JP2884045B2 - 鉄−ラクトフェリン複合体及びその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、広いpH域に対して安定
であり、かつ耐熱性を示す炭酸および／または重炭酸−
鉄−ラクトフェリン複合体及びその製造法に関する。本
発明の炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン
複合体は、鉄独特の収斂味を消し、鉄の持つ過酸化物生
成促進作用を防止するので、貧血の予防あるいは治療、
鉄強化あるいは病原菌付着防止を目的とした食品、医薬
品、飼料、化粧品原料等として有用である。

【０００２】

【従来の技術】ラクトフェリン（以下、Ｌｆという）に
は鉄吸収促進、過酸化脂質生成抑制、抗菌、抗ウィル
ス、細胞増殖、免疫系の制御など様々な生理機能が知ら
れている。そこでＬｆを含有する食品、医薬品、飼料、
化粧品などを製造する試みが色々なされている。このよ
うな製品の多くは加熱殺菌されたり、使用時に熱湯と接
触する場合がある。しかしながら、Ｌｆは熱に不安定で
あり、熱変性すると沈澱したり、鉄結合能を失いその生
理機能も失われてしまうという致命的な欠点があった。
そこで、Ｌｆの熱安定化に関する検討が行われ、pH４に
て加熱したＬｆは生のＬｆと同等に鉄を結合する能力を
有することが報告された(Davidson and Lonnerdal, Am.
J. Physiol. 257:G930-G934, 1989) 。しかし、このよ
うにして調製されたＬｆは保存中に次第に変性し、その
生理機能を失うという欠点があった。また、イオン強度
の低い条件でＬｆを加熱すると生理活性を維持し得るこ
とが知られている（特開平4-108629号公報) 。しかし、
実際の製品の系ではイオン強度は必ずしも低くない。そ
こでpHと電気伝導度Ωの関係が、Ｌｆの熱安定性におよ
ぼす影響が検討され、 log Ω ≦ (2.96/pH)＋ 0.64 (pH＜5) log Ω ≦ (29.37/pH) − 4.62 （５≦pH≦7.9) log Ω ≦−0.917 (pH＞7.9) となるようにＬｆ含有溶液を調整することによってＬｆ
の熱安定化を図る方法が開発された（特開平4-8269号公
報) 。しかし、この条件を満たさない場合には、この条
件に調整したＬｆ溶液と他の原料溶液を別々に殺菌し、
無菌的に両者を混合するという手段をとる必要がある。
ところが「乳および乳製品等に関する厚生省令」によれ
ば、全ての原料を混合後加熱殺菌することが定められて
おり、別々に殺菌することは実用的ではなかった。そこ
で本発明者らはさらに検討を重ねた結果、Ｌｆに鉄を十
分量結合吸着させることで、耐熱性を賦与させることが
可能となることを発見し、その製造方法について特許出
願を行った（耐熱性ラクトフェリン−鉄結合体およびそ
の製法 特開平6-239900号）。しかし、この発明におい
ても、次のような欠点を有していた。 １．製造されたＬｆはpH 7.1以上の環境下では沈澱す
る。 ２．製造されたＬｆはpH 6.5以上であってpH７以下の環
境下では可溶であり耐熱性もあるものの、Ｌｆに結合し
ている鉄が、Ｌｆ１分子あたり 150分子を越える場合に
は製造後、pH 6.5以上であってpH７以下の環境下に保存
しておくと徐々に不溶化する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
欠点を改善することを目的としてなされたものである。
すなわち、本発明は、広いpH範囲で長期間安定で、耐熱
性も有する鉄−Ｌｆ複合体およびその製造方法を提供す
ることを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討したところ、 1)炭酸イオンまたは重炭酸イオンを含有する溶液にＬｆ
類および鉄イオンを含有する溶液を加えて混合すると炭
酸または重炭酸−鉄−Ｌｆ複合体が形成されること、2)
この複合体は、炭酸イオンまたは重炭酸イオンを含有す
る溶液に、炭酸イオンまたは重炭酸イオンに対して特定
の比率のＬｆ類および鉄を含有する溶液を加えるという
手段をとることによって初めて形成され、得られる鉄を
高い比率で含有する複合体が広いpH範囲で長期間に亘り
安定で、しかも耐熱性を有し、さらに鉄独特の収斂味を
消し、鉄の持つ過酸化物生成促進作用を防止することを
見出して本発明を完成するに至った。すなわち本発明
は、Ｌｆ類１分子当り、鉄を15乃至1000分子、かつ炭酸
および／または重炭酸を15分子以上含有する、炭酸イオ
ンおよび／または重炭酸イオン−鉄−Ｌｆ複合体（以
下，鉄−Ｌｆ複合体と略記する）に関する。このような
鉄−Ｌｆ複合体は、pH 2.1以上 9.0以下で常温で少なく
とも１ケ月間沈澱を生じず、また加熱しても沈澱を生じ
ず、鉄独特の収斂味がないという性質を示す。

【０００５】そしてこのような複合体は、i)炭酸、また
はii) 重炭酸、またはiii)炭酸および重炭酸を含む溶液
（Ａ溶液）と、iv) 鉄およびv)ラクトフェリン類を含有
する溶液（Ｂ溶液）を混合することによって得られ、こ
のときＢ溶液のvi) 鉄イオンモル濃度は、vii)Ａ溶液
と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した溶液（反応溶
液）に溶解しているviii) 炭酸イオンおよび重炭酸イオ
ンのモル濃度の 1/3以下、好ましくは 1/10 、より好ま
しくは1/30、さらには1/60、最も好ましくは1/100であ
って、Ｂ溶液のix) ラクトフェリン類のモルの濃度は、
Ｂ溶液のx)鉄イオンモル濃度の1/15から1/1000である必
要がある。Ｂ溶液の鉄とラクトフェリン類はそれぞれ別
々に溶解した溶液をＡ溶液に混合して作成してもよい
し、Ａ溶液に別々に混合しても構わない。ただし、鉄溶
液をラクトフェリン類溶液より先に添加してはならな
い。また、反応は溶液内で行われる必要があるが、添加
する鉄またはラクトフェリン類のいづれか一方が固体状
であっても構わない。さらに、反応溶液中の炭酸イオン
および重炭酸イオンモル濃度を高く保つために、あらか
じめ、溶解しきれない量の炭酸および／または重炭酸塩
をＡ溶液に含有させておいてもよいし、Ａ溶液にＢ溶液
を添加している途中、つまり、Ｂ溶液の一部がＡ溶液に
添加されている階段の反応溶液にi)炭酸および／または
重炭酸塩、および／またはii) 炭酸および／または重炭
酸溶液を添加してもよい。

【０００６】また、Ａ溶液にＢ溶液を添加する際には、
Ａ溶液の炭酸および／または重炭酸塩、および／または
炭酸および／または重炭酸溶液のpHが徐々に減少する。
この際に、ごくたまに、製造中に沈澱を生じることがあ
る。Ｂ溶液のpHは８から９の間にあり、また、Ｌｆの等
電点が同じくpH８から９であること(E.N. ベーカー、ア
ドバンス イン オーガニック ケミストリー 41,390)
から、この現象はＬｆおよび／または鉄−Ｌｆ複合体が
等電点沈澱をおこしている可能性がある。これを避ける
ためには、ＡおよびＢ溶液の混合溶液のpHをＬｆの等電
点より高い値で保つか、ＡおよびＢ溶液の混合液のpHが
Ｌｆおよび／または鉄−Ｌｆ複合体の等電点より高いpH
で製造を終了させるか、Ｂ溶液のpHをＬｆの等電点以下
に調整してから、あるいは混合液のpHをＢ溶液添加中に
随時、等電点以下に調整することが好ましい。このよう
にすると、Ｌｆおよび／または鉄−Ｌｆ複合体の等電点
沈澱と思われる沈澱がおさえられ、特に工業規模で行う
生産の場合にはより確実に安定的に鉄−Ｌｆ複合体を製
造することができる。

【０００７】また、本発明の鉄−Ｌｆ複合体は、i)炭
酸、またはii) 重炭酸、またはiii)炭酸および重炭酸、
かつiv) ラクトフェリン類を含む溶液（Ａ溶液）と、
ｖ) 鉄を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合することによっ
ても得られ、このときＢ溶液のvi) 鉄イオンモル濃度
は、vii)Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した
溶液（反応溶液）に溶解しているviii) 炭酸イオンおよ
び重炭酸イオンのモル濃度の1/3 以下、好ましくは 1/1
0 、さらに好ましくは1/30、さらには1/60、最も好まし
くは1/100 以下であって、Ａ溶液のix) ラクトフェリン
類のモルの濃度は、Ｂ溶液のx)鉄イオンモル濃度の1/15
から1/1000である必要がある。この製法においても、等
電点付近で極くまれに起こる沈澱を防止するため、前記
した方法を使用することが好ましい。

【０００８】本発明において使用するＬｆ類にはヒトや
ウシなどの哺乳類の乳などの分泌液から分離されるラク
トフェリン、または血液や臓器などから分離されるトラ
ンスフェリン、卵などから分離されるオボトランスフェ
リンなどがある。これらはすでに大量に分離する方法が
いくつも知られているが、どのような方法で分離された
ものであってもよい。また、遺伝子操作によって微生
物、動物細胞あるいはトランスジェニック動物から生産
されたものであってもよい。また、これらＬｆ類は酵素
分解したものであってもよい。Ｌｆ類は完全に分離され
ている必要はなく、他の成分が含まれていても構わな
い。

【０００９】添加する鉄の量はＬｆ１モルに対して鉄イ
オンとして15モル以上、より好ましくは30モル以上、さ
らに好ましくは60モル以上であり、上限は1000モル以
下、好ましくは 480モル以下である。製造に要する時間
を短くするため又は、収率を落とさないためには 240モ
ル以下が好ましい。加える鉄量が前記の上限を越えると
鉄が沈澱してくる。使用する鉄剤は、脱イオン水に溶解
した時のpHが４以下を示す鉄塩、例えば塩化第２鉄、硝
酸第２鉄、硫酸第２鉄など、主に３価の鉄剤を例示でき
る。脱イオン水に溶解した時のpHが４を越える鉄塩、例
えば硫酸第１鉄などでは鉄−Ｌｆ複合体を形成すること
ができない。また、この時にpHを４以下に下げても鉄−
Ｌｆ複合体を形成することはできない。

【００１０】次に鉄剤の種類による熱安定性の違いを試
験例にて示す。

【試験例１】 （材料） （Ａ溶液）１モル／リットルの重炭酸ナトリウムを含む
pH 8.3の溶液１リットル （Ｂ１溶液）各種鉄剤を鉄として５ミリモル含む溶液
0.2リットル （Ｂ２溶液）Ｌｆ（オレオフィナ社製）33マイクロモル
を含む溶液 0.8リットル Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後（Ｂ溶液）、Ａ溶液にＢ溶
液を加え、鉄を結合したＬｆを作成した。この溶液を分
子量5000カットの限外濾過膜で脱塩・濃縮後、最終濃度
0.05モル／リットルのイミダゾール、0.15モル／リット
ルの食塩を含むpH 7.5の液状食品を模倣した緩衝液 (模
擬緩衝液) で 3.6ミリモル／リットルの鉄濃度となるま
で希釈し、90℃10分間加熱し、Ｌｆの沈澱の生成を観察
した。その結果を表１に示す。

【００１１】

【表１】 ──────────────────────────────────── 鉄 剤 鉄として 120μg/mlを脱イオン水に 沈澱の有無 溶解した時のpH ──────────────────────────────────── Fe(NO₃)₃ 2.7 無 し FeSO₄ 4.8 有 り FeCl₃ 2.7 無 し FeCl₂ 4.6 有 り Fe(SO₄)NH₄ 4.8 有 り Fe₂(SO₄)₃ 2.6 無 し ピロリン酸鉄 6.8 有 り クエン酸鉄 6.5 有 り フマル酸鉄 4.5 有 り FeSO₄ 4.8 → 2.7 (塩酸でpHを下げた) 有 り ──────────────────────────────────── このように、脱イオン水に溶解した時のpHが４以下の鉄
剤を使用しないと本発明の鉄−Ｌｆ複合体は形成できな
い。また、脱イオン水に溶解した時のpHが４を越える場
合に、そのpHを４以下に調整しても本発明の鉄−Ｌｆ複
合体は形成できない。

【００１２】炭酸または重炭酸を含むＡ溶液としては、
炭酸水、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭
酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム溶液およ
びそれらの混合溶液などを例示することが出来る。これ
らにpH調整剤として水酸化ナトリウム、アンモニア、水
酸化カリウム、塩酸、クエン酸、乳酸などを混合して使
用することができる。また、このＡ溶液には、それ以外
の物質、例えば、糖、蛋白質、脂肪などが含まれていて
も構わない。

【００１３】しかし、重要なことは反応時の鉄イオン濃
度と、炭酸イオンおよび重炭酸イオン濃度の比が、鉄−
Ｌｆ複合体の熱安定性に影響を及ぼす点である。このこ
とに関する試験例を示す。

【試験例２】 （材料） （Ａ溶液）各濃度の重炭酸ナトリウムを含む溶液１リッ
トル （Ｂ１溶液）塩化第二鉄を含む溶液 0.2リットル （Ｂ２溶液）Ｌｆ１ミリモルを含む溶液 0.8リットル Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合して溶液Ｂを作成し、Ａ溶液
にＢ溶液を１リットル加えて鉄を結合したＬｆを作成し
た。なお、Ｂ溶液は脱イオン水で希釈したものも用い
た。最終重炭酸イオンモル濃度を 0.6以上とする場合に
はＡ溶液とＢ溶液混合時に重炭酸ナトリウムを添加する
か、あらかじめＡ溶液に必要量の重炭酸ナトリウムを添
加し、飽和の溶液とした。この溶液を分子量5000カット
の限外濾過膜にて加水脱塩し、さらに濃縮した。そし
て、模擬緩衝液で 3.6ミリモル／リットルの鉄濃度とな
るまで希釈し、90℃10分間加熱し、Ｌｆの沈澱生成を観
察した。その結果を表２に示す。なお、表の最小重炭酸
イオン鉄イオン比は、Ａ溶液とＢ溶液混合後の重炭酸イ
オンモル濃度を、Ｂ溶液の鉄イオンモル濃度で除して算
出した。

【００１４】

【表２】 Ｂ１溶液に30ミリモルの鉄が含まれている場合 ──────────────────────────────────── 重炭酸イオンモル濃度 最小 ────────────── 沈澱の有無 重炭酸イオン／鉄イオン比 Ａ溶液 ＡＢ混合後 （モル濃度／モル濃度） ──────────────────────────────────── 1.0 0.5 無 し 16.67 0.8 0.4 無 し 13.33 0.6 0.3 無 し 10.00 0.4 0.2 やや有り 6.67 0.2 0.1 やや有り 3.33 0.1 0.05 有 り 1.67 ────────────────────────────────────

【００１５】

【表３】 Ｂ１溶液に 200ミリモルの鉄が含まれている場合であって、Ｂ溶液を 20倍希釈した場合（Ｂ溶液中に10ミリモル／リットルの鉄が含まれる） ─────────────────────────────────── 重炭酸イオンモル濃度 最小 ────────────── 沈澱の有無 重炭酸イオン／鉄イオン比 Ａ溶液 ＡＢ混合後 （モル濃度／モル濃度） ─────────────────────────────────── 飽 和 飽 和 無 し 1 2 0 以上 飽 和 1.2 無 し 1 2 0 飽 和 1.0 無 し 1 0 0 飽 和 0.8 ごくわずか有り 8 0 飽 和 0.7 ごくわずか有り 7 0 1.2 0.6 ごくわずか有り 6 0 1.0 0.5 やや有り 5 0 0.6 0.3 やや有り 3 0 0.3 0.15 有 り 1 5 ───────────────────────────────────

【００１６】以上のように、Ｂ溶液の鉄濃度を高めるに
つれて、ＡＢ混合溶液の重炭酸イオン濃度を高める必要
がある。このように、本発明の鉄−Ｌｆ複合体の調製に
あたっては、Ａ溶液にＢ溶液を添加して行く過程におい
て、添加した鉄１分子の周囲には少なくとも３分子、好
ましくは10分子以上の炭酸および／または重炭酸分子が
常に存在している必要がある。さらにいえば、Ｌｆ１分
子に 200分子を越える量の鉄分子を結合させる場合に
は、鉄１分子の周囲には30分子以上、好ましくは60分子
以上、より好ましくは 100分子以上の炭酸イオンおよび
／または重炭酸イオン分子が存在しているとよい。

【００１７】次に、本発明の鉄−Ｌｆ複合体には、どの
くらいの炭酸および／または重炭酸が結合しているかに
ついて次の検討を行った。

【試験例３】 （材料） （Ａ溶液）各濃度の重炭酸ナトリウムを含む溶液１リッ
トル （Ｂ１溶液）塩化第二鉄 100ミリモルを含む溶液 0.2リ
ットル （Ｂ２溶液）Ｌｆ１ミリモルを含む溶液 0.8リットル Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後（Ｂ溶液）、Ａ溶液にＢ溶
液を加え、４℃および37℃にて各反応時間、ゆっくり撹
拌して鉄を結合したＬｆを調製した。この溶液を模擬緩
衝液で 3.6ミリモル／リットルの鉄濃度となるまで希釈
し、90℃、10分間加熱し、Ｌｆの沈澱生成を観察した。
さらに、 192時間反応後の溶液を分子量5000カットの限
外濾過膜にて鉄を結合したＬｆと水溶液を分離し、膜を
透過した溶液中の炭酸イオンおよび重炭酸イオン濃度を
イオンクロマト法により分析した。その結果を表４及び
表５に示す。

【００１８】

【表４】 反応温度４℃の場合 ──────────────────────────────────── 最小重炭酸 濾過膜透過 重炭酸イオン イオン／ 液中の重炭 モル濃度 鉄イオン比 沈 澱 の 有 無 酸イオン濃 ──────── （モル濃度 ────────────── 度（ミリモ Ａ溶液 ＡＢ ／モル濃度） 反 応 時 間 ル／リット 混合後 2 24 48 96 192 ル） ──────────────────────────────────── 1.2 0.6 6 無し 無し 無し 無し 無し 0.4654 0.8 0.4 4 無し 無し 無し 無し 無し 0.2630 0.4 0.2 2 有り 無し 無し 無し 無し 0.0988 0.2 0.1 1 有り 有り 有り 無し 無し 0.0005 0.1 0.05 0.5 有り 有り 有り 有り 有り 0.0007 0.05 0.025 0.25 有り 有り 有り 有り 有り 0.0004 ────────────────────────────────────

【００１９】

【表５】 反応温度37℃の場合 ─────────────────────────────── 最小重炭酸 重炭酸イオン イオン／ モル濃度 鉄イオン比 沈 澱 の 有 無 ───────── （モル濃度 ─────────────── Ａ溶液 ＡＢ ／モル濃度） 反 応 時 間 混合後 2 24 48 96 192 ─────────────────────────────── 1.2 0.8 6 無し 無し 無し 無し 無し 0.8 0.4 4 無し 無し 無し 無し 無し 0.4 0.2 2 有り 有り 有り 有り 有り 0.2 0.1 1 有り 有り 有り 有り 有り 0.1 0.05 0.5 有り 有り 有り 有り 有り 0.05 0.025 0.25 有り 有り 有り 有り 有り ───────────────────────────────

【００２０】以上のように、低温下で長時間反応させる
と炭酸イオンおよび重炭酸イオン／鉄イオン比が１であ
っても本発明の鉄−Ｌｆ複合体を形成できる。しかし、
これ以上の低濃度であると長時間反応させても製造でき
ない。さらに 192時間反応後の限外濾過膜透過液中の炭
酸イオンおよび重炭酸イオン濃度が、最小重炭酸イオン
／鉄イオン比が１以下の場合、脱イオン水の濃度と同じ
であることより、Ａ溶液中の重炭酸は全て鉄−Ｌｆ複合
体と結合したものと考えられる。また、37℃で反応させ
た場合には、炭酸イオンおよび重炭酸イオン／鉄イオン
比が２以下では本発明の鉄−Ｌｆ複合体は形成できな
い。

【００２１】この結果から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体に
は炭酸および／または重炭酸イオンが結合鉄あたり１分
子以上含有しているものと考えられる。さらにこの鉄−
Ｌｆ複合体形成の反応速度を上げるためには炭酸イオン
および／または重炭酸イオン濃度を高めることが効果的
であることも明らかとなった。また、この例から、Ｂ溶
液のi)鉄イオンモル濃度が、ii) Ａ溶液と、Ｂ溶液の一
部または全部が混合した溶液（反応溶液）のiii)炭酸イ
オンおよび重炭酸イオンモル濃度と同等であっても、鉄
−Ｌｆ複合体を形成可能であることが明らかとなった。
しかしながら、この条件では、製造に極端に時間を要す
るため、実用的ではない。

【００２２】

【試験例４】さらに元素分析により鉄原子および炭素原
子のモル数を分析し、本発明の鉄−Ｌｆ複合体の特徴を
示す。モノクローナル抗体により精製した純度99％のウ
シＬｆ（東洋紡績社）はＬｆ溶液を 0.1％エチレンジア
ミン四酢酸を含む0.1 モル／リットル クエン酸溶液
（超純水）に対して分子量 10000カットの透析膜（スペ
クトロポア社）で３日間透析し、脱鉄し、超純水に対し
てさらに４日間透析を行い、完全に鉄を除去し、さらに
凍結乾燥を行った。１モル／リットルの重炭酸ナトリウ
ムを含むpH 8.3の溶液10ミリリットル（Ａ溶液）、塩化
第二鉄を 300マイクロモル含む溶液を２ミリリットル
(B1溶液) 、Ｌｆ 2.5マイクロモルを含む溶液８ミリリ
ットル（B2溶液）を調製した。B1溶液にB2溶液を混合し
（Ｂ溶液）、Ａ溶液にＢ溶液10ミリリットルを加え、鉄
−Ｌｆ複合体を調製し、試料１とした。同様にして、B1
溶液の塩化第二鉄を1.75ミリモルとして作製した鉄−Ｌ
ｆ複合体を試料２とした。また、脱鉄した未処理のＬｆ
を試料３とし、試料１、２および３は超純水に対して、
５日間分子量10000 カットの透析膜 (スペクトロポア
社) で透析し、凍結乾燥した。さらに、メノウ乳鉢で良
く粉化した後、45℃、48時間真空乾燥機により、水分を
除去した。得られた試料は原子吸光分析機 (ICP)により
鉄含有量、 CHN元素分析機により炭素含有量を分析し
た。

【００２３】

【表６】 ──────────────────────────── 試 料 ΔC¹⁾ Fe²⁾ ΔC/Fe (モル) (モル) (モル) ──────────────────────────── １ 60 117 0.5 ２ 71 706 0.1 ────────────────────────────¹⁾ （試料１モルあたりの総炭素原子モル数）−（Ｌｆ
（試料３）１モルあたりの総炭素原子モル数）²⁾ 試料の総鉄原子モル数

【００２４】以上の元素分析の結果から、本発明の鉄−
Ｌｆ複合体には通常のＬｆよりも多量の炭素原子および
鉄原子が結合していることが明らかとなった。また、本
実験系において、炭素原子が増えたのは、重曹から供給
されているとしか考えられず、炭酸イオンまたは重炭酸
イオンが鉄原子と結合していることが本試験例で示され
た。鉄分子に対する炭素原子の割合は 0.1以上であった
ことから、鉄原子１に対して炭酸イオンまたは重炭酸イ
オンが 0.1分子以上の割合で結合していることがわか
る。また、試験例３において鉄１分子に対して重炭酸イ
オンが１分子結合していることが考えられたので、製造
条件より鉄、炭素原子の結合割合は変化していると思わ
れる。いずれにしても、本試験例から、炭酸および／ま
たは重炭酸イオン、および鉄イオンが鉄−Ｌｆ複合体に
結合していることは明らかである。なお、試料３では鉄
原子は検出されず、透析により遊離の鉄はほとんどすべ
て除去されていることを確認した。

【００２５】

【試験例５】特開平 7-17875号公報ではＬｆ溶液に鉄塩
を添加した後、アルカリを加えてpHを上げ、次いでその
溶液から遊離の鉄を除去した後、溶液を蒸発させ、Ｌｆ
粉末として取り出すことからなるＬｆ１グラム当たり
2.1グラム以上の鉄を安定な状態で保持する鉄／Ｌｆ粉
末の製造方法について開示されている。また、特開平4-
141067号公報ではＬｆ１グラムに対して少なくとも 1.5
ミリグラム以上の割合の鉄に相当する鉄化合物を添加
し、Ｌｆと鉄を反応させて鉄／Ｌｆ溶液を調製する製造
方法について開示されている。本試験例ではこれらの鉄
／Ｌｆ溶液と本発明の鉄−Ｌｆ複合体との構造上の違い
について試験例で示す。

【００２６】使用したＬｆは試験例４で示したとおりに
脱鉄したものを使用した。本発明の鉄−Ｌｆ複合体は実
施例４の試料１と同様に調製し、試料１とした。特開平
7-17875号公報の鉄／Ｌｆ溶液はＬｆ 2.5マイクロモル
を含む溶液20ミリリットルに塩化第二鉄を100 マイクロ
モル添加した。さらに、この溶液に１モルの水酸化ナト
リウム水溶液を微量ずつゆっくり滴下し、pHが９になる
まで調製し、試料２とした。特開平4-141067号公報の鉄
／Ｌｆ溶液はＬｆ 2.5マイクロモルを含む溶液20ミリリ
ットルに鉄として硫酸第一鉄七水和物を 300マイクロモ
ル添加して作製し、試料３とした。さらに対照として脱
鉄したＬｆを同じく実施例４の方法で調製し、試料４と
した。得られた４つの試料は試験例４と同様に脱塩、凍
結乾燥、真空乾燥したのち、鉄原子を原子吸光分析機に
より、窒素、炭素および水素原子を CHN元素分析機によ
り分析した。

【００２７】

【表７】 ───────────────────────────── 試 料 ΔC¹⁾ ΔH²⁾ ΔN³⁾ Fe⁴⁾ （モル） （モル） （モル） （モル） ───────────────────────────── １ 60 303 0 117 ２ 3 23 0 19 ３ -10 -8 1 20 ─────────────────────────────¹⁾ （試料１モルあたりの総炭素原子モル数）−（Ｌｆ
（試料４）１モルあたりの総炭素原子モル数）²⁾ （試料１モルあたりの総水素原子モル数）−（Ｌｆ
（試料４）１モルあたりの総水素原子モル数）³⁾ （試料１モルあたりの総窒素原子モル数）−（Ｌｆ
（試料４）１モルあたりの総窒素原子モル数）⁴⁾ （試料１モルあたりの総鉄原子モル数）

【００２８】以上の結果から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体
（試料１）は、通常のＬｆと比較して炭素原子、水素原
子、および鉄原子が通常のＬｆよりも極めて多量に結合
していることがわかる。このことから、本発明の鉄−Ｌ
ｆ複合体は通常のＬｆとは異なる構造体を形成している
ことが明らかである。一方、特開平 7-17875号公報に開
示された鉄／Ｌｆ溶液（試料２）では水素原子で結合水
等の影響が出るため、ややばらつきが認められるもの
の、炭素原子、水素原子、窒素原子ともに通常のＬｆと
同じであり、鉄原子のみが増加していることから、本発
明の鉄−Ｌｆ複合体とは異なる状態で鉄が存在している
ことがわかる。さらに、特開平4-141067号公報の鉄／Ｌ
ｆ溶液も同様に、炭素原子、水素原子、窒素原子ともに
通常のＬｆと同じであり、鉄原子のみが若干増加してい
ることがわかる。以上のことから、構造上、本発明の鉄
−Ｌｆ複合体は特開平 7-17875号公報および特開平4-14
1067号公報の鉄／Ｌｆ溶液とは全く構造上違うものであ
ることが明らかである。

【００２９】一般にＬｆ、鉄および重炭酸塩を混合する
と鉄飽和型Ｌｆが生成することは、従来から知られてい
る。ＬｆはＮロープと呼ばれる領域とＣロープと呼ばれ
る類似した領域との二つの領域で構成されている。鉄は
この二つの領域のそれぞれに１分子づつ結合する。すな
わち、Ｎロープでは、Asp60, Tyr192, Tyr192, His253
の４個のアミノ酸残基に１分子の鉄イオンが結合し、さ
らにこの鉄にＣＯ₃ ^2-が１個結合している。Ｃロープに
おける同様な鉄結合部位はAsp395, Tyr435, Tyr528, Hi
s597である(B.F. Anderson et al., J. Mol. Biol. 20
9:711-734, 1989）。したがって、通常鉄飽和型Ｌｆと
いうのは、Ｌｆ１モル当たり鉄が２モル、ＣＯ₃ ^2-が２
モル結合している。また、鉄飽和型Ｌｆは鉄の結合して
いないＬｆに比べると若干安定性が増すが、65℃以上で
加熱すると沈澱してしまう。ところが本発明による鉄−
Ｌｆ複合体は鉄の結合量、炭酸および／または重炭酸の
結合量がいわゆる鉄飽和型Ｌｆよりはるかに多い。

【００３０】また、特開平4-141067号公報において、Ｌ
ｆに多量の鉄を添加すると鉄がＬｆに結合し非遊離状態
となり、鉄が安定化されることが示されているが、鉄を
多量に添加することによってＬｆに耐熱性が付与される
ことは何ら示されていない。また、同公報では炭酸イオ
ンまたは重炭酸イオンの必要性や炭酸・炭酸塩・重炭酸
塩を用いるということも何ら示されておらず、全ての実
施例においても炭酸・炭酸塩・重炭酸塩が使用されてい
ない。さらに、試験例５から鉄原子、炭素原子、水素原
子数が本発明の鉄−Ｌｆ複合体と明らかに異っている。
したがって本発明による鉄−Ｌｆ複合体とは全く異な
る。

【００３１】本発明の鉄−Ｌｆ複合体は、炭酸および／
または重炭酸の結合量、および鉄結合量がいわゆる鉄を
２分子結合した通常鉄飽和型Ｌｆより遥に多い。炭酸お
よび／または重炭酸、および鉄がＬｆの高次構造（３
次、４次）変化を起こしたり、炭酸および／または重炭
酸、および鉄がＬｆの周囲を取り囲んでいたりするもの
と考えられる。実際、通常鉄飽和Ｌｆを認識する抗Ｌｆ
抗体による本発明の鉄−Ｌｆ複合体の認識の程度は炭酸
および／または重炭酸と鉄がＬｆに結合するに従って、
低くなっていく。その様子を次に示す。

【００３２】

【試験例６】Ｌｆは、Ｌｆ溶液を0.1%エチレンジアミン
４酢酸を含むクエン酸緩衝液に対して透析し、脱鉄した
後、水に対して透析して凍結乾燥したものを用いた。１
モル／リットルの重炭酸ナトリウムを含むpH 8.3の溶液
１リットル（Ａ溶液）、塩化第二鉄を鉄イオンとして０
から 480ミリモルを含む溶液 0.2リットル（Ｂ１溶
液）、Ｌｆ１ミリモルを含む溶液 0.8リットル（Ｂ２溶
液）を調製した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、１〜 1
00倍に脱イオン水で希釈した（Ｂ溶液）。Ａ溶液にＢ溶
液１リットルを加え、鉄を結合したＬｆを調製した。こ
の溶液を模擬緩衝液で倍々に希釈した。一方、 ELISA用
プレートに抗ウシＬｆ抗体をコートした後に、ブロック
エース（大日本製薬（株）販売）でブロッキングした。
先に調製したＬｆ溶液を添加し、室温にて１時間反応さ
せた後、パーオキシダーゼを標識した抗ウシＬｆ抗体を
反応させた。よく洗浄した後にABTS基質を加え、405nm
の吸光度を測定した。このように、鉄がＬｆに対して２
分子結合しているときは、鉄がない場合と同様に認識さ
れるのに対して、鉄量が増えるにしたがって、抗体で認
識されなくなった。その結果を表８に示す。なお、表の
認識率とは、鉄を結合したＬｆの溶液に含有されるＬｆ
量に対する、本測定法で定量されるＬｆ量の比率をい
う。

【００３３】

【表８】 ─────────────────────────── 鉄（モル／モル Ｌｆ） 抗体での認識率 (%) ─────────────────────────── 0 1 0 0 2 1 0 0 1 5 9 0 3 0 8 6 6 0 8 2 9 0 6 0 1 2 0 3 1 1 5 0 1 9 2 4 0 1 4 4 8 0 1 4 ───────────────────────────

【００３４】さらに本発明の鉄−Ｌｆ複合体は、特開平
6-239900号あるいは特開平4-141067号の鉄／ＬｆとpH安
定性の面でも異なっている。このことを次の試験例で示
す。

【試験例７】本発明の鉄−Ｌｆ複合体の作製は試験例６
と同様に行った。特開平6-239900号の鉄−Ｌｆ結合体
は、Ｌｆ 33.75マイクロモル／リットルの水溶液に塩化
第２鉄を鉄として 0.5〜16.2ミリモル／リットルとなる
よう添加し、重炭酸ナトリウムでpHを 6.2に調整して作
製した。特開平4-141067号の鉄／Ｌｆ溶液は、12.5マイ
クロモル／デシリットルとなるようＬｆを溶解した水溶
液に硫酸第１鉄７水和物を鉄として 187〜6000マイクロ
モル／デシリットル溶解して作製した。この際、炭酸イ
オンおよび／または重炭酸イオンを発生する炭酸・炭酸
塩・重炭酸塩などは使用していない。このように３つの
方法で作製した各試料を分子量5000カットの限外濾過膜
にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝液（pH 6.4あるいは 7.2）
にて、Ｌｆとして125 マイクロモル／リットルとなるよ
う希釈した。pHを 6.5と 7.3にそれぞれ調整し、ネジ口
付き試験管に密封した後、90℃、10分間加熱し、室温ま
で自然冷却した後に、3,000rpm、10分間遠心分離し、上
清中のＬｆ含量を測定した。なお、この測定にはBioRad
社製 Protein Assay Kitを使用した。上清に残存してい
るＬｆの割合を表９に示す。

【００３５】

【表９】 ──────────────────────────────────── 特開平4-141067 特開平6-239900 本発明 Fe／Lfモル比 ───────── ───────── ──────── pH6.5 pH7.3 pH6.5 pH7.3 pH6.5 pH7.3 ──────────────────────────────────── 15 5% 6% 80% 43% 100% 100% 30 7 6 84 40 100 100 60 4 3 97 54 100 100 120 6 1 98 38 100 100 150 5 4 81 27 100 100 240 9 2 79 21 100 100 480 2 6 80 13 98 89 ────────────────────────────────────

【００３６】このように、本発明ではpH 6.5あるいは
7.3のいずれにおいても耐熱性を示したが、特開平6-239
900号ではpH 6.5では耐熱性を示したものの、pH 7.3で
は耐熱性を示さなかった。また、特開平4-141067号では
pH 6.5および 7.3のいずれにおいても耐熱性を示さなか
った。

【００３７】

【試験例８】塩濃度の低い領域では、通常のＬｆでも耐
熱性があることが知られている（特開平4-8269号）。以
下に、本発明の鉄−Ｌｆ複合体のみが塩濃度の高い領域
で耐熱性があることを示す。本発明の鉄−Ｌｆ複合体の
作製は、試験例６と同様に行った。特開平6-239900号の
鉄−Ｌｆ結合体および、特開平4-141067号の鉄／Ｌｆ溶
液の作製は試験例７と同様に行った。また、特開平7-17
875 号の鉄／Ｌｆ溶液は、ＡおよびＢ法の２通りについ
て作製した。Ａ法では12.5マイクロモル／デシリットル
となるようＬｆを溶かした水溶液に、塩化第二鉄を鉄と
して 0.5〜16.2ミリモル／リットルとなるように添加
し、さらに1N水酸化ナトリウムでpHを 9.0に調整して作
製した。Ｂ法では12.5マイクロモル／デシリットルとな
るようにＬｆを溶かした50ミリモル／リットル シュウ
酸アンモニウム溶液（pH8.0)に溶解し、塩化第二鉄を
0.5〜16.2ミリモル／リットルとなるように添加し、1N
水酸化ナトリウムでpHを 9.0に調整し作製した。このよ
うに５つの方法で作製した各試料を分子量分画10,000カ
ットの限外濾過膜（アドバンテック社）にて脱塩、濃縮
し、Ｌｆとして 250マイクロモル／リットルとなるよう
に超純水で希釈した。この時の電気伝導度は 0.2ミリジ
ーメンス／センチメートルであった。さらに模擬緩衝液
（pH7.0)で４倍に希釈し、さらに塩濃度を上げるために
30ミリモル／リットルになるように食塩をそれぞれ添加
した。ネジ口付き試験管に密封した後、90℃、10分間加
熱し、Ｌｆの沈澱生成を観察した。沈澱の認められない
ものを０、沈澱のやや認められるものを１、沈澱の多い
もの、および鉄／Ｌｆ溶液作成中にすでに沈澱を生じた
ものを２とした。

【００３８】

【表１０】 ─────────────────────────────────── Fe/Lf比 特開平4-141067 特開平7-17875 特開平6-239900 本発明 Ａ法 Ｂ法 30 2 2 2 0 0 60 2 2 2 0 0 120 2 2 2 0 0 150 2 2 2 1 0 240 2 2 2 2 0 ───────────────────────────────────

【００３９】Ｌｆはイオン強度が低い場合、耐熱性があ
ることが既に開示されている（特開平4-8269号）。この
なかで、Ｌｆ水溶液又は鉄結合型Ｌｆの加熱殺菌が可能
な電気伝導度範囲を以下の式によって開示している。 LogΩ≦2.96/pH+0.64 (pH<5) LogΩ≦29.37/pH-4.62 (5≦pH≦7.9) LogΩ≦-0.917 (pH>7.9) ただし、Ωは電気伝導度（ミリジーメンス／センチメー
トル）を示す。例えば、本試験例で脱塩後のpHは約 7.0
であったので、pH 7.0における通常のＬｆの加熱殺菌可
能な電気伝導度範囲を計算すると、以下の通りになる。
式より LogΩ≦29.37/7-4.62 ≦-0.42 これより Ω≦10^-4.62 ≦0.38

【００４０】すなわち、電気伝導度0.38ミリジーメンス
／センチメートル以下であれば、殺菌することが可能で
あることが既に明らかとなっている。従って、通常の脱
塩処理によって、Ｌｆは加熱殺菌が可能となる。各試料
は異なる調製法であるため、一度全て脱塩し、再度食塩
にて塩濃度を上げて同一条件で、その耐熱性試験を行っ
た。今回行った脱塩処理では 0.2ミリジーメンス／セン
チメートルまで脱塩し、0.03モル／リットルの食塩を添
加し、耐熱性試験を行ったものである。この時の電気伝
導度は0.53ミリジーメンス／センチメートルであった。
この値はよりも高い値であり、通常のＬｆでは耐熱性
が認められない領域である。表１０から、本発明の鉄−
Ｌｆ複合体においては沈澱が認められず、熱に対して通
常のＬｆとは異なる高い熱安定性をもつことを示した。
また、特開平6-239900号でも通常のＬｆと異なる高い熱
安定性を示したが、Fe／Lf比が高いところでは不安定に
なった。特開平4-141067号および、特開平7-17875 号で
はいずれも沈澱したことから、通常のＬｆと同程度の耐
熱性しかもたないことが示された。このことから、本発
明の鉄−Ｌｆ複合体は通常のＬｆおよび他の開示された
鉄／Ｌｆ溶液とは異なる構造をとって高い耐熱性を示し
ていることがわかる。

【００４１】また、本発明の組成物のより高い電気伝導
度における耐熱性については試験例９に示す。

【試験例９】試験例６と同様にして鉄−Ｌｆ複合体を調
製した。ただし、Ｂ１液の鉄含量は1000ミリモルまでと
した。この溶液を分子量5000カットの限外濾過膜で脱塩
・濃縮した後、模擬緩衝液でＬｆ含量として 625マイク
ロモル／リットルとなるよう希釈した。この場合の模擬
緩衝液は、pH 2.0〜3.5 はグリシン−塩酸、pH 3.5〜6.
0 は酢酸、pH 6.0〜7.8 はイミダゾール−塩酸、pH 7.8
〜 9.3はホウ酸−塩化カリウム−水酸化ナトリウムを緩
衝剤とした。また、電気伝導度の調整は塩化ナトリウム
を用いた。これをネジ口付き試験管に密封した後、90
℃、10分間加熱し、室温まで自然冷却した後に、3,000r
pm、10分間遠心分離、上清中のＬｆ含量を測定した。な
お、この測定にはBioRad社製 Protein Assay Kitを使用
した。上清に残存しているＬｆの割合を表１１及び表１
２に示す。

【００４２】

【表１１】 電気伝導度が５ミリジーメンス／センチメートルの場合 ────────────────────────────────── Fe／Lf ｐＨ モル ───────────────────────────── 比 2.0 2.1 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.8 9.0 9.2 ────────────────────────────────── 10 59 58 57 52 50 46 33 38 31 32 34(%) 15 50 73 74 72 71 75 76 80 77 72 45 30 46 82 91 95 96 97 99 100 100 100 36 60 51 95 93 97 98 100 100 100 100 100 43 120 54 97 100 100 100 100 100 100 100 100 39 240 32 99 100 100 100 100 100 99 99 97 40 480 21 92 93 96 100 100 100 98 96 93 47 1000 20 76 77 78 79 78 95 94 92 92 39 1200 19 32 28 31 33 27 29 30 24 33 32 ──────────────────────────────────

【００４３】

【表１２】 電気伝導度が 150ミリジーメンス／センチメートルの場合 ────────────────────────────────── Fe／Lf ｐＨ モル ────────────────────────────── 比 2.0 2.1 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.8 9.0 9.2 ────────────────────────────────── 10 51 50 52 53 49 46 37 34 31 32 31(%) 15 44 70 71 72 70 73 72 73 72 64 40 30 41 73 82 85 85 85 87 88 89 87 34 60 45 84 82 84 85 87 89 88 90 89 36 120 47 87 89 90 90 90 90 92 91 88 34 240 28 88 89 90 90 90 90 89 90 87 35 480 20 79 82 83 81 83 86 85 82 80 41 1000 18 66 68 68 70 69 84 83 80 79 34 1200 19 26 26 28 30 27 26 27 25 29 26 ──────────────────────────────────

【００４４】このようにＬｆ１分子に対して、鉄が１５
分子以上1000分子以下でないと耐熱性が得られず、この
範囲内であれば、pH2.1 から9.0 の範囲で耐熱性が確認
された。さらに言えば、Ｌｆ１分子に対して、鉄が１５
分子よりも３０分子のほうが耐熱性が高く、３０分子よ
りも６０分子、６０分子よりも１２０分子のほうがさら
に耐熱性が高い。また、Ｌｆ１分子に対して、鉄が1000
分子よりも480 分子、480 分子よりも240 分子のほうが
耐熱性が高い。Ｌｆ１分子に対して、鉄が1000分子結合
している場合は、pH５以下よりpH５を超える場合のほう
が耐熱性が高い。特開平6-239900号の方法にて製造され
た鉄−Ｌｆ結合体は鉄が720 分子以上Ｌｆに結合するこ
とができず沈澱するが、本発明では1000分子の鉄を結合
することができるので、この点からも本発明の鉄−Ｌｆ
複合体と特開平6-239900号の方法にて製造された鉄−Ｌ
ｆ結合体は異なっているといえる。特開平4-8269号では
Ｌｆの配合された飲料を殺菌する場合、製品の最終pHは
電気伝導度Ωの関係が、 log Ω（ミリジーメンス／センチメートル）＞ (2.96/p
H)＋ 0.64 (pH＜5) log Ω＞ (29.37/pH) − 4.62 （５≦pH≦7.9) log Ω＞ −0.917 (pH＞7.9) であるような場合でないと沈澱を生じたり、Ｌｆが鉄を
結合できなくなるような変性を受けるとしている。

【００４５】本発明によって得られた鉄−Ｌｆ複合体を
配合した製品を製造する場合、150ミリジーメンス／セ
ンチメートルであって、pHが2.1 から9.0 の範囲であっ
ても耐熱性を有する極めて安定な鉄−Ｌｆ複合体である
ため、ΩとpHの関係が上に記した関係以外の場合であっ
ても製造上、全く問題を生じない。

【００４６】次に、本発明と特開平6-239900号、特開平
7-17875 号及び特開平4-141067号との保存安定性の違い
を示す。

【試験例１０】試験例７、試験例８および試験例９と同
様に鉄−Ｌｆ複合体、鉄−Ｌｆ結合体および鉄／Ｌｆ溶
液を作製し、試験例９と同様に脱塩して５ミリジーメン
スとなるよう電気伝導度を調整した。遠心処理した各試
料を密封して90℃、10分間加熱した後、室温（37℃) で
一ヵ月保存した。その後の沈澱量を目視にて判定した。
沈澱の認められないものを０、沈澱がやや認められるも
のを１、沈澱が多いものを２とした。なお、特開平7-17
875 号については、保存期間３週間で行った。試験例７
の鉄−Ｌｆ結合体および鉄／Ｌｆ溶液の結果を表１３
に、試験例９の鉄−Ｌｆ複合体の結果を表１４に、それ
ぞれ示す。

【００４７】

【表１３】

【００４８】

【表１４】 ───────────────────────────────── Fe／Lf ｐＨ モル ──────────────────────────── 比 2.0 2.1 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.8 9.0 9.2 ───────────────────────────────── 10 2 2 2 2 2 1 1 1 2 2 2 15 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 30 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 60 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 120 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 240 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 480 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1000 2 1 1 1 1 0 0 0 0 0 2 1200 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 ─────────────────────────────────

【００４９】表１３および１４から、本発明の鉄−Ｌｆ
複合体はpH 2.1から 9.0の範囲において、90℃、10分の
熱ストレスを与えた後であっても、常温で高い保存安定
性を有していた。表１３から本発明の鉄−Ｌｆ複合体
は、他の特許に開示されたＬｆにはない保存安定性があ
ることがわかる。特開平6-239900号ではpH 6.5ではFe/L
f モル比が150以下であれば安定であるが、pH 7.3では
保存安定性がないことがわかる。また、特開平4-141067
号のＬｆ溶液はpH 6.5および 7.3において、すでに耐熱
性がないため、当然のことながら保存安定性を欠いてい
た。また、特開平7-17875 号においても、ＡおよびＢ法
ともに保存安定性は認められなかった。

【００５０】本発明によって得られたＬｆを配合した製
品を製造する場合、その製造工程については特に制限は
ない。殺菌は、通常実施されている工程に従い処理し、
加熱殺菌あるいは滅菌する。加熱処理は65℃、30分間の
低温殺菌、 120℃、２〜３秒間、 140〜 150℃、３〜５
秒間、あるいはレトルト処理も可能である。また、乾燥
すればＬｆ含有粉末製品を得ることが出来る。凍結乾燥
でもよいが、大量に処理する場合には乾燥コストの安い
噴霧乾燥が適している。再溶解させることを目的とした
場合には、脱脂乳、乳清、カゼイン、ゼラチン、ショ
糖、澱粉などに混合すると溶解性が向上する。このよう
にして得られたＬｆ含有製品は鉄が含まれているので、
貧血予防あるいは治療を目的とした食品、飼料、医薬品
に特に適している。特に、鉄の収斂味を完全に抑えるの
で、鉄強化食品や経口投与の医薬品への鉄材として優れ
ている。さらに鉄の過酸化物生成促進作用を防止する性
質もあるため、脂肪など酸化され易い食品などへの鉄材
として利用価値が高い。

【００５１】

【試験例１１】試験例７と同様にして鉄−Ｌｆ複合体、
鉄−Ｌｆ結合体および鉄／Ｌｆ溶液を調製した。但し、
Ｌｆの終濃度は13.2マイクロモル／リットルとし、添加
した鉄剤の終濃度は鉄量として1.98ミリモル／リットル
となるよう調製した。なお、鉄剤としては、本発明の鉄
−Ｌｆ複合体及び特開平6-239900号の鉄−Ｌｆ結合体で
は塩化第二鉄を使用し、特開平4-141067号のＬｆ溶液で
は硫酸第一鉄を使用した。また、対照として、1.98ミリ
モル／リットル塩化第二鉄水溶液、1.98ミリモル／リッ
トル硫酸第一鉄水溶液、1.98ミリモル／リットル塩化第
二鉄を含む13.2マイクロモル／リットルＬｆ水溶液を調
製した。試料番号７は、1.98ミリモル／リットル塩化第
二鉄及び13.2マイクロモル／リットルＬｆを重炭酸ナト
リウム水溶液に同時に添加したものであり、本発明の製
造法に従わずに製造した試料である。得られた各試料
は、分子量10000 カットのモルカット（ミリポア社）に
１ミリリットル添加し、脱塩した。それぞれの試料につ
いて、リテンテート量が0.2 ミリリットルになったとこ
ろで１ミリリットル加水し、総計６ミリリットル加水し
た。得られたリテンテート及びパーミエートについて
は、原子吸光分析機（ＩＣＰ）により鉄含量を測定し
た。なお、示したモル濃度は全て終濃度で示した。ま
た、リテンテート鉄残存率は次式より求めた。 リテンテート鉄残存率（％）＝｛リテンテート鉄総量÷
（リテンテート鉄総量＋パーミエート鉄総量）｝×１０
０

【００５２】さらに、鉄の収斂味については、調製した
試料を限外濾過膜で処理する前に試験した。結果を表１
５に示す。 試料１：本発明の鉄−Ｌｆ複合体 試料２：特開平6-239900号の鉄−Ｌｆ結合体 試料３：1.98ミリモル／リットル塩化第二鉄含有13.2マ
イクロモル／リットルＬｆ水溶液 試料４：特開平4-141067号のＬｆ溶液 試料５：1.98ミリモル／リットル塩化第二鉄水溶液 試料６：1.98ミリモル／リットル硫酸第一鉄水溶液 試料７：1.98ミリモル／リットル塩化第二鉄及び13.2マ
イクロモル／リットルＬｆ含有重炭酸ナトリウム水溶液

【００５３】

【表１５】 ─────────────────────────────── 試料番号 リテンテート鉄残存率(%) 収斂味 ─────────────────────────────── １ 99.3 な し ２ 98.1 な し ３ 25.3 あ り ４ 10.9 あ り ５ 6.2 あ り ６ 3.9 あ り ７ 23.2 あ り ───────────────────────────────

【００５４】試料５及び試料６において全ての鉄はパー
ミエートに移行しており、水溶液中で使用した鉄剤が分
子量10000 カットの膜を透過したことが判った。一方、
試料１及び試料２では全ての鉄がリテンテートに残存し
ており、鉄がＬｆと結合し、分子量10000 カットの膜を
透過しなかったことが判った。また、試料３は鉄及びＬ
ｆ混合物を重炭酸ナトリウム水溶液に添加する前の状態
を示すものであるが、多くの鉄が遊離状態で存在し、鉄
はパーミエートに移行している。さらに、試料７におい
ては、単に塩化第二鉄、Ｌｆ及び重炭酸ナトリウムを同
時に接触させるだけでは遊離の鉄が多量に存在すること
を示している。

【００５５】以上の結果から、本発明の鉄−Ｌｆ複合体
を調製するに際しては、重炭酸ナトリウム水溶液が必要
であり、かつ、その調製手順も重要であることが改めて
確認された。なお、試料４においては、鉄は殆どパーミ
エートに移行しており、遊離の状態であることが判っ
た。鉄の収斂味（鉄味）については、試料１及び試料２
では認められなかったが、他の試料では認められた。

【００５６】つぎに呈味性の成績を示す。

【試験例１２】試験例７と同様に、３つの方法で作成し
た各種鉄／Ｌｆ混合溶液を分子量5000カットの限外濾過
膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝液（pH 6.8）にて鉄イオ
ンとして 13 ミリグラム/100ミリリットルおよび26ミリ
グラム/100ミリリットルとなるよう蒸留水で希釈した。
このようにして得られた試料について、以下のような官
能評価試験を行った。男５女５名のパネラーに模擬緩衝
液を対照として各試料の収斂味を感じるかどうかを判定
させた。パネラーには目隠しをし、外見による判断要因
を与えないよう配慮した。一試料のための試験は、対
照、試料の順に試飲させ、一試料評価後、最低一日の間
隔をあけて、次の試料を評価するための試験を実施し
た。また、試料評価の日間偏差をなくすため、各パネラ
ー毎に試料評価の順番をランダム化した。その結果、パ
ネラー10人のうちで収斂味を感じた人数を表１６に示
す。

【００５７】

【表１６】 ──────────────────────────────────── 特開平4-141067 特開平6-239900 本発明 Fe／Lfモル比 ───────── ───────── ───────── 鉄濃度（ミリグラム/100ミリリットル） 13 26 13 26 13 26 ──────────────────────────────────── 15 10人 10人 0人 0人 0人 0人 30 10 10 0 0 0 0 60 10 10 0 0 0 0 150 10 10 0 3 0 0 240 10 10 1 4 0 0 480 10 10 1 6 0 0 ────────────────────────────────────

【００５８】以上のように、本発明は鉄の収斂味を全く
感じさせない優れたマスキング効果を有することが明ら
かとなった。また、特開平6-239900号では鉄濃度が26ミ
リグラム/100ミリリットルであってFe／Lfモル比が 150
を超える場合に収斂味を感じるパネラーが認められ、特
開平4-141067号では全ての場合においてパネラー10人全
員が収斂味を認めた。

【００５９】

【試験例１３】試験例９と同様に鉄−Ｌｆ複合体を分子
量5000カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝
液にて、鉄イオンとして26ミリグラム/100ミリリットル
となるよう希釈し、９０℃１０分間の殺菌を施した。こ
のようにして得た試料を試験例１２と同様の方法にて官
能評価試験した。

【００６０】

【表１７】 ───────────────────────────────── Fe／Lf ｐＨ モル ──────────────────────────── 比 2.0 2.1 2.5 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.8 9.0 9.2 ───────────────────────────────── 10 10 9 8 8 7 6 6 5 6 8 10 15 10 3 2 2 1 0 0 0 0 1 10 30 10 1 0 0 0 0 0 0 0 0 10 60 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 120 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 240 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 480 10 2 1 1 1 1 0 0 0 0 10 1000 10 3 2 2 2 1 0 0 0 0 10 ──────────────────────────────────

【００６１】以上のように、本発明の鉄−Ｌｆ複合体
は、Ｌｆ１分子に対して鉄が１５分子以上1000分子以下
結合したものであれば、それを取り巻く環境がpH2.1 か
らpH9.0 の範囲であれば、鉄の収斂味を抑制する効果を
持っていた。この時、Ｌｆ１分子に対して鉄が480 分子
以上結合し、pH2.1 からpH5.0 の範囲で若干の収斂味を
数名が感じたが、鉄含量を13ミリグラム／100 ミリリッ
トルとすると１０名のパネラーの内、収斂味を感じたも
のはいなかった。

【００６２】

【実施例１】重炭酸ナトリウム1.2 モルとＬｆ（ＤＭＶ
社製）１０マイクロモルを含む溶液１リットル（Ａ）。
硫酸第二鉄を鉄イオンとして1.5 ミリモルを含む溶液１
リットル（Ｂ）を作成した。ＡにＢを加え、鉄を結合し
たＬｆを作成した。この試料を分子量5000カットの限外
濾過膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩衝液（pH8.9)にて、鉄
濃度が２６ミリグラム／100 ミリリットルとなるよう希
釈した。これをネジ口付き試験管に密封した後、９０℃
１０分間加熱し、室温まで自然冷却した後、室温にて１
か月保存した。沈澱を肉眼にて判定したところ、全く認
められなかった。さらに試験例１２と同様の方法にて官
能評価試験を実施したところ、パネラー１０名のうちで
収斂味を感じたものは一名も認められなかった。

【００６３】

【実施例２】炭酸カルシウム0.05モル、重炭酸アンモニ
ウム 1.2モルを含む溶液１リットルを塩酸にてpH 7.8に
調製した（Ａ溶液）。硫酸第二鉄を鉄イオンとして 1.5
ミリモルを含む溶液 0.2リットル（Ｂ１溶液）、トラン
スフェリン（アポ型、高純度、牛血漿製、和光純薬工
業）10マイクロモルを含む溶液 0.8リットル（Ｂ２溶
液）を作成した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、Ａ溶液
にＢ１／Ｂ２混合液を加え、鉄を結合したトランスフェ
リンを形成させた。鉄−トランスフェリン結合溶液を分
子量5000カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮し、模擬緩
衝液（pH 6.8）にて、鉄濃度が26ミリグラム/200ミリリ
ットルとなるよう希釈した。これをネジ口付き試験管に
密封した後、90℃、10分間加熱し、室温まで自然冷却し
た後、37℃にて１か月保存した。沈澱を肉眼にて判定し
たところ、全く認められなかった。さらに試験例12と同
様の方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー
10名のうちで収斂味を感じたものは１名も認められなか
った。

【００６４】

【実施例３】炭酸ナトリウム 0.5モル、重炭酸カリウム
0.7モルを含む溶液１リットルを酢酸にてpH 8.3に調製
した（Ａ溶液）。硝酸鉄(III) を鉄イオンとして 1.5ミ
リモルを含む溶液 0.2リットル（Ｂ１溶液）、オボトラ
ンスフェリン（タイプＩＶ、粗、卵白製、無鉄、シグマ
社）10マイクロモルを含む溶液 0.8リットル（Ｂ２溶
液）を作成した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、Ａ溶液
にＢ１／Ｂ２混合液を加え、鉄を結合したオボトランス
フェリンを作成した。鉄−オボトランスフェリン結合溶
液を分子量5000カットの限外濾過膜にて脱塩・濃縮し
た。これを模擬緩衝液 (pH 6.2) にて、鉄濃度が26ミリ
グラム/200ミリリットルとなるよう希釈した。これをネ
ジ口付き試験管に密封した後、90℃、10分間加熱し、室
温まで自然冷却した後、37℃にて１か月保存した。沈澱
を肉眼にて判定したところ、全く認められなかった。さ
らに試験例12と同様の方法にて官能評価試験を実施した
ところ、パネラー10名のうちで収斂味を感じたものは１
名も認められなかった。

【００６５】

【実施例４】重炭酸ナトリウム1.0 モルを含む溶液１リ
ットルを作製した（Ａ溶液）。塩化第二鉄を鉄イオンと
して１ミリモルを含む溶液 0.2リットル (B1溶液) 、ウ
シラクトフェリン(ULN社製）10マイクロモルを含む 0.8
リットル (B2溶液) を作製した。B1とB2を混合後、Ａ溶
液にB1/B2 混合液を加えた。溶液のpHを 8.5に維持する
ために、適時重炭酸ナトリウムを添加し、鉄−Ｌｆ複合
体を作製した。得られた、鉄−Ｌｆ複合体を脱塩を行わ
ずに90℃10分間加熱し、室温まで自然冷却した。この状
態で沈澱は認められなかった。さらに、37℃で一ヵ月間
保存し、再び、沈澱を肉眼で判定したところ、全く認め
られなかった。さらに、試験例12と同様の方法にて官能
評価試験を実施したところ、パネラー10名のうちで収斂
味を感じたものは１名も認められなかった。

【００６６】

【実施例５】重炭酸ナトリウム0.8 モルを含む溶液１リ
ットルを作製した（Ａ溶液）。硫酸第二鉄を鉄イオンと
して１ミリモルを含む溶液 0.2リットル（B1溶液) 、ウ
シラクトフェリン(ULN社製) 10マイクロモルを含む 0.8
リットル (B2溶液) を作製した。B1とB2を混合後、Ａ溶
液にB1/B2 混合液を加え、鉄−Ｌｆ複合体を作製した。
得られた鉄−Ｌｆ複合体を脱塩を行わずに90℃10分間加
熱し、室温まで自然冷却した。この状態で沈澱は認めら
れなかった。さらに、37℃で一ヵ月間保存し、再び、沈
澱を肉眼で判定したところ、全く認められなかった。さ
らに、試験例12と同様の方法にて官能評価試験を実施し
たところ、パネラー10名のうちで収斂味を感じたものは
１名も認められなかった。

【００６７】

【実施例６】炭酸ナトリウム1.0 モルを含む溶液１リッ
トルに2N塩酸でpHを 8.0まで下げてＡ溶液を作製した。
硫酸第二鉄を鉄イオンとして１ミリモルを含む溶液 0.2
リットル (B1溶液) 、ウシラクトフェリン(ULN社製) 10
マイクロモルを含む 0.8リットル (B2溶液) を作製し
た。B1とB2を混合後、Ａ溶液にB1/B2 混合液を加え、鉄
−Ｌｆ複合体を作製した。得られた、鉄−Ｌｆ複合体を
脱塩を行わずに90℃10分間加熱し、室温まで自然冷却し
た。この状態で沈澱は認められなかった。さらに、37℃
で一ヵ月間保存し、再び、沈澱を肉眼で判定したとこ
ろ、全く認められなかった。さらに、試験例12と同様の
方法にて官能評価試験を実施したところ、パネラー10名
のうちで収斂味を感じたものは１名も認められなかっ
た。

【００６８】

【実施例７】重炭酸ナトリウムを24モル含む溶液８リッ
トル（溶けきらない塩が沈澱している）を調製した（Ａ
溶液）。塩化第二鉄を鉄イオンとして20ミリモルを含む
溶液２リットル（Ｂ１溶液）、ラクトフェリン (タツア
バイオロジックス社製) 100マイクロモルを含む溶液８
リットル（Ｂ２溶液）を作成した。Ｂ１溶液とＢ２溶液
を混合後、Ａ溶液を良く撹拌しながら、Ａ溶液にＢ１／
Ｂ２混合液を加え、鉄を結合したラクトフェリンを形成
した。この溶液を分子量5000カットの限外濾過膜にて加
水脱塩後、同様の膜で１リットルにまで濃縮した。これ
を20リットルの還元脱脂乳（脱脂粉乳 100グラムを水１
リットルの比率で還元）に、鉄濃度が26ミリグラム/200
ミリリットルとなるよう添加した。これを撹拌混合後、
プレート型殺菌機を用いて 120℃にて２秒間殺菌し直ち
に５℃に冷却した後、低温（10℃）にて２週間保存し
た。一部を3,000rpm、10分間遠心分離し沈澱を肉眼にて
判定したところ、全く認められなかった。さらに試験例
10と同様の方法にて官能評価試験を実施した。ただし、
対照は還元脱脂乳を同様の条件にて殺菌・保存したもの
を用いた。パネラー10名のうちで収斂味や味・香りなど
に異常を感じたものは１名も認められなかった。

【００６９】

【実施例８】実施例４で作製・濃縮・脱塩した鉄／Ｌｆ
混合溶液を20リットルの生乳に、鉄濃度が26ミリグラム
/200ミリリットルとなるよう添加した。これを均質化し
た後に 150℃４秒間滅菌し直ちに４℃に冷却し 250ミリ
リットルづつ紙容器に無菌的に充填した。37℃にて３ヶ
月保存後、遠心分離し沈澱物の有無を調べたが、沈澱は
全く認められなかった。また、大腸菌数および一般細菌
数共に０であった。また、鉄が存在しているために保存
中に褐変が進行する恐れがあったが、全く褐変は認めら
れなかった。さらに試験例12と同様の方法にて官能評価
試験を実施した。ただし、対照は生乳を同様の条件にて
殺菌・保存したものを用いた。パネラー10名のうちで収
斂味や味・香りなどに異常を感じたものは１名も認めら
れなかった。

【００７０】

【実施例９】実施例４で作製・濃縮・脱塩した鉄／Ｌｆ
複合体溶液（試験群）または硫酸第１鉄溶液（対照群
１）を、鉄濃度が20ミリグラム/100ミリリットルとなる
よう、アスコルビン酸およびアスコルビン酸ナトリウム
をビタミンＣとして 6.2ミリグラム/100グラム含む生理
的リン酸緩衝液（pH 7.2）に溶解し、90℃、10分間の殺
菌をしたものを試験試料とした。対照群２として、ビタ
ミンＣを添加した生理的リン酸緩衝液を殺菌したものも
作成した。離乳直後、21日齢のウィスター系雌ラット
（日本チャールスリバー）の中、体重が45から50グラム
のものを選び、除鉄食（オリエンタル酵母，鉄含量0.25
ミリグラム/100グラム飼料）を２週間与え、血中ヘモグ
ロビン値が７グラム/100ミリリットル以下の貧血ラット
を作成した。ラットは１群４匹として、その後も除鉄食
を与え続けながら、試験試料を１ミリリットル／日、６
週間、強制経口（ゾンデ）投与した。試験試料投与後６
週間目に、尾静脈より採血し、自動血球計測装置（東亜
医用電子）でヘモグロビン値を測定した。その結果を表
１８に示す。

【００７１】

【表１８】 ────────────────────────── ヘモグロビン値 （平均値±標準偏差） ────────────────────────── 試験群 15.2±1.1 （グラム/100ミリリットル） 対照群１ 12.9±0.9 対照群２ 4.8±0.3 ──────────────────────────

【００７２】以上のように、本発明の鉄−Ｌｆ複合体は
貧血治療効果を示し、さらに、その効果は無機鉄である
硫酸第一鉄よりも優れていたことが明らかとなった。

【００７３】

【実施例１０】実施例４で作製・濃縮・脱塩した鉄−Ｌ
ｆ複合体溶液を、アスコルビン酸およびアスコルビン酸
ナトリウムをビタミンＣとして30ミリグラム/200ミリリ
ットル添加した生乳に、鉄濃度が15ミリグラム/200ミリ
リットルとなるよう添加し、約200ミリリットル容量の
耐熱ガラス瓶にヘッドスペース10ミリリットル以下とな
るよう充填した（試験群）。対照として、鉄−Ｌｆ複合
体の代わりにクエン酸鉄ナトリウムを添加したビタミン
Ｃ強化乳を用いた（対照群）。これをＦ値４でレトルト
滅菌し、37℃で２週間保存し、残存するビタミンＣ含量
をビタミンＣ測定器（ＴＯＡ電子社製）にて定量した。
ビタミンＣ残存率は測定値を初期値で割った百分率とし
た。その結果を表１９に示す。

【００７４】

【表１９】

【００７５】以上のように、鉄−Ｌｆ複合体は無機鉄に
比べてビタミンＣの破壊の程度が低く、酸化および過酸
化物生成能の低い鉄材としても有効であることが明らか
となった。

【００７６】さらに、試験群について試験例12と同様の
方法にて官能評価試験を実施した。ただし、対照は鉄を
添加していないビタミンＣ強化乳を同様の条件にてレト
ルト処理したものを用いた。パネラー10名のうちで収斂
味などに異常を感じたものは１名も認められなかった。

【００７７】

【実施例１１】１グラムのＬｆ（ＤＭＶ社製）を 0.2モ
ル／リットルの酢酸緩衝液（pH４）に溶解し、ペプシン
（シグマ社） 26000ユニット添加し、37℃、２時間反応
後、水酸化ナトリウムでｐＨ 7.5とした。これにトリプ
シン（シグマ社）200000ユニットを添加して、37℃、２
時間反応させた。このようにして得た分解Ｌｆは電気泳
動により、主に分子量50000, 40000, 30000 カットの分
解物となっていることを確認した。重炭酸ナトリウムを
1.3モル含む溶液１リットル（溶けきらない塩が沈澱し
ている）を調製した（Ａ溶液）。塩化第二鉄を鉄イオン
として 1.2ミリモルを含む溶液 0.2リットル（Ｂ１溶
液）、ラクトフェリン分解物を分解前のラクトフェリン
として10マイクロモルを含む溶液 0.8リットル（Ｂ２溶
液）を作成した。Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合後、Ａ溶液
を良く撹拌しながら、Ａ溶液にＢ１／Ｂ２混合液を加
え、鉄を結合したラクトフェリン分解物を作成した。こ
れをネジ口付き試験管に密封した後、90℃、10分間加熱
し、室温まで自然冷却した後、37℃にて１か月保存し
た。沈澱を肉眼にて判定したところ、全く認められなか
った。さらに試験例12と同様の方法にて官能評価試験を
実施したところ、パネラー10名のうち、収斂味を感じた
ものは１名も認められなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/79 A61K 38/16

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の性質を示す炭酸および／または重炭
   酸−鉄−ラクトフェリン複合体。 １）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を15乃至1000分子
   および、炭酸および／または重炭酸15分子以上を含有す
   ること、 ２）pH 2.1以上 9.0以下で常温で少なくとも１ケ月間沈
   澱を生じないこと、 ３）加熱しても沈澱を生じないこと、 ４）鉄独特の収斂味がないこと。
2. 【請求項２】 鉄−ラクトフェリン複合体に結合してい
   る炭素原子および鉄原子について、（（請求項１記載の
   鉄−ラクトフェリン複合体１モルあたりの総炭素原子モ
   ル数）−（鉄を結合していないラクトフェリン１モルあ
   たりの総炭素原子モル数））／（請求項１記載の鉄−ラ
   クトフェリン複合体１モルあたりの総鉄原子モル数）の
   値が 0.1以上である請求項１記載の複合体。
3. 【請求項３】 i)炭酸、またはii) 重炭酸、またはiii)
   炭酸および重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）に、iv) 鉄およ
   びv)ラクトフェリン類を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合
   することによって得られ、次の１）から４）の性質を示
   す炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合
   体。ただし、このときＢ溶液のvi) 鉄イオンモル濃度
   は、vii)Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した
   溶液（反応溶液）に溶解しているviii) 炭酸イオンおよ
   び重炭酸イオンのモル濃度の 1/3以下であって、Ｂ溶液
   のix) ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のx)鉄イ
   オンモル濃度の1/15から1/1000である。 １）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を15乃至1000分
   子、かつ炭酸および／または重炭酸15分子以上含有する
   こと、 ２）pH 2.1以上 9.0以下で常温で少なくとも１ケ月間沈
   澱を生じないこと、 ３）加熱しても沈澱を生じないこと、 ４）鉄独特の収斂味がないこと。
4. 【請求項４】 i)炭酸、またはii) 重炭酸、またはiii)
   炭酸および重炭酸、かつiv) ラクトフェリン類を含む溶
   液（Ａ溶液）に、v)鉄を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合
   することによって得られ、次の１）から４）の性質を示
   す炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合
   体。ただし、このときＢ溶液のvi) 鉄イオンモル濃度
   は、vii)Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合した
   溶液（反応溶液）に溶解しているviii) 炭酸イオンおよ
   び重炭酸イオンのモル濃度の 1/3以下であって、ix) Ａ
   溶液のラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のx)鉄イ
   オンモル濃度の1/15から1/1000である。 １）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を15乃至1000分
   子、かつ炭酸および／または重炭酸15分子以上含有する
   こと、 ２）pH 2.1以上 9.0以下で常温で少なくとも１ケ月間沈
   澱を生じないこと、 ３）加熱しても沈澱を生じないこと、 ４）鉄独特の収斂味がないこと。
5. 【請求項５】 i)炭酸、またはii) 重炭酸、またはiii)
   炭酸および重炭酸を含む溶液（Ａ溶液）に、iv) 鉄およ
   びv)ラクトフェリン類を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合
   することを特徴とする、次の１）から４）の性質を示す
   炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体
   の製造法。ただし、このときＢ溶液のvi) 鉄イオンモル
   濃度は、vii)Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合
   した溶液（反応溶液）に溶解しているviii) 炭酸イオン
   および重炭酸イオンのモル濃度の 1/3以下であって、Ｂ
   溶液のix) ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のx)
   鉄イオンモル濃度の1/15から1/1000である。 １）ラクトフェリン類１分子当り、鉄15乃至1000分子、
   かつ炭酸および／または重炭酸15分子以上を含有するこ
   と、 ２）pH 2.1以上 9.0以下で常温で少なくとも１ケ月間沈
   澱が生じないこと、 ３）加熱しても沈澱を生じないこと、 ４）鉄独特の収斂味がないこと。
6. 【請求項６】 i)炭酸、またはii) 重炭酸、またはiii)
   炭酸および重炭酸、かつiv) ラクトフェリン類を含む溶
   液（Ａ溶液）に、v)鉄を含有する溶液（Ｂ溶液）を混合
   することを特徴とする、次の１）から４）の性質を示す
   炭酸および／または重炭酸−鉄−ラクトフェリン複合体
   の製造法。ただし、このときＢ溶液のvi) 鉄イオンモル
   濃度は、vii)Ａ溶液と、Ｂ溶液の一部または全部が混合
   した溶液（反応溶液）に溶解しているviii) 炭酸イオン
   および重炭酸イオンのモル濃度の 1/3以下であって、Ａ
   溶液のiX) ラクトフェリン類のモル濃度は、Ｂ溶液のx)
   鉄イオンモル濃度の1/15から1/1000である。 １）ラクトフェリン類１分子当り、鉄を15乃至1000分
   子、かつ炭酸および／または重炭酸15分子以上含有する
   こと、 ２）pH 2.1以上 9.0以下で常温で少なくとも１ケ月間沈
   澱を生じないこと、 ３）加熱しても沈澱を生じないこと、 ４）鉄独特の収斂味がないこと。