens 50%, besser um >80% reduziert. Bestimmt wird dieser Wert über die Auswertung eines Western Blots.
Mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren sind
Proteinfraktionen aus Pflanzenproteinen mit folgenden
weiteren Eigenschaften herstellbar:
Techno-funktionelle Eigenschaften :
Es wurde erkannt, dass die techno-funktionellen Eigenschaften der Proteinfraktion durch die erfindungsgemäßen
Verfahrensschritte deutlich verbessert wurden. Folgende Werte wurden in den Proteinfraktionen typischerweise gefunden: Proteinlöslichkeit bei pH 4:
Die Proteinlöslichkeit, bestimmt nach Morr et al . (Morr et al . 1985, "A Collaborative Study to Develop a
Standardized Food Protein Solubility Procedure", Journal of Food Science 50:1715-1718), ist größer als 5%, bevorzugt größer als 20%. Typischerweise liegt die
Proteinlöslichkeit im Bereich von >5-90%.
Proteinlöslichkeit bei pH 7:
Die Proteinlöslichkeit, bestimmt nach Morr et al . 1985 ist vorzugsweise größer als 25%, bevorzugt größer als 50%. Typischerweise liegt die Proteinlöslichkeit im Bereich von >35-90%.
Emulgiereigenschaften :
Die Emulgierkapazität , bestimmt nach der Konduk- tivitätsmessungs-Methode, betragt mindestens 200 ml Öl/g, bevorzugt mindestens 500 ml Öl/g.
Wasser- und Ölbindevermögen :
Die Wasserbindung, bestimmt nach dem AACC- Bestimmungsverfahren, beträgt mindestens 2 ml/g, bevorzugt mindestens 3 ml/g.
Die Ölbindung, bestimmt nach dem Fettbinde- Bestimmungsverfahren, beträgt mindestens 1 ml/g, bevorzugt mindestens 2 ml/g.
Schaumbildende Eigenschaften:
Die Schaumaktivität beträgt mindestens 1000%.
Vergleichsmessungen mit frischem Hühnereiklar bei
Aufschlag während 3 min auf Stufe 3 in einer Hobart 50N Standard-Küchenmaschine mit Rührbesen zeigen, dass die Schaumaktivität der Proteinfraktion mindestens 60% der Schaumaktivität von Hühnereiklar entspricht. Die
Schaumdichte liegt im Bereich von 30 bis 220 g/1. Die Schaumstabilität beträgt mindestens 2%, vorzugsweise mindestens 50%. Sensorische Eigenschaften:
Neben der hellen Farbe ist die Proteinfraktion im
Wesentlichen geruchsfrei und geschmacksneutral.
Insbesondere fehlen weitgehend die pflanzen- oder saateigenen Aromen. So sind im Wesentlichen kein
„bohniger" und „grün/grasiger" Geruch und Geschmack sowie im Wesentlichen kein Bittergeschmack wahrnehmbar.
Sensorische Tests mit einem geschulten Sensorik Panel zeigten, dass der Proteinfraktion ein Wert von 2 oder weniger (typischerweise ein Wert von 0 bis 1) zugeordnet wird. Farbe, Eigengeschmack und Eigengeruch der
Proteinfraktion sind so, dass bei der Einarbeitung in Lebens- und Futtermittel im Wesentlichen keine mit üblichen statistischen Methoden ermittelte signifikante, als negativ zu wertende Veränderung des arteigenen
Aussehens, Geruchs und Geschmacks der fertigen
Zubereitung auftritt.
Farbe, Eigengeschmack und Eigengeruch der
Proteinfraktion sind so, dass bei der Einarbeitung in Lebens- und Futtermittel im Wesentlichen keine mit üblichen statistischen Methoden ermittelte signifikante, als negativ zu wertende Veränderung des arteigenen
Aussehens, Geruchs und Geschmacks der fertigen
Zubereitung auftritt.
Sensorische Tests zeigen, dass die Geschmacks- und
Aromaänderung, die in einer Lebensmittelzubereitung durch den Einsatz der Proteinfraktion hervorgerufen wird, gegenüber der Lebensmittelzubereitung ohne die Proteinfraktion auf ein derartiges Maß begrenzt ist, dass ein geschulter Prüfer eine Abweichung eines der oben genannten Geschmacks- oder Aromamerkmale auf einer
Skala von 1-10 von maximal 3 Stufen, besser maximal 1 Stufe (fast nicht mehr erkennbare Abweichung) erkennen kann .
Die erfindungsgemäße Proteinfraktion kann daher eine oder mehrere der obigen techno-funktionellen und sensorischen Eigenschaften aufweisen.
Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Proteinfraktion als Lebensmittelzutat eingesetzt. Da neben der verbesserten Funktionalität und Sensorik auch die Immunreaktivität der erfindungsgemäßen Proteinfraktion deutlich reduziert ist, kann die Proteinfraktion aus einem Rohstoff (z.B. Soja oder Sonnenblume) oder Mischungen aus verschiedenen Rohstoffen vorteilhaft als hypoallergene oder allergen-reduzierte
Proteinzutat in Lebensmitteln verwendet werden.
Aufgrund der hohen Funktionalität der Proteinfraktion kann zudem die Einsatzmenge zur Erzielung der gewünschten
Textureffekte (z.B. Stabilisierung einer Emulsionen) im Vergleich zu bislang am Markt verfügbaren Proteinzutaten weiter reduziert werden, so dass eine geringere
Immunreaktivität der Proteinfraktion zusammen mit einer geringeren Einsatzmenge der Zutat zu einer geringeren
Immunreaktion bei potenziell allergischen Menschen führen wird. Es sind Anwendungen möglich, wie Emulsionen (z.B.
pflanzlicher Ersatz für Milch, Sahne, Joghurt, Käse, Wurst, Mayonnaise,...), pflanzliche Back-, feine Back- und Teigwaren, in denen auf den Zusatz von Ei verzichtet wird oder
extrudierte nasse oder trockene Proteinprodukte (wie z.B. pflanzliche Fleischalternativen aus der Kochextrusion oder pflanzliche Trockenextrudate) .
Ausführungsbeispiel
Es wurde eine Sojaproteinfraktion gewonnen, die mittels wässriger Extraktion bei pH 8 aus zermahlenen und mit Wasser vorextrahierten Sojabohnen extrahiert und mit einer Fällung am isoelektrischen Punkt aufkonzentriert wurde. Die dabei erhaltene Suspension wurde neutralisiert und auf ein Protein : Wasser-Verhältnis von 1:20 eingestellt. Danach wurden folgende Prozessschritte durchgeführt:
• enzymatische Hydrolyse (zweistufige Enzymkombination aus Endopeptidase und Exopeptidase) bei 30°C, gefolgt von einer
• Erhitzung auf 85 °C, gefolgt von einer
• aeroben Fermentation mittels Milchsäurebakterien (Lb. perolens) , unter vorheriger Zugabe von 2% Glukose, gefolgt von einer
• Homogenisation der jeweiligen Fraktionen bei einem Druck von 200*105 Pa (200 bar) und einer Temperatur von 30°C und einer
• anschließenden Sprühtrocknung.
Die dabei erhaltene Proteinfraktion hat eine fast weiße
Farbe, einen sehr neutralen Geschmack und zeigt im Sandwich ELISA und Western Blot mit spezifischen monoklonalen Maus- Antikörpern und Humanseren von Soja-Allergikern keine oder im Vergleich zum nativen Protein nur noch eine sehr geringe Immunreaktivität, aber gleichzeitig Funktionalitätswerte hinsichtlich Emulgierkapazität von 700 mL Öl/g und 50%
Löslichkeit bei pH 7.
Bestimmungsverfahren :
Zur quantitativen Charakterisierung der hergestellten
Proteinfraktion wird auf folgende Bestimmungsverfahren zurückgegriffen :
- Proteingehalt:
Der Proteingehalt ist definiert als der Gehalt, der sich aus der Bestimmung des Stickstoff (N) und dessen Multiplikation mit dem Faktor 6,25 errechnet. Der Proteingehalt wird z. B. in Prozent bezogen auf die Trockenmasse (TS) angegeben. - Farbe: Die wahrnehmbare Farbe ist mittels CIE-L*a*b*-
Farbmessung definiert (vgl. DIN 6417) . Dabei gibt die L*- Achse die Helligkeit an, wobei Schwarz den Wert 0 und Weiß den Wert 100 hat, die a*-Achse beschreibt den Grün- oder Rotanteil und die b*-Achse den Blau- oder Gelbanteil.
- Proteinlöslichkeit (bei pH 7 oder pH 4) :
Die Proteinlöslichkeit ist mittels Bestimmungsverfahren nach Morr bestimmt (Morr et al . , "A Collaborative Study to Develop a Standardized Food Protein Solubility Procedure", Journal of Food Science 50:1715-1718). Dabei wird die Proteinfraktion zu einem Masse-Volumenanteil von 1:25 bis 1:50 (w/v) (d. h. 1-2 g der Proteinfraktion auf 50 ml Lösung) in einer 0,1 M NaCl- Losung bei Raumtemperatur suspendiert und unter Verwendung von 0,1 M HCl- oder NaOH-Lösung ca. 60 min bei einem pH-Wert von pH 7 (oder pH 4) gehalten und mit ca. 200 U/mm gerührt und das unlösliche Sediment danach für 15 min bei 20.000 x g abzentrifugiert . Die Proteinlöslichkeit wird z.B. in Prozent angegeben, wobei eine Proteinlöslichkeit νθΠ X "6 bedeutet, dass x% des in der Proteinfraktion vorhandenen Proteins im geklärten Überstand wiedergefunden werden, wenn die genannte Methode angewendet wird.
- Wasserbindung:
Das Wasserbindevermögen ist mittels Bestimmungsverfahren (hier AACC-Bestimmungsverfahren genannt) definiert, wie es angegeben ist in: American Association of Cereal Chemists, "Approved methods of the AACC". 10th ed., AACC . St. Paul, MN, 2000; Method 56-20. "Hydration capacity of pregelatinized cereal products". Das Wasserbindevermögen ist z. B. in ml/g angebbar, d.h. Milliliter gebundenes Wasser pro Gramm
Proteinfraktion, und wird gemäß dem AACC-Bestimmungsverfahren bestimmt über das Gewicht des mit Wasser gesättigten
Sediments abzüglich der Einwaage der trockenen Proteinfraktion nach Mischung von ca. 2 g Proteinfraktion mit ca. 40 ml Wasser für 10 Minuten und Zentrifugation bei 1000g für 15 Minuten bei 20°C.
- Ölbindung:
Das Ölbindevermögen ist mittels Bestimmungsverfahren (hier Fettbinde-Bestimmungsverfahren genannt) definiert, wie es angegeben ist in: Ludwig I. et al . , "Eine Mikromethode zur Bestimmung der Fettbindkapazität". Nahrung/Food, 33(1), 99. Das Ölbindevermögen wird z.B. in ml/g angegeben, d. h.
Milliliter gebundenes Öl pro Gramm Proteinfraktion, und wird gemäß o.g. Bestimmungsverfahren gemessen als Volumen des ölbindenden Sediments nach Mischung von 1,5 g Proteinfraktion mit 15 ml Maiskeimöl für 1 Minute und Zentrifugation bei 700g für 15 Minuten bei 200C.
- Emulgierkapazität :
Die Emulgierkapazität ist mittels Bestimmungsverfahren (hier Konduktivitätsmessungs-Methode genannt) bestimmt, bei welchem einer 1 %igen Suspension der Proteinfraktion von 100 ml, pH 7, Maiskeimöl zugegeben wird bis zur Phaseninversion der Öl- in-Wasser-Emulsion . Die Emulgierkapazität ist definiert als das maximale Ölaufnahmevermögen dieser Suspension, bestimmt über die spontane Abnahme der Leitfähigkeit bei der
Phaseninversion (Wäsche A. et al . , "New processing of lupin protein isolates and functional properties". Nahrung/Food 45:393-395) und wird z.B. angegeben in ml Öl/g, d. h.
Milliliter emulgiertes Öl pro Gramm Proteinfraktion.
- Schaumaktivität:
Die Schaumaktivität ist angegeben in Prozent, gemessen als Volumenzunahme einer 5 %igen Proteinlösung, pH 7, bei
Aufschlag wahrend 8 min auf Stufe 3 (591 U/mm) in einer
Hobart 50N Standard-Küchenmaschine (Stahlkessel mit 5 Liter Inhalt) mit Rührbesen (Drahtbesen) .
- Schaumdichte:
Die Schaumdichte ist angegeben in g/1, d. h. Masse des
Schaums pro Volumeneinheit, und wird gemessen nach Aufschlag einer 5 %igen Proteinlösung, pH 7, von 8 min auf Stufe 3 (591 U/min) in einer in einer Hobart 50N Standard-Küchenmaschine
(Stahlkessel mit 5 Liter Inhalt) mit Rührbesen (Drahtbesen) . - Schaumstabilität:
Die Schaumstabilität ist angegeben in Prozent, gemessen als übrig gebliebenes Volumen von 100 ml Schaum innerhalb einer Stunde nach Aufschlag einer 5 %igen Proteinlösung, pH 7, 8 min auf Stufe 3 (591 U/min) in einer Hobart 50N Standard- Küchenmaschine (Stahlkessel mit 5 Liter Inhalt) mit Rührbesen (Drahtbesen) .
- Gelbildungskonzentration:
Die Gelbidlungskonzentration ist mittels Bestimmungsverfahren definiert, wie es angegeben ist in: Sathe SK et al . ,
"Functional-properties of Winged Bean 620 [ Psophocarpus- Tetragonolobus (L) De] Proteins". Journal of Food Science 47 (2) :503-621 509.
- Molekulargewichtsverteilung:
Die Molekulargewichtsverteilung ist mittels
Bestimmungsverfahren (hier SDS-PAGE Analyse genannt)
definiert, wie es angegeben ist in: Laemmli, „Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage- T4". Nature, 227, 680) . Die Auftrennung der Proteine wird mittels 4-20% midi CriterionTM TGX Stain-FreeTM precast
Fertiggele (Bio-Rad Laboratories, München, Deutschland) in der CriterionTM Cell (Bio-Rad Laboratories, München,
Deutschland) durchgeführt und die Visualisierung und
Auswertung erfolgt dabei mit Hilfe des Gel DocTM EZ Imager (Bio-Rad Laboratories, München) .
- Hydrolysegrad:
Der Hydrolysegrad ist mittels Bestimmungsverfahren (hier DH- Wert Analyse genannt) definiert, wie es angegeben ist in: Nielsen P. M. et al . , „Improved method for determining food protein degree of hydrolysis". Journal of Food Science
66 : 642-646.
- Immunreaktivität:
Die Immunreaktivität ist mittels Bestimmungsverfahren (Sandwich ELISA und Western Blot) definiert, wie es angegeben ist: Meinlschmidt P. et al . , " Immunoreactivity, sensory and physicochemical properties of fermented soy protein isolate", Food Chemistry 205: 229-238.
- Sensorische Eigenschaften:
Sensorische Tests, in welchen geschulte Prüfer einen
bestimmten Geschmacks- oder Aromaeindruck der Proteinfraktion und einer geeigneten Referenzsubstanz vergleichen und auf einer Skala von 1 bis 10 (1 = nicht wahrnehmbar, 10 = stark wahrnehmbar) bewerten, wobei zwei Referenzsubstanzen so gewählt sind, dass bei ihr der zu prüfende Geschmacks- oder Aromaeindruck mit 5 und 10 bewertet werden. - Die Quantifizierung der Mikroorganismen kann mit Hilfe von mikroskopischen Verfahren erfolgen oder durch Quantifizierung der in der Proteinfraktion enthaltenen DNA-Stränge der
Mikroorganismen. Die Quantifizierung der DNA-Stränge erfolgt mit einer molekularbiologischen Methode, die unter dem
Begriff "Quantitative PCR" bekannt ist. Im Rückstand wird die Menge an DNA über die quantitative PCR ermittelt und kann folglich mit der ursprünglich eingesetzten Zellzahl
korreliert werden, wobei die Zellzahl mit den KbE
gleichgesetzt wird.
Beispiele von zu testenden Geschmacks- oder Aromaeindrucken sind :
- bohniger Geschmack im Vergleich zu Sojabohnen;
- Grüner bis grasiger Geschmack im Vergleich zu grünem
Paprika oder grünen Erbsen;
- Bittergeschmack im Vergleich zu zwei wässrigen 1,0 und 2,5%igen wässrigen Alcalase-Hydrolysat Lösungen
(Herstellungsbedingungen: E/S = 0,5%, 180 min, pH 8,0, 60°C, ohne pH-Wert Regulierung) .
Das Panel wurde zuvor mittels eines sensorischen
Schwellentests zur Erkennung von „Bitter und nicht Bitter Schmeckern" mit Hilfe von Koffein-Lösungen ausgewählt.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Herstellung einer Pflanzenprotein-Fraktion aus Leguminosen oder Ölsaaten, bei dem
in einem Fraktionierungsschritt aus zerkleinerten
Leguminosensamen oder Ölsaaten mit Hilfe eines
mechanischen Verfahrens und/oder mit Hilfe eines
Lösemittels eine erste Proteinfraktion abgetrennt wird, wobei eine zweite Proteinfraktion zurück bleibt, und eine durch den Fraktionierungsschritt direkt oder nach Zugabe von Wasser erhaltene wasserhaltige
Proteinfraktion
- einer ein- oder mehrmaligen Hydrolyse,
- einer ein- oder mehrmaligen Erhitzung auf eine
Temperatur > 70 °C,
- optional einer ein- oder mehrmaligen Fermentation und
- einer ein- oder mehrmaligen Druck- und/oder
Scherbehandlung unterzogen wird,
um die Pflanzenprotein-Fraktion zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass nach der Hydrolyse im weiteren Verlauf des
Verfahrens eine Trennung der wasserhaltigen
Proteinfraktion nach Größe oder Sedimentierbarkeit in eine Retentat- oder Sedimentfraktion und eine Permeat- oder Überstandsfraktion erfolgt, um die Pflanzenprotein- Fraktion zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass als Lösungsmittel im Fraktionierungsschritt Wasser oder ein wässriges Lösungsmittel eingesetzt wird, wodurch als erste Proteinfraktion direkt die wasserhaltige Proteinfraktion erhalten
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass als Lösungsmittel im Fraktionierungsschritt kein Wasser oder wässriges Lösungsmittel eingesetzt und die wasserhaltige Proteinfraktion durch Zugabe von Wasser der ersten oder zweiten Proteinfraktion erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass ein Wassergehalt der wasserhaltigen Proteinfraktion durch ein Membranverfahren oder ein destillatives
Verfahren zur Erhöhung des Trockensubstanzgehaltes auf einen Wert bis zu 12 Mass-%, vorteilhaft bis zu 15 Mass- % Trockensubstanz reduziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Hydrolyse der wasserhaltigen Proteinfraktion mit Proteasen oder Peptidasen erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Hydrolyse der wasserhaltigen Proteinfraktion mit Enzymkombinationen bestehend aus mindestens einer Endo- und mindestens einer Exopeptidase erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Hydrolyse der wasserhaltigen Proteinfraktion durch eine 2-stufige enzymatische Hydrolyse mittels Endo- und Exopeptidasen erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Fermentation nach Zugabe von Mikroorganismen für die Fermentation mit einer Dosierung von > 1010 KbE pro Gramm Protein und unter Anwesenheit von Glukose oder einem anderen einfach zu fermentierendem Kohlenhydrat erfolgt .
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Druck- und/oder Scherbehandlung nach der
Fermentation und nach der Erhitzung durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass die wasserhaltige Proteinfraktion oder eine daraus erhaltene Retentat- oder Sedimentfraktion oder Permeat- oder Überstandsfraktion nach Durchführung der Schritte der Enzymbehandlung, Erhitzung, Fermentation und Druck- und/oder Scherbehandlung getrocknet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Druck- und/oder Scherbehandlung bei einem Druck oberhalb von 5*105 Pa, vorzugsweise bei einem Druck oberhalb von 150*105 Pa durchgeführt wird. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Scherbehandlung so durchgeführt wird, dass Scherraten von größer 10s-1, vorteilhaft größer 100s-1, besonders vorteilhaft größer 500s-1 auftreten.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet,
dass ein Wassergehalt der wasserhaltigen Proteinfraktion so gewählt wird, dass bis zum Abschluss der Fermentation ein Massenverhältnis von Wasser zu Protein in der wasserhaltigen Proteinfraktion höher als 1:21,
vorteilhaft höher als 8:1, besonders vorteilhaft höher als 16:1 liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass die wasserhaltige Proteinfraktion mehr als zweimal auf eine Temperatur > 80°C erhitzt wird.
Pflanzenprotein-Fraktion aus Leguminosen oder Ölsaaten, die
- eine oder mehrere Teilfraktionen von Proteinen einer oder mehrerer Spezies der Leguminosen oder einer oder mehrerer Spezies der Ölsaaten enthält,
- einen Proteingehalt von mehr als 25 Mass-% Protein, vorteilhaft höher als 60%, besonders vorteilhaft höher als 90%, und
- eine Molekulargewichtsverteilung aufweist, bei der mehr als 30% der Molekülgrößen kleiner 25 kDA sind, bevorzugt mehr als 50%, besonders bevorzugt mehr als 90%,
- aus einem Anteil an Protein besteht, das bei pH 7 zu mind. 25%, bevorzugt zu mind. 50%, besonders bevorzugt zu mind. 60% löslich ist, und
- eine Schaumaktivität von größer als 1000%, bevorzugt größer als 1500%, besonders bevorzugt größer als 2000% aufweist .
Pflanzenproteinfraktion nach Anspruch 16,
die DNA-Stränge von Mikroorganismen enthält, die einer Mikroorganismen-Konzentration von mehr als 108 KbE pro g Protein, bevorzugt mehr als 109 KBE pro Gramm Protein, besonders bevorzugt mehr als 1010 KBE pro Gramm Protein entsprechen .
Pflanzenprotein-Fraktion aus Leguminosen oder Ölsaaten, die
- eine oder mehrere Teilfraktionen von Proteinen einer oder mehrerer Spezies der Leguminosen oder einer oder mehrerer Spezies der Ölsaaten enthält,
- einen Proteingehalt von mehr als 50 Mass-% Protein, vorteilhaft höher als 60%, und
- eine Molekulargewichtsverteilung aufweist, bei der Molekülgrößen zu mehr als 50% kleiner als 25 kDa sind, bevorzugt zu mehr als 70%, besonders bevorzugt zu mehr als 90%,
- eine Löslichkeit aufweist, die bei pH 7 mehr als 60%, bevorzugt mehr als 70%, besonders bevorzugt mehr als 80% beträgt, und
- eine Schaumaktivität von größer als 1000%, bevorzugt größer als 1500%, besonders bevorzugt größer als 2000% aufweist .
Pflanzenproteinfraktion nach Anspruch 18,
die DNA-Stränge von Mikroorganismen enthält, die einer Mikroorganismen-Konzentration von mehr als 106 KbE pro g Protein, bevorzugt mehr als 107 KbE pro g Protein entsprechen .
Pflanzenprotein-Fraktion aus Leguminosen oder Ölsaaten, die
- eine oder mehrere Teilfraktionen von Proteinen einer oder mehrerer Spezies der Leguminosen oder einer oder mehrerer Spezies der Ölsaaten enthält,
- einen Proteingehalt von mehr als 50 Mass-% Protein, vorteilhaft höher als 60%, besonders vorteilhaft höher als 90%, und
- eine Molekulargewichtsverteilung aufweist, bei der weniger als 60% der Molekülgrößen kleiner als 25 kDa sind, bevorzugt weniger als 50%, besonders bevorzugt weniger als 20%,
- eine Löslichkeit aufweist, die bei pH 7 weniger als 60%, bevorzugt weniger als 50%, besonders bevorzugt weniger als 40% beträgt, und - eine Schaumaktivität von größer als 1000%, bevorzugt größer als 1500%, besonders bevorzugt größer als 2000% aufweist .
Pflanzenproteinfraktion nach Anspruch 20, die DNA-Stränge von Mikroorganismen enthält, die einer Mikroorganismen- Konzentration von mehr als 108 KBE pro g Protein, bevorzugt mehr als 109 KBE pro g Protein, besonders bevorzugt mehr als 1010 KBE pro g Protein entsprechen.
22. Pflanzenprotein-Fraktion nach einem der Ansprüche 17, 19 und 21,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Anteil an Biomasse aus Mikroorgansimen
inaktiviert vorliegt.
23. Pflanzenprotein-Fraktion nach einem der Ansprüche 17, 19, 21 und 22,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Anteil an Biomasse aus Mikroorgansimen bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Pflanzenprotein- Fraktion größer als 0,5 Mass-% ist.
24. Pflanzenprotein-Fraktion nach einem der Ansprüche 17, 19 und 21 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Biomasse aus Mikroorgansimen bis zu einem
Anteil von 1 Mass% bezogen auf den Trockensubstanzgehalt der Pflanzenprotein-Fraktion mit Milchsäurebakterien oder Hefen oder Schimmelpilzen angereichert ist.
25. Pflanzenprotein-Fraktion nach einem der Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet,
dass die Pflanzenprotein-Fraktion eine Emulgierkapazität von >200 ml Öl/g Protein aufweist.
26. Pflanzenprotein-Fraktion nach einem der Ansprüche 16 bis 25, dadurch gekennzeichnet,
dass die Pflanzenprotein-Fraktion eine mittels CIE- L*a*b-Farbmessung ermittelte Helligkeit mit einem L-Wert > 70 aufweist.
Pflanzenprotein-Fraktion nach einem der Ansprüche 16 bis
26, dadurch gekennzeichnet,
dass die Pflanzenprotein-Fraktion einen Anteil von
Aromakomponenten aus einer Fermentation enthält.
Pflanzenprotein-Fraktion nach einem der Ansprüche 16 bis
27, dadurch gekennzeichnet,
dass eine über eine Auswertung eines Western Blots ermittelte Immunreaktivität der Pflanzenprotein-Fraktion im Vergleich zu einem nativen Protein aus derselben Pflanze um mindestens 50% reduziert ist.
Verwendung der Pflanzenprotein-Fraktion nach einem der Ansprüche 16 bis 28 oder der mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 erhaltenen Pflanzenprotein Fraktion als Zutat für Lebensmittel oder Futtermittel.
EP17719814.0A 2016-04-08 2017-04-06 Techno-funktionelle pflanzenprotein-fraktion aus leguminosen oder ölsaaten Withdrawn EP3439490A1 (de)

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