JP5179950B2 - 葉酸及び/又はビタミンb12−ラクトフェリン類複合物 - Google Patents
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Description
ラクトフェリン類を50mM炭酸水素ナトリウム水溶液(pH 8.5)に溶解して調製したラクトフェリン類溶液1μmol/20mlに、葉酸を10〜300 μmol /20ml となるように添加した後、限外濾過(UF)膜(分画分子量5kDa、ミリポア社製)処理により、パーミエートとリテンテートとに分離した。さらに、リテンテートの残りに50mM炭酸水素ナトリウム水溶液(pH 8.5)を添加してパーミエートを回収し、これを4回繰り返して16万倍に希釈し、全ての遊離の葉酸をパーミエート中に回収した。回収したパーミエート中に含まれる遊離の葉酸を 362nmにおける吸光度測定の値から、リテンテートに残存した結合型の葉酸の量を算出した。その結果を表1に示す。なお、葉酸の吸光度測定においては、パーミエートにタンパク質が溶出していないことと、タンパク質由来の阻害物質が存在していないことを確認した。また、タンパク質を含まない葉酸水溶液を同時にUF膜処理し、対照として用いた。これらの操作及び測定は、遮光下で行い、葉酸の光劣化を抑制し、また、測定期間中に葉酸の劣化がないことを、吸光度測定から確認した。
葉酸−ラクトフェリン複合物の光照射試験を行った。すなわち、ラクトフェリン類を50mM炭酸水素ナトリウム水溶液(pH8.5) 50ml に溶解して調製した1μmol の溶液に、100 μmol となるように葉酸を添加した後、透析膜(分画分子量10kDa)で5mMリン酸緩衝液(pH6.5)に対して透析を行い、凍結乾燥して、葉酸−ラクトフェリン複合物を得た。そして、この葉酸−ラクトフェリン複合物の粉末を3mg/100mlになるように50mMリン酸緩衝液(pH6.5)に溶解した。一方、葉酸(シグマ社製)を0.8 mg/100mlとなるように50mMリン酸緩衝液(pH6.5 )に溶解した。各試料溶液5mlをポリスチレン製の透明容器に入れ、水層の厚さが5mmとなるようにし、30mmの上部から40ワットの蛍光灯を照射した。そして、微生物を用いた方法により葉酸量を測定した。すなわち、葉酸−ラクトフェリン複合物の試料については、 pHを2.0 とし、試料1ml当たり2mgのペプシン(シグマ社製) を添加して、37℃で 120分間の反応でタンパク質を分解した後、さらに pHを 7.5とし、試料1ml当たり2mgのトリプシン(シグマ社製) を添加して、37℃で 120分間の反応でタンパク質を分解し、脱気後、5分間加熱し、15,000G により遠心分離して上清を回収し、微生物を用いた方法により葉酸量を測定した(Davis,R.E., D.J.Nicol & A.Kelly, J. Clin. path., vol.23, pp.47-53, 1970) 。また、葉酸(シグマ社製)を用いて検量線を作成した。これらの操作及び測定は、蛍光灯照射時以外遮光下で行った。その結果を表2に示す。
葉酸及び試験例2で用いた葉酸−ラクトフェリン複合物を、それぞれ葉酸のモル換算で0.1〜10μmol/10mlとなるように脱イオン水に添加し、濁度を測定した。濁度は660nm で測定した。その結果を表3に示す。
葉酸及び試験例2で用いた葉酸−ラクトフェリン複合物を、それぞれ葉酸のモル換算で0.25μmol/10mlとなるように10mMクエン酸緩衝液(pH2.5)に溶解した。次に、50mlずつ褐色ビンに詰め、90℃で30分間加熱殺菌した後、37℃で保存した。そして、試験例2と同様の方法で葉酸量を測定した。
ラクトフェリン類を50mMイミダゾール緩衝液(pH6.5) に溶解して調製したラクトフェリン類溶液0.1 μmol/20mlにビタミンB12を1〜50μmol/20mlとなるように添加した後、UF膜(分画分子量5kDa、ミリポア社製)処理により、パーミエートとリテンテートとに分離した。さらに、リテンテートの残りに50mMイミダゾール緩衝液(pH6.5) を添加して、パーミエートを回収し、これを4回繰り返して、16万倍に希釈し、全ての遊離のビタミンB12をパーミエート中に回収した。また、リテンテート中のビタミンB12−ラクトフェリン複合物の試料については、pHを2.0 とし、試科1ml 当たり2mg のペブシン(シグマ社製)を添加して、37℃で60分間の反応でタンパク質を分解し、さらにpHを7.5 とし、試料1ml 当たり2mg のトリプシン(シグマ社製)を添加して、37℃で120 分間の反応でタンパク質を分解し、加熱後、15,000G より遠心分離して上清を回収し、微生物を用いた方法によりビタミンB12量を測定した(ビタミンの事典、日本ビタミン学会編、朝倉書店、p.501、1996)。また、シアノコバラミン(シグマ社製)を用いて検量線を作成した。その結果を表5に示す。
ラクトフェリン類を50mMイミダゾール緩衝液(pH6.5)50ml に溶解して調製した0.1 μmol のラクトフェリン類溶液に20μmol となるようにビタミンB12を添加した後、透析膜(分画分子量5kDa)で脱イオン水に対して透析を行い、凍結乾燥して、ラクトフェリン類1分子当たり57分子のビタミンB12を保持したビタミンB12−ラクトフェリン複合物を調製した。そして、14μg/100ml となるようにビタミンB12−ラクトフェリン複合物をそれぞれ50mMイミダゾール緩衝液(pH 6.5)又は50mMクエン酸緩衝液(pH3.0) に溶解した。一方、対照として、ビタミンB12(シグマ社製)を用い、5.6 μg/100ml となるようにビタミンB12を、それぞれ50mMイミダゾール緩衝液(pH6.5) 又は50mMクエン酸緩衝液(pH3.0) に溶解した。各試料溶液5ml を耐熱性ガラス瓶に密封し、90℃で30分間加熱殺菌した後、35℃で2ケ月保存して、ビタミンB12の減少量を測定した。なお、ビタミンB12量は、試験例5の方法により測定した。
葉酸(日本ロシュ社製)6mmol 及びラクトフェリン(TATUA社製) 1.2mmol を混合し、 100 lの脱イオン水に溶解した。一晩10℃で反応させた後、UF膜(分画分子量 50kDa)処理により濃縮した。得られた 2 lの溶液を凍結乾燥して、葉酸−ラクトフェリン類複合物の粉末 81gを得た。この粉末について、試験例2の方法で葉酸量を測定したところ、ラクトフェリン1分子当たり葉酸2分子が保持されていることが判った。
葉酸(日本ロシュ社製)870mmol を2%炭酸水素ナトリウム水溶液 100 lに溶解し、さらにラクトフェリン(TATUA社製) 2mmol を混合した後、UF膜(分画分子量50kDa )処理により濃縮、脱塩した。得られた 2 lの溶液を試験用噴霧乾燥機で噴霧乾燥して、葉酸−ラクトフェリン類複合物の粉末240gを得た。この粉末について、試験例2の方法で葉酸量を測定したところ、ラクトフェリン1分子当たり葉酸 210分子が保持されていることが判った。
葉酸(日本ロシュ社製)110mmol を、1N水酸化ナトリウム水溶液でpH9に調整しながら、水道水80 l中へ溶解し、さらにラクトフェリン(TATUA社製) 0.6mmol混合した。1時間放置後、UF膜(分画分子量 50kDa)処理により濃縮、脱塩した。得られた 2 lの溶液を−40℃にて凍結し、葉酸−ラクトフェリン類複合物の凍結濃縮液として保存した。この凍結濃縮液について、試験例2の方法で葉酸量を測定したところ、ラクトフェリン1分子当たり葉酸 82 分子が保持されていることが判った。また、常温において凍結濃縮液を融解したところ、沈澱等は観察されなかった。
重炭酸ナトリウム1.2 mol とラクトフェリン(DMV社製)10μmol及び葉酸0.5 mmolを含む溶液1l(A液)、及び硫酸第二鉄を鉄イオンとして1.5 mmol含む溶液1 l(B溶液)を調製した。A溶液にB溶液を加えて、鉄と葉酸を保持したラクトフェリン複合物を調製し、UF膜(分画分子量5kDa)処理により、濃縮、脱塩した。この複合物について、試験例2の方法で葉酸量を測定したところ、ラクトフェリン1分子当たり葉酸27分子が保持されており、また、鉄量を原子吸光分析により測定したところ、ラクトフェリン1分子当たり鉄148 分子が保持されていることが判った。
ビタミンB12(日本ロッシュ社製)300gを脱イオン水300 l に溶解し、さらにラクトフェリン(TATUA社製) 100gを混合して、20℃で8時間反応させた後、遊離のビタミンB12を除去するため、UF膜(分画分子量50kDa )処理により分画し、さらに濃縮した。得られた1 l の溶液を試験用噴霧乾燥機で噴霧乾燥し、ビタミンB12−ラクトフェリン類複合物の粉末を220g得た。この粉末について、試験例5の方法でビタミンB12量を測定したところ、ラクトフェリン1分子当たりビタミンB1283分子が保持されていることが判った。また、この粉末の溶解性は良好であった。
炭酸カルシウム0.05molと重炭酸アンモニウム1.2molを含む溶液1 l を塩酸でpH7.8 に調製し、(A溶液)硫酸第二鉄を鉄イオンとして1.5mol含む溶液O.2 l(B1溶液)及びトランスフェリン(アポ型、高純度、牛血漿由来、和光純薬工業社製)10μmol とビタミンB121mmolを含む溶液0.8 l(B2溶液)を調製した。B1とB2溶液を混合後、A溶液に加え、鉄とビタミンB12を保持したトランスフェリン複合物を調製し、UF膜(分画分子量5kDa)処理により濃縮、脱塩し、複合物の濃縮液100ml を調製した。この複合物について、試験例5の方法でビタミンB12量を測定したところ、トランスフェリン1分子当たりビタミンB1232分子が保持されており、また、鉄量を原子吸光分析により測定したところ、ラクトフェリン1分子当たり鉄139 分子が保持されていることが判った。
葉酸50mmolを2%炭酸水素ナトリウム水溶液10 lに溶解した。一方、ラクトフェリン(DMV社製)0.38mmol及びビタミンB12(日本ロシュ社製)20mmolを脱イオン水30 lに溶解した。そして、これらの溶液を混合し、室温下で2時間撹拌した後、UF膜(分画分子量5kDa)処理により濃縮、脱塩して葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を調製し、凍結乾燥して粉末とした。この粉末について、試験例2及び試験例5の方法で葉酸量及びビタミンB12量を測定したところ、ラクトフェリン類1分子当たり葉酸79分子及びビタミンB1224分子が保持されていることが判った。
重炭酸ナトリウム1.0mol及び葉酸(日本ロシュ社製)2mmolを含む溶液1l(A溶液)、塩化第二鉄を鉄イオンとして1mmol を含む溶液0.2 l(B1溶液)及びウシラクトフェリン(ULN杜製)10μmol とビタミンB12(日本ロシュ社製)400μmol を含む溶液0.8 l(B2溶液)を調製した。B1溶液とB2溶液を混合後、A溶液に加え、溶液のpHを8.5 に維持するために、適宜、重炭酸ナトリウムを添加し、葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を調製し、UF膜(分画分子量5kDa)処理により濃縮、脱塩し、凍結乾燥して粉末とした。この粉末について、試験例2及び試験例5の方法並びに原子吸光分析で葉酸量、ビタミンB12量及び鉄量を測定したところ、ラクトフェリン類1分子当たり葉酸90分子、ビタミンB124分子、及び鉄96分子が保持されていることが判った。
ラクトフェリン20gを脱イオン水100gに溶解し、塩酸でpHを2.0 とした。これに、ペプシン(シグマ社製)100mg を添加し、37℃で2時間反応させ、ラクトフェリン加水分解物を調製した。反応後、pHを7.0 とし、凍結乾燥した。葉酸20mmolを10%炭酸ナトリウム水溶液100 l に溶解した。一方、先に調製したラクトフェリン加水分解物10g 及びビタミンB12(日本ロシュ社製)15mmolを脱イオン水30 lに溶解した。そして、これらの溶液を混合し、室温下で2時間撹拌した後、UF膜(分画分子量5kDa)処理により濃縮、脱塩して、葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を調製し、凍結乾燥して葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物の粉末23gを得た。この粉末について、試験例2及び試験例5の方法で葉酸量及びビタミンB12量を測定したところ、ラクトフェリン1分子当たり、葉酸130 分子及びビタミンB1253分子が保持されていることが判った。
実施例2で製造した葉酸−ラクトフェリン類複合物を用いて、ドリンク剤を製造した。すなわち、イオン交換水10kgに、葉酸−ラクトフェリン類複合物48g を溶解し、さらにイオン交換水 2,200kgに加えて撹拌した後、さらにトレハロース(林原社製)300kg とステビア(丸善製薬社製)1.2kg を加えて撹拌し、溶解した。次に、クエン酸(和光純薬工業社製)15kgを加えて撹拌した後、フレーバー6kgを加え、さらに、全量が 3,000kgとなるように脱イオン水を加えて調整した。これをプレート式加熱殺菌機で加熱殺菌(85℃、15秒)した後、透明瓶に充填し、さらに85℃の熱水中に15分間保持した後、冷却してドリンク剤を製造した。このドリンク剤は、冷蔵下、蛍光灯で約1ヶ月間照射テストを行った後においても、色調は変化せず、沈澱等も発生していなかった。一方、対照として、複合物の代わりに葉酸(日本ロシュ社製)2.0gを添加し、同様にしてドリンク剤を製造した。このドリンク剤は、製造直後でやや濁りが認められ、さらに、冷蔵下、蛍光灯で約1ヶ月間照射テストを行った結果、黄色い変色が認められ、沈澱も認められた。なお、分析の結果、葉酸−ラクトフェリン類複合物を用いたドリンク剤では葉酸量の減少率が8%であったのに対して、葉酸を用いたドリンク剤では葉酸量の減少率は64%であった。
実施例2で製造した葉酸−ラクトフェリン類複合物160mg 、マルチトール64.3kg、パラチニット25.5kg、アスパルテーム 0.2kg、クエン酸 3.0kg、乳化剤 3.0kg、フレーバー 4.0kgを混合し、常法に従ってチュアブルタブレットを製造した。得られたチュアブルタブレットについては、風味等、特に問題はなかった。また、透明プラスチック容器内で、50℃、蛍光灯照射条件において、4週間保存した後、葉酸量を測定したところ、製造直後と殆ど変化はなかった。
実施例5で調製したビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を用いて、ドリンク剤を製造した。すなわち、イオン交換水10kgにビタミンB12−ラクトフェリン類複合物900mg を溶解し、さらにイオン交換水2,200kg を加えて撹拌した後、さらにトレハロース(林原社製)300kg とステビア(丸善製薬社製)1.2kg を加えて撹拌し、溶解した。次に、クエン酸(和光純薬工業社製)15kgを加えて撹拌した後、フレーバー6kg を加え、さらに、全量が3,000kg となるように脱イオン水を加えて調整した。これをプレート式加熱殺菌機で加熱殺菌(85℃、15秒)した後、透明瓶に充填し、さらに85℃の熱水中に15分間保持した後、冷却してドリンク剤を製造した。一方、対照として、複合物の代わりにビタミンB12(日本ロシュ社製)630mg を添加し、同様にしてドリンク剤を製造した。そして、これらのドリンク剤を37℃で4ヶ月間保存した後、ビタミンB12量を測定したところ、ビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を用いたドリンク剤ではビタミンB12量の減少率が11%であったのに対して、ビタミンB12を用いたドリンク剤ではビタミンB12量の減少率は58%であった。
水10kgに実施例7で調製した葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物1.8kg を溶解し、さらに水200kg を添加後、安定剤(太陽化学社製)5.8kg を添加した。さらに水780kg を添加後、砂糖140kg 、梅果肉100kg 、クエン酸1.6kg、クエン酸3ナトリウム0.4kg 、香科(長谷川香料社製)0.18kgを添加し、溶解後、レトルト容器に充填した。これを120 ℃、12分間加熱し、レトルト殺菌してゼリーを製造した。一方、対照として、複合物の代わりに葉酸410 μg/l 及びビタミンB12320 μg/l を添加し、同様にしてゼリーを製造した。そして、これらのゼリーを20℃で3ヶ月間保存した後、葉酸量及びビタミンB12量を測定したところ、葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を用いたゼリーでは葉酸量の減少率が6%及びビタミンB12量の減少率が7%であったのに対して、葉酸及びビタミンB12を用いたゼリーでは、葉酸量の減少率が28%、ビタミンB12量の減少率は35%であった。
水10kgに実施例8で調製した葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物10g を溶解し、さらに水200kg を添加後、安定剤(太陽化学社製)5.8kg を添加した。さらに水780kg を添加後、砂糖140kg 、梅果肉100kg 、クエン酸1.6kg 、クエン酸3ナトリウム0.4kg 、香料(長谷川香料社製)0.18kgを添加し、溶解後、レトルト容器に充填した。これを120 ℃、12分間加熱し、レトルト殺菌してゼリ−を製造した。一方、対照として、複合物の代わりに葉酸310 μg/100ml 及びビタミンB1225μg/100ml を添加し、同様にしてゼリーを調製した。そして、これらのゼリーを20℃で3ヶ月間保存した後、葉酸量及びビタミンB12量を測定したところ、葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を用いたゼリーでは葉酸量の減少率が5%及びビタミンB12量の減少率が7%であったのに対して、葉酸及びビタミンB12を用いたゼリーでは葉酸量の減少率が24%及びビタミンB12量の減少率が30%であった。
Claims (8)
- ラクトフェリン、トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトフェリン分解物のいずれか一つ以上を含むラクトフェリン類に対し、ビタミンB12を40倍量乃至52倍量(モル比)混合し、葉酸及びビタミンB12をラクトフェリン類に保持させることを特徴とする葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物。
- 請求項1記載の葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を使用し調製した飲食品又は医薬品。
- ラクトフェリン、トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトフェリン分解物のいずれか一つ以上を含むラクトフェリン類に対し、ビタミンB12を10倍量乃至500倍量(モル比)混合し、ビタミンB12をラクトフェリン類に保持させることを特徴とするビタミンB12−ラクトフェリン類複合物。
- 請求項3記載のビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を使用し調製した飲食品又は医薬品。
- ラクトフェリン、トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトフェリン分解物のいずれか一つ以上を含むラクトフェリン類1分子当たり、ビタミンB 12 を4〜53分子保持することを特徴とする葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物。
- 請求項5記載の葉酸及びビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を使用し調製した飲食品又は医薬品。
- ラクトフェリン、トランスフェリン、オボトランスフェリン、ラクトフェリン分解物のいずれか一つ以上を含むラクトフェリン類1分子当たり、ビタミンB12を4〜130分子保持することを特徴とするビタミンB12−ラクトフェリン類複合物。
- 請求項7記載のビタミンB12−ラクトフェリン類複合物を使用し調製した飲食品又は医薬品。
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