KR101761506B1 - 락토바실러스 펜토서스를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 - Google Patents
락토바실러스 펜토서스를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P) 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주는 조절 T 세포 및 조절 B 세포 유도, 면역 활성 사이토카인(IL-12)에 대한 면역 관용 사이토카인(IL-10; 항염증성 사이토카인)의 비율 조절, 면역글로불린 E(IgE) 생성 억제, 면역과민반응 시 Th1 관련 사이토카인, Th17 관련 사이토카인, 및 Th2 관련 사이토카인의 생성 억제, 및 IgA 분비에 따른 장관면역반응 증진에 의하여 알레르기 및 염증을 효과적으로 제어하는바, Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환, 더욱 바람직하게는 알레르기 또는 염증 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P) 및 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
최근 미국을 중심으로 장내 세균의 균총을 규명하는 메타게놈 프로젝트 진행결과 장내 균총의 분포와 알레르기를 포함하는 다양한 면역계 질환과의 상관관계가 밝혀지고 있다. 이에 따라 장내 세균의 분포와 다양성 그리고 장 면역과 면역계가 밀접히 연관되어 있음이 규명되고 있는 단계이다.
프로바이오틱스(probiotics) 관련 시장 규모를 살펴보면, 2014년 기준 세계 프로바이오틱스 시장규모는 35조 원이며 2020년까지 57조 원으로 연평균 7.6%의 지속적인 성장을 보일 것으로 예측되고 있다. 국내 프로바이오틱스 시장은 2014년 기준 1500억 원으로 시장 규모가 크지는 않으나, 2013년 대비 250%의 성장률을 보이는 등 시장이 급격히 성장하고 있다.
알레르기 억제와 같은 면역제어용 프로바이오틱스 발굴 및 평가 기술은 아직 확립되지 않은 상태이므로, 체계적인 시험관 내(in vitro) 실험 또는 생체 내(in vivo) 실험 모방 스크리닝 시스템을 개발하고 그 기술을 잘 활용한다면 경제적인 효용가치도 막대할 것으로 예상된다.
프로바이오틱스의 근본적 작용기작에 대한 연구는 미비한 상태이며 대부분의 연구가 in vitro에서 행해지고 있다. 즉, 프로바이오틱스 섭취는 구강을 통해 이루어짐에도 불구하고 지금까지의 연구는 대부분 세포주를 이용한 in vitro 실험이 주를 이루었으며 이러한 실험 방법은 사람이 프로바이오틱스 섭취 시 나타낼 수 있는 기능에 대한 연구를 대체할 수 없는 큰 단점이 있다. 또한, 프로바이오틱스에 노출되는 장내 면역계(GALT)는 다양한 면역세포가 동시에 존재하여 상호작용을 일으킴으로써 프로바이오틱스의 면역작용을 나타내나 in vitro 실험은 생체 내 환경과는 차이가 많다.
이에, 본 발명에서는 한국형 전통식품에서 분리한 균주의 항알레르기 활성을 평가하기 위해 다양한 면역세포를 생쥐에서 직접 분리한 후 이들에 대한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)의 영향을 평가함으로써 in vivo 시스템에 가까운 연구결과를 도출하였다.
현재 해외의 프로바이오틱스에 대한 면역조절 능력의 평가는 다양한 질환 동물모델에 적용되고 있으며, 그 성과 역시 해마다 가파른 속도로 증가하고 있는 단계이다. 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 퇴행성 관절염, 궤양성 대장염과 같은 염증성 질환들의 염증 반응 억제를 타겟팅하는 분야만이 아니라, 독감 바이러스나 암과 같은 질병에 대항할 수 있도록 면역 반응을 증대시킬 수 있는 프로바이오틱스의 기능에 대해서도 연구가 활발히 진행 중이다(한국 등록특허 10-1355440). 이외에도 알레르기, 천식, 아토피와 같은 질병의 예방 및 치료 목적으로도 프로바이오틱스의 역할 및 그 기능이 많은 주목을 받고 있다.
대부분의 프로바이오틱스는 그 유래가 인간의 장 또는 식품이기 때문에 동물모델을 이용한 효능이 입증되면 다른 화학적 약제와 안정성의 입증에 큰 문제가 없다는 장점이 있다. 또한, 최근 들어 면역조절제로서 프로바이오틱스의 질병 치료 효능이 다양한 임상실험을 통해 검증되고 있는데, 천식, 궤양성 대장염, 관절염 등의 질병이 많이 시도되어지고 있으며 최근 들어 아토피에 대한 임상시도 및 연구가 가속화 되고 있는 실정이다.
산업화 동향 분석에 따르면, 전통적으로 강세인 유럽에서 프로바이오틱스 개발을 주도하고 있으며 미국, 일본 등지에서도 최근에 기능성 프로바이오틱스 개발 및 사업화가 활발히 진행되고 있는 상태이다. 대표적인 상품으로 VSL3#는 캐나다의 VSL Pharmaceutical company에 의해서 개발되었고, 현재 전 세계 시장을 대상으로 활발한 판매활동을 벌이고 있으며 최근에 국내시장에도 면역조절 개별인정형으로 판매되고 있다.
본 발명자들은 Th1, Th17, 또는 Th2 면역 반응에 의해 유발되는 알레르기 및 염증 질환을 예방 또는 치료하기 위한 프로바이오틱스를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전통발효식품인 김치로부터 항알레르기 및 항염증 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) 균주를 선별하고, 상기 균주를 처리한 경우 조절 T 세포 유도, 조절 B 세포 유도, 면역 활성 사이토카인(IL-12)에 대한 면역 관용 사이토카인(IL-10; 항염증성 사이토카인)의 비율 조절, 면역글로불린 E(IgE) 생성 억제, 면역과민반응 시 Th1-관련 사이토카인, Th17-관련 사이토카인, 및 Th2-관련 사이토카인의 생성 억제, 및 장관면역반응 증진에 의하여 알레르기 및 염증이 효과적으로 제어됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선, 또는 치료 활성을 갖는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 유효성분으로 포함하는, Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 유효성분으로 포함하는, Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 균주는 김치로부터 분리된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 균주는 생균 또는 사균일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 조절 T세포를 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 조절 B세포를 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 인터루킨-12(IL-12) 생성량에 대한 인터루킨-10(IL-10) 생성량의 비율을 5-30이 되도록 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 면역글로불린 E(IgE) 생성을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 Th1, Th17, 또는 Th2 관련 사이토카인 생성을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 장관면역반응을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Th1-매개 면역 질환 또는 Th17-매개 면역 질환은 이식 거부, 자가면역질환, 또는 염증 질환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 Th2-매개 면역 질환은 알레르기 질환일 수 있다. 상기 알레르기 질환은 구체적으로 식품알레르기, 기관지 천식, 알레르기성 비염(급성 또는 만성), 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 중이염, 두드러기 및 아나필라시 쇼크, 접촉성 과민증, 알레르기성 접촉성 피부염, 세균 알레르기, 진균 알레르기, 바이러스 알레르기, 약물 알레르기, 갑상선 및 알레르기선 뇌염을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 약학적, 식품, 건강기능성 식품, 화장료, 또는 사료 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 유효성분으로 포함하는 조성물의 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)는 조절 T 세포 및 조절 B 세포 유도, 면역 활성 사이토카인(IL-12)에 대한 면역 관용 사이토카인(IL-10; 항염증성 사이토카인)의 비율 조절, 면역글로불린 E(IgE) 생성 억제, 면역과민반응 시 Th1 관련 사이토카인, Th17 관련 사이토카인, 및 Th2 관련 사이토카인의 생성 억제, 및 IgA 분비에 따른 장관면역반응 증진에 의하여 알레르기 및 염증을 효과적으로 제어하는바, Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환, 더욱 바람직하게는 알레르기 또는 염증 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주와 면역세포의 공동배양에 따른 Foxp3의 발현 변화를 측정한 결과이다.
도 2a 내지 도 2d는 아토피피부염을 유발시킨 마우스에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 경구 투여에 따른 아토피피부염 개선 효과를 보여주는 결과로서, 도 2a는 귀 두께 변화를 나타내고, 도 2b는 홍반, 각질, 부종 등을 점수화한 결과를 나타내며, 도 2c는 아토피피부염 병변 부위인 마우스 귀를 촬영한 사진이고, 도 2d는 병변부위를 H&E 또는 TB 염색하여 상피세포 두께 및 염증세포 침윤을 관찰한 결과이다.
도 3a는 아토피피부염을 유발시킨 마우스에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 경구 투여한 후 마우스의 각 림프절에서 분리한 림프구에서 IL-4 분비량을 측정한 결과이며(PP: Payer's patch, mLN: 장간막 림프절, dLN: 드레이닝 림프절), 도 3b는 병변조직에서 Th2의 전사인자인 GATA-3의 발현을 측정한 결과이다.
도 4a 내지 도 4d는 아토피피부염을 유발시킨 마우스에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 생균 또는 사균의 경구 투여에 따른 아토피피부염 개선 효과를 보여주는 결과로서, 도 4a는 귀 두께 변화를 측정한 결과이고, 도 4b는 아토피피부염 병변 부위인 마우스 귀를 촬영한 사진이며, 도 4c는 Th17에 의해 분비되는 IL-17A 양을 측정한 결과이고(PBS: 대조군, 340: 생균, HK340: 사균), 도 4d는 Th17 관련 전사인자인 RORγt의 발현을 측정한 결과이다.
도 5a는 비장세포에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주에 의한 IL-10 분비량 증가를 나타내는 결과이고, 도 5b는 상기 균주 처리에 의해 비장에서 B세포의 활성이 증가함을 보여주는 결과이며, 도 5c는 상기 균주 처리에 의한 B220+CD5+CD1d+ B10 세포 population 증가를 나타내는 결과이다.
도 6은 아토피피부염 마우스 모델에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여에 의한 B220+CD5+CD1d+의 발현 변화를 측정한 결과이다(SPL: 비장, PP: Payer's patch).
도 7은 아토피피부염 마우스 모델에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여 후 Payer's patch 내의 수지상세포(DC)의 빈도 증가, 증가한 수지상세포의 CD80 및 CD86 발현 감소를 나타내는 결과이다.
도 8a 및 도8b는 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 수지상세포(DC)에 대한 직접적인 영향을 알아보기 위한 것으로, 도 8a는 골수 유래 수지상세포(bone marrow dendritic cell; BMDC)에 상기 균주 처리 후 IL-10 및 TGF-β의 mRNA 및 단백질 발현을 측정한 결과이고, 도 8b는 수지상세포(DC) 또는 Payer's patch에서 BAFF mRNA 발현을 측정한 결과이다.
도 9a는 아토피피부염을 유발시킨 마우스에 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여 전(0W)과 투여 후 실험 종료일(8W)에 마우스 분변을 회수하여 IgA의 양을 측정한 결과이고, 도 9b는 IL-6의 양을 측정한 결과이다.
도 10은 식품 알레르기 마우스 모델 제작을 위한 실험 방법 및 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 11a 내지 도 11c는 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 식품 알레르기 억제 활성을 보여주는 결과로서, 도 11a는 직장온도 변화, 도 11b는 설사 반응, 및 도 11c는 아나필락시스를 측정한 결과이다.
도 12는 접촉성 피부염 마우스 모델에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 경구 투여에 따른 귀두께 변화를 나타낸 결과이다.
도 2a 내지 도 2d는 아토피피부염을 유발시킨 마우스에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 경구 투여에 따른 아토피피부염 개선 효과를 보여주는 결과로서, 도 2a는 귀 두께 변화를 나타내고, 도 2b는 홍반, 각질, 부종 등을 점수화한 결과를 나타내며, 도 2c는 아토피피부염 병변 부위인 마우스 귀를 촬영한 사진이고, 도 2d는 병변부위를 H&E 또는 TB 염색하여 상피세포 두께 및 염증세포 침윤을 관찰한 결과이다.
도 3a는 아토피피부염을 유발시킨 마우스에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 경구 투여한 후 마우스의 각 림프절에서 분리한 림프구에서 IL-4 분비량을 측정한 결과이며(PP: Payer's patch, mLN: 장간막 림프절, dLN: 드레이닝 림프절), 도 3b는 병변조직에서 Th2의 전사인자인 GATA-3의 발현을 측정한 결과이다.
도 4a 내지 도 4d는 아토피피부염을 유발시킨 마우스에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 생균 또는 사균의 경구 투여에 따른 아토피피부염 개선 효과를 보여주는 결과로서, 도 4a는 귀 두께 변화를 측정한 결과이고, 도 4b는 아토피피부염 병변 부위인 마우스 귀를 촬영한 사진이며, 도 4c는 Th17에 의해 분비되는 IL-17A 양을 측정한 결과이고(PBS: 대조군, 340: 생균, HK340: 사균), 도 4d는 Th17 관련 전사인자인 RORγt의 발현을 측정한 결과이다.
도 5a는 비장세포에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주에 의한 IL-10 분비량 증가를 나타내는 결과이고, 도 5b는 상기 균주 처리에 의해 비장에서 B세포의 활성이 증가함을 보여주는 결과이며, 도 5c는 상기 균주 처리에 의한 B220+CD5+CD1d+ B10 세포 population 증가를 나타내는 결과이다.
도 6은 아토피피부염 마우스 모델에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여에 의한 B220+CD5+CD1d+의 발현 변화를 측정한 결과이다(SPL: 비장, PP: Payer's patch).
도 7은 아토피피부염 마우스 모델에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여 후 Payer's patch 내의 수지상세포(DC)의 빈도 증가, 증가한 수지상세포의 CD80 및 CD86 발현 감소를 나타내는 결과이다.
도 8a 및 도8b는 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 수지상세포(DC)에 대한 직접적인 영향을 알아보기 위한 것으로, 도 8a는 골수 유래 수지상세포(bone marrow dendritic cell; BMDC)에 상기 균주 처리 후 IL-10 및 TGF-β의 mRNA 및 단백질 발현을 측정한 결과이고, 도 8b는 수지상세포(DC) 또는 Payer's patch에서 BAFF mRNA 발현을 측정한 결과이다.
도 9a는 아토피피부염을 유발시킨 마우스에 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여 전(0W)과 투여 후 실험 종료일(8W)에 마우스 분변을 회수하여 IgA의 양을 측정한 결과이고, 도 9b는 IL-6의 양을 측정한 결과이다.
도 10은 식품 알레르기 마우스 모델 제작을 위한 실험 방법 및 스케줄을 나타낸 그림이다.
도 11a 내지 도 11c는 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 식품 알레르기 억제 활성을 보여주는 결과로서, 도 11a는 직장온도 변화, 도 11b는 설사 반응, 및 도 11c는 아나필락시스를 측정한 결과이다.
도 12는 접촉성 피부염 마우스 모델에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 경구 투여에 따른 귀두께 변화를 나타낸 결과이다.
본 발명자들은 Th1 또는 Th2 면역 반응에 의해 유발되는 알레르기 및 염증 질환, 질병 또는 상태를 예방 또는 치료하기 위한 프로바이오틱스를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 전통발효식품인 김치로부터 항알레르기 및 항염증 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) 균주를 선별하고, 상기 균주를 처리한 경우 조절 T 세포 유도, 조절 B 세포 유도, 면역 활성 사이토카인(IL-12)에 대한 면역 관용 사이토카인(IL-10; 항염증성 사이토카인)의 비율 조절, 면역글로불린 E(IgE) 생성 억제, 면역과민반응 시 Th1-관련 사이토카인, Th17-관련 사이토카인, 및 Th2-관련 사이토카인의 생성 억제, 및 장관면역반응 증진에 의하여 알레르기 및 염증이 효과적으로 제어됨을 확인하였다.
이에, 본 발명은 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료 활성을 갖는 신규한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 유효성분으로 포함하는 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"이란 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다. 이때 상기 조성물은 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방 또는 개선을 위하여 해당 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환, 또는 Th2-매개 면역 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “유효성분으로 포함하는”이란, 상기의 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주는 식품, 바람직하게는 김치로부터 분리한 미생물 균주이므로, 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없어 상기 균주가 본 발명의 조성물에 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 상기 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주는 김치로부터 분리된 균주이며, 상기 균주는 생균 또는 사균 일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 조절 T 세포를 유도할 수 있다. 상기 조절 T 세포 유도는 하기 실시 예에서 입증한 바와 같이 조절 T 세포 전사인자인 Foxp3 발현 증가에 의하여 확인할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서 본 발명의 조성물은 조절 T 세포의 활성화를 음성 대조군과 비교하여 2-20배, 5-20배, 5-15배, 5-10배 또는 7-9배 증가시킴을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 조절 B 세포를 유도할 수 있다. 상기 조절 B 세포 유도는 하기 실시예에서 입증한 바와 같이 B220+CD5+CD1d+ B 세포(B10 세포)의 발현 증가에 의하여 확인할 수 있다. B10 세포는 B세포의 하위 서브세트로 항염증성 사이토카인인 IL-10 생성 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 염증반응과 자가면역반응을 조절하는데 중요한 역할을 한다.
본 발명의 일실시예에서, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 흡수되어지는 Payer's patch의 수지상세포(DC)를 억제성 수지상세포로 유도함으로써 IL-10 및 BAFF의 생산을 촉진하거나, 림프절을 통해 비장으로 이동하여 직접 조절 B 세포를 유도하는 것을 확인하였다(실시예 6 참조). 본 발명의 조성물은 조절 B세포의 활성화를 음성 대조군과 비교하여 2-20배, 2-10배, 2-8배, 3-7배 또는 4-6배 증가시킨다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 IL-10 생성을 증가시킬 수 있다. IL-10은 대식세포와 모노사이트(monocyte) 및 T-세포 림프구 복제와 염증성 사이토카인 (IL-1, TNF-α, TGF-β, IL-6, IL-8 및 IL-12)의 분비를 억제하는 림프계 세포에 의해 생성되는 항염증성 사이토카인으로서 IL-10이 증가되면 염증반응이 억제된다.
본 발명의 일실시예에서, 장간막 림프절 림프구와 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 공동 배양한 결과, 상기 균주에 의해 림프구에서 IL-10 생성량이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 조성물은 IL-12 생성량에 대한 IL-10 생성량의 비율을 5-30이 되도록 할 수 있으며, 보다 바람직하게는 IL-12 생성량에 대한 IL-10 생성량의 비율을 10-30, 15-30 또는 20-30이 되도록 할 수 있다(실시예 3-1 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 IgE 생성을 억제할 수 있다. IgE는 면역 글로불린 E(immunoglobulin E)로 비만세포 또는 혈중의 호염기구 등에 친화성을 가져 이들에 부착된 IgE 항체와 이에 대응하는 항원(알레르겐)이 반응하면 염증반응을 일으키게 된다. 즉, IgE는 알레르기에 의한 아나필락시 또는 염증반응을 일으키는 항체인바 상기 IgE 생성이 억제되면 알레르기 반응 또는 염증반응이 억제되는 것을 알 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 Th1-관련 사이토카인 생성을 억제할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 다양한 Th1-매개 면역 질환, 질병 또는 상태의 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "Th1 세포"는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예컨대, Th1 세포는 IL-2 및 IFN-γ를 생성하지만 IL-4, IL-5, IL-10 및 IL-13은 생성하지 않는 사이토카인 발현 패턴을 나타낸다. Th1 세포는 다양한 세포 내 병원균에 대한 세포-매개 면역반응, 기관-특이적 자가면역 질환 및 지연성 과민반응에 관여한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Th1-매개 면역 질환"은 Th1 세포의 생성 및/또는 활성에 의해 생성되는 사이토카인(Th1 관련 사이토카인), 예컨대, IL-1β, IL-2, IL-12, IFN-γ 또는 TNF-α 등이 관여하는 질환을 의미한다. 상기 Th1-매개 면역 질환은 이식거부, 자가면역질환, 또는 염증질환일 수 있고, 보다 구체적으로는 대장염, 염증성 장질환, 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 류마티스 관절염, 반응성 관절염(Reactive Arthritis), 골관절염, 건선, 공피증, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임 질환(Lyme), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 낭창, 원판성 낭창, 동창성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 천식, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크론씨병, 그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파킨스병, 다발경화증, 자폐스펙트럼 장애, 주의력결핍 장애, 및 주의력 결핍 과잉행동장애를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 Th17-관련 사이토카인 생성을 억제할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 다양한 Th17-매개 면역 질환, 질병 또는 상태의 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Th17 세포"는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예를 들어, Th17 세포는 TGF-β, IL-6 또는 IL-21에 의해 유도되어 IL-17, IL-22 및 IL-21 등을 생성하지만 IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-13는 생성하지 않는 사이토카인 발현 패턴을 나타낸다. Th17 세포는 염증 및 자가면역 병인에 직접적인 역할을 하며 병원체에 대한 숙주방어 또는 이상 면역반응을 유도한다고 보고되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Th17-매개 면역 질환"은 Th17 세포의 생성 및/또는 활성에 의해 생성되는 사이토카인(Th17-관련 사이토카인), 예컨대, IL-17이 관여하는 질환을 의미한다. 바람직하게 상기 Th17-매개 면역 질환은 구체적으로는 이식 거부, 자가면역질환 또는 염증 질환일 수 있으며, 보다 구체적으로는 류마티스관절염, 건선, 다발성 경화증, 대장염, 염증성 장질환, 전신홍반루프스 등과 같은 염증성 자가면역질환일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 Th2-관련 사이토카인 생성을 억제할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 다양한 Th2-매개 면역 질환, 질병 또는 상태의 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 IL-4 및 IL-13으로 구성된 군으로부터 선택되는 사이토카인 생성을 억제할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “Th2 세포”는 유전자 발현, 단백질 분비 및 기능적 활성 측면에서 특정되는 헬퍼 T 세포 림포사이트의 서브세트를 의미한다. 예컨대, Th2 세포는 IL-4, IL-5 및 IL-13 사이토카인(Th2-관련 사이토카인) 발현 패턴을 나타내며, Th2 세포는 체액성 면역반응에 관여한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “Th2-매개 면역 질환”은 알레르겐-특이 Th2 세포의 생성 및 활성에 의한 IgE 및 비만세포가 관여하는 질환을 의미하며, 바람직하게는 알레르기 질환일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 알레르기 질환은 식품 알레르기, 기관지 천식, 알레르기성 비염(급성 또는 만성), 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 중이염, 두드러기 및 아나필라시 쇼크, 접촉성 과민증, 알레르기성 접촉성 피부염, 세균 알레르기, 진균 알레르기, 바이러스 알레르기, 약물 알레르기, 갑상선 및 알레르기선 뇌염을 포함한다.
본 발명의 일실시예에서는, 아토피피부염을 유발시킨 마우스에 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 경구투여하고 염증 부위의 림프절에서 분리한 림프구로부터 사이토카인 변화를 측정한 결과, Th1 관련 사이토카인인 IFN-γ, Th17 관련 사이토카인인 IL-17, Th2 관련 사이토카인으로 비만세포의 탈과립을 유도하여 IgE 분비를 매개하는 IL-4 및 IL-13의 생성이 억제되는 것을 확인하였다(실시예 5-3 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 장관면역반응을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 아토피피부염을 유발시킨 마우스에서 0일차 또는 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 투여하고 8주차에 분변을 채취하여 분석한 결과 IgA 분비량이 증가하였으며, IgA의 분비를 유도하는 IL-6의 생성도 증가하는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 명세서에서 사용되는 용어 “알레르기”는 인체의 어떤 물질에 대한 과민증, 즉 외부로부터 들어온 물질에 대한 신체 면역계의 과도한 반응으로 유발되는 다양한 질환, 질병 또는 이상 상태를 의미한다. 본 발명의 조성물에 적용되는 알레르기 질환으로는, 바람직하게는, 제 Ⅰ 형 즉시형 과민반응 및 제 Ⅳ 형 지연형 과민반응이다. 제 Ⅰ 형 즉시형 과민반응은 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 중이염, 두드러기 및 아나필라시 쇼크(anaphylatic shock)이고, 제 Ⅳ 형 지연형 과민반응은 접촉성 과민증, 알레르기성 접촉성 피부염, 세균 알레르기, 진균 알레르기, 바이러스 알레르기, 약물 알레르기, 갑상선염 및 알레르기성 뇌염이다. 제 Ⅰ 형 즉시형 과민반응은 2 단계로 나뉘는데 제 1 단계는 알레르겐의 체내 침입에 의하여 IgE 및 IgG1의 분비를 억제하고, IgG2a의 분비를 증가시키는 IL-12 및 IFN-γ를 생산하는 Th1 세포반응과 IL-4, IL-5 및 IL-13 등을 생산하는 Th2 세포반응의 균형이 Th2 쪽으로 기울어지게 되면 Th2의 과도한 면역반응으로 IL-4 및 IL-13 등이 분비되고 그 영향으로 B 세포가 생산한 IgE 특이항체들이 비만세포(mast cell) 및 호염기구(basophil)의 표면에 부착됨으로써 알레르기 발증이 준비된 단계이다. 이를 알레르겐에 감작되었다고 한다. 알레르기 발증의 제 2 단계는 초기반응과 후기반응으로 나뉘며, 초기반응은 알레르겐이 체내에 재침입하여 비만세포를 자극하고 탈과립 반응을 유발하여 이때 방출된, 히스타민, 지질대사물, 사이토카인 등에 의한 혈관확장 등이 일어나는 것이고, 후기반응은 해당 조직에 호중구, 호산구, 대식세포, Th2 세포, 호염기구 등이 침윤하여 활성화됨으로써 염증이 유발되어 아토피피부염, 비염, 천식 등을 일으키는 것이다. 바람직하게 본 발명의 알레르기는 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 아토피 피부염, 또는 식품 알레르기일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 아토피피부염, 식품알레르기, 접촉성피부염 억제활성을 확인하였으며, 생균뿐만 아니라 열처리한 사균 역시 유사한 효과를 나타내는 것을 관찰하였다(실시예 5, 8, 및 9 참조).
이에, 본 발명의 신규한 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주는 약학적, 건강기능성 식품, 식품, 화장료, 또는 사료 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 락토바실러스 펜토서스의 약제학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약학적 유효량”은 상술한 락토바실러스 펜토서스의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물이 건강기능성 식품 조성물로 제조되는 경우, 조성물은 담체, 희석제, 부형제, 및 첨가제 중 하나 이상을 포함하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 분말제, 캡슐제, 및 액제 제형으로 이루어진 군에서 선택된 하나로 제형된 것을 특징으로 한다. 본 발명의 조성물에 첨가 할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 식품류 등이 있다. 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 첨가제로는, 천연 탄수화물, 향미제, 영양제, 비타민, 광물(전해질), 풍미제(합성 풍미제, 천연 풍미제 등), 착색제, 충진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH조절제, 안정화제, 방부제, 산화 방지제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 및 과육으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 성분을 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명에 따른 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 팩트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제, 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토오스, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐키롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피로리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상이 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 유효성분 포함하는 항알레르기용 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우에는, 유효 성분으로서의 락토바실러스 펜토서스 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용 될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 유효성분 포함하는 항알레르기용 조성물이 사료 조성물로 제조되는 경우, 락토바실러스 펜토서스를 그대로, 또는 사료 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제 등을 가하여 제조할 수 있다. 예컨대, 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제이다. 그 형상에는 분체, 과립, 펠릿 또는 현탁액 등이 포함된다.
본 발명의 조성물이 사료 조성물로 제조되는 경우, 육상 또는 수상 동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다. 본 발명의 사료에는 분말사료, 고형사료, 모이스트 펠릿사료, 드라이 펠릿사료, EP(Extruder Pellet) 사료, 날먹이 등이 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료 활성을 갖는 균주는 상술한 Th1-매개 면역 질환, Th17-매개 면역 질환 또는 Th2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물과 대상 질환을 공통으로 하기 때문에, 상기 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
]
실시예
1: 균주의 분리 및 동정
균주는 락토바실러스 MRS 한천 배지(MRS 배지, BD288130, 디프코사, 미국)를 이용하여 전통식으로 제조된 김치로부터 분리하였으며, 16S rDNA 시퀀싱을 통해 상기 분리된 균주를 동정하였다. 동정 결과, 상기 균주의 16s rDNA 염기서열(서열목록 제1서열)은 기존의 락토바실러스 펜토서스 JCM1558(T) 균주와 99.73%의 상동성을 보였다.
상기 균주의 배양을 위한 배지 조성은 MRS 배지이고, 배양조건은 pH 6.5 ± 0.2, 온도 37℃ 및 48시간 정치배양이며, 산소요구성은 통성혐기성이고, 동결건조보존 또는 세포현탁액 동결을 통해 균주 보존이 가능하다. 본 발명자들은 상기 균주를 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340로 명명하고, 국제미생물기탁기관인 한국미생물보존센터(KCCM)에 2015년 3월 6일자로 기탁하였으며, 수탁번호 KCCM 11675P를 부여받았다.
실시예
2: 실험준비 및 방법
2-1. 실험동물
본 연구를 위해 유전적으로 어떠한 변형도 일어나지 않은 야생형의 생쥐(계통 번호-C57BL/6, 스탁(stock) 번호-000664, the Jackson laboratory)를 사용하였다. 또한, Foxp3의 발현 정도를 비교적 쉽게 확인하기 위해 유전적으로 변형된 생쥐(Foxp3-GFP 넉인 마우스, 계통 이름-B6.Cg-Foxp3tm2Tch/J, 스탁 번호-006772, Jackson laboratory)를 이용하였다. 상기 생쥐의 경우 야생형의 종을 기반으로 만들어졌기 때문에 전반적인 유전 정보는 동일하나, Foxp3가 발현될 때 형광 신호를 낼 수 있는 분자인 EGFP(enhanced green fluorescence protein)가 함께 발현하여 이러한 형광 신호가 Foxp3 발현 정도를 대변해 주기 때문에 상기 생쥐를 이용하면 감지가 어려운 Foxp3의 발현 정도를 항체의 사용 없이도 비교적 용이하게 확인할 수 있다.
2-2. 면역 세포 분리 및
락토바실러스
펜토서스와의
공동배양(co-culture)
생쥐의 장간막 림프절(mesenteric lymph node; MLN)을 적출한 후, 림프절에 존재하는 면역 세포(대부분 림프구)를 단일 세포로 부유하여 실험에 이용하였다. 장내에 존재하는 프로바이오틱스는 장 내 면역계에 존재하는 면역 세포들에 의해 인지되기 때문에 프로바이오틱스의 특성을 분석하기에 적절한 면역 세포는 장간막 림프절에 존재하는 면역 세포이다. 따라서 상기 림프절에서 분리한 면역세포로 락토바실러스 펜토서스 KF340의 특성을 분석하였다.
이를 위해, 상기 방법에 따라 분리한 면역 세포와 락토바실러스 펜토서스 KF340을 1:10 비율 즉, 면역 세포 3x106과 균주 3x107 cfu를 72시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 이때 항생제인 젠타마이신(11811-031, 15 ㎍/mL, GIBCO)을 함께 처리하여 시험 균주의 과잉성장을 방지하였다.
실시예
3: 항알레르기 및 항염증 활성 확인
3-1. 공동배양액 내의 사이토카인 측정
ELISA는 효소를 표식자로 하여 항원항체 반응을 이용한 항원 또는 항체의 양을 측정하는 방법 중 하나이다. 면역 세포와 유산균을 공동 배양 후 상등액에 존재하는 사이토카인의 양을 측정하기 위해 IL-10(Mouse IL-10 ELISA Ready-SET-Go, eBioscience) 및 IL-12p70(Mouse IL-12p70 ELISA Ready-SET-Go, eBioscience) ELISA를 실시하였다. 각각의 사이토카인을 감지하는 코팅용 항체를 96-웰에 처리한 후, 상층액을 넣고 일정시간 동안 반응이 진행되도록 놓아둔 후, 각각의 사이토카인을 감지하는 또 다른 검출용 항체를 처리하였다. 이때 처리하는 검출용 항체는 효소(HRP)와 결합하고 있는데, 이때 효소의 기질(Tetramethylbenzidine Substrate Solution, eBioscience)을 첨가하여 효소-기질 반응에 의한 결과물로 색의 변화가 일어난다. 이러한 간접적인 방법을 통해 사이토카인의 절대량을 측정할 수 있다.
IL-10(interleukin 10)은 대표적인 면역관용 사이토카인이며, IL-12(interleukin 12)는 대표적인 면역 활성 사이토카인으로 알려져 있으므로 두 사이토카인의 절대적/상대적 양을 파악하여 항알레르기 특성을 갖는 유산균을 선별할 수 있다. 이에, 상기 실시예 2-2의 방법에 따라 Foxp3 넉인 실험용 생쥐의 장간막 림프절 세포를 분리하여 각각의 시험 균주와 1:10 비율 혼합한 후 공동 배양하였다. 3일간 배양 후 배양 상등액을 취하여 면역 활성 사이토카인인 IL-12p70과 항염증 사이토카인인 IL-10의 절대량을 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)를 통해 측정하였으며, 이 두 분자의 양을 상대적으로 수치화하여 비교하였다.
그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 장간막 림프절 세포와 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 공동배양 하였을 때 림프구에서 lL-10 및 IL-12p70 분비량의 상대적인 비율(lL-10/IL-12p70)이 24.17로 음성대조군에 비해 높게 나타나는 것을 확인하였다. 이를 통해 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 항염증 활성이 있음을 알 수 있었다.
| IL-10(pg/mL) | IL-12p70(pg/mL) | IL10/IL-12p70 | |
| PBS | 241.68 | 0* | 0* |
| 락토바실러스 펜토서스 KF340 | 512.27 | 21.187 | 24.17 |
*미검출(not detect), 검출 영역에서 벗어날 정도도 소량이 분비되므로 항염증활성을 기대할 수 없음.
3-2.
Foxp3
발현 측정
Foxp3는 과도한 면역을 억제하는 T 세포의 서브셋(subset)인 조절 T 세포의 전사인자로, Foxp3 발현 정도를 통해 조절 T 세포의 분포를 확인할 수 있다.
상기 조절 T 세포(regulatory T cell)는 T 세포의 부분 집합 중 하나로 다른 T 세포와 다르게 과도한 면역 반응을 억제하는 역할을 수행한다. 이러한 조절 T 세포가 알레르기 질환을 억제한다는 것이 다양한 연구 결과를 통해 뒷받침되고 있으므로, 시험 균주와 장간막 림프절 세포를 공동배양 시, 조절 T 세포의 분포를 늘릴 수 있는 균주가 항 알레르기 효능을 갖는 프로바이오틱스가 될 가능성이 높다.
따라서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주와 공동배양한 장간막 림프구 면역 세포의 표면 분자 발현 정도를 비교하기 위해, 상기 실시예 3-1의 방법에 따라 분리한 장간막 림프절 면역 세포들에 대하여 유세포 분석법을 통해 Foxp3가 발현할 때 함께 발현하는 GFP 시그널을 측정함으로써 Foxp3의 발현량을 측정 및 비교하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주와 공동배양한 면역세포의 경우 Foxp3의 발현량(12.48%)이 대조군에서의 발현량(1.48%)에 비하여 약 8.43배 증가하였다. 이를 통해 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 조절 T 세포 유도 활성을 가지며, 이에 의해 알레르기 질환을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실시예
4:
Th2
사이토카인 억제에 의한 항알레르기 활성 확인
락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 Th2 사이토카인 생성 억제를 통해 항알레르기 활성을 나타내는지 평가하고자 하였다.
이를 위해, OVA(20 μg)와 알럼(aluminum hydroxide gel, 2 mg)의 혼합액을 30분간 섞어준 다음 5주령 된 암컷 Balb/c 생쥐에 마리당 100 ㎕씩 1주 간격으로 2차례 복강주사하여 알레르기를 유발하였다. 면역 1주 후 생쥐 비장을 적출하여 단세포화 및 용혈한 비장세포를 96-웰 플레이트에 5×106 세포/웰로 분주하였다. 이때 항원(OVA, 100 ㎍/mL) 및 락토바실러스 펜토서스 KF340(5×107 CFU/웰) 균주를 첨가하고 37℃ CO2 인큐베이터에서 72시간 배양 후 상징액을 회수하고 대표적인 Th2-관련 사이토카인인 IL-4의 분비량을 측정하였다.
그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 대조군에 비하여 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 처리한 경우 IL-4 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 이는 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 IL-4의 생성을 억제함으로써 알레르기 반응을 억제할 수 있음을 의미한다.
| OVA | 샘플 | IL-4(%) |
| - | 대조군 1 | 25.13 ± 10.18 |
| + | 대조군 2 | 100.00 |
| + | 락토바실러스 펜토서스 KF340 | 50.26 ± 8.62 |
*대조군 1: 알레르기를 유발하지 않은 실험군, 대조군 2: 알레르기를 유발한 실험군
실시예
5:
항아토피
활성 확인
5-1. 아토피피부염 유도
마우스에 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 5×108 CFU/일로 주 5회 이상 8주간 경구투여를 진행하였다. 최초 경구투여 3주 후, 마우스의 귀를 외과용 테이프(surgical tape)를 이용하여 벗긴 후 1.0% DNCB(2,4-디나이트로클로로벤젠, 2,4-dinitrochlorobenzene)와 집먼지 진드기 20 ㎕(10 mg/mL)를 도포하였다. 일주일 후 1% DNCB 및 20 ㎕(10 mg/mL)의 진드기를 주 1회씩 번갈아 처리하는 방법으로 5주 반복하여 아토피 피부염을 유발시켰다.
5-2. 귀 두께 및 조직학적 변화
상기 실시예 5-1의 방법에 따라 집먼지진드기 유도 아토피피부염 마우스 모델에 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 8주간 투여한 후 조직학적 변화를 측정하여 항아토피 활성을 평가하였다. 이때 양성 대조군으로는 아토피피부염 치료제로 사용되고 있는 스테로이드제제인 덱사메타손(dexamethasone)을 이용하여 동일한 조건에서 실험을 진행하였다.
마우스의 귀 두께 변화, 홍반, 부종, 및 각질 발생 정도를 측정한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 아토피피부염을 유발시킨 후 PBS를 투여한 음성 대조군(PBS control)과는 달리, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 투여한 군(340)의 경우 귀 두께가 양성 대조군(Dex)과 유사한 정도로 감소하였으며, 도 2b에 나타낸 바와 같이 귀부분의 홍반, 부종, 각질, 건조 수준(scoring)이 심하게 일어난 음성 대조군과는 달리, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 경구 투여군은 양성 대조군과 유사한 정도의 수준을 보였다.
또한, 육안으로 관찰한 결과 도 2c와 같이 락토바실러스 펜토서스 KF340 경구 투여군은 아토피피부염이 매우 개선된 것을 관찰하였으며, 염증 부위인 귀조직의 조직학적 분석 결과, 도 2d의 H&E 및 TB 염색 결과를 통해 락토바실러스 펜토서스 KF340 투여군이 음성 대조군에 비해 상피세포(epithelial cell) 두께가 감소하였으며 염증 세포의 침윤도 현저히 억제되었음을 확인하였다.
5-3. 사이토카인 변화 측정
세포학적 분석을 위하여 마우스의 염증부위의 림프절인 드레이닝 림프절(표면 림프절, 액와부 림프절, 기관지 림프절)에서 드레이닝 림프구를 분리한 후, 항원인 집먼지 진드기로 세포를 자극시킨 다음 발현되는 사이토카인을 e-Bioscience사의 사이토카인 정량 키트를 이용하여 ELISA 방법을 통해 확인하였다.
그 결과, 하기 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이 락토바실러스 펜토서스 KF340을 각각 지속적으로 투여한 실험군에서는 아토피 피부염 발병 및 악화를 촉진하는 염증성 사이토카인인 IFN-γ와 IL-17A의 양이 감소하는 양상을 보였으며, Th2-관련 사이토카인인 IL-4 및 IL-13의 분비량도 감소하여 락토바실러스 펜토서스 KF340이 아토피 피부염 억제 활성이 있음을 확인하였다.
| 실험군 | IFN-γ(ng/mL) | IL-17A(ng/mL) | IL-4(pg/mL) | IL-13(ng/mL) |
| 정상 대조군 | 0.01 | 0 | 0 | 0 |
| 음성 대조군(PBS 투여군) | 3.31 | 38.16 | 69.75 | 2.57 |
| 락토바실러스 펜토서스 KF340 | 0.58 | 3.37 | 29.75 | 0.71 |
이에 더하여, 장관관련림프조직(gut-associated lymphoid tissue; GALT)에 해당하는 Payer's patch(이하, PPs) 및 장간막림프절(mLN)에서 림프구를 분리하여 상기와 동일한 방법으로 Th2 사이토카인인 IL-4를 측정한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, IL-4 분비량이 현저히 감소하는 것을 확인하였으며, 도 3b와 같이 염증이 일어난 귀에서 Th2의 전사인자인 GATA-3의 발현이 유의적으로 감소하였다.
5-4.
락토바실러스
펜토서스
KF340
사균의
항아토피
활성 확인
상기 실시예 5-2 및 5-3을 통해 락토바실러스 펜토서스 KF340 생균이 항아토피 활성을 나타내는 것을 확인하였는바, 상기 균주의 사균도 동일한 항아토피 활성을 나타내는지 검증하고자 하였다.
이를 위해, 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 아토피피부염 마우스 모델을 제작하고 상기에서 투여한 락토바실러스 펜토서스 KF340 생균 또는 이를 121℃에서 15분간 열처리하여 준비한 사균을 동일한 방법으로 마우스에 투여하였다.
락토바실러스 펜토서스 KF340 생균 또는 사균 투여에 의한 마우스의 귀두께 변화를 측정한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 상기 생균 및 사균 모두 대조군(PBS)에 비하여 귀 두께 증가가 완화되는 것을 확인하였다. 또한, 도 4b에 나타낸 바와 같이. 귀 사진을 통해서도 홍반, 부종, 각질 등의 증상이 완화되는 것을 관찰할 수 있었으며, 사균 보다는 생균에서 항아토피 활성이 좀 더 높은 것을 알 수 있었다.
이에 더하여, 락토바실러스 펜토서스 KF340 생균 또는 사균 투여에 따른 Th17 세포 및 IL-17A의 변화를 측정하였다. T 세포 매개 질환은 대부분 Th1/Th2에 의해 발생하는 질환으로 생각되어지지만 최근에는 IL-17을 분비하는 Th17 세포가 피부면역에 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. IL-17A는 Th17 세포에서 생성되는 주된 사이토카인으로 조직의 염증 반응에 중요한 역할을 하며, 호중구를 조직으로 불러오는 역할을 한다고 알려져 있다.
실험 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, 상기 생균 또는 사균 투여에 의해 IL-17의 생성량이 대조군에 비하여 감소하였으며, 도 4d와 같이 유세포 분석을 통해 Th17 관련 전사인자인 RORγt 의 발현도 감소하는 양상을 보이는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 생균 및 사균 모두 Th17 면역반응 억제를 통해 아토피피부염 억제활성이 있음을 알 수 있었다.
실시예
6:
락토바실러스
펜토서스
KF340의
항아토피
활성 기전 구명
6-1.
in vitro
및
in
vivo
에서
B220+CD5+
CD1d
+ 세포 증가 확인
상기 실시예 3-1을 통해 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 IL-10의 생성을 증가시킴을 확인하였으므로, 상기 균주가 조절 T 세포 이외에 IL-10 분비를 유도하는 세포에 영향을 미쳐 항알레르기 활성을 나타내는 것이라 판단하여, in vitro 및 in vivo에서 유세포 분석기(COULTER Epics XL, BECKMAN)를 사용하여 IL-10을 분비하는 세포를 스크리닝하였다.
In vitro 실험 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 처리에 의해 비장에서 IL-10의 분비가 현저히 증가되었고, 특히, 도 5b와 같이 비장의 B 세포에서 그 활성이 유의하게 증가하는 것을 발견하였다. 나아가 도 5c에 나타낸 바와 같이, 상기 균주 처리에 의해 splenic B 세포 내의 B220+CD5+CD1d+ 세포의 population이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
B10 세포(표현형: B220+CD5+CD1d+ 또는 CD19+CD5+CD1d+)는 조절 B 세포의 하위 서브세트로 비장에 특이적으로 많은 IL-10 사이토카인을 분비하여 알레르기를 억제할 수 있다고 보고되어 있으며, 염증반응과 자가면역반응을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 알려져있다.
상기 결과를 증명하기 위해, 상기 실시예 5-1에서 제작한 아토피피부염 마우스 모델에 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 경구 투여한 후 마우스의 비장을 적출하여 단세포화 하고 유세포 분석법을 통해 B220+CD5+CD1d+의 발현을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여군(340)의 경우 음성대조군(PBS control)에 비하여 B220+CD5+CD1d+ B 세포의 population이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 그러나 PPs 내에서의 B220+CD5+CD1d+ B 세포는 증가하지 않는 것으로 보아 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 시스테믹한 작용에 의한 것으로 판단된다.
6-2.
락토바실러스
펜토서스
KF340에 의한 DC 유도 확인
상기 실시예 6-1의 결과에서 확인한 바와 같이, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 비장의 B220+CD5+CD1d+ B 세포의 population을 증가시켰으나, 이는 비장에 직접적으로 작용했을 가능성은 매우 낮으므로, PPs 내의 작용으로 인한 이차적 반응(secondary response)으로써 비장에 작용했을 가능성이 있다. 이를 증명하기 위해, 상기 실시예 5-1에서 제작한 아토피피부염 마우스 모델에 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 경구투여한 후 PPs 내의 cell population을 관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군(PBS control)에 비하여 균주를 투여한 군(340)에서는 PPs 내의 수지상세포(dendritic cell; 이하, DC)의 빈도가 높아짐을 발견하였다. 또한, 증가한 DC는 CD80, CD86의 발현이 감소되는 패턴을 보이는 것을 확인하였다.
6-3.
락토바실러스
펜토서스
KF340에 의한
BAFF
발현 촉진 확인
상기 실시예 6-2의 결과를 통해, 억제성 DC가 림프조직에서 비장으로 이동하여 비장세포(splenocyte)에 영향을 미쳐 직간접적인 영향으로 조절 B 세포의 유도를 도왔을 가능성이 있는 것으로 판단하여, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 DC에 대한 직접적인 영향을 확인하고자 하였다.
이를 위해, 골수 유래 수지상세포(bone marrow dendritic cell; BMDC)에 상기 균주를 처리한 후 관련 사이토카인인 IL-10 및 TGF-β와 조절 B 세포 유도에 있어 중요한 인자로 알려진 BAFF의 mRNA 및 단백질 수준을 Real-time PCR 및 웨스턴 블롯을 통해 측정하였다. 상기 real-time PCR 수행시 사용한 각 프라이머 서열은 하기 표 4에 나타내었다.
| 유전자 | 방향 | 서열 | 서열번호 |
| IL-10 | forward | 5′-ATAACTGCACCCACTTCCCA-3′ | 2 |
| reverse | 5′-TCATTTCCGATAAGGCTTGG-3′ | 3 | |
| TGF-β | forward | 5′- TGGAGCAACATGTGGAACTC-3′ | 4 |
| reverse | 5′- TGCCGTACAACTCCAGTGAC-3′ | 5 | |
| BAFF | forward | 5′- AGGCTGGAAGAAGGAGATGAG-3′ | 6 |
| reverse | 5′- CAGAGAAGACGAGGGAAGGG-3′ | 7 |
실험 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, IL-10의 경우에는 대조군에 비하여 mRNA 발현 및 단백질 생산이 현저히 증가하였으나, TGF-β의 경우 유의한 차이가 나타나지 않았다. 그러나 조절 B 세포의 유도에 있어 중요한 인자로 알려진 BAFF의 mRNA 발현수준을 측정한 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, KF340 균주를 처리한 경우 대조군에 비하여 DC에서 발현이 크게 증가하였으며, 이와 동일하게 아토피피부염 마우스 모델의 PPs에서도 BAFF의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 실험 결과들을 통해, 아토피피부염 모델에서 항아토피 효과를 나타낸 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주는 조절 B 세포의 일종인 비장의 B220+CD5+CD1d+ B10 세포의 population을 증가시킴으로써 IL-10 분비를 증가시키는 특성을 가지고 있는 것을 확인하였다. 이러한 B10 세포의 증가는 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 흡수되어지는 PPs의 DC를 억제성 DC로 유도함으로써 IL-10 및 BAFF의 생산을 촉진하거나, 림프절을 통해 비장으로 이동하여 직접 B10 세포를 유도하는 것으로 여겨진다.
실시예
7:
락토바실러스
펜토서스
KF340의 장관면역 증진활성 확인
락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 장관면역 증진 여부를 평가하기 위하여, 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 마우스에 아토피피부염을 유발시키고 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 경구 투여한 후 상기 균주 투여에 따른 분비형 IgA의 농도를 측정하였다. 이를 위해, 실험 0일차와 실험 종료 후(8주차) 마우스의 분변을 수집한 후 BD사의 마우스 IgA 정량 키트를 사용하여 분변 내 IgA 및 IgA의 분비를 유도하는 사이토카인인 IL-6의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 아토피피부염을 유발시킨 마우스에서 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여에 의해 IgA의 생성량이 증가하였다. 또한, IL-6를 측정한 결과, payer's patch에서 IgA의 분비를 유도하는 IL-6 생성이 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 IgA의 생성을 유도하여 점막면역 강화에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
실시예
8: 식품 알레르기 억제 활성
8-1.
식품알레르기
유도 및
락토바실러스
펜토서스
KF340 투여
실험동물은 5주령의 자성 BALB/c 마우스를 (주)오리엔트바이오로부터 공급받아 실험동물실에서 일주일간 사육, 순화시킨 후 사용하였다. 도 10에 그림으로 나타낸 실험 과정에 따라, OVA(20 ㎍) 및 알럼(2 mg) 혼합 용액을 마리당 100 ㎕씩 복강 주사하여 1차 면역하고, 14일 뒤 동일한 방법으로 2차 면역을 실시하였다. 2차 면역 14일 후 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 마리당 5×108 CFU/일 농도로 매일 투여하였다. 이때 정상대조군(Naive)은 락토바실러스 펜토서스 KF340 현탁액 대신 현탁 용매인 PBS를 동량 투여하였으며, 양성대조군[PC(daxa)]은 면역억제제인 덱사메타손을 투여하였다. 식품 알레르기 유도를 위해 2차 면역 14일 후부터 3일 간격으로 모든 group에 50 mg/마리/일 농도의 OVA를 경구 투여하여 알레르기를 유발시켰다. OVA 경구투여 후 30분 간격으로 식품 알레르기 유발 지표인 아낙필락시스 반응과 설사반응을 확인하였으며, 직장온도의 변화를 20분 간격으로 60분 동안 측정하였다.
그 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주를 투여한 경우, 직장온도가 샴(sham)군에 비해 높게 유지되었으며, 도 11b 및 도 11c와 같이 설사반응이나 아나필락시스 반응도 역시 샴군에 비해 적게 일어나 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주가 식품 알레르기 증상완화 활성이 있음을 확인하였다.
8-2. 혈청
IgE
변화 확인
실험종료 후 마우스 안와정맥을 통해 채혈한 후, 3500 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청 내 IgE 함량은 BD사의 마우스 IgE 정량 키트를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여시 알레르기 증상과 밀접한 관련이 있는 IgE가 감소하였다.
8-3. 사이토카인 변화 확인
각 그룹의 마우스에서 MLN 및 비장을 적출한 후, 단세포한 세포(single cell suspension)를 5x106 농도로 96-웰에 seeding하고, 항원 특이적 반응을 확인하기 위해 세포에 OVA를 20 ㎍ 처리한 후, 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후, 상층액에 존재하는 사이토카인을 BD사의 사이토카인 정량 키트를 이용하여 ELISA 방법을 통해 확인하였다.
그 결과, 하기 표 5에서 볼 수 있는 바와 같이 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주 투여시 MLN 배양상등액에서 IgE 생산을 유도하는 IL-4 및 IL-13 분비가 감소한 바, 락토바실러스 펜토서스 KF340 균주의 식품 알레르기 억제 활성을 확인할 수 있었다.
| 실험군 | IL-4(pg/mL) | IL-13(pg/mL) | IgE(ng/mL) |
| 정상 대조군(Naive) | 8.01 | 46.58 | 1737.40 |
| 샴(sham) | 466.77 | 3049.87 | 27209.26 |
| 락토바실러스 펜토서스 KF340 | 331.61 | 2544 | 20422.95 |
| 덱사메타손 | 8.71 | 62.875 | 17434.98 |
실시예
9: 접촉성 피부염 억제 활성
9-1. 접촉성 피부염 유도 및
락토바실러스
펜토서스
KF340 투여
5주령의 암컷 BALB/c를 1주일간 적응시킨 후 0(Day 0)일에 정상대조군(Naive)을 제외한 모든 실험군의 옆구리 털을 제모한 후 5% TMA용액[아세톤과 이소프로필미리스테이트(isopropylmyristate)의 4:1(v/v) 혼합액을 용매로 사용] 50 ㎕를 도포하여 첫 감작을 실시하였다. 감작 5일 후 정상대조군(Naive)을 제외한 모든 실험군을 대상으로 5% TMA 10 ㎕를 양쪽 귀에 2차 감작시키고, 이후 3일에 한번 2% TMA 10 ㎕를 양쪽 귀에 도포하였다. 락토바실러스 펜토서스 KF340은 1차 감작 후 매일 5×108 CFU/마리 농도로 투여하였고, 샴군은 락토바실러스 펜토서스 KF340를 현탁하는데 사용한 PBS만을 동량 투여하였으며, 양성 대조군은 면역억제제로 사용되고 있는 프레드니솔론(P)을 처리하여 실험을 진행하였다.
TMA는 피부 외피를 통과하여 피부 내부로 침입 후 피부조직의 단백질과 결합하여 면역세포의 알레르기성 과민반응을 유도하는 화학적 합텐(hapten)의 일종으로 Th2 반응을 강하게 유도하며, TMA의 반복 처리는 유발부위의 염증발생 및 조직의 두께 증가를 유도한다. 실험 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 펜토서스 KF340 투여시 TMA를 처리한 귀 두께가 음성 대조군에 비해 감소하였다
9-2. 혈청
IgE
변화 확인
실험종료 후 마우스 안와정맥을 통해 채혈한 후, 3500 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청 내 IgE 함량은 BD사의 마우스 IgE 정량 키트를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 하기 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이 알레르기성 접촉성 피부염 환자에서 높은 발현을 보이는 IgE 함량이 샴군에 비해 감소하였다.
9-3. 사이토카인 변화 확인
각 그룹의 마우스에서 DLN 및 비장을 적출한 후, 단세포 현탁 과정 후 3x106 세포 96시간 동안 배양하였다. 이때 항원 특이적 반응을 확인하기 위해 세포만 배양하는 경우 및 진드기를 10 ㎍ 처리한 두 경우로 나눠 진행하였으며, 96시간 배양후 상층액에 존재하는 사이토카인을 e-Bioscience사의 사이토카인 정량 키트를 이용하여 ELISA 방법을 통해 확인하였다.
그 결과, 하기 표 6에서 볼 수 있는 바와 같이 DLN에서 Th2-관련 사이토카인인 IL-4의 분비량이 감소하는 것으로 나타나 락토바실러스 펜토서스 KF340가 알레르기성 접촉성 피부염 억제 활성이 있음을 확인하였다.
| 실험군 | IgE(ng/mL) | IL-4(pg/mL) |
| 정상 대조군(Naive) | 242.25 | 10.30833 |
| 샴(sham) | 4729.47 | 196.974 |
| 락토바실러스 펜토서스 KF340 | 3820.30 | 164.33 |
| 프레드니솔론(P: Prednisolone) | 2264.40 | 101.8833 |
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Th1-mediated Immune Disease, Th17-mediated Immune Disease, or
Th2-mediated Immune Disease Comprising Extracts from
Lactobacillus pentosus as an Active Ingredients
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<212> DNA
<213> Lactobacillus pentosus KF340 16S rDNA
<400> 1
cagagtttga tcatggctca ggacgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa 60
cgaactctgg tattgattgg tgcttgcatc atgatttaca tttgagtgag tggcgaactg 120
gtgagtaaca cgtgggaaac ctgcccagaa gcgggggata acacctggaa acagatgcta 180
ataccgcata acaacttgga ccgcatggtc cgagtttgaa agatggcttc ggctatcact 240
tttggatggt cccgcggcgt attagctaga tggtggggta acggctcacc atggcaatga 300
tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc 360
tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg agcaacgccg 420
cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt taaagaagaa catatctgag 480
agtaactgtt caggtattga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc 540
agccgcggta atacgtaagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg 600
caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa 660
actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 720
agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg 780
cttcgaaaag tatgggtcgc aaacaggatt agataccctg gtagtccata ccgtaaacga 840
tgaatgctaa gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagcatt 900
ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa 960
gcggtggagc atgtggttta attcgaagct acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacata 1020
ctatgcaaat ctaagagatt agacgttccc ttcggggaca tggatacagg tggtgcatgg 1080
ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat 1140
tatcagttgc cagcattaag ttgggcactc tggtgagact gccggtgaca aaccggagga 1200
aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa 1260
tggatggtac aacgagttgc gaactcgcga gagtaagcta atctcttaaa gccattctca 1320
gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc 1380
agcatgccgc gggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga 1440
gtttgtaaca cccaaagtcg gtggggtaac cttttaggaa ccagccgcct aacgtgggac 1500
agatgattag ggtgaagtcg taacaaggta cc 1532
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-10 Forward
<400> 2
ataactgcac ccacttccca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-10 Reverse
<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGF-b Forward
<400> 4
tggagcaaca tgtggaactc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TGF-b Reverse
<400> 5
tgccgtacaa ctccagtgac 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BAFF Forward
<400> 6
aggctggaag aaggagatga g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BAFF Reverse
<400> 7
cagagaagac gagggaaggg 20
Claims (24)
- 알레르기, 염증질환, 또는 자가면역질환의 예방, 개선, 또는 치료 활성을 가지는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P).
- 제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 유효성분으로 포함하는, 알레르기, 염증질환, 또는 자가면역질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 균주는 김치로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 균주는 생균 또는 사균인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 조절 T 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 조절 B 세포를 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 인터류킨-12(IL-12) 생성량에 대한 인터류킨-10(IL-10) 생성량의 비율을 5 내지 30이 되도록 하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 면역글로불린 E(IgE) 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 Th1-관련 사이토카인인 인터페론-감마(IFN-γ), 종양괴사인자알파(TNF-α), 또는 인터류킨-12(IL-12)의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 Th17-관련 사이토카인인 인터류킨-17(IL-17), 인터류킨-21(IL-21), 또는 인터류킨-22(IL-22)의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 Th2-관련 사이토카인인 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 또는 인터류킨-13(IL-13)의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 조성물은 장관면역을 증진시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 유효성분으로 포함하는, 알레르기, 염증질환, 또는 자가면역질환 개선용 건강기능성 식품 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 균주는 김치로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 건강기능성 식품 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 균주는 생균 또는 사균인 것을 특징으로 하는, 건강기능성 식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) KF340 균주(수탁번호 KCCM 11675P)를 유효성분으로 포함하는, 알레르기, 염증질환, 또는 자가면역질환 개선용 화장료 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 균주는 김치로부터 분리된 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
- 제20항에 있어서, 상기 균주는 생균 또는 사균인 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
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| JP2011004620A (ja) | 2009-06-23 | 2011-01-13 | Tokai Igaku Kensa Kenkyusho:Kk | ラクトバチルス属菌株及び前記菌株を含有する食品及び医薬品 |
| WO2014170595A1 (fr) | 2013-04-15 | 2014-10-23 | Greentech | Applications cosmétiques et pharmaceutiques de lactobacillus pentosus |
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2016
- 2016-03-04 KR KR1020160026193A patent/KR101761506B1/ko active IP Right Grant
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