CN111647559A - 葡甘聚糖在提高nk细胞杀伤活性、制备nk细胞培养基方面的应用 - Google Patents

葡甘聚糖在提高nk细胞杀伤活性、制备nk细胞培养基方面的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111647559A
CN111647559A CN202010537689.7A CN202010537689A CN111647559A CN 111647559 A CN111647559 A CN 111647559A CN 202010537689 A CN202010537689 A CN 202010537689A CN 111647559 A CN111647559 A CN 111647559A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
culture medium
glucomannan
improving
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202010537689.7A
Other languages
English (en)
Inventor
陈茜
张潇武
许泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningxia Houze Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Ningxia Houze Biomedical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningxia Houze Biomedical Technology Co ltd filed Critical Ningxia Houze Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN202010537689.7A priority Critical patent/CN111647559A/zh
Publication of CN111647559A publication Critical patent/CN111647559A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了葡甘聚糖在提高NK细胞杀伤活性、制备NK细胞培养基方面的应用。自然杀伤细胞(NK细胞，CD3‑CD56+)作为机体固有免疫的重要成员，是抗肿瘤免疫的先行者，在肿瘤免疫方面发挥着至关重要的作用。如何提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用NK细胞进行细胞免疫治疗的关键。本发明实验结果表明，魔芋葡甘聚糖具有提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的活性，可以用于制备提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的细胞培养基。

Description

葡甘聚糖在提高NK细胞杀伤活性、制备NK细胞培养基方面的 应用
技术领域
本发明属于免疫细胞领域，涉及NK细胞，具体涉及葡甘聚糖在提高NK细胞杀伤活性、制备NK细胞培养基方面的应用。
背景技术
随着肿瘤免疫学的不断进展，肿瘤免疫治疗已经成为继手术和放、化疗之后第四种肿瘤治疗的手段，并且有望成为最终攻克肿瘤的方向。
自然杀伤细胞(NK细胞，CD3-CD56+)作为机体固有免疫的重要成员，是抗肿瘤免疫的先行者，在肿瘤免疫方面发挥着至关重要的作用。多项研究表明，NK细胞发挥抗肿瘤细胞毒性作用的这一过程依赖于NK细胞表面某些功能受体，如NKG2和自然杀伤细胞抑制性受体家族等。此外，NK细胞还会产生一系列细胞因子和趋化因子来调节免疫反应。通过释放CCL5、XCL1和XCL2，NK细胞能促进树突状细胞向实体瘤聚集，促进CD8+T细胞抗肿瘤免疫作用，延长病人的生存期。NK细胞还可以通过其他一些机制杀伤肿瘤细胞。
如何提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用NK细胞进行细胞免疫治疗的关键。
于淮海等发表了综述“STAT3、STAT5在NK细胞中的抗肿瘤作用研究进展”(转化医学电子杂志，2017年05期)，该综述中指出，STAT3的激活会抑制NK细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，同时紊乱免疫细胞之间的调节，抑制免疫细胞向肿瘤的迁移。因此，抑制NK细胞中STAT3的表达可能是提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的一种机制。
魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)又称魔芋葡甘露聚糖、魔芋胶、魔芋粉，是魔芋内含有的中性半纤维素复合杂多糖。KGM作为一种天然无端基可溶性膳食纤维，具有抗氧化自由基、抗肿瘤癌变、降血糖等功能，有较高的营养与保健价值。在食品加工与保鲜应用方面，KGM与儿茶素共抑香肠中ω-3脂肪酸的氧化，包埋鱼油赋予乳制品低脂特性；在医疗临床与保健应用方面，控谷胱甘肽S-转移酶基因表达下调Bcl-2促上皮细胞凋亡，复配脂多糖实现口服结肠定位给药系统点控药物释放，延长乳酸菌在胃中的残留时间；在日用化学化妆品中，与聚丙酰胺复合修复受损皮肤，延缓脑神经胶质、动脉内皮细胞老化。
目前没有魔芋葡甘聚糖用于NK细胞体外培养提高其杀瘤活性的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供葡甘聚糖在提高NK细胞杀伤活性、制备NK细胞培养基方面的应用。
本发明上述目的通过如下方案实现：
一种葡甘聚糖在体外培养NK细胞提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用，其中：所述所述葡甘聚糖为魔芋葡甘聚糖。具体实施例中，与对照组相比，100μg/mL、200μg/mL魔芋葡甘聚糖干预过的药物组的NK细胞明显具有更高的肿瘤杀伤活性，并且可见剂量依赖效应。
一种用于提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的细胞培养基，该培养基中含有魔芋葡甘聚糖。
有益效果：
自然杀伤细胞(NK细胞，CD3-CD56+)作为机体固有免疫的重要成员，是抗肿瘤免疫的先行者，在肿瘤免疫方面发挥着至关重要的作用。如何提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用NK细胞进行细胞免疫治疗的关键。结果表明，魔芋葡甘聚糖具有提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的活性，可以用于制备提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的细胞培养基。
附图说明
图1为各组NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率；该结果显示，100μg/mL、200μg/mL魔芋葡甘聚糖具有明显的体外提高NK细胞杀瘤活性的作用，并且可见剂量依赖效应；
图2为Western blot检测结果；该结果显示，100μg/mL、200μg/mL药物组NK细胞中STAT3蛋白表达水平均比对照组降低。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。
实施例1：
一、实验材料
NK细胞培养基购自德国CellGro公司。
各种试剂或试剂盒均为常规市售的试剂或试剂盒。
魔芋葡甘聚糖，食品级，购自云南昭通三艾有机魔芋发展有限责任公司。称取适量魔芋葡甘聚糖缓慢添加到超纯水中，50℃水浴搅拌溶解，作为母液备用，临用现配。
二、实验方法
1、单个核细胞分离、NK细胞诱导培养和流式检测
采集健康志愿者外周血，用4℃预冷的PBS缓冲液等体积稀释，然后缓慢加入淋巴细胞分离液上层，于650g、4℃离心20min，收集白色细胞层，即分离得到单个核细胞，用生理盐水洗涤后，用NK细胞培养基调至起始密度为2.0×106/L。
于第0天加入IL-2500U/mL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，以后每3d添加含500U/mL IL-2的NK细胞培养基继续培养，并调整细胞密度为2.0×106/mL。
取0d和培养至9d的细胞，按常规的流式操作规程，以FITC-CD3、APC-CD56单抗检测CD3-CD56+细胞比例。
2、MTT法测定魔芋葡甘聚糖对NK细胞增殖活性的影响
取培养至9d的NK细胞，消化后用含500U/mL IL-2的NK细胞培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2.5×104/mL，接种于96孔板，每孔200μL，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。培养12h后，药物组更换为含有100μg/mL或200μg/mL魔芋葡甘聚糖和500U/mL IL-2的NK细胞培养基继续培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组(但含有与药物组等量的溶媒)，以及不含细胞的培养液为空白组。继续培养48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，孵育4h，弃上清液，每孔加入200μLDMSO，振荡使结晶物充分溶解，以空白组调零，测定药物组和对照组各孔490nm波长下OD值，以对照组细胞增殖率为100％计，按如下公式计算药物组细胞增殖率。每个浓度3个复孔。
细胞增殖率(％)＝OD药物组/OD对照组×100％
3、CCK-8法测定魔芋葡甘聚糖对NK细胞杀伤活性的影响
效应细胞的制备：取培养至9d的NK细胞，消化后用含500U/mL IL-2的NK细胞培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/mL，接种于6孔板，每孔2mL，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。培养12h后，药物组更换为含有100μg/mL或200μg/mL魔芋葡甘聚糖和500U/mL IL-2的NK细胞培养基继续培养48h，同时设置不加药培养的细胞为对照组(但含有与药物组等量的溶媒)。
分别以药物组和对照组的NK细胞为效应细胞，以对数生长期HepG2细胞为靶细胞，消化、洗涤后分别用含10％胎牛血清的DMEM培养基制成2×106/mL、2×105/mL的细胞悬液，各取100μL按照效靶比10:1接种于96孔板中，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，于37℃、5％CO2条件的细胞培养箱中培养；培养24h后，每孔加入20μL CCK-8试剂，继续培养4h，用酶标仪测定各孔在450nm波长下的吸光度OD值，根据如下公式计算杀伤率：
杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值]×l00％。
4、Western blot法测定NK细胞中STAT3蛋白表达的影响
取培养至9d的NK细胞，消化后用含500U/mL IL-2的NK细胞培养基制成细胞悬液，细胞浓度为2×105/mL，接种于6孔板，每孔2mL，在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。培养12h后，药物组更换为含有100μg/mL、200μg/mL魔芋葡甘聚糖和500U/mL IL-2的NK细胞培养基继续培养，同时设置不加药培养的细胞为对照组(但含有与药物组等量的溶媒)。继续培养48h后，弃培养液，PBS洗涤，将细胞消化下来，细胞冰上裂解，BCA试剂盒测定蛋白浓度，各组取50μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭，加入STAT3和GAPDH一抗4℃孵育过夜，TBS-T洗涤液洗膜，加入二抗室温孵育1h，ECL法显色、曝光，化学发光成像系统拍照。
5、数据处理
采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±SD表示。组间比较采用t检验，p<0.05代表具有显著性差异。
三、实验结果
1、单个核细胞分离、NK细胞诱导培养和流式检测
单个核细胞中CD3-CD56+表型的NK细胞比例较低，经含500U/mL IL-2的NK细胞培养基诱导培养后，CD3-CD56+表型的NK细胞比例会显著升高。流式检测结果显示，与0天CD3-CD56+表型比例(3.67±1.15)％相比，诱导培养至9天时，显著升高至(35.29±4.06)％。
2、魔芋葡甘聚糖对NK细胞增殖活性的影响
MTT法测定结果如表1所示，与对照组相比，含有100μg/mL、200μg/mL魔芋葡甘聚糖的药物组中NK细胞增殖活性无明显升高。
表1各组NK细胞增殖率(％)
对照组 100μg/mL药物组 200μg/mL药物组
增殖率(％) 100 107.4±4.5 105.8±4.7
该结果表明，魔芋葡甘聚糖对NK细胞的体外增殖无明显促进作用。
3、魔芋葡甘聚糖对NK细胞杀伤活性的影响
CCK-8法测定结果如表2和图1所示，与对照组相比，100μg/mL、200μg/mL魔芋葡甘聚糖干预过的药物组的NK细胞明显具有更高的肿瘤杀伤活性，并且可见剂量依赖效应。
表2各组NK细胞对肿瘤细胞的杀伤率(％)
对照组 100μg/mL药物组 200μg/mL药物组
杀伤率(％) 27.3±4.8 48.5±4.7 72.8±5.4
该结果表明，魔芋葡甘聚糖具有明显的体外提高NK细胞杀伤活性的作用。
4、魔芋葡甘聚糖对NK细胞中STAT3蛋白表达的影响
Western blot检测结果如图2所示，与对照组相比，100μg/mL、200μg/mL药物组NK细胞中STAT3蛋白表达水平明显下调。已知STAT3的激活会抑制NK细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，STAT3抑制剂具有增强NK效应细胞杀瘤活性的作用。该结果说明，魔芋葡甘聚糖对NK细胞杀伤活性的提高可能与抑制STAT3蛋白表达有一定关系。
自然杀伤细胞(NK细胞，CD3-CD56+)作为机体固有免疫的重要成员，是抗肿瘤免疫的先行者，在肿瘤免疫方面发挥着至关重要的作用。如何提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，是大规模使用NK细胞进行细胞免疫治疗的关键。本发明以上实验结果表明，魔芋葡甘聚糖具有提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的活性，可以用于制备提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的细胞培养基。
实施例2：
一种用于提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的细胞培养基，含有有效浓度的魔芋葡甘聚糖。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (2)

1.一种葡甘聚糖在体外培养NK细胞提高其对肿瘤细胞杀伤力方面的应用，其中：所述所述葡甘聚糖为魔芋葡甘聚糖。
2.一种用于提高NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的细胞培养基，其特征在于：该细胞培养基中含有魔芋葡甘聚糖。
CN202010537689.7A 2020-06-12 2020-06-12 葡甘聚糖在提高nk细胞杀伤活性、制备nk细胞培养基方面的应用 Withdrawn CN111647559A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010537689.7A CN111647559A (zh) 2020-06-12 2020-06-12 葡甘聚糖在提高nk细胞杀伤活性、制备nk细胞培养基方面的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010537689.7A CN111647559A (zh) 2020-06-12 2020-06-12 葡甘聚糖在提高nk细胞杀伤活性、制备nk细胞培养基方面的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111647559A true CN111647559A (zh) 2020-09-11

Family

ID=72349206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010537689.7A Withdrawn CN111647559A (zh) 2020-06-12 2020-06-12 葡甘聚糖在提高nk细胞杀伤活性、制备nk细胞培养基方面的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111647559A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115305238A (zh) * 2022-09-19 2022-11-08 南京良纬生物科技有限公司 一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115305238A (zh) * 2022-09-19 2022-11-08 南京良纬生物科技有限公司 一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用
CN115305238B (zh) * 2022-09-19 2023-11-17 杭州凤喆凰生物科技有限公司 一种提高自然杀伤细胞杀伤力的成分在自然杀伤细胞培养中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101826071B1 (ko) 포유동물 체내에서 유래된 세포밖 소포체를 포함하는 조성물 및 이의 용도
Moriguchi et al. High dietary vitamin A (retinyl palmitate) and cellular immune functions in mice.
EP2039365B1 (en) Visceral fat accumulation inhibitor, and agent for promoting the increase in and/or inhibiting the decrease in blood adiponectin level
Oku et al. Mechanism of inhibitory effect of unavailable carbohydrate on intestinal calcium absorption
Tan et al. Anti-tumor and immunomodulatory activity of the aqueous extract of Sarcodon imbricatus in vitro and in vivo
Tai et al. The effects of recombinant granulocyte‐macrophage colony‐stimulating factor (GM‐CSF) and interleukin‐3 on the secretory capacity of human blood eosinophils
KR101400900B1 (ko) 탄시논을 유효성분으로 함유하는 자연살해세포 분화 또는 활성 증진용 조성물
CN111647559A (zh) 葡甘聚糖在提高nk细胞杀伤活性、制备nk细胞培养基方面的应用
Xiang et al. Immunomodulatory effect of Ganoderma atrum polysaccharides on Th17/Treg balance
KR20130117491A (ko) 참곱슬이 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물
Taniguchi et al. Utility and safety of LPS-based fermented flour extract as a macrophage activator
Bourantas et al. Serum beta‐2‐microglobulin, TNF‐α and interleukins in myeloproliferative disorders
US20210177879A1 (en) Vitamin d receptor agonist
CN103550760A (zh) 乳铁蛋白在制备炎症因子偏高肥胖人群贫血药物中的应用
CN111635887A (zh) 一种葡甘聚糖在cik细胞体外培养方面的用途及cik细胞培养基
Fatemi et al. Effects of the Cell Debris and Supernatant of Saccharomyces boulardii on 7, 12-Dimethylbenz (a) Anthracene-Induced Breast Cancer in Rats
Goldman et al. Future research in human milk
Jia et al. A literature review on lactopontin and its roles in early life
Kiremidjian-Schumacher et al. Effects of selenium supplementation on macrophage-mediated tumor cytodestruction
Geddes et al. 7 Human Milk: Bioactive Components and Their Effects on the Infant and Beyond
US20180264050A1 (en) (en) potentiated t-cell modulator able to modulate immune response, method for extracting, testing and counting a dialysable leucocyte extract from shark spleen to produce same, and therapeutic use thereof
KR20180013981A (ko) 우유 효소 처리물, 그 제조 방법, 조성물 및 제품
TWI222515B (en) LAK activity-screening materials containing lentinus extract of edodes mycelium and LAK activity-screening methods using the extract
CN109432116A (zh) 黄芪皂苷ⅲ在制备肿瘤免疫治疗药物中的用途
Du et al. 5-Hydroxytryptophan inhibits β-casein biosynthesis and promotes goat mammary epithelial cell apoptosis through the JAK2/STAT5a axis and the HTR7

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20200911

WW01 Invention patent application withdrawn after publication