CN103550760A

CN103550760A - 乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用

Info

Publication number: CN103550760A
Application number: CN201310545921.1A
Authority: CN
Inventors: 方锐
Original assignee: WUXI KGBIO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUXI KGBIO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-11-07
Filing date: 2013-11-07
Publication date: 2014-02-05

Abstract

本发明的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，将乳铁蛋白将作为药物用于治疗炎症因子偏高的肥胖人群的缺铁性贫血，其能够有效治疗炎症因子偏高的肥胖人群的贫血，有效抑制脂肪细胞表达铁调素基因，使肥胖病人血清中铁调素恢复到正常水平，有效缓解肥胖病人的慢性炎症，减低炎症因子的表达，使病人血液中炎症因子和铁含量恢复正常水平；所述肥胖是指人的体重指数（BMI）大于30，并且检测到其血清中的炎症因子中的一种或者多种偏高，其中炎症因子包括白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-8(IL-8)、TNFα和C反应蛋白。

Description

乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用

技术领域

本发明涉及乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群缺铁性贫血药物中的应用。

背景技术

研究表明，肥胖人群分泌的炎症因子高于非肥胖健康人群，肥胖人群的贫血是由于过度肥胖，体内拥有大量的脂肪细胞，脂肪细胞分泌大量的炎症因子，刺激肝细胞表达铁调素基因，铁调素的上调导致小肠细胞和巨噬细胞膜转运蛋白降解，使小肠细胞或巨噬细胞中的铁无法释放出来，引起贫血症状；在这种状态下，普通的补铁剂，如硫酸亚铁，血红素铁等，并不能有效改善具有慢性炎症的肥胖人群贫血，通过普通的补铁剂大量的补充铁，会导致铁在小肠细胞中聚集，形成氧化自由基，破坏小肠组织，引发更为严重的炎症，不但不能改善贫血，反而使血症状更为严重。

乳铁蛋白又名乳转铁蛋白，是一种分子质量为70～80kDa的糖蛋白，属于转铁蛋白家族成员，广泛分布于哺乳动物乳汁和其他多种组织及其分泌液中(包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞)。

近年来，肥胖和铁缺乏已经成为世界上最为普遍的营养紊乱症状，肥胖在儿童和青少年中的流行趋势不断的上升。儿童缺铁会损伤其认知能力，造成发育的迟缓，影响学习能力。调查研究表明肥胖的人群中铁缺乏的比例是正常体重人的两倍以上。

铁是人体必雪的微量元素，是维持细胞的新陈代谢的基础，参与到DNA的复制，电子的传递，血红蛋白和各种氧化还原酶的合成等等。铁吸收不足导致起体内铁的缺乏，导致多种常见疾病，如贫血，人能力障碍等。但是铁的过量对人体也会造成毒害作用，铁的过度积累产生活性氧自由基，自由基又会引起蛋白和细胞膜脂的氧化，DNA的损伤，最终导致细胞的凋亡。因此哺乳动物在进化过程中，形成一套严密的调节机制，调控铁的吸收和转运，维持体内的铁平衡。成年的女性体内的铁含量约为3g，男性体内的铁含量约为4g。人体所需要的铁主要是由巨噬细胞提供。巨噬细胞吞噬和分解衰老的红细胞，每天产生的铁大约20-30mg，能够被释放出来重新利用。人体需要从体外吸收的铁仅为1-2mg。

人体内的铁主要是在小肠的十二指肠部位吸收，食物中的三价铁首先由小肠细胞色素b还原为二价铁，在由二价的金属离子转运蛋白体1转运进入细胞，在膜铁蛋白和膜铁转运辅助蛋白的作用下，将铁由小肠细胞释放到胞外，与转铁蛋白结合，通过血液循环被运输到机体各个部位。小肠对的铁吸收和巨噬细胞释放铁是由铁调素来调节控制，铁调素是由肝细胞合成的一种分泌型多肽激素，成熟的铁调素由25个氨基酸残基组成。它与膜转铁蛋白结合，导致转铁蛋白的降解，从而抑制小肠细胞和巨噬细胞内铁的释放。炎症因子，如白细胞介素6，白细胞介素2，肿瘤转化因子等，能够促进肝细胞表达铁调素蛋白。

慢性炎症病人由于铁调素的过度表达，使机体内的铁转运受到抑制，大量的铁被隔离在肠细胞和巨噬细胞中，引起血清中的铁含量下降，导致体内铁平衡的紊乱，从而产生贫血的症状。

肥胖被认为是一种慢性病，研究发现肥胖人体内的炎症因子—白细胞介素6和铁调素水平显著地高于健康人。因为肥胖病人长期高水平地表达炎症因子，容易导致其体内铁代谢紊乱，所以肥胖病人很容易患上贫血症状。简单的补充铁并不能有效地改善肥胖病人的铁紊乱。由于在炎症状态下铁不能被有效的转运到血液，过分补充铁还会导致肠细胞吸收过多的铁。造成小肠细胞中铁的聚集，产生大量的氧自由基，使炎症加剧。

目前对于贫血的治疗主要通过铁的强化食品，或是补铁剂，如硫酸亚铁，血红素铁等等，来增加小肠对铁的吸收，改善机体中铁的不足。研究数据显示，患有贫血的肥胖病人，通过补铁剂，如硫酸亚铁，血红素铁等补充铁并不能够缓解贫血症状。

因此，本领域迫切地需要开发新的，能够有效的预防和治疗肥胖病人的贫血药物。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其能够有效治疗炎症因子偏高的肥胖人群的贫血，有效抑制脂肪细胞表达铁调素基因，使肥胖病人血清中铁调素恢复到正常水平，有效缓解肥胖病人的慢性炎症，减低炎症因子的表达，使病人血液中炎症因子和铁含量恢复正常水平。

本方明的第二个方面，提供了一种乳铁蛋白的用途，它被用于制备预防或是改善肥胖病人的贫血保健品或食品补充剂。

本发明的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，是将乳铁蛋白将作为药物用于治疗炎症因子偏高的肥胖人群的缺铁性贫血，其能够有效的预防和治疗的炎症因子偏高的肥胖人群的贫血，有效抑制脂肪细胞表达铁调素基因，使肥胖病人血清中铁调素恢复到正常水平，有效缓解肥胖病人的慢性炎症，减低炎症因子的表达，使病人血液中炎症因子和铁含量恢复正常水平；

所述肥胖是指人的体重指数（BMI）大于30，并且检测到其血清中的炎症因子中的一种或者多种偏高，其中炎症因子包括白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-8(IL-8)、TNFα和C反应蛋白；

上述人的体重指数（BMI）=W ÷（H²）

式中：W为体重，体重的单位为kg ；

H为身高，身高的单位为m。

本发明的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其中所述IL-6>40 pg/ml，所述IL-2>200 pg/ml，所述IL-8>20 pg/ml，TNFα>60ng/L，所述C反应蛋白>10mg/L。

本发明的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其中所述的乳铁蛋白是重组人乳铁蛋白，重组人乳铁蛋白来源于奶牛乳腺生物反应器或羊乳腺生物反应器或水稻生物反应器。

本发明的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其中所述的乳铁蛋白铁饱和度为10-30%，通过口服给药，饭前补充，每天两次，每次100mg。

本发明的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其中所述的乳铁蛋白可制作成制剂，制剂包括片剂，胶囊，颗粒剂，粉剂。

本发明的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用中，乳铁蛋白可以调节人体的免疫系统，抑制炎症因子的分泌，长期服用乳铁蛋白可以有效降低肥胖人群的炎症因子分泌，使铁代谢平衡重新恢复，治疗具有慢性炎症的肥胖人群的贫血。

下面对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

具体实施方式

本发明人研究发现，乳铁蛋白可以有效的抑制脂肪细胞表达铁调素基因，使肥胖病人血清中铁调素恢复到正常水平；长期服用乳铁蛋白还能有效的缓解肥胖病人的慢性炎症，减低炎症因子的表达，使血液中白细胞介素6和铁含量恢复正常水平，因此，乳铁蛋白可用于制备预防或是治疗具有慢性炎症肥胖病人贫血的药物，在此基础上完成本发明。

具体地，以转人乳铁蛋白基因奶牛乳汁为原料，经离心、脱脂、去除乳清中的颗粒状杂质、阳离子交层析纯化等处理步骤，获得高纯度的乳铁蛋白。

购买断奶后大鼠30只，平均体重60g。每组10只，分为三个组，一组饲喂普通饲料，一组饲喂高热量食物并每天补充80μg重组人乳铁蛋白，另空白组饲喂高热量食物并补充80μg牛肉粉，连续饲喂2个月，饲喂高能量饲料的大鼠出现肥胖症状。检测大鼠的血液指标铁转运蛋白浓度，结果显示添加乳铁蛋白组的实验组中的大鼠没有发现有现血铁过少或是贫血的症状；空白组中，大鼠出现血铁过少，而且血清中铁调素与白细胞介素6的水平有明显上升。将空白组的饲料更换为添加80μg重组人乳铁蛋白的高热量食物，继续饲喂2个月后，大鼠的血铁浓度重新恢复正常，血清中铁调素与白细胞介素6水平明显降低，恢复正常表达。

重组人乳铁蛋白抑制脂肪细胞铁调素基因和白细胞介素-6的表达

1材料与方法

1.1试剂与材料

24孔细胞培养板（美国康宁公司），DMEM基础培养基，Gibco胎牛血清，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，地塞米松，胰岛素，胰酶，油红染料，Trizol试剂（达科为），SYBR Green试剂（ABI），定量PCR仪（罗氏）。

脂肪前体细胞3T3-L1细胞株（购自ATCC）

1.2 方法

将3T3-L1脂肪细胞用含10%小牛血清DMEM培养液在37℃，5%CO2的条件下培养，待细胞融合2天后，加入含0.5mmol/L，1-甲基-3-3异丁基黄嘌呤，0.25μmol/L地塞米松，10μg/mL胰岛素、10%胎牛血清的DMEM培养48小时，换含10μg/ml胰岛素的培养液，每2天换液１次，诱导分化８～１２小时的3T3-L1细胞，油红染色后在显微镜下观察发现90%多呈脂肪细胞表型。

已经分化完全的脂肪细胞中添加不同浓度的乳铁蛋白，终浓度至0μg/ml，10μg/ml，25μg/mg，50μg/ml，每个浓度3个重复。共孵育24小时后，去掉培养基，PBS洗三次，收集细胞。提取总RNA，根据Trizol提取总RNA说明书。相对定量PCR检测，GAPHD为内参基因，Ct法分析铁调素基因的相对表达量。

1.3结果

定量结果表明乳铁蛋白能够显著地抑制脂肪细胞中铁调素与白细胞介素-6基因的表达，抑制作用与乳铁蛋白的浓度没有正相关。

重组人乳铁蛋白预防和治疗肥胖小鼠贫血

3.1材料与方法

高能量饲料：普通饲料60%，奶粉5%、花生 5%、鸡蛋10%、猪油12%、蔗糖5%、麻油1%、食盐2%混合而成。

动物来源：大鼠，由中国军事医学科学院实验动物研究中心提供

动物：断奶，体重：50-60g。

重组人乳铁蛋白

从转人乳铁蛋白基因羊奶中纯化获得。

3.2实验分组

分组	剂量	动物数目
			普通组	普通饲料	10只
空白对照	高能饲料加1.6mg牛肉粉	10只
			乳铁蛋白组	高能饲料加1.6mg重组人乳铁蛋白	10只

3.3模型建立

对照组和实验组分别饲喂高能量饲料，连续饲喂2个月，ELISA检测大鼠血浆Serum Ferritin, hepcin, IL-6水平。将空白照组更换为重组人乳铁蛋白，继续饲喂2个月，ELISA检测对照组大鼠血浆中sFerritin，hepcidin，IL-6水平。

3.4结果

在饲喂高能量食物2个月后大鼠出现肥胖症状，统计结果显示空白组中大鼠血浆中血铁浓度有明显的降低，乳铁蛋白组血铁没有显著性的变化，如表1。

表1 ELISA检测实验组与对照组血浆中Serum Ferritin, hepcin

表1

	空白对照组	乳铁蛋白组	P值
				sFerritin	6±3.3	11±5.2	<0.05
Hepcidin(nmol/L)	2.8±0.8	1.9±0.9	<0.01
				IL-6(pg/ml)	1.7±0.6	1.2±0.4	<0.01

将空白组饲料更换成添加乳铁蛋白，继续饲喂2个月，发现大鼠的血铁浓度重新恢复正常，如表2。

表2 ElISA检测空白组添加乳铁蛋白后血浆中Serum Ferritin, hepcin

表2

	两个月前	两个月后	P值
				sFerritin	6±3.3	9±2.8	<0.05
Hepcidin(nmol/L)	2.8±0.8	2.0±1	<0.05
				IL-6(pg/ml)	1.7±0.6	1.4±0.4	<0.05

实施例

口服重组人乳铁蛋白胶囊治疗肥胖人群的缺铁性贫血

体重指数（BMI）大于30，且有血铁过少的贫血患者，口服100mg重组人乳铁蛋白胶囊，每天两次。给药两个月，血清铁蛋白（sFtn,serum）和血清总铁(TSI, total serum iron)水平恢复。

表3为20名患者在每天2次给予100mg重组人乳铁蛋白治疗前后血清铁蛋白和血清总铁的平均值

表3

给药两个月后，检测血清中的铁调素（hepcidin）和白细胞介素-6平均值低于治疗前。治疗两个月后，血液中铁调素浓度从2.8 nmol/L下降到到1.9nmol/L,白细胞介素-6从1.71.2pg/mL下降到1.2pg/mL。

本发明的主要优点在于：

1）乳铁蛋白是生物利用很高的补铁剂，一分子的乳铁蛋白能够螯合两个三价的铁离子。目前，乳铁蛋白已经被批准成为食品添加剂，大量食用乳铁蛋白不会产生副作用。

2）乳铁蛋白能够调节机体免疫反应，具有抗炎症的功能，口服乳铁蛋白可以有效降低炎症因子分泌，有助于缓解肥胖病人的慢性炎症。长期使用乳铁蛋白不产对胃肠道产生破坏，能够起到预防或是治疗肥胖病人血铁过少或是缺铁性贫血的作用，具有非常好的市场应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其特征在于：将乳铁蛋白将作为药物用于治疗炎症因子偏高的肥胖人群的缺铁性贫血，其能够有效治疗炎症因子偏高的肥胖人群的贫血，有效抑制脂肪细胞表达铁调素基因，使肥胖病人血清中铁调素恢复到正常水平，有效缓解肥胖病人的慢性炎症，减低炎症因子的表达，使病人血液中炎症因子和铁含量恢复正常水平；

上述人的体重指数（BMI）=W ÷（H²）

式中：W为体重，体重的单位为kg ；

H为身高，身高的单位为m。

2.根据权利要求1所述的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其特征在于：所述IL-6>40 pg/ml，所述IL-2>200 pg/ml，所述IL-8>20 pg/ml，TNFα>60ng/L，所述C反应蛋白>10mg/L。

3.根据权利要求2所述的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其特征在于：所述的乳铁蛋白为重组人乳铁蛋白，重组人乳铁蛋白来源于奶牛乳腺生物反应器或羊乳腺生物反应器或水稻生物反应器。

4.根据权利要求3所述的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其特征在于：所述的乳铁蛋白铁饱和度为10-30%，通过口服给药，饭前补充，每天两次，每次100mg。

5.根据权利要求4所述的乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用，其特征在于：所述的乳铁蛋白可制作成制剂，制剂包括片剂，胶囊，颗粒剂，粉剂。