JP5860817B2 - 医薬組成物およびその製造方法 - Google Patents
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Description
[1]ヒト血清を、β−ガラクトシダーゼと接触させる工程を含んでなる、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物の製造方法、
[2]ヒト血清を、シアリダーゼと接触させる工程をさらに含んでなる、上記[1]記載の製造方法、
[3]上記[1]または[2]記載の製造方法により得られる、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物、
[4]ヒト血清が、健康な他人から採取した血液から調製されたものである、上記[3]記載の医薬組成物、
[5]医薬組成物が抗癌用または抗感染症用である、上記[3]または[4]記載の医薬組成物、
[6]ヒト血清が癌患者または感染症患者から採取した血液から調製されたものであって、かつ、医薬組成物が血液を採取した該患者に投与されるものである、上記[5]記載の医薬組成物、
[7]1回の投与用として、0.1〜0.4mg/kgのタンパク質を含む、上記[3]〜[6]のいずれか一つに記載の医薬組成物、
に関する。
さらに、本発明に係るヒト血清酵素処理物は、ヒト血清をβ−ガラクトシダーゼ、または、β−ガラクトシダーゼおよびシアリダーゼで処理することによって調製できるため、これを含んでなる本発明の医薬組成物の製造方法は、簡便かつ低コストであるという利点を有する。
本発明において、β−ガラクトシダーゼは、単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
本発明において、シアリダーゼは、単独で用いてもよく、2種以上を組み合わせて用いてもよい。
酵素処理の温度は、酵素が活性を示す温度であれば特に限定はないが、通常酵素が高い活性を示す37℃付近の温度である。
熱処理後の検体は、所望により、濃縮してもよい。当該濃縮は、市販の機器、例えば遠心濃縮器(例えば、MILLIPORE社製の10000MWCO YM−10)を用いて行うことができる。
(検体1)
患者(属性:男性、63歳、家族性高コレステロール血症)から血液50mlを、真空採血管に採取した。該血液を遠心(3000rpm、10分間)して、血球成分を分離し、血清を得た。
該血清100μlをエッペンチューブにとり、β−ガラクトシダーゼ(和光純薬工業(株)製、カタログNo.072−04141,10mU/μl)6.5μl、シアリダーゼ(SIGMA−ALDRICH社製,N2876,10mU/μl)6.5μl、および100mMSPB(15.601gのNaH2PO4・2H2Oおよび35.814gのNa2HPO4・12H2Oを、500mlの蒸留水に溶解して、200mM SPB(pH7.0)を調製し、これを希釈して、100mM SPBとした。)87μlを加え、37℃で3時間インキュベートした。インキュベート後、100mMSPBをさらに200μl加え、60℃で10分間、熱処理した。熱処理後、マイクロコン(10000MWCO YM−10、MILLIPORE社)で濃縮し、タンパク質濃度を、波長570nmでの吸光度測定により決定したところ(BSA(bovine serum albumin、SIGMA,A4503)について作成した検量線を使用)、79.4μg/μlであった(検体1)。
患者(属性:男性、63歳、家族性高コレステロール血症)から血液を採取し、上記検体1の調製と同様に処理して、検体2(タンパク質濃度:137.96μg/μl)を得た。
検体1の調製に際し、酵素処理する前の血清について、タンパク質濃度を同様に決定したところ、134.1μg/μlであった(比較検体1)。該比較検体1を、100mMSPBを用いて希釈し、タンパク質濃度がそれぞれ、0.1ng/10μl(比較検体1−1)、1ng/10μl(比較検体1−2)、10ng/10μl(比較検体1−3)、100ng/10μl(比較検体1−4)、1μg/10μl(比較検体1−5)、10μg/10μl(比較検体1−6)である各検体を調製した。
さらに、TX−1934(2−[(4−メトキシ−3,5−ジメチルフェニル)メチレン]−4−シクロペンテン−1,3−ジオン)を、(DMSO):(生理食塩水):(2%メチルセルロースを含む生理食塩水)=1:9:10の割合で混合した溶媒に溶解して、10μg/10μlの濃度とし、これを、比較検体2とした。該比較検体2は、血管新生阻害作用の観察において、ポジティブコントロールとして用いた。
マウス(8週齢、ICR系雌性、日本エスエルシー)を頸椎脱臼し、腹部の外皮を剥ぎ、内臓を傷つけないようにして、腹腔にリン酸緩衝生理食塩水(PBS:0.01Mのリン酸ナトリウム、0.9%のNaClおよび5単位/mlのヘパリンを含有する)を10 mlを注入した。腹部を1分程度タッピングした後、腹腔液を回収し、腹膜細胞を収集した。回収した腹腔液を遠心(1000rpm,4℃,15分)した後、上清を破棄しRPMI培地を加え、ピペッティングした。Burker−Turk型血球計算盤で細胞数を計測し、1.0×106cells/mlになるように、さらにRPMI培地を加えて調整した。なお、RPMI培地は以下の操作にて調製した。すなわち、クリーンベンチ内で、粉末培地(GIBCO社製、カタログ番号:856846)を精製水900mlに溶解した後、さらに2gのNaHCO3を溶解した。混合物を、1NHClでpH7.2に調整した後、精製水を用いて全量を1000mlとした。こうして得た溶液をフィルター(MILLIPORE、SLGVJ13SL)にて濾過したものをRPMI培地とし、使用時まで、4℃で保管した。
(1日目)プレインキュベーション
孵卵0日目の鶏受精卵を、鶏卵台の上に尖った方を下に向けて置き、孵卵器で孵卵させながら37.6℃で4日間、プレインキュベーションした。器内の底部にSDW(滅菌水)を満たしたバットを置き、湿度を保った。
4日間培養した受精卵を、鶏卵台に載せたまま孵卵器から取り出し、受精卵を70%エタノール綿で消毒後、卵殻の気室上方部と側部の2ヶ所に、錐で穴をあけた(図4A)。鶏卵側部の穴から約4mlの卵白を注射器(10ml,18G)の針の穴を卵殻の方に向けた状態で吸引除去した。次に気室上方部の穴にシリコンスポイトをあてて吸引し、卵殻膜から卵黄のうや胚を剥離した。鶏卵側部の穴をテガタームでシールした。シールした受精卵は、クリーンベンチに移動させ、気室上方部の穴の周りの卵殻を、先の曲がったピンセットで除去し、直径1cm程度に広げて卵殻膜を露出させた。この露出した卵殻膜の一部を、先の尖ったピンセットを用いて取り除いた(図4B)。気室上方部にステンレス製のキャップをかぶせ、39℃で湿度を保ったインキュベーターで24時間、インキュベーションした。
インキュベーターから受精卵を取り出し、クリーンベンチ内に移動させた。ステンレス製のキャップを取り、CAMを3段階でサイズ分けした(1:直径5mm以上,2:直径3mm以上〜5mm未満,3:直径3mm未満)。異なる検体を添加する各群間において、CAMの大きさがほぼ平等になるように分け、いずれの検体を添加するのかわかるよう、ラベリングして並べた。このときコントロール群には、最も成長のよいものを選んだ。
シリコンリングをCAMのほぼ中心に乗せ、各検体をシリコンリングの中央に10μl添加した(図5)。なお、コントロールとして、(DMSO):(生理食塩水):(2%メチルセルロースを含む生理食塩水)=1:9:10の割合で混合した溶媒を10μl添加した。再びステンレス製のキャップを被せ、インキュベーターに戻した。
インキュベーターから受精卵を取り出し、クリーンベンチ内に移動させた。ステンレス製のキャップを取り、リングがCAMの上に乗っているかを確認し、リングが移動している場合は、先の尖ったピンセットを用いて、CAMの上にスライドさせた。その後、再びステンレス製のキャップを被せ、インキュベーターに戻した。そして、インキュベーターの温度を39.5℃に変え、インキュベートした。
インキュベーターから受精卵を取り出し、プラッテの上に置いた。ハサミを用いて殻を取り除き窓を広げ、CAMを観察しやすいようにした。このとき、卵殻膜が残っていた場合は、血管を傷つけないように先の尖ったピンセットで剥した。シリンジ(1ml,27G)に、イントラリポス輸液(大塚製薬(株)製、承認番号22000AMX00284)約1mlをとり、空気が入らないように注意しながら、CAM上の血管の少ない部分に針を刺して、ゆっくり注入した。このときイントラリポスが漏れたり、流血したりしたときはキムワイプを用いてふき取った。
各卵についての血管新生阻害効果を表3の判断基準に基づき判定した。
1群5匹のICRマウス(10週齢、メス)に、エールリッヒ腹水癌細胞(細胞起しから、in vivoで、2代継代培養したもの)を腹腔内移植した(1×107cell/マウス)。移植翌日から、1日1回7日間、各マウスに、検体2を含む生理食塩水0.1ml/マウスを腹腔内投与した。検体2の投与量は、投与したタンパク質量の総量が、11.25μl/kgとなるようにそれぞれ調節した。なお、検体2を含む生理食塩水は、7回投与分を一度にまとめて調製後、0.22μmの滅菌フィルターに通し、4℃、遮光条件下で保存したものを使用した。コントロールとして、検体2を含む生理食塩水に代えて、等量(0.1ml/マウス)の生理食塩水を投与した。
2 貪食されているSRBC
3 マクロファージ
4 漿尿膜(CAM)
5 シリコンリング
6 胎児
Claims (6)
- ヒト血清を、β−ガラクトシダーゼと接触させる工程およびシアリダーゼと接触させる工程を含んでなる、ヒト血清酵素処理物を含んでなる医薬組成物の製造方法。
- ヒト血清をβ−ガラクトシダーゼと接触させる工程と、ヒト血清をシアリダーゼと接触させる工程が同一の工程である、請求項1記載の製造方法。
- 請求項1または2記載の製造方法により得られる、ヒト血清酵素処理物を含んでなる、抗癌用または抗感染症用である医薬組成物。
- ヒト血清が、健康な他人から採取した血液から調製されたものである、請求項3記載の医薬組成物。
- ヒト血清が癌患者または感染症患者から採取した血液から調製されたものであって、かつ、医薬組成物が血液を採取した該患者への投与用である、請求項3記載の医薬組成物。
- 1回の投与用として、0.1〜2.0mg/kgのタンパク質を含む、請求項3〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物。
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