CN102372770A - 一种抑血管生成素、纯化方法及含有它们的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑血管生成素，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，具有用非还原性SDS-PAGE法测定的25000～35000道尔顿之间的分子量。其纯化方法包括：先将尖吻蝮蛇粗毒溶解于缓冲液中，离心取上清；然后将所得上清液过经阴离子交换层析得到抑血管生成素粗溶液；再将杂交瘤细胞株1D9(CCTCC C200970)分泌的单克隆抗体与亲和层析载体偶联，制备得免疫亲和层析柱；最后用所得免疫亲和层析柱纯化粗溶液得到所述抑血管生成素。本发明所述抑血管生成素可以被制成注射用粉针剂型，具有抗血管生成活性，特别是与肿瘤生长有关的血管生成，在抗肿瘤及肿瘤转移中效果较为明显。

Description

一种抑血管生成素、纯化方法及含有它们的药物组合物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种血管生成抑制物，更具体地说，本发明涉及一种抑血管生成素、其纯化方法，以及含有它们的药物组合物。

背景技术

肿瘤血管生成(angiogenesis)是指血管内皮细胞从现存的血管系统中分化、迁移而形成新的微血管的复杂生物学过程。成人的血管内皮细胞基本处于静止状态，在伤口愈合、组织修复、女性生育和月经期、胎儿发育等生理刺激下会生成新的血管，这属于生理性血管生成。此时的血管生成是处于刺激因子和抑制因子的严格控制和协调下，在有限时间内的一种有序的生理过程，增生的内皮细胞很快恢复为正常的静止状态。当血管生成调节机制失控和血管生成过度时，则成为致病因素，导致风湿性关节炎、糖尿病性或黄斑变性视网膜病变、婴儿血管瘤和恶性肿瘤等血管生成依赖性疾病的发生和发展。早在1971年，Folkman阐明了肿瘤血管生成在肿瘤发展、转移和扩散中的重要意义，并提出血管发生的抑制剂可能会成为一种新型的、有价值的肿瘤治疗手段。目前，破坏血管生成在癌症研究中占据重要的地位。内源性和外源性的肿瘤血管生成抑制物为这类疾病的治疗提供新的临床用药方向。

蛇毒是从毒蛇的毒腺中分泌出来的一种毒液，主要有蛋白质、多肽及一些酶类，具有广泛的生物学活性。目前，蛇毒的许多组分已得到了较为深入的研究，并且它们在抗血栓、止血、镇痛及抗肿瘤方面具有良好的作用。自从1965年开展蛇毒分离纯化工作以来，已可以找到具有专一性的抗肿瘤组分，进入细胞及分子水平的研究，其中许多单一纯组分都被发现有不同程度的体内或体外抗癌活性。

持续的血管生成是肿瘤生长的特征。血管生成不但是肿瘤生长所必需的，而且肿瘤细胞与新生血管系统的接触还是导致远处转移的原因。近年来，对肿瘤的治疗主要依赖于新型药物的开发以及基因治疗方面。如题为“血管生成抑制多肽及其制备方法和应用”的中国专利200610039298.2就公开了一种通过对内皮抑素的第6-49氨基酸进行修饰后得到的多肽，其具有比内皮抑素更强的体内抗肿瘤活性及肿瘤靶向性。其中，该发明所采用的大肠杆菌表达系统虽然表达量高，但得到的包涵体蛋白难溶解、难复性，易造成应用不便；即使蛋白重新折叠可溶，此过程会损失大量蛋白，导致利用率不高。另外，内皮抑素在体内的半衰期较短，且该血管生成抑制多肽其制备工艺复杂，成本相对较高，不利于大规模生产。因此，对一些恶性程度高、手术根治率低、且对放化疗不敏感的肿瘤，积极寻求新的安全有效的抗肿瘤药物显得非常重要。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种抑血管生成素，其通过抑制肿瘤血管生成以实现抗肿瘤的作用。

本发明的另一个目的在于提供用于纯化该抑血管生成素的方法。

本发明的再一个目的是提供用于抑制肿瘤血管生成以实现抗肿瘤作用的药物组合物。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种抑血管生成素，其氨基酸序列选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，具有用非还原性SDS-PAGE(非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)法测定的25000～35000道尔顿之间的分子量，具有抑血管生成活性。

根据本发明的抑血管生成素，能有效抑制不需要的血管生成，特别是与肿瘤生长有关的血管生成，在抗肿瘤及肿瘤转移中效果较为明显。

根据本发明的实施方式，所述抑血管生成素采用还原性SDS-PAGE(还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳)法测定显示为两条带，分别称α链和β链，分子量分别为12000～22000道尔顿、9000～19000道尔顿，其中，α链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本发明的实施方式，所述的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、或添加且具有抑血管生成活性的由其衍生的蛋白质。

本发明所述抑血管生成素可在抑制血管生成活性不受影响的条件下对其氨基酸序列进行改进，如将一个或几个氨基酸分别突变、缺失或添加一个或几个氨基酸不影响蛋白质的活性，甚至一些氨基酸改变可能使抑制血管生成的特性优化，本领域的技术人员可以用标准做法来实现。

根据本发明的实施方式，所述抑血管生成素经双向电泳后会分别产生与所述α链和β链对应的异构体各三个。

在经双向电泳即等电聚集电泳和还原SDS-PAGE电泳后，所述抑血管生成素可得到六个条带，其中α链和β链对应各有三个条带。六个条带经质谱做鉴定后表明，其分别为α、β两个亚基的异构体形式，即该蛋白在等电聚集条件下因其结构方面的特异性，会产生异构体，从而导致双向电泳时会出现六个条带，不具备单一等电点。

根据本发明的实施方式，所述抑血管生成素与杂交瘤细胞株1D9，保藏号CCTCC C200970，分泌的单克隆抗体特异性结合，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的主要抗性为与抑血管生成素特异性结合。该杂交瘤于2009年12月23日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，名称为杂交瘤细胞株1D9，保藏编号为CCTCC-C200970。

根据本发明的实施方式，所述抑血管生成素其能够抑制肿瘤生长，其中，所述肿瘤选自人的黑色素瘤、Hela细胞以及K562细胞。国内外文献报道的与抗肿瘤作用有关的蛇毒，最多的是眼镜蛇和蝮蛇，金环蛇、尖吻蝮蛇、响尾蝮蛇蛇毒次之。目前蛇毒的来源主要是采取捕蛇或养蛇提取蛇毒方法进行，但蛇毒种类不同、产地不同、甚至同种蛇毒毒液收集时期不同其成分也有差异，因此，蛇毒的纯化工艺很难固定。尖吻蝮是蝰科蝮亚科尖吻蝮属中唯一的一种，又名放丝蛇，在我国分布较广，其中以武夷山山区和皖南山区贮量最多。生活于山区或丘陵林木茂盛的阴湿地方，垂直分布范围海拔100～1350米。本发明所使用的尖吻蝮蛇毒购自黄山市徽州毒蛇研究所。

为制得高纯度的抑血管生成素，经过反复研究，本发明采用现代免疫学原理，结合抗原抗体特异性反应与亲和层析技术，从尖吻蝮蛇粗毒中进行分离纯化抑血管生成素。该方法首先从尖吻蝮蛇粗毒中提取得到抑血管生成素粗溶液，再将所得粗溶液分别经阳离子交换层析和凝胶层析，制备得抑血管生成素的初纯物；然后以该初纯物为抗原，制备针对其的特异性单克隆抗体；随后再与适宜的亲和层析载体偶联，制备成抗体亲和层析柱；最后使用偶联得到的抗体亲和层析柱，即可对具有抑制血管生成活性的的抑血管生成素粗溶液进行免疫亲和层析，制备得到高纯的抑血管生成素。

优选地，本发明的抑血管生成素的纯化方法，包括如下步骤：

(a)将尖吻蝮蛇粗毒溶解于缓冲液中，其中蛇毒与缓冲液的体积比为1～2∶10，离心得到上清液；

(b)将所得上清液经DEAE(二乙胺乙基)阴离子交换层析，得到抑血管生成素粗溶液；

(c)将杂交瘤细胞株1D9，保藏号CCTCC C200970，分泌的单克隆抗体与亲和层析载体偶联，制备得免疫亲和层析柱；

(d)用所得免疫亲和层析柱纯化步骤(b)所得抑血管生成素粗溶液，以洗脱缓冲液洗脱，收集得到所述抑血管生成素。

其中，步骤(a)所述缓冲液为pH 7.0～9.0的0.01～0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。所述尖吻蝮蛇粗毒离心2次，离心速度为4000r/min，每次离心15min。

步骤(b)用pH 6.0～9.0的0.01～0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和0.05～0.6mol/L NaCl溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱。

步骤(c)所述亲和层析柱载体为4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶、羧甲基葡聚糖凝胶中的任意一种。

步骤(d)所述洗脱缓冲液为的pH 2.0～4.0、0.01～0.03mol/LGly-HCl缓冲液，洗脱时间为480min，洗脱流速5ml/min。

本发明还提供一种用于抑制肿瘤血管生成以实现抗肿瘤作用的药物组合物。所述药物组合物含有抑血管生成素，并含有药学可接受的载体。本发明还提供的注射剂，含有抑血管生成素和药学上可接受的赋形剂、稳定剂。

根据本发明的实施方式，每毫升所述注射剂含有至少1mg的抑血管生成素原料，然后经常规加工直接或间接地加入药学上可接受的赋形剂、稳定剂以制成注射剂。

根据本发明的实施方式，每毫升所述注射剂包含抑血管生成素至少1mg、右旋糖酐32～48mg、海藻糖1.6～2.4mg。

本发明所述抑血管生成素具有以下几方面优点：首先，特异性强。癌症治疗目前临床通常采用手术、放疗、化疗、生物疗法及联合疗法，可用于化疗的各种抗癌药物的共同特点是对所有快速分裂的细胞的增殖起抑制作用，但是缺乏对抗癌细胞增殖的特异性，在抗癌细胞增殖的同时，对骨髓胃肠及其他组织器官中快速分裂的细胞有很大的毒副作用。本发明所述抑血管生成素特异性强，能通过抑制不需要的血管生成，特别是与肿瘤生长有关的血管生成，从而有效抑制肿瘤的生长和转移；其次，利用率高，制备工艺相对简便。相对于目前的关于血管生成抑制物的制备，本发明所述的抑血管生成素制备工艺较为简便，能克服内源性血管生成抑制物的半衰期短的缺点，以及避免了因重组或转基因导致的转染率较低、蛋白利用率低和费用昂贵等问题，并且重复性强，成本低，利于工业化生产；另外，蛇毒具有抗血栓、止血、镇痛以及其在抗肿瘤方面的作用，已收到世界范围内的广泛关注。我国蛇毒资源丰富，具有广阔的研究和应用前景。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

根据本发明所建立的杂交瘤细胞株已于2009年12月23日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为C200970，分类命名为杂交瘤细胞株1D9。

图1是根据本发明的抑血管生成素的制备工艺流程图；

图2是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素制备工艺中阴离子交换柱层析的紫外吸收(280nm)图谱；

图3是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素制备工艺中阳离子交换柱层析的紫外吸收(280nm)图谱；

图4是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素制备工艺中凝胶S-100柱层析的紫外吸收(280nm)图谱；

图5是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素制备工艺中亲和层析柱层析紫外吸收(280nm)图谱；

图6是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素非还原性SDS-PAGE电泳图谱；

图7是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素双向电泳图谱(28-1、28-2、28-3、28-4、28-5分别代表五个条带斑点)；

图8是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素体外对鸡胚绒毛尿囊膜模型中鸡胚血管生成抑制作用效果图；

图9是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素对抗转基因鼠结肠癌体内药效试验中给药后4周小鼠体重变化图；

图10是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素对抗转基因鼠结肠癌体内药效试验中抑血管生成素对肿瘤节的影响图；

图11是根据本发明的一个实施例的抑血管生成素对抗转基因鼠结肠癌体内药效试验中抑血管生成素对不同大小肿瘤数目的影响图。

具体实施方式

本发明采用现代免疫学原理，结合抗原抗体特异性反应与亲和层析技术，从尖吻蝮蛇粗毒中进行分离纯化抑血管生成素。

图1是根据本发明的抑血管生成素的制备工艺流程图。如图1所示：首先，将尖吻蝮蛇粗毒溶于缓冲液一定时间后离心取上清，得尖吻蝮蛇毒溶液；再将所得蛇毒溶液经阴离子交换层析得抑血管生成素的粗溶液，接着取适量粗溶液先后经阳离子交换层析和凝胶层析，制备得抑血管生成素的初纯品；然后，以该初纯品为抗原，制备针对其的特异性单克隆抗体；随后，再与适宜的亲和层析载体偶联，制备成抗体亲和层析柱；最后，使用偶联得到的抗体亲和层析柱，对前面制备的具有抑制血管生成活性的抑血管生成素粗溶液进行免疫亲和层析，制备得到高纯的抑血管生成素。

下面的实施例将对本发明作进一步的解释，但是本发明并不仅仅局限于这些实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所作出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。

实施例1高纯度抑血管生成素的制备

1、蛇毒粗毒的处理

首先，准确称取购自黄山市徽州毒蛇研究所的尖吻蝮蛇蛇毒5g，用0.02mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液将其置于4℃冰箱内溶解，溶解时间6～12h，然后以4000r/min离心，分别离心两次，每次离心15min，收集上清液待用。

2、初步纯化得到用于制备单抗的抗原

(1)阴离子交换层析

首先，取所得上清液以流速3.0ml/min上样于已平衡的阴离子交换层析DEAE柱中，上样后先以0.02mol/L pH 8.5的Tris-HCl缓冲液洗脱不能被层析介质吸附的杂蛋白，洗脱时间360min，洗脱流速3ml/min；然后，再以0.02mol/L pH 6.5的Tris-HCl缓冲液加入0.5mol/L的NaCl进行梯度洗脱，梯度0～100％，洗脱时间1440min，洗脱流速5ml/min；最后，收集具有抑制血管生成活性的组分。蛋白检测采用纯化系统(AKTA prime plus)自带紫外检测器在280nm处检测，其紫外吸收图谱如图2所示，收集以系统所带分部收集器收集，收集设置为4min/管，即得抑血管生成素的粗溶液。

(2)阳离子交换层析

首先，将所收集的抑血管生成素粗溶液用截留分子量为1万的滤膜进行超滤，浓缩至体积为30～80ml，再转入已煮过的透析袋中，置于4℃冰箱内透析6～12h。然后，将透析后所得样品以流速3.0ml/min上样于已平衡的阳离子交换层析CM(羧甲基纤维素)柱中，上样后先以0.02mol/L pH6.5的Tris-HCl缓冲液洗脱不能被层析介质吸附的杂蛋白，洗脱时间360min，洗脱流速3ml/min；随后再以0.02mol/L，pH8.5的Tris-HCl缓冲液加入0.5mol/L的NaCl进行梯度洗脱(0～100％)，洗脱时间1440min，洗脱流速5ml/min。最后，收集具有抑制血管生成活性的组分。蛋白检测采用纯化系统AKTA prime plus自带紫外检测器在280nm处检测，其紫外吸收图谱如图3所示，收集以系统所带分部收集器收集，收集设置为4min/管，即得抑血管生成素的初品。

(3)凝胶层析

首先，将收集得到的抑血管生成素初品溶液用截留分子量为1万的滤膜进行超滤，浓缩至体积为30～80ml，再以millopore ultra系列离心超滤管于4℃下进行低温离心超滤浓缩，浓缩体积到5～15ml。然后，将浓缩后所得样品以流速1.0ml/min上样于已平衡的凝胶层析S-100柱中，并以0.02mol/L pH7.6的Tris-HCl缓冲液加入0.15mol/L的NaCl进行洗脱，洗脱时间960min，洗脱流速0.3ml/min。最后，收集具有抑制血管生成活性的组分。检测方法同上，蛋白检测采用纯化系统AKTA prime plus自带紫外检测器在280nm处检测，其紫外吸收图谱如图4所示，收集以系统所带分部收集器收集，收集设置为10min/管，所得样品为抑血管生成素的初纯品。

3、抑血管生成素特异性单抗的制备

(1)抗原鉴定：先将所得抑血管生成素的初纯品进行SDS-PAGE电泳鉴定，其纯度不低于85％，显示为一条主带，且活性检测有抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集作用后，方可用于制备单抗。

(2)抗原的动物免疫：选用6-12周龄Balb/c小鼠免疫抗原，分为三次免疫。第一次以每支小鼠0.1mg(约0.2ml)加等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔免疫；待2-4周后加强免疫，量减半，改用不完全佐剂；第三次冲击免疫在融合前3天进行，每只小鼠0.03mg，融合成功的标志是在融合时脾脏能够提供处于增殖状态的特异性B细胞，并以间接ELISA法(间接酶联免疫吸附测定法)检测血清中抗体效价。

(3)杂交瘤细胞株建立：首先，取免疫小鼠脾细胞悬液和骨髓瘤细胞以1∶5的比例在聚乙二醇作用下按常规法融合。然后，以间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，筛选阳性克隆后，再进行亚克隆化，并进行扩增冻存。随后，经过3次有限稀释克隆化，将分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化鉴定之。建立的杂交瘤细胞株已于2009年12月23日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为C200970，分类命名为杂交瘤细胞株1D9。

(4)单克隆抗体的制备与纯化：将上述所得的杂交瘤细胞株以无血清培养基在体外进行增量培养，获得的培养液过以ProteinA，重组金黄色葡萄球菌蛋白A，偶联的亲和层析柱，亲和层析纯化以得到抗抑血管生成素的特异性单克隆抗体。

4、抑血管生成素特异性单克隆抗体亲和层析柱的制备

首先，将上述纯化得到的抑血管生成素单克隆抗体以0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液于4℃透析过夜，再加10ml CNBr-Sepharose 4B，溴化氰偶联的琼脂糖凝胶4B，到10ml抗体溶液中，将其置于摇床或振荡器上，于4℃下轻轻振摇过夜。然后，加入1ml 2mol/L的乙醇胺溶液封闭CNBr-Sepharose 4B残余的活性基团，并于4℃下继续振摇1小时。随后，将偶联好抗体的Sepharose 4B(琼脂糖凝胶4B)柱装到适当的层析柱中。用0.1mol/L的柠檬酸钠缓冲液洗柱，接着用两倍柱体积0.1mol/L、pH6.5、含1mol/L的NaCl柠檬酸钠缓冲液洗脱。最后，用两倍柱体积的PBS(磷酸缓冲液)洗脱。另外，凝胶在使用和保存时，须始终保持在液面以下，不得干燥。

5、制备高纯度的抑血管生成素

首先，将步骤2(1)中经阴离子交换层析得到的抑血管生成素的粗溶液超滤浓缩后用亲和层析平衡缓冲液，具体为0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 7.8、含0.25mol/L的NaCl透析。然后，上抗体亲和层析柱，并用上述亲和层析平衡缓冲液平衡至洗脱液洗脱曲线在紫外检测上显示为基线后。最后，用pH4.0、0.02mol/ml的Gly-HCl缓冲液，甘氨酸-盐酸缓冲液，作为亲和层析洗脱液进行洗脱，收集活性峰。检测方法同上，蛋白检测采用纯化系统AKTA prime plus自带紫外检测器在280nm处检测，其紫外吸收图谱如图5所示，收集以系统所带分部收集器收集，收集设置为4min/管，所得样品即为高纯度的抑血管生成素。将上述制备方法重复10次，编号1-10组。

实施例2本发明所述抑血管生成素的质量研究

1、纯度及结构鉴定

纯度鉴定：随机抽取一组实施例1中所得高纯度的抑血管生成素第3组样品进行非还原性SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳)，如图6所示，显示为一条带，分子量为30000～35000道尔顿。

结构鉴定：将上述抽取的第3组样品进行经双向电泳即等电聚集电泳和还原SDS-PAGE电泳，如图7所示，所述抑血管生成素经双向电泳后可得到六个条带，其中α链和β链对应各有三个条带。六个条带经质谱做ID鉴定后表明，其分别为两个亚基的异构体形式，即该蛋白在等电聚集条件下因其结构方面的特异性，会产生异构体，从而导致双向电泳时会出现六个条带，不具备单一等电点。

2、神经毒、出血毒、内毒素检测

(1)抑血管生成素出血毒检验标准：先随机选取实施例1所得三组(第1组、第4组、第9组)高纯度的抑血管生成素适量，分别用氯化钠注射液制成每1ml中含20单位的溶液；再选取体重为18～22g的小白鼠15只，每组样品5只，于背部皮下注射0.2ml所制溶液；随后，在注射24小时后处死动物，剥皮观察，小鼠背部未见出血现象。

经检测，所测的高纯度的抑血管生成素样品均符合规定。

(2)抑血管生成素神经毒检验标准：再取上述第1组、第4组、第9组中高纯度的抑血管生成素适量，用氯化钠注射液制成每毫升中含有20单位溶液；再选取取体重300～500g鸽子9只，每组样品3只；所用剂量按每公斤注射0.5ml，静脉给药，观察24小时，动物不得出现抽搐、死亡。如每组样品中，3只中有一只出现抽搐或死亡，应另取5只复试，均未出现死亡。

经检测，所测的高纯度的抑血管生成素样品均符合规定。

(3)抑血管生成素内毒素检测标准：再取上述第1组、第4组、第9组中高纯度的抑血管生成素适量，依中国药典2005年版二部附录XIE检查。

经检测，每单位样品中内毒素含量不高于20EU。

实施例3高纯度抑血管生成素原料药含量检测方法

为检测血清中抑血管生成素含量，以便用于药代动力学试验，建立了一套采用双抗体夹心法检测抑血管生成素原料药含量的方法，该方法检测灵敏度能够达到1ng/ml。

具体检测方法如下：

1、包被一个单抗：先用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液将实施例1中所制备的单抗作适当稀释，在每个聚苯乙烯酶标板的反应孔中加0.1ml，于4℃过夜或保持18-24h。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min(简称洗涤，下同)。

2、加样：加入待检样品或作适当稀释的标准参考品于反应孔中，同时作空白孔、阴性和阳性孔对照。于37℃孵育1小时，洗涤。

3、加HRP标记，即辣根过氧化物酶标记，的另一个单抗：将已作适当稀释的HRP标记的另一个自行制备的抑血管生成素单抗，加于酶标板中，每孔0.1ml，于37℃孵育30～60min，洗涤。

4、底物显色：于上述各反应孔中加入临时配制OPD(邻苯二胺)底物反应溶液0.1ml，于37℃下反应10～30min，再加2mol/L 0.05ml的H₂SO₄以终止反应。

6、结果判定：上述酶标板置于酶标仪上于450nm处测OD值。根据相应已知浓度对照品的OD值与浓度关系，绘制标准曲线。再由待测样品所测OD值，代入标准曲线中，求得相应样品中抑血管生成素浓度。本方法检测灵敏度能够达到1ng/ml。

实施例4注射用抑血管生成素制备方法

注射制剂配方如下：

抑血管生成素      1000±20mg

右旋糖酐          20±4g

海藻糖            1±0.2g

补水至            500ml

总体积            500ml

按照0.5ml/支分装，共分装1000支。

首先，在局部百级洁净区内，按照配方将本发明实施例1所制备并经各项检测合格的抑血管生成素作为原料药，与右旋糖酐等辅料准确称量在配液容器内，加注射用水充分溶解或稀释，使右旋糖苷浓度为1％，搅拌混匀后，得到制剂中间体。然后，除菌过滤，其中过滤前后应对除菌过滤系统进行完整性测试。随后，将过滤后的中间体按装量装入西林瓶中，再分装过程中应进行至少4次装量检查，保证每一只瓶内装入的药量准确。最后，将装入药品的西林瓶冻干，再抽真空，在真空状态下缓慢升温至35～40℃，保持一定时间后再降至室温并取出，压塞、轧盖得成品。

成品经检验，符合注射用抑血管生成素质量标准后，入库存放。

实施例5注射用抑血管生成素的药效学评价

将实施例4制备的射用抑血管生成素用于下列试验。

1、鸡胚绒毛尿囊膜模型体外评价

以鸡胚绒毛尿囊膜为模型，将阳性对照药物VEGF(血管内皮生长因子)和相应给药剂量混合到一起作为实验组，进过三次试验，结果表明如图8所示：(1)VEGF和药物混合后给药剂量与对鸡胚血管抑制效果呈现剂量关系，随着给药剂量增加，抑制效果越明显，10ng药物对血管生长没有明显抑制，25ng有一定抑制效果，50和100ng抑制效果较明显，而大剂量方面，500ng剂量依然没有杀死鸡胚，因此致死剂量摸索依然需要进一步增加用药量。(2)将药物和其单抗(过量)充分结合后给药的情况下，药物对鸡胚血管生长基本没有抑制，和阳性对照组血管生长一样旺盛，说明是由于药物作用而抑制血管生长。同时，将药物和其单抗(过量)充分结合后给药的情况下，药物对鸡胚血管生长基本没有抑制，和阳性对照组血管生长一样旺盛。

2、细胞学试验

在体外进行了药物对HUEVCs(人脐带静脉内皮细胞)进行增殖、分化、迁移、粘附等的影响试验，结果表明：5μmol/L的样品对FBS(胎牛血清)和VEGF诱导的细胞增殖均没有明显抑制效果，但对VEGF和FBS诱激产生的管状网络结构有一定阻止作用；细胞趋化性试验表明，抑血管生成素对FBS、FGF(成纤维细胞生长因子)和VEGF诱导的细胞迁移运动有明显抑制作用，且在高剂量条件下，迁移细胞恢复到基线水平。抑血管生成素对生长因子诱导的通过基质胶表面的HUEVCs细胞侵入运动明显减少，且这种减少与给药剂量间有剂量依赖性关系。为判定抑血管生成素是否是整连蛋白受体抑制剂，设计了HUEVCs细胞的粘附试验，以现有已知的整连蛋白抑制剂作为对照组，结果表明，样品对整合素avb3/avb5介导的粘附作用没有明显影响。

以上两次细胞学试验结果表明，抑血管生成素对内皮细胞分化、迁移和侵入有直接和明显抑制作用，但是对内皮细胞的增殖和粘附没有明显影响。这说明抑血管生成素机理与生长因子(VEGF和FGF2)或者络氨酸蛋白酶受体相关信号途径没有明显关系。

3、MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐；商品名：噻唑蓝)法检测蛋白对黑色素瘤、Hela细胞以及K562的抑制作用。

抑血管生成素对黑色素瘤、Hela细胞以及K562细胞的体外抑制作用的试验结果表明：相对avastin(阿瓦斯丁，又名bevacizumab，人类血管内皮生长因子VEGF单克隆抗体)和顺铂，抑血管生成素对黑色素瘤A375细胞有明显抑制作用，对Hela细胞也有明显抑制效果，对K562细胞抑制效果不是很明显。

4、抗转基因鼠结肠癌体内药效试验

对转基因鼠植入结肠癌，从植入瘤细胞后第13周开始，到第17周，通过观察结肠节评价药物对肿瘤细胞抑制效果。给药方式为腹膜内注射，每周2次，共4周。试验设计对照组(生理盐水，3只鼠)、试验组1(低剂量组，10μg，3只鼠)、试验组2(高剂量组，45μg，3只鼠)，结果检查方法为显微镜检查法，检测和测定主要参数包括：鼠体重变化、肿瘤结节数目、有效实体瘤大小。

试验结果表明：(1)如图9所示，鼠体重在对照组和试验组之间没有明显区别，说明测试药物低剂量和高剂量对小鼠的毒性均很小。(2)如图10所示，试验组两个剂量均能显著、有效抑制总肿瘤结节数，低剂量组抑制率16.22％，高剂量抑制率28.64％。(3)如图11所示，试验组两个剂量组均能显著、有效抑制1-2mm大小的实体瘤。上述结果表明，药物在转基因鼠植入结肠癌模型中可以有效抑制结肠癌生长。

实施例6注射用抑血管生成素急性毒性评价

通过观察抑血管生成素单次静脉注射给予昆明小鼠后的急性毒性反应，初步估计最大耐受量或半数致死剂量(LD₅₀)。

试验用昆明小鼠8只，设4个剂量组，每组2只，雌雄各半。静脉注射给药，给药容量为0.25mL/10g，给药剂量为14.5、10.88、8.16、6.12mg/kg体重，药后连续观察4天。

结果显示，注射用抑血管生成素单次静脉注射给予小鼠后所有动物均精神状态良好，活动正常。试验期间未出现动物死亡，大体解剖观察各组织脏器未见异常。

在本试验条件下，注射用抑血管生成素单次静脉注射给予昆明小鼠的最大耐受量(MTD)大于等于14.5mg/kg体重

上述对注射用抑血管生成素的药效学评价表明：VEGF和药物混合后给药剂量与对鸡胚血管抑制效果呈现剂量关系，随着给药剂量增加，抑制效果越明显；并且注射用抑血管生成素对内皮细胞分化、迁移和侵入均有有直接和明显抑制作用，同时对内皮细胞的增殖和粘附没有明显影响。另外，注射用抑血管生成素对黑色素瘤、Hela细胞以及K562均有不同程度的抑制作用，且在转基因鼠植入结肠癌模型试验中能有效抑制结肠癌生长。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种抑血管生成素，其特征在于，其氨基酸序列选自SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2，具有用非还原性SDS-PAGE法测定的25000～35000道尔顿之间的分子量，具有抑血管生成活性。

2.如权利要求1所述的抑血管生成素，其特征在于，采用还原性SDS-PAGE法测定显示为两条带，分别称α链和β链，分子量分别为12000～22000道尔顿、9000～19000道尔顿，其中，α链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求2所述的抑血管生成素，其特征在于，经双向电泳后会分别产生与所述α链和β链对应的异构体各三个。

4.如权利要求1所述的抑血管生成素，其特征在于，其与杂交瘤细胞株1D9，保藏号CCTCC C200970，分泌的单克隆抗体特异性结合，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的主要抗性为与抑血管生成素特异性结合。

5.如权利要求1所述的抑血管生成素，其特征在于，其能够抑制肿瘤生长。

6.如权利要求5所述的抑血管生成素，其特征在于，所述肿瘤选自人的黑色素瘤、Hela细胞以及K562细胞。

7.如权利里要求1至6任一项所述的抑血管生成素的纯化方法，包括如下步骤：

(a)将尖吻蝮蛇粗毒溶解于缓冲液中，其中蛇毒与缓冲液的体积比为1～2∶10，离心得到上清液；

(b)将所得上清液过二乙胺乙基阴离子交换层析柱进行层析，得到抑血管生成素粗溶液；

(c)将杂交瘤细胞株1D9，保藏号CCTCC C200970，分泌的单克隆抗体与亲和层析载体偶联，制备得免疫亲和层析柱；

(d)用所得免疫亲和层析柱纯化步骤(b)所得抑血管生成素粗溶液，以洗脱缓冲液洗脱，收集得到所述抑血管生成素。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述缓冲液为pH 7.0～9.0的0.01～0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述尖吻蝮蛇粗毒离心2次，离心速度为4000r/min，每次离心15min。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述层析pH 6.0～9.0的0.01～0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液和0.05～0.6mol/L NaCl溶液作为洗脱液进行线性梯度洗脱，洗脱时间为1440min，洗脱流速5ml/min。

11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(c)所述亲和层析柱载体为4B琼脂糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶、羧甲基葡聚糖凝胶中的任意一种。

12.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(d)所述洗脱缓冲液为pH2.0～4.0、0.01～0.03mol/L的Gly-HCl缓冲液。

13.一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1的抑血管生成素，并含有药学可接受的载体。

14.一种注射剂，其特征在于，含有权利要求1的抑血管生成素和药学可接受的赋形剂、稳定剂。

15.如权利要求14所述的注射剂，其特征在于，每毫升所述注射剂含有至少1mg的抑血管生成素。

16.如权利要求14或15任一项所述的注射剂，其特征在于，每毫升所述注射剂包含抑血管生成素至少1mg、右旋糖酐32～48mg、海藻糖1.6～2.4mg。

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