JP6796299B2 - 免疫賦活用組成物及びサイトカイン産生促進用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、自然免疫及び獲得免疫を活性化するための免疫賦活用組成物及びサイトカイン産生促進用組成物に関する。

外来異物に対する防御反応として、自然免疫及び獲得免疫がある。また、獲得免疫は、細菌などの細胞外異物に対する体液性免疫と、ウイルスなどの細胞内異物に対する細胞性免疫とに大別される。

自然免疫では、細菌やウイルスなどの外来異物を、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞などが細胞表面や細胞膜貫通型のパターン認識受容体であるＴＬＲ（Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；トール様受容体）を介して感知する。このようにして異物の侵入を感知した細胞は、サイトカイン、ケモカイン、脂質メディエーターなどの生理活性物質を産生する。

外来異物が細胞外異物である細菌である場合は、上記の生理活性物質の作用などによって、マクロファージや好中球といった貪食細胞が細菌を貪食及び分解する。外来異物が細胞内異物であるウイルスである場合は、ウイルスやウイルスに感染した細胞はマクロファージ、樹状細胞、ＮＫ細胞によって貪食又は破壊され、さらにこれらの細胞によって産生されたインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）などのサイトカインによる抗ウイルス作用によってウイルスの増殖や複製が阻害される。

一方、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）などの細菌によっても、ＩＦＮ−αの産生が誘導されることが知られている。産生したＩＦＮ−αにより、マクロファージやＮＫ細胞が活性化して、外来異物である細菌を貪食及び破壊することが想定される。

自然免疫は、外来異物を大まかに認識して、非特異的な反応として生じる。それに対して、獲得免疫は、特定の抗原を認識して、特異的な反応として生じる。

外来異物を取り込んだ樹状細胞やマクロファージは、外来異物を分解しながらリンパ管に入り、リンパ節に移動する。これらの細胞は抗原提示細胞としてＭＨＣクラスＩＩ分子を介して外来異物の抗原部分を細胞表面上に抗原提示する。この抗原提示の部分と、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の細胞表面にある抗原認識受容体であるＴＣＲ（Ｔｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｔ細胞受容体）とが、特異的に結合する。

抗原提示を受けたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞は、マクロファージや樹状細胞により産生されるサイトカインの作用によって、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、細胞障害性Ｔ細胞（Ｔｃ）などのエフェクターＴ細胞に分化及び増殖する。例えば、マクロファージ、樹状細胞及びＮＫ細胞によって産生されたインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）やＩＦＮ−γにより、抗原提示を受けたＣＤ４＋ナイーブＴ細胞はＴｈ１細胞へ分化及び増殖する。

その後、ヘルパーＴ細胞であるＴｈ１細胞及びＴｈ２細胞が産生するＩＦＮ−γといったサイトカインの作用などにより、Ｂ細胞は特定の抗原に対する抗体を産生する形質細胞へ、及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞はＴｃ細胞への分化、増殖及び活性化を通じて、獲得免疫が発揮される。このように、獲得免疫ではＴｈ１細胞が重要な役割を担うことから、獲得免疫を活性化するためにはＴｈ１細胞への分化を誘導するＩＬ−１２及びＩＦＮ−γの産生が求められる。

自然免疫におけるＩＦＮ−αなどのサイトカインの産生や獲得免疫における抗原提示など、免疫系において樹状細胞が重要な役割を担う。樹状細胞は、プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）及びミエロイド樹状細胞（ｍＤＣ）に大別でき、ｍＤＣはさらにＣＤ１９が陰性であるｍＤＣ１及びＢＤＣＡ３が陽性であるＢＤＣＡ３ＤＣに分けることができる。これらの樹状細胞サブセットは、それぞれ発現する細胞表面分子マーカーの種類及び程度、産生するサイトカインの種類などが相違することが知られている（例えば、非特許文献１及び２を参照）。

樹状細胞のうち、ｐＤＣは、ヒト末梢血における単核球の１％にも満たない極めてマイナーなサブセットである。ｐＤＣは、樹状形態を有するｍＤＣとは異なり、末梢血中に存在して形質細胞に似た形質を示し、外来異物を取り込むなどして刺激を受けると樹状細胞様に分化する。ｐＤＣが外来異物に応答すると、ＩＦＮ−αといったＩ型ＩＦＮが大量に産生され、自然免疫を活性化する。

例えば、ｐＤＣを活性化してＩＦＮ−αの産生を促進する可能性があるものとして、特許文献１にはラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ）が記載されている。

また、乳酸菌によるサイトカインの産生誘導に関する文献として、特許文献２及び特許文献３が知られている。すなわち、特許文献２には、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）及びペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）がマウス腹腔滲出マクロファージのＩＬ−１２産生を誘導したことが記載されている。特許文献３には、テトラジェノコッカス・ハロフィラス（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）がマウス骨髄由来樹状細胞（ｍＤＣ）のＩＦＮ−β及びＩＬ−１２の産生を誘導したことが記載されている。

国際公開第２０１２／０９１０８１号 特開２００６−０２８０４７号公報 特許第５３１２３２２号

Jens Geginat et al., Frontiers in Immunology, October 2015, Vol.6, Article 527 Bing Liu et al., Gastroenterology Research and Practice, Vol. 2015, Article ID 796461

特許文献１によれば、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスにより、ｐＤＣによるＩＦＮ−αの産生が誘導されている。しかし、ＩＦＮ−γについてはＩＦＮ−αより産生量が少なく、さらに菌株間でのばらつきが大きい。また、特許文献１には、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスにより、ｐＤＣを含む樹状細胞のＩＬ−１２の産生誘導について、実証された実験データを伴った記載が無い。

したがって、特許文献１に記載のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスによって自然免疫が活性化し得るとしても、ＩＬ−１２やＩＦＮ−γといったＣＤ４＋ナイーブＴ細胞をＴｈ１細胞へと分化する作用を有するサイトカインの産生を通じた獲得免疫の活性化は期待できず、たとえ活性化されるとしてもその程度は非常に小さい蓋然性がある。

また、特許文献２には、ｐＤＣを含む樹状細胞による獲得免疫を活性化するサイトカインの産生を誘導し得る乳酸菌についての記載は無い。特許文献３には、ｍＤＣだけではなく、ｐＤＣに対しても、テトラジェノコッカス・ハロフィラスが、自然免疫及び獲得免疫を活性化するサイトカインの産生促進作用を有することについての記載は無い。

したがって、特許文献１〜３には、ｐＤＣに対して自然免疫及び獲得免疫を活性化するサイトカインの産生促進作用を示す物質についての記載は無い。また、ｐＤＣが自然免疫を活性化するサイトカインだけではなく、獲得免疫を活性化するサイトカインを産生することも、ほとんど知られていない。

そこで、本発明が解決しようとする課題は、ｐＤＣによる自然免疫及び獲得免疫を活性化するサイトカインの産生促進作用を示す物質を有効成分として含有する組成物を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）及びペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）といったペディオコッカス属乳酸菌がｐＤＣに対してＩＦＮ−α及びＩＬ−１２の産生促進作用を示すことを見出した。これまでｐＤＣが自然免疫を活性化するＩＦＮ−αに加えて、獲得免疫を活性化するＩＬ−１２の産生を促進することがほとんど知られていなかったという事実を鑑みれば、ペディオコッカス属乳酸菌がｐＤＣに対してＩＦＮ−α及びＩＬ−１２の産生を促進するということは驚くべきことである。

また、ペディオコッカス属乳酸菌が有するｐＤＣによるＩＦＮ−α及びＩＬ−１２の産生促進作用の程度は、特許文献１に記載のラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティスに比べると、非常に大きかった。このように、ｐＤＣに対してＩＦＮ−γの産生促進作用を有することがある程度は認められている菌株よりも、ペディオコッカス属乳酸菌が有するｐＤＣによるＩＦＮ−α及びＩＬ−１２の産生促進作用が大きいということは、非常に驚くべきことである。

さらに、ペディオコッカス属乳酸菌の中でも、ペディオコッカス・アシディラクティシが有するｐＤＣによるＩＦＮ−α及びＩＬ−１２の産生促進作用の程度は、マクロファージに対しては遜色の無いＩＬ−１２の産生促進作用を有することが認められているペディオコッカス・ペントサセウスよりも大きい。

これらの知見を基に、本発明者らは、ペディオコッカス属乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物などを有効成分として含有し、かつ、プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用を有する、免疫賦活用組成物を創作することに成功した。本発明はこれらの知見及び成功例に基づいて完成するに至った発明である。

したがって、本発明の一態様によれば、以下の［１］〜［９］に示す態様の組成物が提供される。
［１］ペディオコッカス属乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有し、かつ、プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用を有する、免疫賦活用組成物。
［２］前記組成物は、ウイルス感染に対する免疫賦活用組成物である、［１］に記載の組成物。
［３］ペディオコッカス属乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有し、かつ、プラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用を有する、サイトカイン産生促進用組成物。
［４］前記組成物は、前記有効成分と同量のラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ） ＪＣＭ５８０５株を用いる場合よりも高い、プラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用を有する、［３］に記載の組成物。
［５］前記ペディオコッカス属乳酸菌は、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）及びペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）からなる群から選ばれるペディオコッカス属乳酸菌である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組成物。
［６］前記ペディオコッカス属乳酸菌は、ペディオコッカス・アシディラクティシである、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組成物。
［７］前記組成物は、前記有効成分と同量のペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ９９株を用いる場合よりも高い、プラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用を有する、［６］に記載の組成物。
［８］前記組成物が、腸溶の組成物である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の組成物。
［９］［１］〜［８］のいずれか１項に記載の組成物を含有する飲食品用組成物。

本発明の一態様の組成物は、ｐＤＣによる自然免疫及び獲得免疫を活性化するサイトカインの産生促進作用を有し、さらに該作用に関連して、抗菌効果、抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗アレルギー効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗増殖活性効果、抗腫瘍効果、抗癌効果などを奏することが期待できる。

本発明の一態様の組成物で用いられる有効成分は飲食品の添加物などの使用実績のあるものである。したがって、本発明の一態様の組成物は、安全性が高いものであり、抗菌効果、抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗アレルギー効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗増殖活性効果、抗腫瘍効果、抗癌効果などとして有用であり、経口的又は非経口的な形態で提供することが期待できるものである。

図１Ａは、実施例に記載されているとおりの、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＪＭ５８０５株（「ＪＣＭ５８０５」）、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ９９株及びＮＲＩＣ１２２株（「ＮＲＩＣ９９」及び「ＮＲＩＣ１２２」）並びにペディオコッカス・アシディラクティシ ＪＣＭ８７９７株及びＫ１５株（「ＪＣＭ８７９７」及び「Ｋ１５」）による、被験者Ａから採取したｐＤＣのインターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）産生促進試験の結果を示す図である。なお、ネガティブ・コントロール（「ＮＣ」）としては培地（「Ｍｅｄ」）を用いている。 図１Ｂは、被験者Ｂから採取したｐＤＣを用いた以外は、図１Ａと同様のＩＬ−１２産生促進試験の結果を示す図である。 図１Ｃは、被験者Ｃから採取したｐＤＣを用いた以外は、図１Ａと同様のＩＬ−１２産生促進試験の結果を示す図である。 図１Ｄは、被験者Ｄから採取したｐＤＣを用いた以外は、図１Ａと同様のＩＬ−１２産生促進試験の結果を示す図である。 図２Ａは、実施例に記載されているとおりの、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＪＭ５８０５株（「ＪＣＭ５８０５」）、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ９９株及びＮＲＩＣ１２２株（「ＮＲＩＣ９９」及び「ＮＲＩＣ１２２」）並びにペディオコッカス・アシディラクティシ ＪＣＭ８７９７株及びＫ１５株（「ＪＣＭ８７９７」及び「Ｋ１５」）による、被験者Ａから採取したｐＤＣのインターフェロン−α（「ＩＦＮ−α」）産生促進試験の結果を示す図である。なお、ネガティブ・コントロール（「ＮＣ」）としては培地（「Ｍｅｄ」）を用いている。 図２Ｂは、被験者Ｂから採取したｐＤＣを用いた以外は、図２Ａと同様のＩＦＮ−α産生促進試験の結果を示す図である。 図２Ｃは、被験者Ｃから採取したｐＤＣを用いた以外は、図２Ａと同様のＩＦＮ−α産生促進試験の結果を示す図である。 図２Ｄは、被験者Ｄから採取したｐＤＣを用いた以外は、図２Ａと同様のＩＦＮ−α産生促進試験の結果を示す図である。 図３Ａは、実施例に記載されているとおりの、ラクトコッカス・ラクティス・サブスピーシーズ・ラクティス ＪＭ５８０５株（「ＪＣＭ５８０５」）、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ９９株及びＮＲＩＣ１２２株（「ＮＲＩＣ９９」及び「ＮＲＩＣ１２２」）並びにペディオコッカス・アシディラクティシ ＪＣＭ８７９７株及びＫ１５株（「ＪＣＭ８７９７」及び「Ｋ１５」）による、被験者Ａから採取したｐＤＣの共刺激分子マーカーＣＤ８６の解析結果を示す図である。なお、ネガティブ・コントロール（「ＮＣ」）としては培地（「Ｍｅｄ」）を用いている。 図３Ｂは、解析した共刺激分子マーカーがＣＤ８０である以外は、図３Ａと同様の共刺激分子マーカーの解析結果を示す図である。 図４Ａは、実施例に記載されているとおりの、被験者にペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株（「Ｋ１５」）及びデキストリン（「プラセボ」）を投与した場合のインフルエンザウイルスの罹患率の解析結果を示す図である。 図４Ｂは、実施例に記載されているとおりの、被験者にペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株（「Ｋ１５」）及びデキストリン（「プラセボ」）を投与した場合の発熱日数の解析結果を示す図である。 図４Ｃは、実施例に記載されているとおりの、他の乳酸菌を２０日以内に摂取した被験者にペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株（「Ｋ１５」）及びデキストリン（「プラセボ」）を投与した場合の発熱日数の解析結果を示す図である。

以下、本発明の一態様である組成物の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。

本発明の一態様の組成物は、ペディオコッカス属乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分（以下、単に「有効成分」とよぶ場合がある。）を少なくとも含有する。

本発明の一態様の組成物は、含有する有効成分によって、プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用、プラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用及びこれらの両方の作用を有し得る。本明細書では、これらの作用を総じて、「有効作用」とよぶ場合がある。本発明の一態様の組成物は、有効作用を有することにより、代表的には免疫賦活用組成物及びサイトカイン産生促進用組成物の態様をとり得る。

本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。

例えば、「組成物」は、通常用いられている意味のものとして特に限定されないが、例えば、２種以上の物質が組み合わさってなる物であり、具体的には、有効成分と別の物質とが組み合わさってなるもの、有効成分の２種以上が組み合わさってなるものなどが挙げられ、より具体的には、有効成分の１種以上と固形担体又は溶媒の１種以上とが組み合わさってなる固形組成物及び液性組成物などが挙げられる。

本明細書における「プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用」とは、例えば、プラズマサイトイド樹状細胞が関与する自然免疫及び獲得免疫がより向上する作用を意味する。プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用の評価方法は特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載があるように、プラズマサイトイド樹状細胞における共刺激分子ＣＤ８０／ＣＤ８６の発現量を測定することなどにより評価することができる。また、インフルエンザウイルスの罹患率により自然免疫の活性化作用を評価してもよく、さらに発熱した後、平熱に戻るまでの発熱日数により獲得免疫の活性化作用を評価してもよい。

本発明の一態様の組成物は、プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用を有することにより、免疫賦活用組成物の態様をとり得る。免疫賦活用組成物としての好ましい態様は、プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用を通じて、ウイルスの減弱又は感染したウイルスの除染をもたらす、ウイルス感染に対する免疫賦活用組成物である。

プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用は、プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫に関連するサイトカインの産生が向上する作用を包含する。したがって、本発明の別の一態様の組成物は、サイトカイン産生促進用組成物である。

プラズマサイトイド樹状細胞が産生する自然免疫に関連するサイトカインとしては、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−αなどが挙げられる。プラズマサイトイド樹状細胞が産生する獲得免疫に関連するサイトカインとしては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１２などが挙げられる。

ＩＦＮ−αは、Ｉ型インターフェロンの一種であり、ウイルスの増殖や複製を抑制する抗ウイルス作用を有する。また、ＩＦＮ−αは、ウイルスに感染した細胞の増殖抑制作用、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの自然免疫に関わる細胞の活性化作用、抗腫傷作用、ウイルス以外の細胞内寄生生物の発育抑制作用などを有する。ＩＦＮ−αはウイルス性肝炎の治療薬として臨床応用されている。

ＩＬ−１２は、３５ｋＤａのサブユニット（ＩＬ−１２Ａｐ３５）及び４０ｋＤａのサブユニット（ＩＬ−１２Ｂｐ４０）によって構成される７０〜７５ｋＤａのヘテロ二量体であり、ナイーブＴ細胞をＴｈ１細胞へ分化誘導する作用を有する。また、ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞及びＴリンパ球によるＩＮＦ−γの産生を誘導する作用を有し、さらにＴ細胞の増殖及び機能を刺激するＴ細胞刺激因子として知られている。また、ＩＬ−１２は、抗血管新生活性を示し、新しい血管の形成を阻害する。ＩＬ−１２は、種々の免疫関連疾患の病因において重要な役割を果たすといわれている。

プラズマサイトイド樹状細胞（ｐＤＣ）は、末梢血中に存在して形質細胞に似た形質を示し、外来異物を取り込むなどして刺激を受けると樹状細胞様に分化する細胞である。有効成分は、ｐＤＣに作用して、有効作用をもたらす。

本明細書におけるサイトカインの「産生促進作用」とは、例えば、サイトカイン遺伝子の発現量を促進すること、サイトカインタンパク質の翻訳量を増大すること及びサイトカインを産生するようにｐＤＣを活性化することのうち少なくともいずれか１つの作用をいう。

本発明の一態様の組成物がｐＤＣによるＩＦＮ−αの産生促進作用を有する場合は、本発明の一態様の組成物はｐＤＣによる自然免疫を活性化する作用を有するともいえる。また、本発明の一態様の組成物がｐＤＣによるＩＬ−１２の産生促進作用を有する場合は、本発明の一態様の組成物はｐＤＣによる獲得免疫を活性化する作用を有するともいえる。

ＩＬ−１２やＩＦＮ−αといったサイトカインの産生促進作用の評価方法は特に限定されず、例えば、後述する実施例に記載があるように、ｐＤＣが発現するサイトカイン遺伝子の発現量やサイトカインタンパク質の量を測定することなどにより評価することができる。

サイトカインの産生促進作用の評価方法の一具体例は、ｐＤＣと本発明の一態様の組成物とを共培養し、次いで培養後に回収した培養上清を試料溶液として、市販のサイトカイン測定キットを用いてサイトカイン濃度を測定することを含む方法などが挙げられるが、これに限定されない。共培養の条件は特に限定されず、例えば、サイトカインが失活せず、かつ、ｐＤＣが死滅しないような条件を挙げることができ、ｐＤＣの維持又は増殖に適した培地、温度、ＣＯ_２濃度、ｐＨなどを採用した培養条件であることが好ましい。

有効作用の程度は特に限定されないが、例えば、本発明の一態様の組成物を用いない場合と比べて、ｐＤＣによるサイトカインの産生量が多くなる程度であり；好ましくは、本発明の一態様の組成物を用いない場合と比べて、ｐＤＣによるＩＬ−１２及び／又はＩＮＦ−αの産生量が多くなる程度であり；より好ましくは、有効成分と同量のラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ） ＪＣＭ５８０５株を用いる場合と比べて、ｐＤＣによるＩＦＮ−α及び／又はＩＬ−１２の産生量が多くなる程度である。ペディオコッカス属乳酸菌がペディオコッカス・アシディラクティシである場合は、有効作用の程度は、有効成分と同量のペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ９９株を用いる場合と比べて、ｐＤＣによるＩＦＮ−α及び／又はＩＬ−１２の産生量が多くなる程度である。

また、有効作用の程度は、例えば、２００μｌ中に１×１０^７個のペディオコッカス属乳酸菌と２．５×１０^４個のｐＤＣとを共培養して２４時間後に回収した上清中のＩＬ−１２の濃度が１５ｐｇ／ｍｌ以上になる程度が好ましく、２０ｐｇ／ｍｌ以上になる程度がより好ましい。また、上限は特に限定されないが、典型的には１，０００ｐｇ／ｍｌ以下である。

本発明の一態様の組成物は、有効作用を有することにより、抗菌効果、抗ウイルス効果、免疫賦活効果、抗アレルギー効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗増殖活性効果、抗腫瘍効果、抗癌効果などを奏することが期待されるものであることから、抗菌用組成物、抗ウイルス用組成物、免疫賦活用組成物、抗感染症用組成物、抗Ｂ型肝炎用組成物、抗Ｃ型肝炎用組成物、腸管免疫賦活用組成物、気道免疫賦活用組成物、抗腫瘍用組成物、抗癌用組成物といった態様をとり得る。

本発明の一態様の組成物が奏する、抗菌効果、抗ウイルス効果、抗アレルギー効果、抗感染症効果、抗Ｂ型肝炎効果、抗Ｃ型肝炎効果、抗増殖活性効果、抗腫瘍効果、抗癌効果といった抗疾患効果とは、例えば、抗ウイルス効果の場合は、本発明の一態様の組成物の摂取個体における現在又は将来のウイルス性疾患の症状を改善、緩和若しくは治療し、又はウイルス性疾患に罹患しているとされる状態になることを抑制、遅滞若しくは予防することをいう。

本発明の一態様の組成物が奏する免疫賦活効果とは、例えば、本発明の一態様の組成物の摂取個体における現在又は将来の免疫系を活性化して、種々の疾患や異常を正常な状態になるように維持又は促進することをいう。

本発明の一態様の組成物の有効成分は、ペディオコッカス属乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物のいずれか１種又は２種以上である。

ペディオコッカス属乳酸菌は、通常知られているとおりのグラム陽性の乳酸を生成する球菌であるペディオコッカス属に属する乳酸菌であれば特に限定されないが、例えば、食経験のあるペディオコッカス属乳酸菌などが挙げられる。

ペディオコッカス属乳酸菌の入手方法は特に限定されず、例えば、ペディオコッカス属乳酸菌は漬物、酒粕、乳製品、醤油諸味などの発酵食品といった乳酸菌含有物から単離株として分離してもよいし、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、東京農業大学（ＮＲＩＣ）、理化学研究所（ＪＣＭ）、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）から分譲される菌株であってもよい。

ペディオコッカス属乳酸菌の具体例としては、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ペディオコッカス・セリコーラ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｌｉｃｏｌａ）、ペディオコッカス・クラウッセニー（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）、ペディオコッカス・ダムノサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｍｎｏｓｕｓ）、ペディオコッカス・エタノーリデュランス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｅｔｈａｎｏｌｉｄｕｒａｎｓ）、ペディオコッカス・イノピナタス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｏｐｉｎａｔｕｓ）、ペディオコッカス・パルヴルス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｒｖｕｌｕｓ）、ペディオコッカス・スティレッシー（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｔｉｌｅｓｉｉ）などが挙げられるが、これらに限定されない。ペディオコッカス属乳酸菌としては、これらのいずれか１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用し得る。

ペディオコッカス・アシディラクティシ及びペディオコッカス・ペントサセウスの具体的な非限定的な例としては、ペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株、ペディオコッカス・アシディラクティシ ＮＲＩＣ０１２４株、ペディオコッカス・アシディラクティシ ＪＣＭ８７９７株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＯＳ株（ＮＩＴＥ Ｐ−３５４）、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ１９１５株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ９９株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ１２２株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＪＣＭ２０２４株、ペディオコッカス・ペントサセウス ＡＴＣＣ３３３１４株などが挙げられる。

ペディオコッカス属乳酸菌の中でも、有効作用が大きく、食経験が豊富であることから、ペディオコッカス・アシディラクティシ及びペディオコッカス・ペントサセウスが好ましく、有効作用がより大きいことからペディオコッカス・アシディラクティシがより好ましく、ペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株及びペディオコッカス・アシディラクティシ ＪＣＭ８７９７株がさらに好ましい。

以下では、ペディオコッカス属乳酸菌として、ペディオコッカス・アシディラクティシを使用することを想定して、本発明の一態様の組成物の詳細について説明する。ただし、ペディオコッカス・アシディラクティシ以外のペディオコッカス属乳酸菌を用いる場合は、以下の「ペディオコッカス・アシディラクティシ」との記載を「ペディオコッカス・ペントサセウス」などの他のペディオコッカス属乳酸菌に読み替えればよい。

ペディオコッカス・アシディラクティシを分離する方法は特に限定されないが、例えば、常法に従って、乳酸菌含有物の抽出液を適宜希釈して、ＭＲＳ培地やＭ１７培地などの公知の乳酸菌培養用培地を用いて、３０℃〜４０℃程度で培養することを含む方法などが挙げられる。例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシ Ｋ１５株は、乳酸菌含有物として糠床から単離した乳酸菌株であり、その至適温度は４０℃前後である。

本発明者らの調べたところによれば、ペディオコッカス・アシディラクティシは、ストレス条件下で培養することにより、二本鎖ＲＮＡを高濃度で含有することができる。二本鎖ＲＮＡの含有量が大きいペディオコッカス・アシディラクティシとしては、例えば、菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり１,５００ｎｇ以上の二本鎖ＲＮＡを含有するペディオコッカス・アシディラクティシや菌体１×１０^１０ｃｆｕあたり核酸の総量に対する二本鎖ＲＮＡの割合が３．５％以上であるペディオコッカス・アシディラクティシなどが挙げられる。また、上限は特に限定されないが、典型的にはそれぞれ２００，０００ｎｇ以下及び９９％以下である。

ストレス条件とは、高塩濃度、高温、低温、貧栄養、富栄養、低ｐＨ、高ｐＨ、通気及びはこれらの組み合わせといった、乳酸菌を通常培養する条件から外れている条件であり、好ましくは乳酸菌の倍加時間が好適な条件で培養した場合の時間よりも長くなるような条件である。

具体的には、塩分によるストレス条件下での培養とは、例えば、塩分０．５〜３０％（ｗ／ｖ）、好ましくは５〜１５％（ｗ／ｖ）を含む培地を使用して培養することが挙げられる。塩分濃度が０．５％（ｗ／ｖ）以下又は３０％（ｗ／ｖ）以上の培地では、ペディオコッカス・アシディラクティシの増殖が極端に遅くなることから好ましくない。

高温又は低温によるストレス条件下での培養とは、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシの増殖に適した至適温度±１℃〜３０℃、好ましくは至適温度±５℃〜２０℃で培養することが挙げられ、具体的にはペディオコッカス・アシディラクティシの至適温度が４０℃であれば１０℃〜３９℃又は４１℃〜６０℃で培養することなどが挙げられる。

通気によるストレス条件下での培養とは、例えば、空気を供給して、撹拌などすることにより溶存酸素濃度を高めるような条件下で培養することなどが挙げられる。この際、空気に代えて酸素ガスを用いてもよく、溶存酸素濃度が高められるのであれば撹拌以外に振盪などの手段を採用してもよい。なお、撹拌数は、培養槽の大きさなどによって適宜設定し得る。

空気の供給量（通気量）は特に限定されないが、例えば、単位体積当たり０．０１〜１０ＶＶＭ程度であり、好ましくは０．１〜１ＶＶＭ程度である。通気量が０．０１ＶＶＭより小さい場合は溶存酸素濃度が高められない可能性があり、通気量が１０ＶＶＭより大きい場合は大量の気泡によって乳酸菌が物理的にダメージを受ける可能性があることから、これらの場合は好ましくない。

ペディオコッカス・アシディラクティシを培養するその他の条件としては、ペディオコッカス・アシディラクティシの増殖に適した条件を用いればよく、例えば、使用する培地としては、ペディオコッカス・アシディラクティシの培養に通常使用する培地を採用することができ、そのような培地としては、例えば、ＭＲＳ培地及びＭ１７培地などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、培養時間はペディオコッカス・アシディラクティシの増殖が認められ、充分な菌体密度が得られる時間であれば特に限定されない。

ペディオコッカス・アシディラクティシは、ストレス条件下で培養することにより、ストレスがない条件下で培養する場合と比べて、例えば、二本鎖ＲＮＡなどの菌体成分をより多く産生し得る。

ペディオコッカス・アシディラクティシは、ストレス条件下で培養したペディオコッカス・アシディラクティシであっても、通常の条件下で培養したペディオコッカス・アシディラクティシであっても、いずれでもよい。ペディオコッカス・アシディラクティシは、例えば、ストレス条件下で培養したペディオコッカス・アシディラクティシの１種又は２種以上と、通常の条件下で培養したペディオコッカス・アシディラクティシの１種又は２種以上とを組み合わせたものであってもよい。

本発明の一態様の組成物における有効成分は、ペディオコッカス・アシディラクティシそれ自体、すなわち、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体に加えて、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体成分、ペディオコッカス・アシディラクティシの培養物、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物のいずれかの処理物であり得る。

ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体は、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシの培養物を遠心分離などの通常知られている固液分離手段を用いて培地を除去することにより得られる菌体などが挙げられる。

ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体成分は、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体内に存在する、又は菌体外に分泌する精製又は非精製の成分が挙げられ、具体的には一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ並びに一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡなどが挙げられる。

ペディオコッカス・アシディラクティシの培養物は、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシを培養して得た培養液そのものが挙げられる。

ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物の処理物は、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物を、殺滅菌処理、乾燥処理などの通常知られている乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物を処理する方法に供して得られる処理物などが挙げられる。

ペディオコッカス・アシディラクティシの培養物を殺菌し、培地を限外ろ過膜や遠心濃縮機などの通常知られている固液分離手段によって培地を除去して菌体を回収し、次いで得られた菌体を水や食塩水などで洗浄することにより、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体を得ることができる。このようにして得られた菌体をそのままで、又はデキストリンなどの糖といった食品素材と混ぜたものを、乾燥処理に供して得られる乾燥粉末などを、有効成分として使用可能である。乾燥処理の方法は特に限定されず、例えば、自然乾燥、風乾、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。本発明の一態様の組成物が含有する有効成分は、保存性や製造上の取り扱いの容易さから、ペディオコッカス・アシディラクティシの乾燥粉末であることが好ましい。

有効成分は、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物であれば特に限定されないが、例えば、核酸を含有する菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物が好ましく、ＲＮＡを含有する菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物であることがより好ましく、二本鎖ＲＮＡを含有する菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物であることがより好ましい。

ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物は、それらのいずれか１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができるが、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からＲＮＡ、好ましくは二本鎖ＲＮＡを単離して使用してもよい。ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からＲＮＡを単離する方法は特に限定されないが、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体から二本鎖ＲＮＡを単離する方法としては、特許文献３に記載の方法などが挙げられる。

二本鎖ＲＮＡを含有するペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物を入手する方法は特に限定されないが、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシを通常のＭＲＳ培地に植菌し、３５℃〜４５℃で２４時間〜７２時間培養することにより、二本鎖ＲＮＡを含有するペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物を入手する方法などが挙げられる。

ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物から二本鎖ＲＮＡを単離する方法の具体例としては、例えば、以下の方法が挙げられる。すなわち、二本鎖ＲＮＡを含有するペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物を９０〜１００℃で５〜２０分間の加熱殺菌処理に供して加熱殺菌処理液を得る。次いで加熱殺菌処理液を遠心分離等の固液分離手段に供して固形分を回収する。次いで固形分を洗浄して緩衝液に懸濁して懸濁液を得る。次いで懸濁液にリゾチームを添加して３５〜４０℃で加温してリゾチーム処理液を得る。次いでリゾチーム処理液にＳＤＳ及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを添加して３５〜４０℃で加温してプロテナーゼ処理液を得る。次いでプロテナーゼ処理液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール処理に供し、遠心分離等の固液分離手段により上清として粗核酸抽出液を得る。粗核酸抽出液には、ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡなどを含有する核酸混合物である。次いで、粗核酸抽出液を、セルロースカラムクロマトグラフィーに供することによって、精製された二本鎖ＲＮＡを得ることができる。セルロースカラムクロマトグラフィー及びその後の高度な精製手段は、特許文献３の記載に準じて実施することができる。

一般的なペディオコッカス・アシディラクティシは、長期にわたりヒトに摂取されてきた実績があり安全性が高いことから、本発明の一態様の組成物は、実用性が高く、そのままで、又は加工することにより、種々の用途に適用可能である。

本発明の一態様の組成物は、その摂取方法について特に限定されず、例えば、経口的又は非経口的に適用され得る。非経口的な適用としては、皮内、皮下、静脈内、筋肉内投与などによる注射及び注入；経皮；鼻、咽頭などの粘膜からの吸入などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の一態様の組成物の摂取個体は特に限定されず、例えば、動物、中でも哺乳類が挙げられ、哺乳類としてはヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジなどが挙げられ、これらの中でもヒトであることが好ましい。摂取個体は、健常な個体であってもよいが、抗疾患効果や免疫賦活効果が望まれる個体であることが好ましい。

本発明の一態様の組成物は、用途に応じて、例えば、有効成分と他の成分とを組み合わせて含有し得る。すなわち、本発明の一態様の組成物は、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物に加えて、本発明の目的を達成し得る限り、他の成分として種々のものを配合できる。

他の成分としては、例えば、糖質甘味料、安定化剤、乳化剤、澱粉、澱粉加工物、澱粉分解物、食塩、着香料、着色料、酸味料、風味原料、栄養素、果汁、卵などの動植物性食材、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、香油、保存剤、緩衝剤などの通常の食品加工や医薬品加工に使用される添加物などを挙げることができる。他の成分の使用量は、本発明の課題の解決を妨げない限り特に限定されず、適宜設定され得る。

本発明の一態様の組成物は、通常用いられる形態であれば特に限定されず、例えば、固形状、液状、ゲル状、懸濁液状、クリーム状、シート状、スティック状、粉状、粒状、顆粒状、錠状、棒状、板状、ブロック状、ペースト状、カプセル状、カプレット状などの各形態を採り得る。

本発明の一態様の組成物は、例えば、経口用組成物である場合に、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物を、食道及び胃を経由して小腸へ送達し得るものとして、腸溶性組成物とすることが好ましい。腸溶性組成物は、胃酸では溶けずに小腸において溶解する形態の組成物であれば特に限定されず、例えば、耐酸性マイクロカプセルやリポソームの形態の組成物などが挙げられる。

有効成分の含有量は、いずれかの有効作用が認められる量であれば特に限定されないが、経口用組成物としては、例えば、組成物全体に対して、０．０００１質量％〜９９質量％、好ましくは０．００１質量％〜９０質量％であり、非経口用組成物としては、例えば、０．００００１質量％〜９９質量％、好ましくは０．０００１質量％〜９０質量％である。

本発明の一態様の組成物の摂取量は特に限定されず、摂取個体の年齢、体格、症状などの摂取個体の特性；摂取方法；適用部位などに合わせて適宜設定することができる。本発明の一態様の組成物の摂取量は、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体を有効成分とする組成物の摂取量は１〜１，０００ｍｇ／体重６０ｋｇ／日である。摂取回数は特に限定されないが、例えば、１日１〜３回であり、摂取量に応じて適宜回数を増減することができる。

本発明の一態様の組成物は、該組成物を単独で、又は該組成物を配合する飲食品用組成物や医薬品用組成物などの形態をとり得る。したがって、本発明の具体的な一態様は、有効成分を含有する、又は本発明の一態様の組成物を含有する、飲食品用組成物、医薬品用組成物、医薬部外品用組成物、化粧品用組成物、動物飼料用組成物などである。

本発明の一態様の組成物が飲食品用組成物である場合は、摂取後に少なくとも有効作用が発揮し得る限り、あらゆる飲食品の形態をとり得るが、例えば、果汁飲料、野菜ジュース、果物野菜ジュース、茶飲料、コーヒー飲料、スポーツドリンク、清涼飲料、健康飲料などの飲料；ヨーグルトやチーズなどの乳製品；スープ、麺、プリン、ジャムなどの加工飲食品；チューインガム、キャンディ、錠菓、グミゼリー、チョコレート、ビスケット、スナックなどの菓子；アイスクリーム、シャーベット、氷菓などの冷菓；醤油や味噌などの調味料などが挙げられる。

飲食品用組成物の具体的な一態様は、例えば、生体に対して一定の機能性を有する飲食品である機能性飲食品である。機能性飲食品は、例えば、特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、栄養機能飲食品、保健機能飲食品、特別用途飲食品、栄養補助飲食品、健康補助飲食品、サプリメント、美容飲食品などのいわゆる健康飲食品に加えて、乳児用飲食品、妊産婦用飲食品、高齢者用飲食品などの特定者用飲食品を包含する。さらに機能性飲食品は、コーデックス（ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会）の食品規格に基づく健康強調表示（Ｈｅａｌｔｈ ｃｌａｉｍ）が適用される健康飲食品を包含する。

飲食品用組成物の包装形態は特に限定されず、適用される形態などに応じて適宜選択できるが、例えば、コーティング紙、ＰＥＴやＰＴＰなどのプラスチック、アルミなどの金属、ガラスなどを素材とするパック、瓶、缶、パウチなどが挙げられる。

本発明の一態様の組成物が医薬品用組成物である場合は、適用後に少なくとも有効作用が発揮し、それに伴い抗疾患効果が現われる限り、あらゆる医薬品の形態をとり得る。

医薬品用組成物の剤型は特に限定されないが、例えば、注射剤（筋肉、皮下、皮内）、経口製剤、点鼻製剤などが例示される。例えば、医薬品用組成物は、抗ウイルス効果を発揮するためのワクチンとして調製することができる。医薬品用組成物がワクチンの形態である場合、複数種類の有効成分を含む混合カクテルワクチンであってもよい。

本発明の一態様の組成物の製造方法は特に限定されず、例えば、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物と、任意に他の成分とを混合して、所望の剤形に成形する方法などが挙げられる。

本発明の一態様の組成物の製造方法の具体的態様としては、例えば、ＭＲＳ培地にペディオコッカス・アシディラクティシを植菌し、ペディオコッカス・アシディラクティシの至適温度±５〜２０℃で１２〜７２時間培養することにより培養物を得て、次いで得られた培養物から培地を限外ろ過膜や遠心濃縮機などの通常知られている固液分離手段によって培地を除去して菌体を回収し、次いで得られた菌体を水や食塩水などで洗浄することにより、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体を得ることを含む方法などが挙げられる。このようにして得られた菌体、該菌体を水や食塩水などに懸濁した菌体懸濁液、該菌体を乾燥処理に供して得られる乾燥粉末などは、本発明の一態様の組成物の有効成分として使用可能である。乾燥処理の方法は特に限定されず、例えば、自然乾燥、風乾、噴霧乾燥、凍結乾燥などが挙げられる。

本発明の一態様の組成物の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。

［例１．乳酸菌のインターロイキン−１２産生促進試験］
ペディオコッカス属乳酸菌が有するインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）産生促進作用を以下のとおりに評価した。

１−１．乳酸菌懸濁液の調製
乳酸菌としては、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ） Ｋ１５株及びＪＣＭ８７９７株；ペディオコッカス・ペントサセウス（Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ） ＮＲＩＣ９９株及びＮＲＩＣ１２２株；及びラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＪＣＭ５８０５株を用いた。

なお、「ＮＲＩＣ」の菌株は東京農業大学、「ＪＣＭ」の菌株は理化学研究所から分譲された菌株であることを示す。また、Ｋ１５株は、乳酸菌含有物として糠床から単離した。

各乳酸菌株は、ＭＲＳ培地に１×１０^７個／ｍｌとなるように接種して乳酸菌原液を調製した。この乳酸菌原液を、２６℃〜３０℃で２４時間静置培養した後、９５℃で１０分間の煮沸殺菌処理を行うことにより、培養殺菌処理液を調製した。培養殺菌処理液を遠心分離して得た菌体を、生理食塩水にて洗浄した後、生理食塩水に１×１０^９個／ｍｌとなるように懸濁し、乳酸菌懸濁液を調製した。

１−２．プラズマサイトイド樹状細胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ ＤＣ；ｐＤＣ）の分離
非ウイルス感染健常者である被験者Ａ〜Ｄの４名の各末梢血５０ｍｌより、リンパ球分離液（ナカライテスク社）を用いて低密度勾配遠心法により末梢血単核細胞を分離した。その後、末梢血単核細胞からＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）及びＭＡＣＳ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、ＣＤ１４陽性細胞を取り除いた。ＣＤ１４陽性細胞を取り除いた後に、ＦＩＴＣ標識ＣＤ３０４抗体（ミルテニーバイオテク社）で標識後、ＦＩＴＣマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）と反応させ、ＭＡＣＳによりＣＤ３０４陽性細胞を分離し、この細胞（ＣＤ１４陰性ＣＤ３０４陽性）をｐＤＣとして用いた。

１−３．乳酸菌とｐＤＣとの共培養
細胞培養液として１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、２５ｍＭ Ｄ−グルコース、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１μＭ ピルビン酸ナトリウムを含有するＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ社）を用いた。９６ウェルＲｏｕｎｄ−ｂｏｔｔｏｍプレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社）を用いて、１×１０^７個の各乳酸菌株と２．５又は５×１０^４個のｐＤＣとを共培養し、２４時間後に細胞及び上清を回収した。

１−４．ＩＬ−１２産生促進活性の測定
回収した培養上清を用いて、ＩＬ−１２の濃度をＨｕｍａｎ ＩＬ−１２ｐ７０ ＥＬＩＳＡ Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。

１−５．評価
被験者Ａ〜Ｄから採取したｐＤＣのＩＬ−１２産生促進活性の測定結果をそれぞれ図１Ａ〜図１Ｄに示す。

図１Ａが示すとおり、ペディオコッカス・アシディラクティシ及びペディオコッカス・ペントサセウスは、ラクトコッカス・ラクティスに比べて、ｐＤＣに対するＩＬ−１２の高い産生誘導能を有していた。また、ペディオコッカス・アシディラクティシは、ｐＤＣに対する顕著に優れたＩＬ−１２の産生誘導能を有していた。

図１Ｂ〜図１Ｄが示すとおり、ペディオコッカス・アシディラクティシが有するｐＤＣに対する顕著に優れたＩＬ−１２の産生誘導能は、いずれの被験者に由来するｐＤＣを用いても確認された。

以上の結果より、ペディオコッカス属乳酸菌はｐＤＣに対するＩＬ−１２の産生誘導能を有し、なかでもペディオコッカス・アシディラクティシは顕著に優れたｐＤＣに対するＩＬ−１２の産生誘導能を有していた。

［例２．乳酸菌のインターフェロン−α産生促進試験］
ペディオコッカス属乳酸菌が有するインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）産生促進作用を以下のとおりに評価した。

２−１．ＩＦＮ−α産生促進活性の測定
例１の乳酸菌とｐＤＣとの共培養後に回収した培養上清を用いて、ＩＦＮ−αの濃度をＨｕｍａｎ ＩＦＮ−ａ Ｍａｔｃｈｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐａｉｒｓ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて測定した。

２−２．評価
被験者Ａ〜Ｄから採取したｐＤＣのＩＦＮ−α産生促進活性の測定結果をそれぞれ図２Ａ〜図２Ｄに示す。

図２Ａが示すとおり、ペディオコッカス・アシディラクティシ及びペディオコッカス・ペントサセウスは、ラクトコッカス・ラクティスに比べて、ｐＤＣに対するＩＦＮ−αの高い産生誘導能を有していた。また、ペディオコッカス・アシディラクティシは、ｐＤＣに対する顕著に優れたＩＦＮ−αの産生誘導能を有していた。

図２Ｂ〜図２Ｄが示すとおり、ペディオコッカス・アシディラクティシが有する顕著に優れたｐＤＣに対するＩＦＮ−αの産生誘導能は、いずれの被験者に由来するｐＤＣを用いても確認された。

以上の結果より、ペディオコッカス属乳酸菌はｐＤＣに対するＩＦＮ−αの産生誘導能を有し、なかでもペディオコッカス・アシディラクティシは顕著に優れたｐＤＣに対するＩＦＮ−αの産生誘導能を有していた。

［例３．ｐＤＣの共刺激分子マーカーの解析］
３−１．ｐＤＣの共刺激分子マーカーの測定
例１の乳酸菌とｐＤＣとの共培養後に回収した被験者Ａ由来のｐＤＣを用いて、７ＡＡＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）、ＢＶ６０５標識ＣＤ８０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）及びＡＰＣ標識ＣＤ８６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）を用いて、ｐＤＣによるＣＤ８０及びＣＤ８６の発現についてＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩを用いて調べた。

３−２．評価
図３Ａ及び図３Ｂが示すとおり、ペディオコッカス・アシディラクティシを供した場合は、ｐＤＣにおける共刺激分子ＣＤ８０／ＣＤ８６の発現が高くなることが確認された。これにより、ペディオコッカス・アシディラクティシは、ｐＤＣの抗原提示を通じて、及び／又はｐＤＣの共刺激分子からの相互刺激によって、ｐＤＣが産生するＩＬ−１２やＩＦＮ−αといったサイトカインのさらなる産生を促進する可能性があることが示された。

以上の結果から、ペディオコッカス属乳酸菌はｐＤＣに対するＩＬ−１２及びＩＦＮ−αの産生誘導能を有することから、ペディオコッカス属乳酸菌の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物を有効成分として含有する組成物は、ｐＤＣによる自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用を有するものであることが確認された。

また、ペディオコッカス・アシディラクティシは、顕著に優れたｐＤＣに対するＩＬ−１２及びＩＦＮ−αの産生誘導能を有しており、さらにｐＤＣにおける共刺激分子ＣＤ８０／ＣＤ８６の発現を高め得ることから、ペディオコッカス・アシディラクティシの菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物を有効成分として含有する組成物は、顕著に優れたｐＤＣによる自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用を有するものであることが確認された。

［例４．インフルエンザ罹患率及び発熱日数の評価］
４−１．被験者の選択基準
幼稚園に通う３〜６歳の健康な幼児を被験者とした。ただし、過去に乳酸菌製剤若しくは大豆製品に対してアレルギーの既往がある者、先天性心疾患若しくは重症の気道疾患を有している者又は早産（在胎３７週未満で出生）若しくは低出生体重児（２５００ｇ未満で出生）の幼児は除外した。

４−２．試験方法
被験者のうち、乾燥Ｋ１５株 ９．１ｍｇを賦形剤であるデキストリンと混合して得られた被験試料 １ｇを４ヵ月間（１６週間）経口投与により摂取した群をＫ１５群（８７名）とした。また、デキストリン １ｇを同様に経口投与により摂取した群をプラセボ群（８５名）とした。

４−３．評価
被験者は、健康観察日誌に、毎日２回（朝・夕）及び発熱時（３７．５℃以上を発熱と定義した）の体温（腋窩温）を記録し、さらに感冒症状の有無、被験試料の摂取、乳酸菌を含む食品の摂取、副作用、医師への受診、インフルエンザワクチン接種日、インフルエンザ抗原検査の結果、抗インフルエンザ薬の投与日数などを記録した。その結果、Ｋ１５群及びプラセボ群の間には被験者背景に偏りがなく、均等に割付が実施されていたことがわかった。

４−４．結果
Ｋ１５群及びプラセボ群のインフルエンザウイルスの罹患率（＝インフルエンザウイルスに罹患した被験者の数／被験者の数）の結果を図４Ａに示す。図４Ａに示すとおり、Ｋ１５群は、プラセボ群に比べて、インフルエンザ罹患率が低かった。

Ｋ１５群及びプラセボ群における発熱日数（発熱から平熱に戻るまで日数）の結果を図４Ｂに示す。図４Ｂに示すとおり、Ｋ１５群は、プラセボ群に比べて、発熱日数が短かった。

また、Ｋ１５群及びプラセボ群のうち、他の乳酸菌を２０日以内に摂取した被験者について解析した。結果を図４Ｃに示す。図４Ｃが示すとおり、Ｋ１５群（３６名）は、プラセボ群（４１名）と比較して、有意に発熱日数が減少した。この結果から、他の乳酸菌を摂取したとしても、Ｋ１５株を摂取することにより有意に発熱日数が短縮することがわかった。

以上の結果より、ペディオコッカス属乳酸菌を含有する組成物は、摂取個体に対して、インフルエンザの罹患率を低減し、発熱日数を短縮するという抗ウイルス活性を有することがわかった。

本発明の一態様の組成物は、経口的及び非経口的のいずれの態様においても適用可能な有効成分を含むものであり、プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用やプラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用を通じて、抗菌活性、抗ウイルス活性、免疫賦活活性、抗アレルギー活性、抗感染症活性、抗Ｂ型肝炎活性、抗Ｃ型肝炎活性、抗増殖活性、抗腫瘍活性、抗癌活性を期待する摂取個体にとって有用なものであり、このような摂取個体の健康及び福祉に資する飲食品、医薬品、医薬部外品、化粧品などとして利用可能なものである。

Claims (6)

1. ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有し、かつ、プラズマサイトイド樹状細胞による自然免疫及び獲得免疫を活性化する作用を有する、免疫賦活用組成物であって、
   前記有効成分と同量のペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ９９株を用いる場合よりも高い、プラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用を有する、前記組成物。
2. 前記組成物は、ウイルス感染に対する免疫賦活用組成物である、請求項１に記載の組成物。
3. ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）の菌体、菌体成分及び培養物並びにこれらの処理物からなる群から選ばれる少なくとも１種の有効成分を含有し、かつ、プラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用を有する、サイトカイン産生促進用組成物であって、
   前記有効成分と同量のペディオコッカス・ペントサセウス ＮＲＩＣ９９株を用いる場合よりも高い、プラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用を有する、前記組成物。
4. 前記組成物は、前記有効成分と同量のラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ） ＪＣＭ５８０５株を用いる場合よりも高い、プラズマサイトイド樹状細胞によるインターフェロン−α及びインターロイキン−１２の産生促進作用を有する、請求項３に記載の組成物。
5. 前記組成物が、腸溶の組成物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を含有する飲食品用組成物。