CN104387499A - 一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，属于生物医药技术领域，以解决现有技术中醇沉法提纯硫酸软骨素纯度低的问题。本发明包括以下步骤：1）将硫酸软骨素作为免疫原免疫小鼠，制备抗硫酸软骨素单克隆抗体；2）抗硫酸软骨素单克隆抗体与固相载体偶联后作为免疫亲和柱填料，制备硫酸软骨素免疫亲和柱；3）通过硫酸软骨素免疫亲和柱纯化硫酸软骨素。本发明筛选出的用于捕获硫酸软骨素的抗体具高特异性，对样品中的硫酸软骨素具有极强的滞留和浓缩能力，偶联了该抗体的亲和层析介质分离纯化出的硫酸软骨素样品具有纯度高、品质好、环保节能、生产周期短等优点，适合规模化生产，易于推广。

Description

一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法。 

背景技术

硫酸软骨素是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，存在于除植物以外的所有生物中。以其为主要原料开发的相关产品主要用于制药工业，因此，对于硫酸软骨素的纯度和其中的杂质限定有较为严格的要求。 

目前，硫酸软骨素主要从动物(如鲨鱼、牛、鸡等)的软骨中提取，提取方法主要为酶解法，除杂方法主要为醇沉法。以上工艺所生产的硫酸软骨素普遍存在纯度不高，工艺繁琐，生产周期较长、生产成本较高、且对环境造成污染较为严重等问题，因此，有必要对其纯化方式进行改进。 

如申请公布号为“CN 102190740A”的发明专利公开了一种硫酸软骨素的制备方法，软骨加水浸没，碱调PH至8～9，5～60℃保温4～6小时；加入2709碱性蛋白酶，搅拌6～8小时，升温至沸腾，过滤得硫酸软骨素溶液；向硫酸软骨素溶液中加入氯化钠，再加入溶液体积2～3倍的酒精，静止6小时，过滤得硫酸软骨素沉淀；将硫酸软骨素沉淀加入水中溶解，同时向水中加入氯化钠，调节pH10～12，加入溶液重量1～3％双氧水氧化6小时过滤得滤液；调节硫酸软骨素滤液pH5～6，加入滤液体积4～6倍体积的酒精二次沉淀，得硫酸软骨素沉淀；将二次硫酸软骨素沉淀倒入装有乳化剂的脱水罐中，将硫酸软骨素沉淀体积3～5倍的酒精泵入脱水罐，抽滤，收集沉淀，干燥，得硫酸软骨素成品。 

免疫亲和技术是一种利用抗原抗体之间所形成的高特异性的亲和力所发生的特异性、具有可逆性的相结合的原理，在含有众多组分的混合物中分离出特定的目标抗原物质或抗体的一类层析技术。到目前为止，该技术已在激素、抗体、多肽以及小分子化合物如黄曲霉毒 素、氯霉素等的分析检测领域得到广泛的应用。尽管免疫亲和纯化方法在20世纪80年代以来逐渐在分离纯化领域得到广泛的应用，并且工业上对硫酸软骨素产品的纯度提出越来越高的要求，但利用免疫亲和技术来分离纯化硫酸软骨素的方法尚未见到报道。 

发明内容

本发明提供了一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，以解决现有技术中醇沉法提纯硫酸软骨素纯度低的问题。 

本发明的技术方案为： 

一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，包括以下步骤： 

1)将硫酸软骨素作为免疫原免疫小鼠，制备抗硫酸软骨素单克隆抗体； 

2)所述抗硫酸软骨素单克隆抗体与固相载体偶联后作为免疫亲和柱填料，制备硫酸软骨素免疫亲和柱； 

3)通过所述硫酸软骨素免疫亲和柱纯化硫酸软骨素。 

作为优选方案，所述步骤1)包括： 

a.小鼠皮下注射硫酸软骨素，使小鼠产生免疫应答； 

b.分离步骤a产生抗体反应的小鼠脾脏中的脾细胞，所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按1:3～10的比例进行细胞融合； 

c.将步骤b所得的融合的杂交瘤细胞用HAT培养基筛选，得到融合成功的杂交瘤细胞； 

d.对步骤c中所得到的融合成功的杂交瘤细胞进行ELISA检测，筛选出针对硫酸软骨素的特异性阳性杂交瘤细胞； 

e.将步骤d所获得的阳性杂交瘤细胞进行大罐培养或注射小鼠，取培养上清或采集腹水，以硫酸铵沉淀法和protein A/G纯化，提取特异性的抗硫酸软骨素单克隆抗体。 

作为优选，步骤2)中所述的固相载体为琼脂糖珠，所述琼脂糖珠为经过溴化氰活化的琼脂糖珠。 

进一步的，所述步骤2)包括： 

f.将活化的琼脂糖珠以PBS溶液悬浮分散，以PBS溶液稀释所述抗硫酸软骨素单克隆抗体，将所述抗硫酸软骨素单克隆抗体的PBS溶液加至琼脂糖珠的PBS溶液中，室温搅拌0.3～3小时，偶联得到偶联复合物，离心并以PBS溶液洗涤，以除去未结合的抗体； 

g.采用含有0.2～0.8mol/L NaCl的pH为8.0的Tris-HCl缓冲液浸泡所述偶联复合物2小时，以封闭所述偶联复合物中多余的活性基团；然后用5～12倍于所述偶联复合物体积的所述Tris-HCl缓冲液洗涤； 

h.使用上述偶联复合物装柱。 

进一步的，步骤f所述的PBS溶液浓度为0.1mol/L。 

优选的，步骤f所述琼脂糖珠与所述抗硫酸软骨素单克隆抗体的用量比为2:1～5:1mg/mL。 

作为优选方案，步骤3)具体为：将过滤后的硫酸软骨素粗提物溶液加至所述硫酸软骨素免疫亲和柱，使其自然滴下；过完柱后以0.1mol/L的PBS溶液洗柱以除去未与所述偶联复合物装柱结合的物质；最后采用体积分数为70％乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，干燥得提纯后的硫酸软骨素。 

本发明的有益效果为： 

本发明筛选出的用于捕获硫酸软骨素的抗体具高特异性，对样品中的硫酸软骨素具有极强的滞留和浓缩能力，偶联了该抗体的亲和层析介质分离纯化出的硫酸软骨素样品具有纯度高、品质好、环保节能、生产周期短等优点，适合规模化生产，易于推广。 

附图说明

图1为对比例中采用醇沉法提纯的硫酸软骨素的液相色谱图； 

图2为本发明实施例1中提纯的硫酸软骨素的液相色谱图。 

具体实施方式

试剂：实施例和对比例中所使用的试剂均购自Sigma公司。 

仪器：岛津LC-10AT高效液相色谱仪； 

色谱检测条件 

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的硅胶柱； 

流动相：10％乙腈、0.12％辛烷磺酸钠、0.08％磷酸、高纯水补足； 

检测波长：195nm。 

对比例： 

采用申请公布号为“CN 102190740A”的发明专利中记载的方法，鲨鱼软骨加水浸没，碱调PH至8～9，50℃保温5小时；加入2709碱性蛋白酶，搅拌7小时，升温至沸腾，过滤得硫酸软骨素粗液。 

采用申请公布号为“CN 102190740A”的发明专利中记载的醇沉提纯方法提纯所述硫酸软骨素粗液，得到醇沉法提纯后的硫酸软骨素。采用醇沉法提纯的硫酸软骨素产品的检验报告，结果如下： 

另外，采用高效液相色谱法检测醇沉法提纯的硫酸软骨素产品，结果如图1所示，仍然存在较多杂质峰。 

实施例1 

a.小鼠皮下注射对比例中得到的经醇沉法纯化的硫酸软骨素，使小鼠产生免疫应答；具体的，称取经醇沉法纯化的硫酸软骨素180微克，溶于500微升生理盐水中，再与等体积的福氏完全佐剂混匀，充分乳化，对3只Balb/c小鼠进行初次皮下免疫；每隔2周，称取经醇沉法纯化的硫酸软骨素180微克，溶于500微升生理盐水中，再采用等体积的不完全福氏佐剂乳化，进行第二次免疫和第三次免疫；在第四次加强免疫前，小鼠断尾采血，分离血清，以硫酸软骨素包被酶标板，以ELISA测定血清中抗硫酸软骨素多克隆抗体效价，以OD值读数是阴性血清的2.1倍时的最大稀释度作为血清的抗体效价；当血清抗体效价达到1:10000时，对小鼠以不含佐剂的抗原进行加强免疫； 

b.加强免疫3天后的小鼠，取脾，分离细胞，分离出的脾细胞与处于对数生长期的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞以1:3～10(细胞数量比)进行细胞融合； 

c.将步骤b所得的融合的杂交瘤细胞铺96孔细胞培养板，用HAT培养基筛选，得到融合成功的杂交瘤细胞； 

d.对步骤c中所得到的融合成功的杂交瘤细胞培养上清，以硫酸软骨素为检测原，进行ELISA筛选，对ELISA检测阳性的细胞株进行三轮亚克隆，获得单克隆细胞株一株3A2，筛选出针对硫酸软骨素的特异性阳性杂交瘤细胞； 

e.将小鼠10只提前一周以0.5毫升/只注射灭菌的液体石蜡，再将阳性杂交瘤细胞(数量级至 少为107个细胞)注射入小鼠腹腔，待小鼠腹腔胀大后，采集腹水；亦可采用发酵罐进行大规模的阳性杂交瘤细胞培养，取上清；腹水或上清以硫酸铵沉淀法和Protein A/G纯化，提取特异性的抗硫酸软骨素单克隆抗体； 

f.将活化的琼脂糖珠打散(打成较小颗粒以悬浮于溶液)，采用0.1mol/L的PBS溶液充分洗涤，以去除活化的琼脂糖珠中的保存液；用20毫升0.1mol/L的PBS溶液悬浮分散5mg已去除保存液的琼脂糖珠；以8毫升0.1mol/L的PBS溶液稀释2ml步骤e中获得的抗硫酸软骨素单克隆抗体；将抗硫酸软骨素单克隆抗体的PBS溶液加至琼脂糖珠的PBS溶液中，室温搅拌0.3～3小时，偶联得到偶联复合物，以1000rpm离心10分钟，以0.1mol/L的PBS溶液洗涤偶联复合物，以除去未结合的抗体； 

g.采用含有0.5mol/L NaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)浸泡步骤f所得偶联复合物2小时，以封闭偶联复合物中多余的活性基团；然后用8倍于偶联复合物体积的上述Tris-HCl缓冲液洗涤三次； 

h.以0.1mol/L的PBS溶液对空柱进行彻底清洗，并将疏水的筛板放至柱子底部，然后将偶联复合物采用0.1mol/L的PBS溶液悬浮，并灌入柱子，避免气泡的产生；柱中的PBS溶液完全流出柱后，将顶部滤片塞入柱子，至琼脂糖珠的表面；再次以0.1mol/L的PBS溶液清洗，以除去柱子内部的气泡；最后，以含有0.01mol/L叠氮钠的PBS缓冲液保存柱子，于4度冰箱冷藏保存； 

i.将硫酸软骨素的粗提液20毫升过滤后，加至硫酸软骨素免疫亲和柱中，使其自然滴下，过完柱后，以0.1mol/L的PBS溶液洗柱三次，以除去未与偶联复合物装柱结合的物质；最后采用70％(V/V)的乙醇溶液进行洗脱，收集70％(V/V)的乙醇洗脱液，室温下静置5min，离心15分钟，干燥，即得到所需的高纯度硫酸软骨素。 

将本实施例纯化后的硫酸软骨素的硫酸软骨素产品的检验报告，结果如下： 

另外，采用高效液相色谱法检测本实施例提纯的硫酸软骨素产品，结果如图2所示，本发明提纯方法使得硫酸软骨素的纯度得到极大的得高，几乎没有杂质峰。相关检测也达到产品要求，满足生产中对高纯度硫酸软骨素的需求。 

Claims (7)

1.一种利用免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将硫酸软骨素作为免疫原免疫小鼠，制备抗硫酸软骨素单克隆抗体；

2）所述抗硫酸软骨素单克隆抗体与固相载体偶联后作为免疫亲和柱填料，制备硫酸软骨素免疫亲和柱；

3）通过所述硫酸软骨素免疫亲和柱纯化硫酸软骨素。

2.如权利要求1所述的免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述步骤1）包括：

a.小鼠皮下注射硫酸软骨素，使小鼠产生免疫应答；

b.分离步骤a产生抗体反应的小鼠脾脏中的脾细胞，所述脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞按1:3~10的比例进行细胞融合；

c.将步骤b所得的融合的杂交瘤细胞用HAT培养基筛选，得到融合成功的杂交瘤细胞；

d.对步骤c中所得到的融合成功的杂交瘤细胞进行ELISA检测，筛选出针对硫酸软骨素的特异性阳性杂交瘤细胞；

e.将步骤d所获得的阳性杂交瘤细胞进行大罐培养或注射小鼠，取培养上清或采集腹水，以硫酸铵沉淀法和protein A/G纯化，提取特异性的抗硫酸软骨素单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，其特征在于：步骤2）中所述的固相载体为琼脂糖珠，所述琼脂糖珠为经过溴化氰活化的琼脂糖珠。

4.如权利要求3所述的免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，其特征在于，所述步骤2）包括：

f.将活化的琼脂糖珠以PBS溶液悬浮分散，以PBS溶液稀释所述抗硫酸软骨素单克隆抗体，将所述抗硫酸软骨素单克隆抗体的PBS溶液加至琼脂糖珠的PBS溶液中，室温搅拌0.3~3小时，偶联得到偶联复合物，离心并以PBS溶液洗涤，以除去未结合的抗体；

g.采用含有0.2~0.8 mol/L NaCl的pH为8.0的 Tris-HCl缓冲液浸泡所述偶联复合物2小时，以封闭所述偶联复合物中多余的活性基团；然后用5~12倍于所述偶联复合物体积的所述Tris-HCl缓冲液洗涤；

h.使用上述偶联复合物装柱。

5.如权利要求4所述的免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，其特征在于：步骤f所述的PBS溶液浓度为0.1 mol/L。

6.如权利要求4所述的免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，其特征在于：步骤f所述琼脂糖珠与所述抗硫酸软骨素单克隆抗体的用量比为2:1~5:1mg/mL。

7.如权利要求1所述的免疫亲和技术提纯硫酸软骨素的方法，其特征在于，步骤3）具体为：将过滤后的硫酸软骨素粗提物溶液加至所述硫酸软骨素免疫亲和柱，使其自然滴下；过完柱后以0.1 mol/L 的PBS溶液洗柱以除去未与所述偶联复合物装柱结合的物质；最后采用体积分数为70%乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，干燥得提纯后的硫酸软骨素。