CN118043062A

CN118043062A - 包含沙克乳酸杆菌或源自其的细胞外囊泡作为有效成分的用于治疗自身免疫性疾病的组合物

Info

Publication number: CN118043062A
Application number: CN202280046612.7A
Authority: CN
Inventors: 陈和燮
Original assignee: Lisco Biosciences Ltd
Current assignee: Lisco Biosciences Ltd
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2022-07-06
Publication date: 2024-05-14

Abstract

本发明涉及包含沙克乳酸杆菌或源自其的细胞外囊泡的组合物。并且，本发明涉及新型沙克乳酸杆菌LBML6菌株。本发明的沙克乳酸杆菌为具有抑制血中肿瘤坏死因子α(TNFα)及免疫球蛋白G(IgG)的活性且增加耐受性树突状细胞(tolDC)和调节性T细胞(Tregs)的比例的菌株，可以在预防、改善和/或治疗人或动物的自身免疫性疾病的同时，为肠道调节等用途中多种多样地使用。

Description

包含沙克乳酸杆菌或源自其的细胞外囊泡作为有效成分的用于治疗自身免疫性疾病的组合物

技术领域

本发明涉及包含沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发

酵物或者从它们分离的细胞外囊泡作为有效成分的用于预防、改善或

治疗自身免疫性疾病的组合物。

背景技术

自身免疫疾病为我们身体的免疫功能攻击自身而引起的疾病，经

长时间形成，症状以慢性持续，通常大体上引起器官永久性的损伤，

而几乎没有治愈的方法。长期以来，虽然有关自身免疫性疾病的知识

有着长足的发展，但明确的生成机制、自身抗原的真面目、调节基因

因子等至今尚未明确。自身免疫疾病可以大体分为器官特异性

(organ-specific)疾病和全身性(systemic)疾病。

器官特异性自身免疫疾病通过有关器官特异性抗原的免疫反应引

起，可以在我们身体的几乎所有器官中发生。全身性自身免疫疾病不

是引起对某种特定细胞的免疫反应，而是通过对在全身表达抗原的免

疫反应引起。这样的全身性自身免疫疾病也可以选择性地在特异的器

官中引起疾病。

自身免疫性疾病的例包括已知因过敏反应引起人体器官的损伤和

异常而发生临床症状的哮喘、特应性皮炎、银屑病、过敏性鼻炎、过

敏性结膜炎、荨麻疹等。并且，还包括已知因示出对自身蛋白质(免

疫球蛋白、胶原、脱氧核糖核酸(DNA)等自身抗原)的过敏反应(包括自身抗体反应)而发生疾病的类风湿关节炎和狼疮(Vaughan JH.Med

Times 1969；97:187-204)等。上述狼疮及类风湿关节炎等已知因对存在

于人体内的自身蛋白质的过敏反应而通过与存在于体内的抗原(自身

抗原)反应的抗原特异-免疫球蛋白G(IgG)抗体来在特定器官中诱发损伤和炎症，据此分类为自身免疫性疾病。

至今尚未明确发现诱发自身免疫性疾病的直接病因，为了治疗该疾病而使用类固醇、非类固醇类抗炎剂、免疫抑制剂等多种治疗剂。然而，这样的治疗剂无法表现出根本性的治疗效果，还因多种副作用而使其使用受到限制。并且，若干种化疗药剂具有对已发生的自身免疫性疾病的功效不足等缺点。

因此，需要开发治疗副作用少、在炎症症状和疼痛的缓解中示出效果、服用简便的自身免疫性疾病治疗剂。

上述背景技术的说明事项仅用于增进对本发明背景的理解，不应被认为相当于本发明所属技术领域的普通技术人员已知的现有技术。

发明内容

技术问题

本发明人致力于寻找能够适用于包括类风湿关节炎在内的多种自身免疫性疾病的乳酸菌菌株。结果，确认到沙克乳酸杆菌或其培养物通过抑制成为多种自身免疫性疾病的病因的促炎性因子或增加免疫抑制细胞的比例来具有预防或治疗自身免疫性疾病的效果，从而完成本发明。

因此，本发明的目的在于，提供一种用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物，包含沙克乳酸杆菌(Lactobacillus sakei)、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自(derived)上述沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡(Extracellular vesicle)作为有效成分。

本发明的再一目的在于，提供一种预防、改善或治疗自身免疫性疾病的方法，包括向有需要的对象(subject)给药沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自上述沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡的步骤。

本发明的另一目的在于，提供沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的治疗用途(for use in therapy)。

本发明的还一目的在于，提供源自沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡的治疗用途。

本发明的又一目的在于，提供用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物的制备方法。

本发明的又一目的在于，提供以保藏编号KCCM13011P保藏的沙克乳酸杆菌LBML6(Lactobacillus sakei LBML6)菌株。

本发明的其他目的及优点将通过下述发明的详细说明、发明要求保护范围以及附图得以进一步明确。

技术方案

根据本发明的一实施方式，本发明提供一种用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物，包含沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自上述沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡作为有效成分。

本发明中可利用的沙克乳酸杆菌菌株不受限制，优选地，包括在韩国微生物保存中心中以保藏编号KCCM13011P保藏的沙克乳酸杆菌LBML6菌株或以保藏编号KCCM12654P保藏的沙克乳酸杆菌WIKIM31菌株以及在生物资源中心中以保藏编号KCTC13818BP保藏的沙克乳酸杆菌WIKIM0109菌株，最优选地，为沙克乳酸杆菌LBML6菌株。

根据本发明的其他实施方式，本发明提供以保藏编号KCCM13011P保藏的沙克乳酸杆菌LBML6菌株。

本发明组合物中包含的沙克乳酸杆菌能够以活菌体或死菌体存在，并且，还能够以干燥或冷冻干燥的形式存在。适合包含在多种组合物内的乳酸菌的形式及配制方法是本发明所属技术领域的普通技术人员熟知的。例如，沙克乳酸杆菌可以配制为在公知的液体培养基或固体培养基中培养并获得的培养物，或者上述菌株与追加的成分一同培养来获得的发酵物，或者使用有机溶剂提取上述菌株的提取物，或者通过使上述菌株的细胞膜裂解或通过破碎或均质化处理的裂解物(或破碎物)等形式，但不限定于此。

在一具体例中，上述组合物可以为包含以活菌或死菌存在的沙克乳酸杆菌菌株的组合物。

在其他具体例中，上述组合物可以为包含沙克乳酸杆菌菌株的培养物、破碎物、提取物或发酵物的组合物。

在其他具体例中，上述组合物可以为包含源自沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡的组合物。

细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)使细胞间物质(蛋白质、脂质、遗传物质)交换成为可能，发挥以生理/病理传导信号的介质的功能。细胞外囊泡大体分为外泌体(exosomes)和微泡(microvesicles)。外泌体的大小根据生物的起源而不同，为多囊泡内体(multi-vesicular endosomes)在成熟的过程中内体膜进入内侧而生成的腔内囊泡(intraluminal vesicles)，在多囊泡内体与细胞表面结合时分泌。微泡的大小为10-1000nm，为质膜(plasma membrane)向外突出分离而向细胞外分泌的小囊泡。各细胞根据生理状态以不同方式生成细胞外囊泡，分泌具有特定脂质/蛋白质/核酸组成的细胞外囊泡(李在旭(2019)，揭示细胞外囊泡的细胞生物学。BRIC View 2019-R03)。

本说明书中的术语“细胞外囊泡”以包括上述外泌体及微泡在内的含义来使用。

上述外泌体或细胞外囊泡在约1-1000nm的范围内具有多种直径，优选地，具有10-1000nm的直径，更优选地，具有10-800nm的直径，最优选地，具有20nm至600nm的直径。

本发明的组合物所包含的外泌体或细胞外囊泡大量包含在沙克乳酸杆菌培养液(例如，培养上清液)内。

上述外泌体或细胞外囊泡大量包含在沙克乳酸杆菌培养物(例如，培养上清液)内，可以将分离并纯化其的外泌体或细胞外囊泡本身用作治疗剂，或者也可以将大量包含上述外泌体或细胞外囊泡的培养物、破碎物、提取物或发酵物用作治疗剂。

本说明书中的术语“分离(isolation)”不仅是指从生物学试样(例如，沙克乳酸杆菌培养物)内选择性地获得所目标的物质(例如，外泌体)的过程(正向分离(positiveisolation))，还包括选择性地去除所目标的物质以外的杂质的过程(反向分离(negativeisolation))。因此，术语“分离”能够以与“获得(obtain)”、“提取(extract)”、“纯化(purify)”相同的含义来使用。在本说明书中，分离外泌体或细胞外囊泡的过程可以不受限制地使用本发明所属技术领域中通常使用的所有方法，例如，可以利用上述商用化的外泌体分离试剂盒(例如，EXO-BB、Capturem ^TM ExosomeIsolation Kit、全外泌体分离试剂盒(Total Exosome Isolation Kit)、ExoTrap ^TMExosome Isolation Spin Column Kit、Exo2DTM等)，或者包括根据溶液内成分间的比重差异的分离(例如，离心分离法)、根据大小的分离(例如，超滤或真空过滤)、基于对特定基质的亲和度的分离(例如，亲和层析)，但不限定于此，可以不受限制地使用本发明所属技术领域中通常使用的作为基于非均质试样中所目标物质的固有物性的分离方法的所有方法。

根据本发明的优选实例，上述自身免疫性疾病选自由特应性皮炎、银屑病、斑秃、过敏、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、克罗恩病、炎症性大肠炎、强直性脊柱炎、狼疮、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿关节炎、肩周炎、肌腱炎及多发性硬化症组成的组中。

本发明的沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自上述沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡通过抑制成为多种自身免疫性疾病的病因的促炎性因子(例如，肿瘤坏死因子α(TNFα)及自身免疫抗体(Autoantibody)胶原抗原特异性免疫球蛋白G)，或者增加免疫抑制细胞(例如，耐受性树突状细胞(tolDC)及调节性T细胞(Tregs)等)的比例来在自身免疫性疾病的预防或治疗中有效使用。

根据本发明的优选实例，上述组合物为药物组合物。

根据本发明的其他实施方式，本发明提供预防、改善或治疗自身免疫性疾病的方法，包括将治疗有效量的沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自上述沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡给药到需要其的对象的步骤。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的治疗用途。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供源自沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡的治疗用途。

根据本发明的优选实例，上述治疗用途为自身免疫性疾病的预防、改善或治疗用途。

其中，使用的“对象(subject)”是指作为治疗、观察或实验的对象的哺乳动物，优选地，可以为需要预防、改善和/或治疗自身免疫性疾病的人类或动物。

本发明的药物组合物可以口服或胃肠外给药。

在胃肠外给药的情况下，例如，可以通过静脉内注射、经皮给药、皮下注射、肌肉内注射、玻璃体内注射(intravitreal injection)、滴眼给药(eye drop administration)、脑室内注射(intracerebroventricular injection)、脊髓腔内注射(intrathecalinjection)、羊膜内注射(intraamniotic injection)、动脉内注射(intraarterialinjection)、关节腔内注射(intraarticular injection)、心脏内注射(intracardiacinjection)、阴茎海绵体内注射(intracavernous injection)、脑内注射(intracerebralinjection)、脑池内注射(intracisternal injection)、冠状动脉内注射(intracoronaryinjection)、颅内注射(intracranial injection)、硬膜内注射(intradural injection)、硬膜外注射(epidural injection)、海马体内注射(intrahippocampal injection)、鼻腔内注射(intranasal injection)、骨内注射(intraosseous injection)、腹腔内注射(intraperitoneal injection)、胸腔内注射(intrapleural injection)、脊椎内注射(intraspinal injection)、胸廓内注射(intrathoracic injection)、胸腺内注射(intrathymic injection)、子宫内注射(intrauterine injection)、阴道内注射(intravaginal injection)、心室内注射(intraventricular injection)、膀胱内注射(intravesical injection)、结膜下注射(subconjunctival injection)、肿瘤内注射(intratumoral injection)、局部注射及腹腔注射(intraperitoneal injection)等来给药。

本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。本说明书中的术语“药学上可接受的载体”是指不十分刺激生物体并且不妨碍给要成分的生物活性及特性的载体或稀释剂。本说明书中的药学上可接受的载体可以使用生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇以及上述成分中的一种，或者混合一种以上来使用，可以根据需要加入抗氧化剂、缓冲液及静菌剂等其他通常的添加剂来配制为向组织或器官注射的适当的注射剂的形式。并且，还可以配制为等渗性灭菌溶液，或者根据情况配制为能够添加灭菌水或生理盐水来成为可注射溶液的干燥制剂(尤其是冷冻干燥制剂)。并且，可以将靶向器官特异性抗体或其他配体与上述载体结合来使用，以能够特异性地作用在靶向器官。本发明所属技术领域中已知的制剂可以使用文献Remington'sPharmaceutical Science,Mack Publishing Company,Easton PA中公开的内容。

并且，优选地，本发明的组合物还可以包含填充剂、赋形剂、崩解剂、结合剂及滑泽剂等。并且，本发明的组合物可以使用本发明所属技术领域中公知的方法配制来在向哺乳动物给药后提供活性成分迅速、持续或延迟的释放。

在本说明书中，“给药”是指通过适当的方法向对象导入本发明的组合物，本发明的组合物可以通过能够到达目标组织的口服或胃肠外的多种途径来给药。

例如，本发明的组合物在临床给药时可以通过肌肉、静脉或腹腔注射来给药。

为了注射，优选地，可以配制为Hank’s溶液、林格氏(Ringer)溶液或生理盐水缓冲液等符合药理学的缓冲液。为了粘膜渗透给药，在剂型中使用适合所要通过的屏障的非渗透剂。这样的非渗透剂是本发明所属技术领域中公知的。

用于胃肠外给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬混剂、油剂等。非水溶溶剂、助悬溶剂可以使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射的酯类等。

在本说明书中，“有效量”是指使所目标的需要治疗的特定疾病的发病或进程延迟或完全终止所需的量，本发明的药物组合物所包含的沙克乳酸杆菌的有效量是指实现自身免疫性疾病的预防、改善或治疗效果所需的量。因此，上述有效量可以根据包括疾病的种类、疾病的严重程度、组合物所包含的其他成分的种类及含量、患者的年龄、一般健康状态、性别及饮食、给药时间、给药途径、治疗期间、同时使用的药物在内的多种因素来调节。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说显而易见的是，适当的一日总给药量可以在正确的医学判断范围内通过处置医生来决定。

根据本发明的目的，优选地，针对特定患者的具体的治疗有效量根据包括所要实现的反应的种类和程度、根据情况是否使用其他制剂在内的具体的组合物、患者的年龄、体重、一般健康状态、性别及饮食、给药时间、给药途径及组合物的成分比例、治疗期间、与具体组合物一同使用或同时使用的药物等多种因素以及医药领域中广为人知的相似的因素的不同而不同地采用。

在本说明书中，“治疗”是指用于痊愈或获得优选的临床结果的接触。为了本发明的目的，痊愈或优选的临床结果包括症状的缓解、疾病范围的减少、疾病状态的稳定(即，不进一步恶化)、疾病集成的延迟或速度的减少、疾病状态的改善或临时缓解以及减轻(部分或全体)、可检测或不可检测与否，但不限定于此。并且，“治疗”还可以是指与未接受治疗时相比，存活率增长的情况。“治疗”是指治疗学治疗及预防性或预防措置方法。上述治疗不仅包括所要预防的障碍，还包括在已发生的障碍中所需的治疗。“缓解”疾病是指与未进行治疗相比，疾病状态的范围和/或不希望的临床症状减少和/或病程的时间进程(timecourse)被放缓或延长。

根据本发明的优选实例，本发明的组合物为食品组合物。

本发明的食品组合物所包含的沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡同样适用前述所有内容。

在本发明的组合物用作食品组合物的情况下，上述食品组合物可以包括保健功能食品或调味料、饮料、棒装食品等形式。并且，包含上述菌株作为有效成分的食品组合物可以包括发酵乳等饮料。于是，本发明提供由沙克乳酸杆菌或其培养物形成的食品发酵用乳酸菌发酵剂。

除上述有效成分以外，本发明的食品组合物还可以使用食品学上适当的生理学上可接受的辅助剂来制备，上述辅助剂可以使用赋形剂、崩解剂、甜味剂、结合剂、包衣剂、膨胀剂、润滑剂、滑泽剂或香味剂等。

除上述记载的有效成分以外，上述食品组合物还可以为给药而包含一种以上食品学上可接受的载体来优选地配制为食品组合物。

例如，为了配制为片剂或胶囊剂，有效成分可以与乙醇、甘油、水等口服、无毒性的药学上可接受的非活性载体结合。并且，在希望或需要的情况下，还可以包含适当的结合剂、润滑剂、崩解剂及着色剂作为混合物。适当的结合剂包括淀粉、明胶、葡萄糖或β乳糖等天然糖、玉米甜味剂、阿拉伯胶、黄芪胶或油酸钠等天然或合成胶、硬质酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等，但不限定于此。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等，但不限定于此。配制为液体溶液的组合物中用作药学上可接受的载体可以使用灭菌及适合生物体的，可以使用生理盐水、灭菌水、林格氏液、缓冲生理盐水、白蛋白注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇以及混合上述成分中的一种以上来使用，还可以根据需要加入抗氧化剂、缓冲液、静菌剂等其他通常的添加剂。并且，还可以加入稀释剂、分散剂、表面活性剂、结合剂及润滑剂来配制为水溶液、悬混液、乳浊液等注射用剂型，或者丸药、胶囊、颗粒或片剂。

本发明食品组合物可以添加到各种食品中。可以添加本发明的组合物的食品有例如饮料类、维生素复合剂、保健辅助食品类等。

本发明的食品组合物可以包含制备食品时通常添加的成分，例如，包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养素、调味剂及香味剂。上述碳水化合物的为通常的糖以及木糖醇、山梨糖醇赤藓糖醇等糖醇，上述糖包括：单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖、寡糖等；以及多糖，例如糊精、环糊精等。香味剂可以使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如莱苞迪甙A、甘草甜素等))及合成香味剂(唐静、阿斯巴甜等)。例如，在本发明的食品组合物制备为饮剂和饮料类时，还可以包含柠檬酸、液体果糖、白糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁及各种植植物提取液。

根据本发明的还一实施方式，本发明提供包含沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自上述沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡作为有效成分的饲料添加剂或饲料。

在用作饲料添加剂的情况下，上述组合物可以制备为20％至90％的高浓缩液或者粉末或颗粒形式。上述饲料添加剂可以包含柠檬酸、腐殖酸、己二酸、乳酸、苹果酸等有机酸，或者磷酸钠、磷酸钙、酸式焦磷酸盐、聚磷酸盐(磷酸盐聚合物)等磷酸盐，或者多酚、儿茶素、α-生育酚、迷迭香提取物、维生素C、绿茶提取物、甘草提取物、壳聚糖、单宁酸、植酸等天然抗氧化剂中的一种以上。在用作饲料的情况下，上述组合物可以配制为通常的饲料形式，可以一同包含通常的饲料成分。

上述饲料添加剂及饲料还可以包含：谷物，例如粉碎或破碎的小麦、燕麦、大麦、玉米及大蜜；植物性蛋白饲料，例如以油菜、大豆及向日葵为主要成分的饲料；动物性蛋白饲料，例如血粉、肉粉、骨粉及鱼粉；糖分及乳制品，例如由各种奶粉及乳清粉末形成的干燥成分等。此外，还可以包含营养补充剂、消化及吸收促进剂、生长促进剂等。

上述饲料添加剂可以向动物单独给药，也可以在食用载体中与其他饲料添加剂组合来给药。并且，上述饲料添加剂可以作为顶部敷料，或者将其与动物饲料直接混合，或者作为与独立于饲料的口服剂型来轻松向动物给药。当上述饲料添加剂独立于动物饲料来给药时，可以如本发明所属技术领域中广为人知的与食品学上可接受的食用载体组合来制备为即时释放或缓释剂型。这样的食用载体可以为固体或液体，例如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、大豆颗粒、花生油、橄榄油、芝麻油及丙二醇。在使用固体载体的情况下，饲料添加剂可以为片剂、胶囊剂、散剂、锭剂或糖衣片剂或微分散性形式的顶部敷料。在使用液体载体的情况下，饲料添加剂可以为明胶软质胶囊剂、糖浆剂或悬混液、乳剂或者溶液剂的剂型。

并且，上述饲料添加剂及饲料可以含有辅助剂，例如保存剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶液促进剂等。上述饲料添加剂可以通过浸渍、喷雾或混合添加到饲料中来使用。

本发明的饲料或饲料添加剂可以适用于包括哺乳类、家禽及鱼类在内的大多数动物饮食中。

上述哺乳动物不仅为猪、牛、羊、山羊及实验用啮齿动物，还可以为宠物(例如狗、猫)，上述家禽类可以为鸡、火鸡、鸭、鹅、野鸡及鹌鹑等，上述鱼类可以为鳟鱼等，但不限定于此。

本发明的饲料或饲料添加剂可以应用在动物饮食中来用于强化动物的生长、免疫等。

以一次为基准，本发明组合物所包含的沙克乳酸杆菌菌株的量可以为约10⁶cfu/ml至10¹²cfu/ml，例如，可以为10⁷cfu/ml至10¹¹cfu/ml、10⁸cfu/ml至10¹⁰cfu/ml。在给药菌株的情况下，以活菌状态给药为佳，可以在摄取前杀灭或者以衰减(attenuation)状态给药。并且，在使用培养上清液等来制备时，还可以经过通过热处理过程的灭菌过程。具备最小功效所需的菌株量及每日摄取程度可以根据摄取者的身体或健康状态的不同而不同，但通常可以为约10⁶cfu/ml至10¹²cfu/ml，例如，可以为10⁷cfu/ml至10¹¹cfu/ml、10⁸cfu/ml10¹⁰cfu/ml。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物的制备方法，包括如：步骤(a)，准备沙克乳酸杆菌菌株；以及步骤(b)，在培养液中培养上述菌株。

根据本发明的优选实例，上述制备方法还包括在上述培养液中分离源自沙克乳酸杆菌菌株的细胞外囊泡的步骤。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物的制备方法，包括准备源自沙克乳酸杆菌菌株的细胞外囊泡的步骤。

发明的效果

摘要本发明的特征及优点如下。

(i)本发明提供包含沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自上述沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡作为有效成分的用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物。

(ii)本发明的组合物所包含的沙克乳酸杆菌或细胞外囊泡可以通过抑制成为多种自身免疫性疾病的病因的促炎性因子(例如，肿瘤坏死因子α及自身免疫抗体胶原抗原特异性免疫球蛋白G)，或者增加免疫抑制细胞(例如，耐受性树突状细胞及调节性T细胞等)的比例来在自身免疫性疾病的预防或治疗中有效使用。

附图说明

图1示出向胶原诱导关节炎小鼠模型口服给药沙克乳酸杆菌LBML6菌株后7周内的关节炎分数(arthritic score)和发病率。

图2为采集实验动物的血液并测定血液内作为前炎症细胞因子(proinflammatorycytokine)的肿瘤坏死因子α的浓度的结果。

图3为采集实验动物的血液并测定血液内自身抗体胶原抗原特异性免疫球蛋白G的浓度的结果。

图4为测定在肠内淋巴结中抑制免疫的耐受性树突状细胞(Tolerogenicdendritic cells，tolDC)的比例的结果。

图5为测定在肠内淋巴结中抑制免疫的调节性T细胞(Regulatory T Cells，Tregs)的比例的结果。

图6示出从沙克乳酸杆菌LBML6菌株分离的细胞外囊泡(EV)的尺寸。

图7示出从沙克乳酸杆菌LBML6菌株分离的细胞外囊泡的浓度。

图8为确认处理沙克乳酸杆菌LBML6菌株或从其分离的细胞外囊泡时作为皮肤细胞的分裂标记物的K10的表达的结果。

图9为确认处理沙克乳酸杆菌LBML6菌株或从其分离的细胞外囊泡时作为皮肤细胞的分裂标记物的内披蛋白(Involucrin)的表达的结果。

图10为确认处理沙克乳酸杆菌LBML6菌株或从其分离的细胞外囊泡时是否抑制CD4 T细胞的活性的结果。

具体实施方式

以下，通过实施例更为详细地说明本发明。这些实施例仅用于更为具体地说明本发明，本发明所属技术领域的普通技术人员应该自明的是，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例。

实施例

材料及方法

1.准备沙克乳酸杆菌LBML6菌株

将2021年06月15日以KCCM13011P的保藏编号保藏在韩国微生物保存中心的沙克乳酸杆菌LBML6菌株以0.1％接种在30ml的MRS液体培养基中，在30℃的温度下培养18小时。培养后，在3500rpm的条件下离心10分钟，使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤3次后，去除剩余的培养基成分来获得菌体。

2.准备实验动物

利用牛胶原蛋白(Bovine collagen)在DBA-1J小鼠(Mice)中制备自身免疫性疾病之一的类风湿关节炎模型(Rheumatoid arthritis model)后，为评估试验物质的效果而进行本试验。

3.给药试验物质

在称量适量的试验物质后，稀释在赋形剂中来制备实施例的给药试验物质。试验组的构成及给药量设定如下述表1所示。

表1

分别以200μL/只的量以5次/周的频率口服给药试验物质7周，对照组仅给药生理盐水。口服给药为使用颈背部皮肤固定法固定动物后，利用口服给药用探棒直接向胃内给药。

试验组以正常组(对照组(Control)；磷酸盐缓冲溶液)、CIA(关节炎诱发+磷酸盐缓冲溶液)、CIA+菌株(关节炎诱发+本发明菌株)来构成并设定给药量。

4.分离细胞外囊泡

将沙克乳酸杆菌(LBML6)以0.1％接种在30ml的MRS液体培养基中，在30℃的温度下培养18小时。培养后，在3500rpm、4℃的条件下进行10分钟的一次离心后，在10000xg、4℃的条件下进行20分钟的二次离心来回收培养上清液，最终使用0.22μm的过滤器(filter)过滤来回收去除菌体的培养上清液。混合等量的培养上清液与溶有16％的聚乙二醇6000(PEG6000)的1M的氯化钠(NaCl)溶液并在4℃的温度下反应15小时后，在10000xg、4℃的条件下离心20分钟来获得细胞外囊泡颗粒(EV pellet)。使用溶有5％的聚乙二醇6000的0.5M的氯化钠溶液使获得的细胞外囊泡颗粒再悬浮(resuspension)并洗涤后，在11000rpm、4℃的条件下离心20分钟，在磷酸盐缓冲溶液中使颗粒(pellet)再悬浮来最终分离源自沙克乳酸杆菌(LBML6)的细胞外囊泡。利用ZetaView(粒子计量有限公司(Particle MetrixGmbH))测定分离的细胞外囊泡的尺寸(图6)和浓度(图7)。

5.从骨髓分化未成熟树突状细胞

利用发克梯度(Ficoll gradient)方法(Hlozkova,K.,Starkova,J.Assessmentof the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells.J.Vis.Exp.(141),e58426,doi:10.3791/58426(2018))通过离心从小鼠的股骨(femur)和胫骨(tibia)的骨髓细胞(bone marrow cells)(Orientbio公司，Balb/c，雌性(female)6周龄(wk))中分离单核细胞(monocytes)。在6孔(well)培养板中以2×10⁶/well的浓度准备上述分离的单核细胞，对包含胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)的培养基(RPMI)中一同处理20ng/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、10ng/ml的白细胞介素4(IL-4)。然后培养6天，经过3天时更换新鲜的培养基和细胞因子来获得未成熟树突状细胞。

6.分化成熟树突状细胞

为了将上述获得的未成熟树突状细胞(Immature DC)分化为成熟树突状细胞(mature DC)，向阳性对照组处理脂多糖(LPS)2小时来诱导成熟树突状细胞的分化及活性后，与作为二次刺激源的沙克乳酸杆菌(LBML6)以及源自沙克乳酸杆菌(LBML6)的细胞外囊泡分别以MOI 1、10共培养24小时。

7.T细胞共培养

将从小鼠脾脏中分离的染色CFSE(英杰公司(Invitrogen))的CD3+T细胞(T cell)与同沙克乳酸杆菌(LBML6)培养24小时的树突状细胞以1∶1的比例共培养3天。为了评估是否通过耐受性树突状细胞抑制T细胞的活性，利用CBA测定试剂盒(assay kit)(BD Th1/2/17CBA kit)测定T细胞的分裂程度、确认分泌的细胞因子生成量(IFNr、白细胞介素-17(IL-17))。并且，为了在银屑病的体外(in vitro)模型中采用，储存通过共培养获得的培养液后使用。

8.准备人类皮肤细胞(humankeratinocytes)的银屑病模型

将4×10⁵的Hacat细胞(cell)(CLS公司)接种到6孔中。细胞附着时，处理氯化钙(CaCl₂)(西格玛公司(Sigma))4小时并追加处理咪喹莫特(imiquimod)(IMQ，Calbiochem公司)来诱发细胞的炎症。24小时后，向各孔处理5.实验中进行的培养液并在24小时后回收细胞分离(isolation)核糖核酸(RNA)来测定基因表达。

9.基因表达测定(实时定量聚合酶链式反应(qPCR))

为了测定各细胞中基因的表达，利用互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成试剂盒(赛默飞世尔公司(Thermo))的逆转录酶(reverse thranscriptase)和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)将细胞的核糖核酸合成为互补脱氧核糖核酸。使用基因的各引物(primer)(Macrogen公司)进行扩增。

实验结果

实施例1.测定胶原诱导关节炎小鼠模型中的关节炎发生率及分数

关节炎分数(Arthritis score)测定：在即将给药试验物质前以及从给药后在试验期间一周3次按照下述表2所示的标准评分(scoring)关节炎程度。求和四肢的分数以16分为最高分数。根据状态的分数表如下。

表2

分数	状态
		0	无浮肿或肿胀
1	局限在关节的轻度浮肿和红肿
		2	在关节中经由腕骨及跗骨的轻度浮肿和红肿
3	在关节经由腕骨及跗骨的重度浮肿和红肿
		4	整体有浮肿和红肿并出现关节僵直

向胶原诱导关节炎小鼠模型口服给药沙克乳酸杆菌LBML6菌株的7周期间的关节炎分数和发病率如图1所示。

结果，在胶原诱导关节炎诱发对照组中示出最高的发病率和关节炎分数，在沙克乳酸杆菌LBML6菌株处理组中确认到发病率和关节炎分数以显著水平减少。

实施例2.测定血中肿瘤坏死因子α及胶原抗原特异型免疫球蛋白G的浓度

采集实验动物的血液来测定作为前炎症细胞因子的肿瘤坏死因子α和自身抗体胶原抗原特异性免疫球蛋白G的浓度。图2为测定肿瘤坏死因子α的浓度的结果，图3为测定免疫球蛋白G及胶原抗原特异性免疫球蛋白G的浓度。

如图2及图3所示，与正常组相比，可以确认诱发关节炎时促进血液内肿瘤坏死因子α及免疫球蛋白G的生成，而向实验动物给药沙克乳酸杆菌LBML6菌株时，可以确认肿瘤坏死因子α及免疫球蛋白G的浓度减少。

实施例3.测定肠内淋巴结免疫抑制细胞

确认在肠内淋巴结中抑制免疫的耐受性树突状细胞和调节性T细胞的比例。图4为测定耐受性树突状细胞的比例的结果，图5为测定调节性T细胞的比例的结果。

如图4及图5所示，确认到与正常组和关节炎诱发对照组相比，给药沙克乳酸杆菌LBML6菌株时，在肠内淋巴结中抑制免疫的耐受性树突状细胞和调节性T细胞的比例增加。

实施例4.LBML6的银屑病缓解功效

向Hacat细胞处理氯化钙和咪喹莫特时，可以通过诱导细胞的分裂和炎症来诱导角质层。确认作为皮肤细胞的分裂标记物的K10(图8)、内披蛋白(图9)的表达时，确认到在LBML6(MOI 1)和LBML6细胞外囊泡中诱导的培养液中基因表达显著减少，从而确认抑制皮肤细胞的分裂。

实施例5.CD4 T细胞活性抑制功效

已知CD4 T细胞的分裂增加使T细胞被激活而与多种炎症反应相关。为了确认通过源自沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡诱导的耐受性树突状细胞是否能够直接抑制CD4 T细胞的活性，将通过沙克乳酸杆菌(LBML6)及源自沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡诱导的耐受性树突状细胞还与染色CFSE的CD4 T细胞以1∶1的比例共培养3天。3天后，回收共培养的细胞来测定CFSE的减少程度。

与处理脂多糖的树突状细胞共培养的T细胞示出近90％程度的分裂。但确认到与处理源自沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡的树突状细胞共培养的T细胞约60％的分裂被抑制。这表明通过源自沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡诱导的耐受性树突状细胞可以通过直接抑制CD4 T细胞的活性来减少免疫反应。

综合上述结果，可以确认沙克乳酸杆菌(LBML6)及源自沙克乳酸杆菌(LBML6)的细胞外囊泡通过减少树突状细胞(DC)的活性来抑制CD4 T细胞的活性，从而减少免疫反应。由此可以调节包括类风湿关节炎在内的多种自身免疫性疾病。

以上，说明了本发明的实施例，但本发明所属技术领域的普通技术人员可以在不脱离发明要求保护范围中记载的本发明的思想的范围内通过结构要素的附加、变更、删除或追加等来多种多样地修正及变更本发明，这些也应包括在本发明的权利范围内。

保藏编号

保藏机构名称：韩国微生物保存中心(国外)

保藏编号：KCCM13011P

保藏日期：2021年06月15日

保藏机构名称：韩国微生物保存中心(国外)

保藏编号：KCCM12654P

保藏日期：2020年01月14日

保藏机构名称：韩国生命工程研究院

保藏编号：KCTC13818BP

保藏日期：2019年03月07日

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Claims

1.一种用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物，其特征在于，包含如下物质作为有效成分：

沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物；或者

源自上述沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡。

2.根据权利要求1所述的用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物，其特征在于，上述组合物为药物组合物或食品组合物。

3.根据权利要求1所述的用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物，其特征在于，上述自身免疫性疾病选自由特应性皮炎、银屑病、斑秃、过敏、哮喘、结膜炎、牙周炎、鼻炎、中耳炎、咽喉炎、扁桃体炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、狼疮、银屑病关节炎、骨关节炎、类风湿关节炎、肩周炎、肌腱炎及多发性硬化症组成的组中。

4.根据权利要求1所述的用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物，其特征在于，上述沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物包含上述沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡。

5.根据权利要求1或4所述的用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物，其特征在于，上述细胞外囊泡的直径为10nm至1000nm。

6.根据权利要求1或4所述的用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物，其特征在于，上述沙克乳酸杆菌为以保藏编号KCCM13011P保藏的沙克乳酸杆菌LBML6菌株。

7.一种预防、改善或治疗自身免疫性疾病的方法，其特征在于，包括将治疗有效量的沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物或者源自上述沙克乳酸杆菌的细胞外囊泡给药到需要其的对象的步骤。

8.一种沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物提取物或发酵物的治疗用途。

9.一种源自沙克乳酸杆菌、其培养物、破碎物、提取物或发酵物的细胞外囊泡的治疗用途。

10.一种用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物的制备方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，准备沙克乳酸杆菌菌株；以及

步骤(b)，在培养液中培养上述菌株。

11.一种用于预防、改善或治疗自身免疫性疾病的组合物的制备方法，其特征在于，包括准备源自沙克乳酸杆菌菌株的细胞外囊泡的步骤。

12.一种以保藏编号KCCM13011P保藏的沙克乳酸杆菌LBML6菌株。