JP2022009514A - 乳酵素処理物、その製造方法、組成物および製品 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】乳をβ-ガラクトシダーゼと接触させる工程を含んでなる、乳酵素処理物の製造方法により得られる乳酵素処理物。
【選択図】なし
Description
[1]乳をβ-ガラクトシダーゼと接触させる工程を含んでなる、乳酵素処理物の製造方法、
[2]乳をシアリダーゼと接触させる工程をさらに含んでなる、上記[1]記載の製造方法、
[3]酵素処理の前に、乳を濃縮または脱チーズ成分処理しておく工程をさらに含んでなる、上記[1]または[2]記載の製造方法、
[4]上記[1]~[3]のいずれか1項に記載の製造方法により得られる乳酵素処理物、
[5]1回の投与用として、0.02μg~40mg、好ましくは0.02μg~20mg、より好ましくは0.2μg~20mg、より好ましくは2μg~20mg、より好ましくは20μg~20mg、より好ましくは200μg~10mg、より好ましくは200μg~2mgの範囲のタンパク質を含む上記[4]記載の乳酵素処理物、
[6]上記[4]または[5]記載の乳酵素処理物を含んでなる医薬組成物、
[7]上記[6]記載の医薬組成物を含んでなる医薬品、
[8]上記[4]または[5]記載の乳酵素処理物を含んでなる飲食品用組成物、
[9]上記[8]記載の飲食品用組成物を含んでなる飲食品、
に関する。
本発明で使用する乳とは、哺乳類が幼児に栄養を与えて育てるために母体が作り出す分泌液をいう。ここで、哺乳類とは、特に限定されないが、好ましい例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ヒト、水牛、ヤク、ラクダ、ロバ、トナカイ、シカなどが挙げられる。また、乳には、分娩後所定日数の間にのみ分泌されるいわゆる初乳も含む。但し、ウシ初乳(母牛が分娩後10日目までに分泌する乳汁)は含まない。ここで、乳は、酵素処理に付す前に、予め前処理しておいてもよい。そのような前処理としては、水分量を減少させる濃縮の他、乳からチーズをつくる際にチーズとして固まる成分(カゼイン、脂肪等)を除去する処理(脱チーズ成分処理)が含まれる。以下、濃縮により得られる乳を「濃縮乳」、脱チーズ成分処理により得られる乳を「脱チーズ成分乳」(乳清)ともいう。
本発明で使用するβ-ガラクトシダーゼは、特に限定なく、周知のいずれの種類のものも使用することができる。そのようなものとしては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)由来のもの、ウシ肝臓(bovine liver)由来のものなどがあげられる。市販されたものとしては、例えば、和光純薬工業(株)のカタログNo.072-04141、SIGMA-ALDRICH社のG1875などが挙げられる。本発明において、β-ガラクトシダーゼは、単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明において、乳と、β-ガラクトシダーゼ若しくはシアリダーゼとの接触(酵素処理)は、それぞれ、十分な量の酵素を用いて十分な時間接触させることにより、それ以上実質的に酵素反応が進行しない程度まで行うのが好ましい。このような目的には、酵素の種類にもよるが、例えば、β-ガラクトシダーゼとして和光純薬工業(株)のカタログNo.072-04141を用いる場合、乳100μlに対して、酵素を65mU使用すれば十分である。また、例えば、シアリダーゼとしてSIGMA-ALDRICH社の製品番号(N2876)を用いる場合、乳100μlに対して、酵素を65mU使用すれば十分である。この場合の酵素処理の時間としては、3時間行えば十分である。
こうして得られる本発明の乳酵素処理物は、さらに、凍結乾燥して、固体ないし粉体状としてもよい。このような乳酵素処理物は、新規組成物である。
本発明の乳酵素処理物は、そのまま、もしくは、適宜、薬学的に許容しうる補助剤(担体)を配合することにより、医薬組成物として調製することができる。このような薬学的に許容し得る補助剤としては、この分野で通常用いられるものをいずれも好適に使用することができ、具体例としては、例えば、希釈剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、賦形剤、結合剤、防腐剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤等が挙げられる。これら補助剤は、医薬組成物の剤型に応じて、適宜配合される。
本発明に係る乳酵素処理物は、必要に応じて、上記補助剤を配合することにより、医薬部外品用組成物とすることができ、さらには、該医薬部外品用組成物をさらに加工して、これを含んでなる医薬部外品とすることができる。該医薬部外品用組成物または医薬部外品は、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ベースト状、ゼリー状等の種々の形態をとり得るものであり、必要に応じ、所望の形状に成形することもできる。医薬部外品用組成物および医薬部外品の調製はいずれも常法にのっとり実施することができる。
本発明に係る乳酵素処理物は、必要に応じて、上記補助剤や、甘味料、香辛料、調味料、防腐剤、保存料、殺菌剤、酸化防止剤などの飲食品に通常用いられる各種添加剤を適宜配合することにより飲食品用組成物とすることができ、さらには、該飲食品用組成物をさらに加工して、これを含んでなる飲食品とすることができる。該飲食品用組成物または飲食品は、溶液状、懸濁液状、シロップ状、顆粒状、クリーム状、ベースト状、ゼリー状等の種々の形態をとり得るものであり、必要に応じ、所望の形状に成形することもできる。また、該飲食品は、パン、麺、菓子、飲料、スープ、加工食品など様々な形態をとることができる。飲食品用組成物および飲食品の調製はいずれも常法にのっとり実施することができる。
(癌、感染症)
本明細書において、癌とは、癌腫(carcinoma)、肉腫(sarcoma)、その他の悪性腫瘍(malignant tumor)のいずれをも含むものであり、例えば、皮膚癌、気管支癌、肺癌、非小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、舌癌、咽頭癌、食道癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、肝癌、膵臓癌、腎臓癌、腎細胞癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、ウィルムス腫瘍、悪性黒色腫、髄膜腫、神経芽腫、骨肉腫、カポジ肉腫、リンパ腫、白血病などが挙げられる。なお、本明細書において、用語「癌」は、これら悪性腫瘍の他、その転移をも含むものである。一方、感染症とは、例えば、ウイルス感染症、細菌感染症などが挙げられ、具体的には、HIV感染症、エイズの他、B型肝炎、C型肝炎、ヘルペス、インフルエンザ、肺炎、結核、EBウイルス感染症などが挙げられる。
疲労とは、身体的あるいは精神的負荷を連続して与えたときに一時的な身体的および/または精神的パフォーマンスの低下として現れる状態をいい、ここで、パフォーマンスの低下とは、身体的および/または精神的作業能力の質的あるいは量的な低下を意味する。また、本発明の「疲労」は、慢性的な疲労や、慢性疲労症候群における疲労または過労死をもたらす疲労をも包含するものとする。
アレルギー疾患とは、少なくもI型アレルギーに起因するアレルギー疾患をいい、ここで、I型アレルギーとは、クームス分類によるものをいう。よって、「少なくもI型アレルギーに起因するアレルギー疾患」としては、例えば、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支ぜんそく、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、好酸球性肺炎、食物アレルギー、アナフィラキシーショックなどが挙げられる。このうち、花粉症、アトピー性皮膚炎が好ましい。
脱毛症とは、種々の原因により毛髪が少なくなった状態(症状)をいう。代表的な脱毛症としては、例えば、男性型脱毛症(禿頭症)、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、老人性脱毛症、円形脱毛症、分娩後脱毛症、機械性(圧迫性)脱毛症、抜毛症(精神疾患)等が挙げられる。このうち、円形脱毛症が好ましい。
皮膚改善とは、皮膚の美白化、色素沈着(例えば、シミ、そばかす、肌のくすみ、老人性色素斑、ホクロ、母斑、ダークサークル)の抑制若しくは改善、角質除去若しくは角質ターンオーバー促進、老化防止、しわ抑制若しくは改善、保湿化、または再生などをいう。このうち、皮膚の美白化、色素沈着の抑制若しくは改善、しわ抑制若しくは改善が好ましい。
固体のウシ乳1mgを、1mlの1×PBSで溶解し、この溶液100μlにβ-ガラクトシダーゼ(和光純薬工業(株)製、カタログNo.072-04141、10mU/μl)6.5μl、シアリダーゼ(SIGMA-ALDRICH社製、N2876、10mU/μl)6.5μl、および100mM SPB(15.601gのNaH2PO4・2H2Oおよび35.814gのNa2HPO4・12H2Oを、500mlの蒸留水に溶解して、200mM SPB(pH7.0)を調製し、これを希釈して、100mM SPBとする。)87μlを加え、37℃で3時間インキュベートする。インキュベート後、100mM SPBをさらに200μl加え、60℃で10分間、熱処理する。熱処理後、マイクロコン(10000MWCO YM-10、MILLIPORE社)で濃縮し、タンパク質濃度を、波長570nmでの吸光度測定により決定(BSA(bovine serum albumin、SIGMA、A4503)について作成した検量線を使用)する。これにより、タンパク質濃度(μg/μl)を求める(検体1)。
マウス(ICR系雌性)を頸椎脱臼し、腹部の外皮を剥ぎ、内臓を傷つけないようにして、腹腔にリン酸緩衝生理食塩水(PBS:0.01Mのリン酸ナトリウム、0.9%のNaClおよび5単位/mlのヘパリンを含有する)を10mlを注入する。腹部を1分程度タッピングした後、腹腔液を回収し、腹膜細胞を収集する。回収した腹腔液を遠心(1500rpm、4℃、15分)した後、上清を破棄しRPMI培地を加え、ピペッティングする。Burker-Turk型血球計算盤で細胞数を計測し、1.0×106cells/mlになるように、さらにRPMI培地を加えて調整する。なお、RPMI培地は以下の操作にて調製する。すなわち、クリーンベンチ内で、粉末培地(GIBCO社製、カタログ番号:856846)を精製水900mlに溶解した後、さらに2gのNaHCO3を溶解する。混合物を、1NHClでpH7.2に調整した後、精製水を用いて全量を1000mlとする。こうして得た溶液をフィルター(MILLIPORE、SLGVJ13SL)にて濾過したものをRPMI培地とし、使用時まで、4℃で保管する。
各検体は、コントロールおよび比較検体に対し、優れた摂食指数を示す。
(各サンプルの調製)
乳サンプルは、未処理ウシ乳を100mM PBS(pH=7.0)で100μg/mlに希釈して調製する。
RPMI培地17mlに、コラゲナーゼD(collagenase D)(Roche、11088858001)2mlとディーエヌエースI(DNaseI)(Roche、11284932001)1mlを溶かし、37℃に温め、コラゲナーゼ培地(collagenase medium)を調製する。
C57BL/6雌マウス(7週齢)に20mg/mlの抱水クロラール(SIGMA、A2374)400μlを腹腔投与し、麻酔をかける。マウスの右腹部を切り裂き、腸を露出させ各サンプル(1mg/kg)を投与した後、腹部を閉じた。投与1時間後、再度腹部を切り裂いて腸を露出させ、非標識OVAプロテイン(SIGMA、A5503-1G)およびAF488標識OVAプロテイン(life technologies、O34781)を投与し、腹部を閉じる。投与1時間後、マウスを頸椎脱臼させ、腸を取り出す。取り出した腸を傷つけないようにして脂肪およびパイエル板を除去し、PBSで洗浄する。腸を2cm程度に切断して、37℃に温めたFACS緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水(PBS:0.01Mのリン酸ナトリウム、0.9%のNaClおよび5単位/mlのヘパリンを含有する)41.98mlに、FBS(非動化済み)(GIBCO社製、10437)5mlと、EDTA(ナカライテスク社製、15111-45、500mM)1mlと、HEPES(MP社製、1688449、1M)1mlと、ピルビン酸ナトリウム(GIMCO社製、11360-070、100mM)500μlと、硫酸ポリネキシンB(GIMCO社製、21850-029、25mg/ml)20μlと、ペニシリン・ストレプトマイシン(GIMCO社製、15140-122、10,000U/ml)500μl)50mlに入れ、37℃のインキュベーター中にて、スターラーで、20分間攪拌する(250rpm程度)。
乳酵素処理物は、酵素未処理の乳に比べ、腸管における卵白アルブミン(OVA)陽性マクロファージの貪食能活性を増加させる。
シアリダーゼを使用しなかったこと以外は、乳酵素処理物(1)の調製と同様に処理して、タンパク質濃度がそれぞれ、10ng/10μl(検体2-1)、100ng/10μl(検体2-2)である各検体を調製する。
上記検体を用いて、マクロファージ貪食能活性(1)と同様にして、摂食指数を求める。その結果、各検体は、コントロールに対し、優れた摂食指数を示す。
ウシ乳(固体)1gを、100mlの50mM SPB(15.601gのNaH2PO4・2H2Oおよび35.814gのNa2HPO4・12H2Oを、500mlの蒸留水に溶解して、200mM SPB(pH7.0)を調製し、これを希釈して、50mM SPBとした。)で撹拌溶解し、1%溶液を調製する。この溶液を8,000rpm、4℃で1時間遠心する。上清を、G2膜、8μm、5μm、1.2μm、0.2μm(ミリポア社、ニトロセルロースフィルター)で順次、ろ過処理する。ろ液を中空糸膜(旭化成ケミカルズ社、ペンシル型モジュールSEP-0013)で透析処理する。
慢性疲労症候群の患者に、5ヵ月間投与したところ、疲労感および意欲低下が大幅に改善する。
アトピー性皮膚炎の患者に3カ月間投与したところ、肌状態は落ち着き、腫れ、赤み、かゆみがおさまり、皮膚が柔らくなり、滑らかになる。花粉症の患者に1カ月間投与したところ、目のかゆみが改善し、鼻づまり、くしゃみなどの症状がなくなる。
円形脱毛症の患者に1ヵ月間投与したところ、新しい毛髪が生えてくる。
しみ、そばかす、しわを有する患者に投与したところ、しみ、そばかすが薄くなり、肌がつるんとし、かつ、肌のきめが細かくなる。
脱チーズ成分処理した粗脱チーズ成分乳(一般財団法人蔵王酪農センターから入手した乳清)を8,000rpm、4℃で1時間遠心し、沈殿物に注意して、上清を回収した。回収した上清と等量の蒸留水(Mill-Qグレード。以下、特に断りの無い限り同じグレードのものを使用)を加え、ペンシル型モジュールUF膜(フナコシ、AIP-0013D)で透析処理した。この時、濾液が加えた蒸留水と等量に達するまで透析を行い、脱チーズ成分乳(乳清)を得た。タンパク質濃度を、波長570nmでの吸光度測定により決定(BSA(bovine serum albumin、SIGMA、A4503)について作成した検量線を使用)した。
上記で得た粉末状の乳酵素処理物(4)を、100mM PBSで希釈し、所定濃度のタンパク質を含む検体4-1(10ng/10μl)および同4-2(100ng/10μl)を、それぞれ調製した。また、酵素処理する前の脱チーズ成分乳を、必要に応じ、100mM PBSで希釈し、所定濃度のタンパク質を含む比較検体4-1(10ng/10μl)および同4-2(100ng/10μl)を、それぞれ調製した。さらに、ポジティブコントロールとして、LPS(Lipopolysaccharide,from Escherichia coli、SIGMA、L2755)が1μg/10μlの検体を調製した。なお、タンパク質濃度は、いずれも、波長570nmでの吸光度測定により決定(BSA(bovine serum albumin、SIGMA、A4503)について作成した検量線を使用)した。
(検体の調製)
マーカーは、ワイドビューTMプレステインたん白質サイズマーカーIII(WIDE-VIEW TM Prestained Protein Size Marker III)(和光純薬工業(株)より入手、230-02461)を用いた。
一次抗体として、WFAに代えて、抗ビタミンD結合タンパク質抗体(10μlのAnti-Vitamin D Binding protein Antibody(Bioss社製、bs-3915R)を10mlのTBS-Tで希釈して調製)を使用したこと、および、二次抗体として、ストレプトアビジンに代えて、Anti-Rabbit IgG(1μlのAnti-Rabbit IgG(whole molecule)1ML(SIGMA、A6154-1ML)を10mlのTBS-Tで希釈して調製)を使用したこと以外は、上記ウエスタンブロッティング(1)と同様に処理して、図3の結果を得た。乳酵素処理物(4)の陽性バンドの分子量に関し、29.3kDa、31.9kDa、48.8kDa、57.8kDa、79.1kDa、96.2kDaに相当することを図3に追記した。
2 貪食されているSRBC
3 マクロファージ
Claims (8)
- 乳をβ-ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼと接触させる工程を含んでなり、
前記乳がウシ初乳を含まない、乳酵素処理物の製造方法。 - 酵素処理の前に、乳を濃縮または脱チーズ成分処理しておく工程をさらに含んでなる、請求項1記載の製造方法。
- 請求項1または2に記載の製造方法により得られる乳酵素処理物。
- 1回の投与用として、0.02μg~40mgの範囲の量のタンパク質を含む請求項3記載の乳酵素処理物。
- 請求項3または4記載の乳酵素処理物を含んでなる医薬組成物。
- 請求項5記載の医薬組成物を含んでなる医薬品。
- 請求項3または4記載の乳酵素処理物を含んでなる飲食品用組成物。
- 請求項7記載の飲食品用組成物を含んでなる飲食品。
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