CN109134693A - 一种桦褐孔菌多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桦褐孔菌多糖的制备方法，该方法是先将桦褐孔菌超微粉碎，后破壁，再利用热水进行提取并离心，获得提取液。提取液经微滤超滤、双水相萃取、大孔吸附树脂脱色、纳滤脱盐浓缩、冷冻干燥等步骤获得桦褐孔菌多糖产品。本发明具有的优点包括：1、采用低温微纳米破壁技术对细胞壁进行破坏，显著提高桦褐孔菌中多糖物质释放。2、用双水相萃取技术可以将大部分的蛋白质从多糖中分离出去，避免对多糖的影响。3、利用大孔吸附树脂脱色素，使多糖成品颜色更浅。4、采用纳滤膜技术可将多糖溶液中混有的柠檬酸钠和其他无机盐去除，还能对多糖溶液浓缩，避免高温对多糖活性的影响。5、使用的溶剂安全、无污染；收率高；操作简便，成本低。
Description
技术领域
本发明属于天然有机化学领域，涉及一种以桦褐孔菌为原料制备桦褐孔菌多糖的方法。特别是涉及一种利用细胞破壁技术和双水相萃取技术制备桦褐孔菌多糖的方法。
背景技术
桦褐孔菌是一种传统的民间野生药用真菌，主要分布于北纬45～50°之间的俄罗斯、北欧、波兰、日本北海道以及中国黑龙江大小兴安岭和吉林长白山等高寒地区，由于其特殊的生长环境，被冠以“森林中的黑钻石”、“奇幻的蘑菇”美称。自十六世纪以来，在世界多个国家，桦褐孔菌广泛用于治疗多种消化道癌症（如胃癌、肝癌和肠癌等）、心脏病和糖尿病等疑难杂症。研究表明，多糖是桦褐孔菌最重要的活性成分之一，具有增强免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖及抗病毒等多种药理活性，已成为国内外研究的热点领域之一。
由于多糖的分子量分布较广，造成了多糖种类很多、成分复杂，而且提取后的桦褐孔菌多糖中含有一定量的小分子化合物、大分子蛋白质和色素，因此有必要对多糖进行分离纯化。小分子化合物的去除方法很多，但蛋白质和色素的去除一直是多糖分离纯化中的一大难题。传统的去蛋白以Sevage法为主，方法操作繁琐，效率低，采用的有机溶剂有毒性因而影响多糖的生物活性；活性炭法去除色素效果较好，但后期的活性炭粉末不易去除，过氧化氢法因为较强的抗氧化活性去除色素效果很好，但对多糖的活性影响较大。
双水相萃取对于传统有机相-水相的溶剂萃取来说是个全新的替代品。适宜萃取蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。由于双水相界面张力远远低于水-有机溶剂两相体系的界面张力,有助于强化相际间的质量传递，分相时间短,一般只需5～15min。而且易于放大和进行连续性操作，萃取环境温和，生物相容性高。大孔吸附树脂是一类高分子吸附材料，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，具有很好的吸附活性，某些大孔吸附树脂已经应用到植物提取物的除色素工艺中，取得了很好的效果。
申请公布号CN 104045727 A（申请号201410288047.2）的中国专利公开了一种“利用AB-8弱极性树脂制备桦褐孔菌粗多糖的方法”，提取过程是先将原料脱脂预处理，然后采用热水浸提制备粗多糖。由于原料中的多糖存在于细胞中，如果不对植物细胞进行破壁处理，那么无法完全提取出细胞中的多糖类物质，影响提取收率。申请公布号CN 102603906 A（申请号201110461635.8）的中国专利公开了“一种桦褐孔菌多糖水溶液的制备方法”，包括以下步骤：微波提取、醇沉、三氯乙酸TCA脱蛋白、活性炭脱色、天然澄清剂澄清。三氯乙酸在2B类致癌物清单中，对人有可能致癌。活性炭法去除色素虽然效果较好，但后期的活性炭粉末不易去除，影响产品品质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种桦褐孔菌多糖的制备方法。本发明先将桦褐孔菌超微粉碎，然后破壁，再利用热水进行提取并离心，获得提取液。提取液经微滤超滤、双水相萃取、大孔吸附树脂脱色、纳滤脱盐浓缩、冷冻干燥等步骤获得桦褐孔菌多糖产品。
本发明的技术方案是这样实现的，它包括以下步骤：
（1）将原料桦褐孔菌超微粉碎至300目以上，得到粉末；
（2）将步骤（1）中得到的粉末进行细胞破壁处理；
（3）将步骤（2）中破壁处理后的粉末用其重量5～10倍的纯化水在80～85℃的条件下提取1～2h后离心，离心机转速为13000～16000r/min，分别收集料渣和离心液，料渣进行第二次提取，提取参数同第一次。两次提取的离心液合并；
（4）将步骤（3）中得到的离心液先用0.1微米的微滤膜除去大颗粒杂质后，透过微滤膜的液体再用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜处理去除小分子物质，收集截留液；
（5）将步骤（4）中收集的截留液用双水相体系进行萃取，收集下层溶液；
（6）将步骤（5）中收集的下层溶液用S-8型大孔吸附树脂进行脱色处理，溶液先以1.5BV/h的流速加入大孔吸附树脂，再用纯化水以2BV/h的速度冲洗大孔吸附树脂，纯化水的用量为4BV，收集这个过程的流出液；
（7）将步骤（6）中收集的下层溶液用截留分子量为500道尔顿的纳滤膜进行浓缩和脱盐处理，收集浓缩液；
（8）将步骤（7）中收集的浓缩液进行冷冻干燥，得到桦褐孔菌多糖粉末。
本发明较好的技术方案是：所述的步骤（2）中，细胞破壁处理的方法为低温微纳米破壁技术，将超微粉末放置于-170℃的低温环境下使其冷冻，随后再常温融化，反复5～8次，使得细胞壁破碎。
本发明较好的技术方案是：所述的步骤（5）中，首先用稀碱液将步骤（4）中收集的截留液的pH值调节至8.5～8.8之间，然后加入聚乙二醇（PEG)8000与柠檬酸钠，聚乙二醇（PEG)8000的加入量为双水相体系总重量的22%～25%之间，柠檬酸钠的加入量为双水相体系总重量的8%～10%之间，搅拌均匀后静置分层，收集下层溶液。
本发明具有以下优点：
1、采用低温微纳米破壁技术对桦褐孔菌细胞壁进行破坏，能够显著提高桦褐孔菌细胞中多糖类物质的释放。
2、采用双水相萃取技术可以将大部分的蛋白质从多糖中分离出去，从而避免其他蛋白质去除方法对多糖类物质的影响。
3、利用大孔吸附树脂脱色素，能够使多糖成品颜色更浅。
4、采用纳滤膜技术可以将多糖溶液中混有的柠檬酸钠和其他无机盐去除，还能对多糖溶液进行浓缩，避免了高温浓缩对多糖中活性物质的影响。
5、使用的溶剂低毒安全、无污染；多糖收率高；操作简便，生产成本低。
具体实施方案
实施例1
取桦褐孔菌1kg用超微粉碎机粉碎至300目以上，然后将超微粉末超低温冷冻至-170℃，再常温放置融化，重复冷冻、融化步骤5次进行破壁。
向破壁处理后的粉末中加入9kg的纯化水，在温度为83±2℃的条件下提取1h。提取完成后将料液用转速为13000r/min的离心机离心，收集离心液至储罐中，料渣进行第2次提取并离心，合并2次离心液。
离心液先用孔径为0.1微米的微滤膜除去大颗粒杂质，然后再用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜除去小分子物质，收集超滤膜截留的液体。
超滤膜的截留液体用稀NaOH水溶液调节pH值为8.54，然后向截留液中加入聚乙二醇（PEG)8000和柠檬酸钠，聚乙二醇（PEG)8000的加入量为双水相体系总重量的25%，柠檬酸钠的加入量为双水相体系总重量的8%，搅拌均匀后静置分层，收集含有多糖成分的下层溶液。
下层溶液以1.5BV/h的流速加入S-8型大孔吸附树脂后用4BV的纯化水进行冲洗，流速为2BV/h，收集从开始上柱到冲洗结束这部分时间流出的液体。
上述液体再用截留分子量为500道尔顿的纳滤膜进行浓缩和脱盐，得到浓缩液。
将浓缩液冷冻干燥，得到浅灰色桦褐孔菌多糖粉末。多糖的纯度为81.39%，多糖转移率为88.41%。
实施例2
取桦褐孔菌1kg用超微粉碎机粉碎至300目以上，然后将超微粉末超低温冷冻至-170℃，再常温放置融化，重复冷冻、融化步骤6次进行破壁。
向破壁处理后的粉末中加入8kg的纯化水，在温度为83±2℃的条件下提取1.5h。提取完成后将料液用转速为14000r/min的离心机离心，收集离心液至储罐中，料渣进行第2次提取并离心，合并2次离心液。
离心液先用孔径为0.1微米的微滤膜除去大颗粒杂质，然后再用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜除去小分子物质，收集超滤膜截留的液体。
超滤膜的截留液体用稀NaOH水溶液调节pH值为8.62，然后向截留液中加入聚乙二醇（PEG)8000和柠檬酸钠，聚乙二醇（PEG)8000的加入量为双水相体系总重量的23%，柠檬酸钠的加入量为双水相体系总重量的9%，搅拌均匀后静置分层，收集含有多糖成分的下层溶液。
下层溶液以1.5BV/h的流速加入S-8型大孔吸附树脂后用4BV的纯化水进行冲洗，流速为2BV/h，收集从开始上柱到冲洗结束这部分时间流出的液体。
上述液体再用截留分子量为500道尔顿的纳滤膜进行浓缩和脱盐，得到浓缩液。
将浓缩液冷冻干燥，得到浅灰色桦褐孔菌多糖粉末。多糖的纯度为82.14%，多糖转移率为86.92%。
实施例3
取桦褐孔菌1kg用超微粉碎机粉碎至300目以上，然后将超微粉末超低温冷冻至-170℃，再常温放置融化，重复冷冻、融化步骤7次进行破壁。
向破壁处理后的粉末中加入6kg的纯化水，在温度为83±2℃的条件下提取2h。提取完成后将料液用转速为15000r/min的离心机离心，收集离心液至储罐中，料渣进行第2次提取并离心，合并2次离心液。
离心液先用孔径为0.1微米的微滤膜除去大颗粒杂质，然后再用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜除去小分子物质，收集超滤膜截留的液体。
超滤膜的截留液体用稀NaOH水溶液调节pH值为8.71，然后向截留液中加入聚乙二醇（PEG)8000和柠檬酸钠，聚乙二醇（PEG)8000的加入量为双水相体系总重量的24%，柠檬酸钠的加入量为双水相体系总重量的10%，搅拌均匀后静置分层，收集含有多糖成分的下层溶液。
下层溶液以1.5BV/h的流速加入S-8型大孔吸附树脂后用4BV的纯化水进行冲洗，流速为2BV/h，收集从开始上柱到冲洗结束这部分时间流出的液体。
上述液体再用截留分子量为500道尔顿的纳滤膜进行浓缩和脱盐，得到浓缩液。
将浓缩液冷冻干燥，得到浅灰色桦褐孔菌多糖粉末。多糖的纯度为80.81%，多糖转移率为87.17%。
上上述实施例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种桦褐孔菌多糖的制备方法，其特征在于，包括以下几个步骤：
（1）将原料桦褐孔菌超微粉碎至300目以上，得到粉末；
（2）将步骤（1）中得到的粉末进行细胞破壁处理；
（3）将步骤（2）中破壁处理后的粉末用其重量5～10倍的纯化水在80～85℃的条件下提取1～2h后离心，离心机转速为13000～16000r/min，分别收集料渣和离心液，料渣进行第二次提取，提取参数同第一次，两次提取的离心液合并；
（4）将步骤（3）中得到的离心液先用0.1微米的微滤膜除去大颗粒杂质后，透过微滤膜的液体再用截留分子量为3000道尔顿的超滤膜处理去除小分子物质，收集截留液；
（5）将步骤（4）中收集的截留液用双水相体系进行萃取，收集下层溶液；
（6）将步骤（5）中收集的下层溶液用S-8型大孔吸附树脂进行脱色处理，溶液先以1.5BV/h的流速加入大孔吸附树脂，再用纯化水以2BV/h的速度冲洗大孔吸附树脂，纯化水的用量为4BV，收集这个过程的流出液；
（7）将步骤（6）中收集的下层溶液用截留分子量为500道尔顿的纳滤膜进行浓缩和脱盐处理，收集浓缩液；
（8）将步骤（7）中收集的浓缩液进行冷冻干燥，得到桦褐孔菌多糖粉末。
2.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的制备方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，细胞破壁处理的方法为低温微纳米破壁技术，将超微粉末放置于-170℃的低温环境下使其冷冻，随后再常温融化，反复5～8次，使得细胞壁破碎。
3.根据权利要求1所述的一种桦褐孔菌多糖的制备方法，其特征在于：所述的步骤（5）中，首先用稀碱液将步骤（4）中收集的截留液的pH值调节至8.5～8.8之间，然后加入聚乙二醇（PEG)8000与柠檬酸钠，聚乙二醇（PEG)8000的加入量为双水相体系总重量的22%～25%之间，柠檬酸钠的加入量为双水相体系总重量的8%～10%之间，搅拌均匀后静置分层，收集下层溶液。
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