CN109206476A - 一种蛋白分离纯化的方法 - Google Patents

Abstract

一种蛋白分离纯化的方法，属于蛋白纯化技术领域。本发明为了能够大剂量纯化出纯度较高的蛋白，本发明提供了一种蛋白分离纯化的方法，包括如下步骤：制备正电荷分子筛：将不带电荷的分子筛树脂与有机溶剂混合，在变性剂和保护剂的作用下，在140‑160℃下反应的时间为24‑48h，制备获得复合分子筛树脂，再加入酸性溶液抽滤洗涤至中性，干燥后获得正电荷分子筛；将待纯化的蛋白样品经步骤1)获得的正电荷分子筛过滤，获得的滤液经尺寸排阻色谱层析对蛋白进行纯化，或者将获得的滤液经阴离子交换层析对蛋白进行纯化，获得纯化溶液。本发明使用于工业化生产目的蛋白。

Description

一种蛋白分离纯化的方法

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，具体涉及一种蛋白分离纯化的方法。

背景技术

分子筛层析又称为凝胶过滤层析或体积排阻层析。分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。以葡聚糖凝胶应用最广，商品名为Sephadex，其型号有多种，从G10到G200，其主要应用范围是：①分级分离各种抗原与抗体；②去掉复合物中的小分子物质。如除盐、荧光素和游离的放射性同位素以及水解的蛋白质碎片；③分析血清中的免疫复合物；④分子量的测定。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。

离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。上世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。离子交换层析是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

发明内容

为了能够大剂量纯化出纯度较高的蛋白，本发明提供了一种蛋白分离纯化的方法，包括如下步骤：

1)制备正电荷分子筛：将不带电荷的分子筛树脂与有机溶剂混合，在变性剂和保护剂的作用下，在140-160℃下反应24-48h，制备获得复合分子筛树脂，再加入酸性溶液抽滤洗涤至中性，干燥后获得正电荷分子筛；

2)将待纯化的蛋白样品经步骤1)获得的正电荷分子筛过滤，获得的滤液经尺寸排阻色谱层析对蛋白进行纯化，或者将获得的滤液经阴离子交换层析对蛋白进行纯化，获得纯化溶液。

进一步地限定，步骤1)所述有机溶剂为甲苯、三甲基苯、丙酮、甲醇、乙醇中的一种或多种的混合；所述变性剂为3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙氧基硅烷等氨基烷类中的一种或多种的混合；所述保护剂为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气中的一种或多种的混合，所述“多种的混合”是指各物质或试剂之间以任意比混合。

进一步地限定，步骤1)所述不带电荷的分子筛树脂、变性剂、有机溶剂三者的比例为(4～5)g:(5～6)mL:(50～60)mL。

进一步地限定，步骤1)中所述的反应结束后，将反应混合液离心，得到的沉淀经洗涤后进行干燥，获得复合分子筛树脂，所述沉淀洗涤用的试剂为甲苯和甲醇的混合物，所述甲苯和甲醇以任意比混合。

进一步地限定，步骤1)所述得到的沉淀经洗涤后进行真空干燥，干燥温度为90℃-100℃，干燥时间为8h-12h。

进一步地限定，步骤1)所述抽滤洗涤所用的酸性溶液为盐酸、硫酸中的一种或两种的混合，浓度为1-2mol/L。

进一步地限定，步骤2)所述阴离子交换过程中所用的平衡液为HEPES溶液，浓度为10-100mM。

进一步地限定，所述待纯化蛋白样品在进行纯化前经0.22μm滤膜过滤除菌。

进一步地限定，所述待纯化蛋白样品为细胞发酵液或由细胞发酵液提取的蛋白样品。

更进一步地限定，所述细胞发酵液为大肠杆菌、酵母菌或中国仓鼠卵巢细胞系发酵获得的培养液。

有益效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)分离纯化的蛋白较传统方法纯度更高，其中以细胞发酵液经正电荷分子筛层析及阴离子交换层析分离纯化蛋白效果最好。

2)经济成本低，符合常规工业大批量生产要求。

3)操作简单、只经过一次层析柱纯化即可达到分子筛和离子交换层析的双重纯化效果，大大减少纯化所需时间，即纯化周期短。

附图说明

图1.细胞发酵液经正电荷分子筛和阴离子交换层析分离纯化结果，横坐标为洗脱体积(毫升)，纵坐标为不同波长紫外线下的吸收值(mAU)，实线为UV 280nm下检测的结果，虚线为UV 254nm下检测的结果。

图2.细胞发酵液经正电荷分子筛和尺寸排阻色谱分离纯化结果，横坐标为洗脱体积(毫升)，纵坐标为不同波长紫外线下的吸收值(mAU)，实线为UV 280nm下检测的结果，虚线为UV 254nm下检测的结果。

图3.细胞发酵液经传统分子筛分离纯化结果，横坐标为洗脱体积(毫升)，纵坐标为不同波长紫外线下的吸收值(mAU)，实线为UV 280nm下检测的结果，虚线为UV 254nm下检测的结果。

图4.细胞发酵液经正电荷分子筛分离纯化结果，横坐标为洗脱体积(毫升)，纵坐标为不同波长紫外线下的吸收值(mAU)，实线为UV 280nm下检测的结果，虚线为UV 254nm下检测的结果。

图5.细胞发酵液经阴离子交换层析方法纯化结果，横坐标为洗脱时间(分钟)，纵坐标为不同波长紫外线下的吸收值(mAU)，实线为UV 280nm下检测的结果，虚线为UV 254nm下检测的结果。

图6.细胞发酵液经传统分子筛和尺寸排阻色谱分离方法纯化结果，横坐标为洗脱时间(分钟)，纵坐标为不同波长紫外线下的吸收值(mAU)，实线为UV 280nm下检测的结果，虚线为UV 254nm下检测的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均采用本领域常规技术。无特殊说明，所有化学试剂均为商用常规分析纯试剂。

本发明将电荷分子筛层析与尺寸排阻色谱层析方法或者与阴离子交换层析方法相结合对蛋白进行分离纯化。具体方法为：

1)制备正电荷分子筛：将不带电荷的分子筛树脂与有机溶剂混合，在变性剂和保护剂的作用下，在140-160℃下反应24-48h，制备获得复合分子筛树脂，再加入酸性溶液抽滤洗涤至中性，干燥后获得正电荷分子筛；

2)将待纯化的蛋白样品经步骤1)获得的正电荷分子筛过滤，获得的滤液经尺寸排阻色谱层析对蛋白进行纯化，或者将获得的滤液经阴离子交换层析对蛋白进行纯化，获得纯化溶液。

本发明所述的蛋白分离纯化方法中使用的正电荷分子筛，为一种组合型层析树脂，即具有分子筛树脂的特性，同时还带有电荷，对与其带相反电荷的蛋白分子具有一定的吸引作用。

所述制备正电荷分子筛所使用的不带电荷的分子筛，可以为任意一种不带电荷的分子筛，包括但不限于Sephacryl S-100HR、Sephacryl S-200HR、Sephacryl S-300HR、Superdex 75Prep Grade、Superdex 200Prep Grade。

上述的任意一种不带电荷的分子筛在变性剂与保护剂的作用下，经140-160℃的高温处理，使其带上正电荷，再加入酸性溶液抽滤洗涤至中性，干燥后用于后续的纯化操作，实现对蛋白样品的过滤与纯化，均能够达到如实施例1中所述的纯化效果。

在制备获得复合分子筛树脂的过程中，反应液经高速离心后获得的固体要经过醇和甲苯等稳定有机溶剂的洗涤方可能除去其他有机杂质。

本发明所述的待纯化样品为表达纳米抗体的细胞发酵液，细胞发酵液可以是由大肠杆菌、酵母菌或中国仓鼠卵巢细胞系CHO细胞经常规发酵培养后获得的发酵液，其中所述的大肠杆菌发酵液的获取可通过如下方法获得：大肠杆菌在5LB搅拌式玻璃生物反应器中生产，利用0.4mM IPTG诱导纳米抗体进行周质表达，将细胞培养液在4℃、4000×g条件下离心20min，收集菌体，然后将菌体重悬提取周质蛋白进行分离纯化；酵母菌发酵液的获取可通过如下方法获得：毕赤酵母在5LB搅拌式玻璃生物反应器中生产，利用甲醇诱导纳米抗体进行分泌表达，将细胞培养液在4℃、4000×g条件下离心20min，上清液经由0.22μm滤膜过滤，收集过滤液；中国仓鼠卵巢细胞系CHO细胞发酵液的获取可通过如下方法获得：在5LB搅拌式玻璃生物反应器中生产，将细胞培养液在4℃、4000×g条件下离心20min，上清液经由0.22μm滤膜过滤，收集过滤液。

待纯化样品经本发明所述的方法分离纯化后，对于获得的浓度较低的纯化溶液可经过高速离心机进行分离浓缩后，置换为中性缓冲液，所用浓缩管孔径截留蛋白分子量在目的蛋白分子量的50％-80％。

下面以中国仓鼠卵巢细胞系CHO细胞发酵液为例，具体描述本发明所述的蛋白分离纯化的方法及纯化效果。

实施例1.利用正电荷分子筛层析与阴离子交换层析方法结合的蛋白纯化方法。

1)制备正电荷分子筛：取5mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，50mL甲苯，加入4g传统分子筛凝胶Sephacryl S-300HR，氮气保护条件下140℃回流24h。反应完毕后待溶液冷却至室温，用高速离心机离心分离，分离后的固体在索氏提取器用甲苯和甲醇洗涤4h，产品于90℃条件下真空干燥8h，确保树脂干燥完全，得到复合分子筛树脂NH₂-Sephacryl S-300HR。取1.0g NH₂-Sephacryl S-300HR中加入100mL 2.0mol/L HCl搅拌5h，再抽滤洗涤至中性，室温干燥24h，即得正电荷分子筛NH³⁺-Sephacryl S-300HR。

2)将待纯化的细胞发酵液经步骤1)获得的正电荷分子筛过滤，获得的滤液经阴离子交换层析对蛋白进行纯化，获得纯化液。

本实施例利用的仪器为：NGC Chromatography System，首先对要纯化的蛋白样品经过正电荷分子筛进行过滤，具体操作方法如下：启动NGC Chromatography System，将pump调至“Manual Load Loop”模式，将A、B泵进样管放入去离子水中。切换至流速设置界面，调节流速为2mL/min，点击“Start”，冲洗5min。然后打开流速设置界面，设置流速为0.5mL/min，设置压力上限为40psi，点击“Apply”，将上述制备获得的正电荷分子筛NH³⁺-Sephacryl S-300安装在NGC Chromatography System上，用去离子水平衡0.5个柱体积(60mL)。第三步，打开流速设置界面，点击“Stop”，将A、B泵进样管放入PBS溶液中，流速仍设置为0.5mL/min，点击“Start”，用PBS溶液平衡2个柱体积(240mL)。紧接着用进样注射器吸取1.2mL PBS溶液，在进样口注射，重复2-3次，冲洗进样环。将纯化的蛋白样品用0.22μm的滤膜过滤，用进样注射器吸取1.2mL过滤后的蛋白样品(共3mg蛋白)，在进样口注射蛋白样品，将pump调至“System Pump Inject Loop”模式，待样品全部进入NGC ChromatographySystem后(如流速为0.5mL/min，进样1mL，则样品需2min进入层析仪)，将pump调至“ManualLoad Loop”模式。根据分离的峰形图，分段收集洗脱液。将收集的洗脱液用10kD超滤管4000rpm浓缩洗脱液至1mL获得滤液。

打开流速设置界面，点击“Stop”，将A、B泵进样管放入0.2M NaOH溶液中，流速仍设置为0.5mL/min，点击“Start”，用0.2M NaOH溶液洗脱0.5个柱体积(60mL)。打开流速设置界面，点击“Stop”，将A、B泵进样管放入去离子水中，流速仍设置为0.5mL/min，点击“Start”，用去离子水洗脱4个柱体积(480mL)。打开流速设置界面，点击“Stop”，将A、B泵进样管放入20％乙醇中，流速仍设置为0.5mL/min，点击“Start”，用20％乙醇洗脱4个柱体积(480mL)。将NH³⁺-Sephacryl S-300HR卸下保存。

然后利用该系统将经过正电荷分子筛过滤的滤液进行阴离子层析，该步骤使正电荷分子筛过滤而得的富含负电荷分子的溶液经过离子交换，高盐梯度洗脱后可得到纯化液，具体方法为：

首先调整A、B泵流量各50％，放入水中清洗机器10min。然后安装柱子后，将A、B泵放入50mM HEPES中，至参数曲线平衡。调整A泵流量为100％，B泵放入20％乙醇。将A泵放入样品，设置样品流速为0.5mL/min，待样品上完后，调整A、B泵流量为各50％，均放入50mMHEPES，平衡至OD检测线稳定。调整模式Mode至Gradient End模式。将％B设置为从10至80，整个过程持续60min。B泵放入洗脱液(1.5M NaCl、50mM HEPES)，A泵放入50mM HEPES。波峰一般在60％出现，不排除特殊情况。收集各波峰后，A、B泵调整为流量各50％，放入0.2MNaOH，清洗20min。A、B泵均放入50mM NaCl平衡20min。A、B泵均放入水中清洗10min。最后将A、B泵放入20％乙醇中，清洗20min后卸下柱子。纯化结果见图1。

细胞发酵液经过正电荷分子筛层析和阴离子交换层析方法纯化后，可见单一的洗脱峰，洗脱峰两侧的曲线较规整，UV280峰值在75左右。且UV280近似于两倍的UV254值，符合蛋白质的特性。纯化效果良好，可以分离出较纯的目的蛋白。

实施例2.利用正电荷分子筛层析与尺寸排阻色谱层析方法结合的蛋白纯化方法。

1)制备正电荷分子筛：参照实施例1中步骤1)所述方法制备正电荷分子筛。

2)将待纯化的细胞发酵液经步骤1)获得的正电荷分子筛过滤，获得的滤液经尺寸排阻色谱层析对蛋白进行纯化，获得纯化液。

本实施例中细胞发酵液经正电荷分子筛过滤的步骤同实施例1中步骤2)所述的步骤，获得的滤液经尺寸排阻色谱层析方法进行分离纯化，具体方法为：将滤液在6mol/L盐酸胍的流动相(pH 6.0)中，配制成1.0mg/mL的溶液，室温下放置过夜，取10μL注入HPLC系统(流动相中含6mol/L盐酸胍，pH 6.0)。蛋白质在尺寸排阻色谱系统中的洗脱分配系数Kd为：

Kd＝(Ve-V0)/(Vt-V0)

Ve为蛋白质的洗脱体积；V0为完全排阻体积，用葡聚蓝测定；Vt为完全渗透体积，用叠氮钠测定。纯化结果见图2。

细胞发酵液经过正电荷分子筛和尺寸排阻色谱方法纯化后，可见两个较独立的洗脱峰，且峰与峰之间的界限较清晰，主峰的峰值的UV280在250左右。洗脱峰两侧的曲线较规整，纯化效果较好，可以分离出较纯的目的蛋白。

对比例1.传统分子筛层析方法分离纯化蛋白。

具体方法如下：首先，启动NGC Chromatography System，将pump调至“ManualLoad Loop”模式，将A、B泵进样管放入去离子水中。切换至流速设置界面，调节流速为2mL/min，点击“Start”，冲洗5min。然后打开流速设置界面，设置流速为0.5mL/min，设置压力上限为40psi，点击“Apply”，将HiPrep 16/60Sephacryl S-300High Resolution安装在NGCChromatography System上，用去离子水平衡0.5个柱体积(60mL)。第三步，打开流速设置界面，点击“Stop”，将A、B泵进样管放入PBS溶液中，流速仍设置为0.5mL/min，点击“Start”，用PBS溶液平衡2个柱体积(240mL)。紧接着用进样注射器吸取1.2mL PBS溶液，在进样口注射，重复2-3次，冲洗进样环。将纯化的蛋白样品细胞发酵液用0.22μm的滤膜过滤，用进样注射器吸取1.2mL过滤后的蛋白样品(共3mg蛋白)，在进样口注射蛋白样品，将pump调至“SystemPump Inject Loop”模式，待样品全部进入NGC Chromatography System后(如流速为0.5mL/min，进样1mL，则样品需2min进入层析仪)，将pump调至“Manual Load Loop”模式。根据分离的峰形图，分段收集洗脱液。将收集的洗脱液用10kD超滤管4000rpm浓缩洗脱液至1mL，打开流速设置界面，点击“Stop”，将A、B泵进样管放入0.2M NaOH溶液中，流速仍设置为0.5mL/min，点击“Start”，用0.2M NaOH溶液洗脱0.5个柱体积(60mL)。打开流速设置界面，点击“Stop”，将A、B泵进样管放入去离子水中，流速仍设置为0.5mL/min，点击“Start”，用去离子水洗脱4个柱体积(480mL)。打开流速设置界面，点击“Stop”，将A、B泵进样管放入20％乙醇中，流速仍设置为0.5mL/min，点击“Start”，用20％乙醇洗脱4个柱体积(480mL)。将HiPrep 16/60Sephacryl S-300High Resolution卸下保存，打开流速设置界面，点击“Stop”，关闭NGC Chromatography System。纯化结果见图3。

细胞发酵液经过传统分子筛分离纯化后可见三个较明显的洗脱峰，且每个峰值的UV280均在500左右。UV254值明显高于UV280值，说明杂质较多，因此纯化效果不佳，没有分离出较纯的蛋白。

对比例2.正电荷分子筛层析方法分离纯化蛋白。

正电荷分子筛制备：取5mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，50mL甲苯，加入4g传统分子筛凝胶Sephacryl S-300HR，氮气保护条件下140℃回流24h。反应完毕后待溶液冷却至室温，用高速离心机离心分离，分离后的固体在索氏提取器用甲苯和甲醇洗涤4h，产品于90℃条件下真空干燥8h得到NH₂-Sephacryl S-300HR。取1.0g NH₂-Sephacryl S-300HR中加入100mL 2.0mol/L HCl搅拌5h，再抽滤洗涤至中性，室温干燥24h，即得NH³⁺-Sephacryl S-300HR。将上述制备获得的正电荷分子筛NH³⁺-Sephacryl S-300HR安装在NGCChromatography System上，经NGC Chromatography System纯化，具体纯化方法参照对比例1，纯化结果见图4。

细胞发酵液经过正电荷分子筛层析方法纯化后，可见五个较明显的洗脱峰，且前四个小峰的峰值的UV280均在500左右。但是只有第一个洗脱峰与第四个洗脱峰的UV280值大于UV254值，符合蛋白特性。第五个洗脱峰虽然单一，且峰值的UV280可达2000以上。但是，杂质含量较高。

对比例3.阴离子交换方法纯化蛋白。

利用NGC Chromatography System进行，首先调整A、B泵流量各50％，放入水中清洗机器10min。然后安装柱子后，将A、B泵放入50mM HEPES中，至三条曲线平衡。调整A泵流量为100％，B泵放入20％乙醇。将A泵放入样品，设置样品流速为0.5mL/min，待样品上完后，调整A、B泵流量为各50％，均放入50mM HEPES，平衡至OD检测线稳定。调整模式Mode至Gradient End模式。将％B设置为从10至80，整个过程持续60min。B泵放入洗脱液(1.5MNaCl、50mM HEPES)，A泵放入50mM HEPES。波峰一般在60％出现，不排除特殊情况。收集各波峰后，A、B泵调整为流量各50％，放入0.2M NaOH，清洗20min。A、B泵均放入50mM NaCl平衡20min。A、B泵均放入水中清洗10min。最后将A、B泵放入20％乙醇中，清洗20min后卸下柱子。纯化结果见图5。

细胞发酵液经过阴离子交换层析方法纯化后，可见多个连续的洗脱峰，且峰与峰之间的界限不清晰，前五个小峰的峰值的UV280均在600左右。主峰UV280的峰值在800左右。纯化效果较差，无法分离目的蛋白与杂蛋白。

对比例4.经传统分子筛层析方法与尺寸排阻色谱方法分离纯化蛋白。

将对比例1经传统分子筛层析方法纯化后收集的样品经尺寸排阻色谱方法进行分离纯化。首先经传统分子筛层析方法纯后的样品在盐酸胍溶液中变性：将待测蛋白质溶液在6mol/L盐酸胍的流动相(pH 6.0)中，配制成1.0mg/mL的溶液，室温下放置过夜，取10μL注入HPLC系统(流动相中含6mol/L盐酸胍，pH 6.0)。蛋白质在尺寸排阻色谱系统中的洗脱分配系数Kd为：

Kd＝(Ve-V0)/(Vt-V0)

Ve为蛋白质的洗脱体积；V0为完全排阻体积，用葡聚蓝测定；Vt为完全渗透体积，用叠氮钠测定。纯化结果见图6。

细胞发酵液经过传统分子筛和尺寸排阻色谱方法纯化后，可见三个较独立的洗脱峰，且峰与峰之间的界限较清晰，主峰的峰值的UV280在400左右。纯化效果较差，无法分离目的蛋白与杂蛋白。

本发明所述的蛋白分离纯化的方法同样适用于纳米抗体的制备与纯化。

实施例3.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤1)所述正电荷分子筛的制备方法为：取6mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，60mL甲苯，加入5g传统分子筛凝胶Sephacryl S-300HR，氮气保护条件下160℃回流48h。反应完毕后待溶液冷却至室温，用高速离心机离心分离，分离后的固体在索氏提取器用甲苯和甲醇洗涤4h，产品于100℃条件下真空干燥12h，确保树脂干燥完全，得到复合分子筛树脂NH₂-Sephacryl S-300HR。取1.0gNH₂-Sephacryl S-100HR中加入100mL 2.0mol/L HCl搅拌5h，再抽滤洗涤至中性，室温干燥24h，即得正电荷分子筛NH³⁺-Sephacryl S-300HR。

细胞发酵液经过正电荷分子筛层析和阴离子交换层析方法纯化后，可见单一的洗脱峰，洗脱峰两侧的曲线较规整，UV280峰值在90左右。且UV280近似于两倍的UV254值，符合蛋白质的特性。纯化效果良好，可以分离出较纯的目的蛋白。

实施例4.重复实施例3，与实施例3的不同在于，本实施例中步骤1)正电荷分子筛的制备方法取6mL 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTS)，60mL甲苯，加入5g传统分子筛凝胶Sephacryl S-300HR，氮气保护条件下160℃回流36h。其余操作与实施例3相同。

细胞发酵液经过正电荷分子筛层析和阴离子交换层析方法纯化后，可见单一的洗脱峰，洗脱峰两侧的曲线较规整，UV280峰值在83左右。且UV280近似于两倍的UV254值，符合蛋白质的特性。纯化效果良好，可以分离出较纯的目的蛋白。

实施例5.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤1)正电荷分子筛的制备方法中所述的传统分子筛凝胶Superdex 75Prep Grade，参照实施例1所述的方法制备获得正电荷分子筛。

细胞发酵液经过正电荷分子筛层析和阴离子交换层析方法纯化后，可见单一的洗脱峰，洗脱峰两侧的曲线较规整，UV280峰值在100左右。且UV280近似于两倍的UV254值，符合蛋白质的特性。纯化效果良好，可以分离出较纯的目的蛋白。

实施例6.重复实施例1，与实施例1的不同在于，本实施例中步骤1)正电荷分子筛的制备方法中所述的传统分子筛凝胶Sephacryl S-200HR，参照实施例1所述的方法制备获得正电荷分子筛。

细胞发酵液经过正电荷分子筛层析和阴离子交换层析方法纯化后，可见单一的洗脱峰，洗脱峰两侧的曲线较规整，UV280峰值在88左右。且UV280近似于两倍的UV254值，符合蛋白质的特性。纯化效果良好，可以分离出较纯的目的蛋白。

Claims (10)

1.一种蛋白分离纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备正电荷分子筛：将不带电荷的分子筛树脂与有机溶剂混合，在变性剂和保护剂的作用下，在140-160℃下反应24-48h，制备获得复合分子筛树脂，再加入酸性溶液抽滤洗涤至中性，干燥后获得正电荷分子筛；

2)将待纯化蛋白样品经步骤1)获得的正电荷分子筛过滤，获得的滤液经尺寸排阻色谱层析对蛋白进行纯化，或者将获得的滤液经阴离子交换层析对蛋白进行纯化，获得纯化溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述有机溶剂为甲苯、三甲基苯、丙酮、甲醇、乙醇中的一种或多种的混合；所述变性剂为3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三乙氧基硅烷等氨基烷类中的一种或多种的混合；所述保护剂为氮气、氦气、氖气、氩气、氪气、氙气中的一种或多种的混合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述不带电荷的分子筛树脂、变性剂、有机溶剂三者的比例为(4～5)g:(5～6)mL:(50～60)mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的反应结束后，将反应混合液离心，得到的沉淀经洗涤后进行干燥，获得复合分子筛树脂，所述沉淀洗涤用的试剂为甲苯和甲醇的混合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)所述得到的沉淀经洗涤后进行真空干燥，干燥温度为90℃-100℃，干燥时间为8h-12h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述抽滤洗涤所用的酸性溶液为盐酸、硫酸中的一种或两种的混合，浓度为1-2mol/L。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述阴离子交换过程中所用的平衡液为HEPES溶液，浓度为10-100mM。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于，所述待纯化蛋白样品在进行纯化前经0.22μm滤膜过滤除菌。

9.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于，所述待纯化蛋白样品为细胞发酵液或由细胞发酵液提取的蛋白样品。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述细胞发酵液为大肠杆菌、酵母菌或中国仓鼠卵巢细胞系发酵获得的培养液。