CN101967192B

CN101967192B - 抗cd20抗体片段与力达霉素的融合蛋白、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN101967192B
Application number: CN2009101573885A
Authority: CN
Inventors: 杨纯正; 甄永苏; 熊冬生; 邵荣光; 朱祯平; 苗庆芳; 程昕; 张胜华; 许元富; 房虹; 高瀛岱; 金莲舫
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS; Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Tianjin Hongri Jinboda Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2009-07-28
Filing date: 2009-07-28
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2029-07-28
Also published as: WO2011011973A1; US20120195895A1; CN101967192A

Abstract

本发明涉及抗癌药物力达霉素的强化融合蛋白：Anti-CD20(scFv)-LDM及Anti-CD20(Fab)-LDM、其编码基因；还涉及所述强化融合蛋白的基因工程构建方法和所述强化融合蛋白的用途。申请人通过提供上述强化融合蛋白，提供了具有良好靶向性的抗肿瘤药物。

Description

抗CD20抗体片段与力达霉素的融合蛋白、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及肿瘤学和生物药学领域。具体而言，本发明提供了可以产生靶向肿瘤杀伤作用的融合蛋白、其制备方法及其用途，进而为肿瘤的靶向治疗提供了优良的候选药物。

技术背景

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤，其发病率和死亡率已居恶性肿瘤第5位。常规的放疗和化疗虽然对NHL有效率较高，但选择性差，在杀伤肿瘤细胞的同时也可能损害体内某些类型的正常细胞，常出现较明显的毒副反应，因此肿瘤靶向治疗已成为提高治疗效果的一条重要途径。

在肿瘤靶向治疗中，靶向治疗的靶点选择非常重要，已知大多数NHL起源于B淋巴细胞，95％以上的B细胞NHL表达CD20抗原，而CD20又仅在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴细胞、成熟B淋巴细胞、激活B淋巴细胞中表达；在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其它组织均无表达，且CD20抗原比较暴露，人体血清中也无游离的CD20存在，因此CD20可作为治疗B细胞淋巴瘤的有效靶点。

在靶向治疗中使用最多的是与肿瘤相关抗原相关的单克隆抗体。自从1997年美国FDA批准抗CD20人鼠嵌合抗体利妥昔抗体(Rituximab)上市，人们对抗体药物产生了极大的期望，另外，最近利用抗CD20抗体治疗自身免疫性疾病如：类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等成为新的研究热点，这也提示抗CD20抗体的治疗应用范围将进一步得到扩展。但随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，药物抗性的问题也越来越明显。随之发展起来的¹³¹I标记的抗CD20鼠源性抗体Bexxa r和⁹⁰Y标记的Zevalin抗体，作用机制与利妥昔抗体不同，克服了药物抗性，但免疫原性大，只能一次注射，且毒副反应大，患者耐受性差。因此研制以CD20为靶点的小型、高效的抗体靶向药物成为当务之急。

发明简述

针对这种现状，申请人设想采用小型化抗CD20抗体片段(靶向载体)与强效抗肿瘤药物(弹头)相结合的策略。

在进行小型化抗体片段选择时，申请人选择了抗CD20抗体Fab片段和抗CD20抗体的scFv片段作为靶向载体。其中Fab片段是由重链可变区VH、恒定区中的CH1和轻链可变区VL、恒定区CL组成，单链抗体(scFv)是由抗体分子中的重链可变区VH和轻链可变区VL通过连接肽(通常为[GlySer4]₃)连接而成，它们均具有分子量小、穿透力强、体内半衰期短以及易于基因改造和可通过细菌发酵大量生产等优点。而且由于Fab、scFv分子量小，免疫原性小而不易产生HAMA反应，且易穿透致密的肿瘤细胞间隙屏障，可进入实体瘤深部；同时它们均缺乏Fc片段，避免了Fc介导的受体结合作用，使得其快速向靶部位集中；此外还易于在体外进行基因改造，通过基因重组技术，在编码Fab、scFv基因后面连接上活性蛋白基因，并在受体中表达，产生靶向融合蛋白。因此抗体Fab片段及scFv作为肿瘤靶向药物的载体具有诱人的前景。

在进行“弹头”选择时，申请人选择了高活性的“弹头”药物力达霉素(LDM)，亦称C-1027或C1027，是从中国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株由球孢链霉菌(Streptomyces globisporus，菌种保藏编号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。LDM由两部分分子组成：一为烯二炔结构的发色团(active enediyne，AE)，具有细胞毒作用，但不稳定；另一为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP)，对发色团的稳定起保护作用。发色团和辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合具有特异性和牢固性，LDM的辅基蛋白和发色团可以拆分和进行分子重建。LDM以其独特的分子结构适合作为“弹头”药物。

申请人通过基因工程方法，从含有抗CD20抗体的重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab’中扩增得到CH1片段，从质粒pET30sngrldp(保藏号CGMCCNo.2010)中扩增得到LDP基因，然后通过SOE-PCR得到Fab-LDP基因，然后将该片段重新组装到切除了CH1基因的质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab’中，得到含有Anti-CD20(Fab)-LDP的质粒，将该质粒转导到表达宿主菌株中，通过改变培养温度、培养基成分和培养时间优化培养条件，获得了可溶性表达的Fab-LDP融合蛋白，将该融合蛋白与AE分子重新组装，得到强化融合蛋白Fab-LDM，在动物试验中，本发明的强化融合蛋白Fab-LDM保留了抗CD20抗体的靶向性和LDM的杀伤活性，相较相同剂量的Fab、LDM，本发明的Fab-LDM表现出更高的肿瘤抑制效果。

同时，申请人同样以基因工程手段，从含有抗CD20抗体的重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab’中扩增得到VH、VL片段，通过SOE-PCR获得scFv基因片段，将该基因与LDP基因同时连接到质粒pGEMT中，获得pGEMT-scFv-LDP，然后从该质粒中双酶切获得scFv-LDP基因，然后将scFv-LDP连接到表达质粒pCANTAB 5E中，得到融合了抗CD20抗体的scFv片段与LDP片段的质粒，将该质粒转导到表达宿主菌株中，通过改变诱导物浓度和培养时间等优化培养条件，获得了主要以包涵体形式表达的scFv-LDP融合蛋白，经过变性和复性的融合蛋白与AE分子重新组装，得到强化融合蛋白scFv-LDM，在动物试验中，本发明的强化融合蛋白scFv-LDM保留了抗CD20抗体的靶向性和LDM的杀伤活性，相较相同剂量的scFv-LDP和LDM，本发明的scFv-LDM表现出显著的肿瘤抑制效果。由此提供了新型的、由抗CD20抗体片段和力达霉素融合而成的可用于肿瘤治疗候选靶向肿瘤治疗药物。

附图说明

图1a为重组表达质粒pCANTAB 5E-Fab-LDP的限制性内切酶分析结果，其中，1为DNA分子量标准；2为重组质粒pCANTAB 5E-Fab-LDP/apaI+sphI。

图1b为重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv-LDP的限制性内切酶分析结果，其中，

1为DNA分子量标准(DL15000)；

2为重组质粒PCANTAB 5E-scFv-LDP；

3为pCANTAB 5E-scFv-LDP/MluI+XhoI；

4为pCANTAB 5E-scFv-LDP/MluI+EcoRI；

5为pCANTAB 5E-scFv-LDP/EcoRI+XhoI；

6为DNA分子量标准(DL2000)。

图2a为融合蛋白Fab-LDP表达产物的SDS-PAGE分析结果，其中，

1为低分子量蛋白标准；

2为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白非还原纯化后；

3为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白非还原流出液；

4为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白非还原上样前；

5为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白还原纯化后；

6为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白还原流出液；

7为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白还原上样前。

图2b为融合蛋白Fab-LDP表达产物的Western印迹分析结果，其中，

1为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白非还原上样前；

2为LDP阳性对照；

3为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白非还原纯化后；

4为重组菌株pCANTAB 5E-Fab-LDP周质腔蛋白非还原流出液。

图2c为融合蛋白scFv-LDP在重组菌株中的诱导表达结果，其中，

1为低分子量蛋白标准；

2为重组菌株pCANTAB 5E表达的全菌蛋白；

3为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的全菌蛋白。

图2d为融合蛋白scFv-LDP表达产物的SDS-PAGE和Western印迹分析结果，其中，

1为低分子量蛋白标准

2为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的全菌蛋白

3为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的培养基上清组分

4为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的细胞周质腔组分

5为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的可溶性细胞质组分

6为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的不可溶包涵体组分

图2e为融合蛋白scFv-LDP经金属螯合层析纯化的SDS-PAGE分析结果，其中，

1为低分子量蛋白标准；

2为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的全菌蛋白；

3为不可溶包涵体的样品预处理；

4-7为不与亲和层析柱结合的杂蛋白；

8-10为经洗脱缓冲液洗脱下来的融合蛋白scFv-LDP。

图3a为抗CD 20Fab和Fab-LDP与Raji细胞的结合活性的FACS分析结果，其中，

代表Fab-LDP；□代表抗CD20Fab

图3b为融合蛋白scFv-LDP对Raji细胞的免疫反应性分析结果。其中，

◆代表2×10⁵个Raji细胞；■代表1×10⁵个Raji细胞；

▲代表0.5×10⁵个Raji细胞。

图3c为融合蛋白scFv-LDP对Daudi细胞的免疫反应性分析结果。其中，

◆代表2×10⁵个Daudi细胞；■代表1×10⁵个Daudi细胞；

▲代表0.5×10⁵个Daudi细胞。

图4a表示强化融合蛋白Fab-LDM与LDM对Raji细胞的细胞毒作用，

其中，●代表Fab-LDM；□代表LDM。

图4b表示强化融合蛋白Fab-LDM与LDM对Daudi细胞的细胞毒作用，

其中，●代表LDM；□代表Fab-LDM。

图4c表示强化融合蛋白Fab-LDM与LDM对K562细胞的细胞毒作用，

其中，▲代表LDM；□代表Fab-LDM。

图4d表示强化融合蛋白Fab-LDM与LDM对不同细胞的IC50的比较，

其中，□代表LDM；代表Fab-LDM。

图4e表示强化融合蛋白scFv-LDM与LDM对Raji细胞的细胞毒作用，

其中，■代表LDM；◆代表s cFv-LDM。

图4f表示强化融合蛋白scFv-LDM与LDM对Daudi细胞的细胞毒作用，

其中，■代表LDM；◆代表scFv-LDM

图5a表示强化融合蛋白Fab-LDM对早期裸鼠移植性CD20+B细胞淋巴瘤模型的治疗作用，其中，

●代表PBS；

■代表抗CD20Fa b 4pmol/kg；

▲代表Fab-LDM 2pmol/kg；

◆代表LDM 4pmol/kg；

代表Fab-LDM 4pmol/kg；

○代表LDM 2pmol/kg。

图5b表示强化融合蛋白Fab-LDM对晚期裸鼠移植性CD20+B细胞淋巴瘤模型的治疗作用。其中，

●代表PBS；

○代表抗CD20Fab 4pmol/kg；

■代表Fab-LDM 2pmol/kg；

◆代表LDM 4pmol/kg；

▲代表Fab-LDM 4pmol/kg；

代表LDM 2pmol/kg。

图5c表示强化融合蛋白scFv-LDM对裸鼠移植性CD20+B细胞淋巴瘤模型的治疗作用。其中，

◆代表PBS；

×代表LDM 0.05mg/kg；

※代表scFv-LDM 0.3mg/kg；

●代表scFv-LDM 0.2mg/kg；

▲代表scFv-LDM 0.1mg/kg。

发明详述

在本发明中所提及的术语均按下述定义来理解。

在本文中提到的“LDM”等同于“LDP-AE”、“力达霉素”、“力达霉素辅基蛋白，其中辅基蛋白上结合有发色团AE”。发色团和辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合具有特异性和牢固性，LDM的辅基蛋白和发色团可以拆分和进行分子重新组装。

在本文中提到的“AE”是指具有下式I所示的化学结构的发色团，

LDM发色团的化学名：

(2R，7S，9R，10R)-7-氨基-7，8-(2*-氯-6*-羟基-1*，4*-亚苯基)-10-(4’-去氧-4’-二甲氨基-5’，5’-二甲基-吡喃核糖基)-4，8-氧杂-5-氧代-1，11，13-三烯-15，18-二炔-三环[7，7，3，0^10，14]-2-十九碳醇-2”，3”-二氢-7”-甲氧基-2”-亚甲基-3”-氧代-1”，4”-苯并恶嗪-5”-羧酸酯。分子式：C₄₃H₄₂O₁₃N₃Cl

力达霉素发色团结构式

(I)

其由野生型力达霉素生产菌产生，天然地结合于力达霉素的辅基蛋白上，而且可以通过在低温条件下用冷甲醇等有机溶剂处理力达霉素的方式得到游离状态的发色团AE，该游离的发色团AE可以与去除了AE的力达霉素辅基蛋白LDP或者基因工程产生的LDP(其上可以融合有其它蛋白片段或者不融合有其它蛋白片断)在低温条件下组装成与天然力达霉素形式相同的活性形式，这种重新组装被称为“强化”。

在本文中提到的“Fab”等同于“Anti-CD20(Fab)、“抗CD20Fab”、“抗CD20抗体的Fab片段”、“SEQ ID NO 1：所示的第24-467位所示的抗CD20抗体Fab片段”。

在本文中提到的“Fab-LDP”等同于“antiCD20(Fab)-LDP”、 “抗CD20抗体的Fab片段与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白”、“SEQ ID NO：1所示的融合蛋白。

在本文中提到的“scFv”等同于、“抗CD20抗体的单链抗体片段”、“antiCD20(s cFv)”、“SEQ ID NO：3的第24-266位所示的抗CD20抗体scFv片段”。

在本文中提到的“scFv-LDP”等同于“anti-CD20(scFv)-LDP”、“抗CD20抗体的单链抗体片段与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白”、“SEQ ID NO：3所示的融合蛋白”。

在本文中提到的“Fab-LDM”等同于“强化融合蛋白Fab-LDM”“antiCD20(Fab)-LDP-AE”、“抗CD20抗体的Fab与力达霉素的融合蛋白”、“SEQ ID NO：1所示的融合蛋白，其中力达霉素霉素辅基蛋白上结合有发色团AE”。

在本文中提到的“scFv-LDM”等同于“强化融合蛋白scFv-LDM”“antiCD20(scFv)-LDP-AE”、“抗CD20抗体的单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白，其中辅基蛋白上结合有发色团AE”、“抗CD20抗体的单链抗体与力达霉素的融合蛋白”“SEQ ID NO：3所示的融合蛋白，其中力达霉素霉素辅基蛋白上结合有发色团AE”。

具体地，本发明了提供了下述内容：

1.融合蛋白，其选自下述序列之一：

(a)由SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列；

(b)具有SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列的生物学功能、且与SEQ ID NO：1或者3所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列构成的氨基酸序列；和

(c)具有SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列的生物学功能，且经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的SEQ ID NO：1或3所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列。

2.项目1的融合蛋白，其还功能性地结合有式(I)所示结构的发色团AE：

力达霉素发色团结构式

(I)

3.核酸分子，其编码项目1的融合蛋白的基因，其选自下述序列之一：

(a)SEQ ID NO：2所示的编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(b)SEQ ID NO：4所示的编码SEQ ID NO：3的核苷酸序列；

(c)编码项目1中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列；

(d)编码项目1中(c)的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(e)因为密码子简并性而分别与SEQ ID NO：2和4不同、但是编码与SEQ ID NO：2或4所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。

4.载体，其可操作地连接有项目3所述的核酸分子。

5.项目4的载体，所述载体是质粒。

6.宿主菌，其包含项目4所述的载体。

7.项目6的宿主菌，其是保藏号为CGMCC No.3125，于2009年06月17日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的名为IHPAYZ的大肠埃希氏菌。

8.项目6的宿主菌，其是保藏号为CGMCC No.3100，于2009年06月17日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的名为IMBPAYZ的大肠埃希氏菌。

9.制备项目2的融合蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)将抗CD20抗体的Fab基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到质粒pCANTAB 5E中，得到重组表达质粒pCANTAB 5E-Fab-LDP，或者将抗CD20抗体的可变区单链scFv基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到质粒pCANTAB 5E中，得到重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv-LDP，

(b)在大肠杆菌HB2151中的诱导表达融合蛋白Fab-LDP、scFv-LDP，

(c)纯化及其复性步骤(b)中获得的融合蛋白，

(d)使步骤(c)中获得的融合蛋白与式(I)的发色团组装，

(e)任选地，其还包括测定步骤(d)中组装后的融合蛋白的生物学活性的步骤。

10.药物组合物，其中含有药学有效量的项目1或者2所述的融合蛋白，任选地，还含有药学上允许的佐剂。

11.项目1或者2的融合蛋白在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途。

12.项目11的用途，所述药物用于靶向杀伤淋巴瘤细胞。

13.项目11的用途，其中的淋巴瘤是裸鼠淋巴瘤或者人B细胞淋巴瘤。

下面通过实施例对本发明的具体实施方式进行阐述，所述的实施方式仅仅用来解释和说明本发明，其并不限制本发明的保护范围。任何本领域技术人员根据公知的知识和现有技术的教导能够想到的等价的变体都包含在本发明的保护范围中。

具体实施方式

实施例1

1.重组表达质粒pCANTAB 5E-antiCD20Fab-LDP的构建：

PCR扩增CH1：

由于重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab’含有抗CD20单抗HI47的VH、VL及人源化CL、CH1基因，且重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab’只有CH1区含有一个apaI酶切位点，所以申请人用含有Fab’基因的重组质粒 pCANTAB 5E Fcd20Fab’(Inhibition of human B-cell lymphoma by ananti-CD20antibody and its chimeric(Fab’)₂fragment via inductionof apoptosis.YinxingLiu，ZhenpingZhu et.al.Cancer Letters205(2004)143-153)作为模版，获得CH1。PCR引物由上海英骏公司合成，分别引入相应酶切位点。

具体地，以pCANTAB 5E Fcd20 Fab’做为模板，用P1作为5’端引物，P2作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件为：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到以apaI酶切位点开头的部分CH1的基因片段A(约324bp)。将片段A进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。

Anti-CD20Fab’上游引物P1：

5’-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC-3’(SEQ ID No：5)apaI酶切位点

Anti-CD20Fab’下游引物P2：

5’-CGCGCTGCCACCGCCACCTGTGTGAGTTTTGTCACAAGA-3’(SEQ ID No：6)LDP上游引物P 3：

5’-ACAGGTGGCGGTGGCAGCGCGCCCGCCTTCTCCGTC3’(SEQ ID No：7)LDP下游引物P4：

5’-GCGCGCATGCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCAC-3’(SEQ ID No：8)

sphI酶切位点

PCR扩增LDP：

用含有LDP基因的重组质粒pET30sngrldp(保藏号CGMCCNo.2010)为模板，用P3作为5’端引物，用P4作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟。得到LDP的基因片段B(约330bp)。将片段B进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。

SOE-PCR扩增Fab-LDP：

利用纯化的片段A(CH1)和片段B(LDP)产物，进行扩增，反应条件：94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共10个循环，然后72℃再延伸10分钟，生成少量CH1-linker-LDP模板。完成上步反应后，补加P1和P4引物，进行扩增，反应条件：94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共30个循环，72℃再延伸10分钟。得到Fab-LDP基因片段C(片段A+B，约669bp)，

将反应产物C进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将回收得到的Fab-LDP片段和pCANTAB 5E Fcd20Fab’载体分别经apaI、sphI酶切后，将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。将得到的载体酶切产物与目的基因的酶切产物按1∶6的比例用Takara公司的T4连接酶16℃连接16个小时后，转化感受态大肠杆菌HB2151，筛选出重组克隆质粒，并进行菌液PCR及酶切鉴定后，测序，结果表明，融合基因重组表达质粒的酶切结果和测序结果与预期完全一致，融合蛋白的基因编码序列为669bp，序列正确，命名为pCANTAB 5E Fab-LDP，菌体PCR产物的电泳图参见图1a。

其中Fab-LDP的蛋白质序列如SEQ ID NO：1所示，其中，1-23位为信号肽；24-132位为轻链可变区；133-237位为轻链恒定区；238-359位为重链可变区；360-467位为重链CH1区；468-472位为G₄S；473-582位为力达霉素辅基蛋白。

Fab-LDP的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，其中：1-69位为信号肽基因序列，70-396位为轻链可变区基因序列；397-711位为轻链恒定区基因序列；712-1077位为重链可变区基因序列；1078-1401位为重链CH1区基因序列；1402-1416位为G₄S；1417-1746位为力达霉素辅基蛋白基因序列；1747-1752位为SphI酶切位点；1753-1755位为终止密码子。

2.重组表达质粒pCANTAB-anti-CD20scFv-LDP的构建

设计PCR引物，所述PCR引物由上海英俊公司合成，分别引入相应酶切位点。

重链可变区(VH)5’端引物PH1(SEQ ID NO：9)：

5’-CAAACGCGTACGCTCAGGTGAAGCTG-3’

MluI

重链可变区(VH)3’端引物PH2(SEQ ID NO：10)：

5’-ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCTCCTGAGGAGACGGTGACCGTGATC-3’

Linker

轻链可变区(VL)5’端引物PL1(SEQ ID NO：11)：

5’-GGCTCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTC-3’

Linker

轻链可变区(VL)3’端引物PL2(SEQ ID NO：12)：

5’-GAGCATGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCAG-3’

SphI his₆ XhoI

PCR扩增VH、VL：

以含有Fab’基因的重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab’为模板，用PH1作为5’端引物，PH2作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟，得到VH基因片段D(约370bp)。将得到的反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用BioDev公司的玻璃奶试剂盒回收纯化VH片段。

以含有Fab’基因的重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab’为模板，用PL1作为5’端引物，用PL2作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5分钟，然后94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72℃延伸10分钟，得到VL基因片段E(约320bp)。将得到的反应产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用BioDev公司的玻璃奶试剂盒回收纯化VL片段。

SOE-PCR扩增scFv：

利用纯化的VH和VL PCR产物，进行扩增，反应条件：94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共7个循环，然后72℃再延伸10分钟，生成少量VH-linker-VL模板。上步反应完后，补加PH1和PL2引物，进行PCR扩增，反应条件：94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共25个循环。72℃再延伸10分钟。扩增得到scFv基因片段F(约760bp)，将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用BioDev公司的玻璃奶试剂盒回收纯化scFv片段。所得到的scFv基因片段是由编码(GGGGS)₃序列的spacer短肽将重链可变区VH和轻链可变区VL连接而成的一条多肽链。

将scFv按Takara公司18T载体试剂盒(产品号D504A)提供的方法与18T载体相连，转化大肠杆菌DH5α(上海生工，产品号SD8411)，筛选出重组克隆质粒，测序正确后命名为18T-scFv。将质粒18T-scFv进行MluI/SphI双酶切，释放出的scFv基因片段与进行同样双酶切的pCANTAB5E载体连接，得到scFv基因重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv，并进行酶切鉴定和序列鉴定。结果表明，重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv的酶切结果和测序结果与预期完全一致，单链抗体基因编码序列为762bp，由254个氨基酸组成，序列正确。

在scFv基因5’端引入了MluI酶切位点，3’端引入了SphI酶切位点，利于与pCANTAB 5E载体连接，3’端XhoI酶切位点的设置，利于下一步LDP的连接；6个连续组氨酸标签肽(His₆-Tag)的密码子，使得下一步表达蛋白的3’端融合有His₆-Tag，便于纯化和鉴定。

3.抗CD20单链抗体scFv基因和力达霉素辅基蛋白LDP基因的克隆及重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv-LDP的构建：

引物P5：5’CAGCATATGAACGCGTACGCTCAGGTGAAG 3’(SEQ ID NO：13)

NdeI MluI

引物P 6：5’CGCGAATTCTGAACCGCCTCCACCTTTGATCTCCACCTTGGT 3’(SEQ ID NO：14)

EcoRI

引物P7：5’CGGAATTCGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTCCC3’(SEQ ID NO：15)

EcoRI

引物P8：5’CCGCTCGAGTCAGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG 3’(SEQ ID NO：16)

XhoI

以前述获得的质粒pCANTAB 5E-scFv为模板，P5为5’端引物，P6为3’端引物，进行PCR扩增反应，反应条件：94℃预变性5分钟后，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，30个循环，最后一个循环结束后，72℃延伸10分钟，得到长约760bp的scFv基因片段。将该反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并用BioDev公司的玻璃奶试剂盒回收纯化scFv片段。

然后将回收得到的scFv片段按Takara公司18T载体试剂盒提供的方法与18T载体相连，转化大肠杆菌DH5α，经转化筛选后得到质粒18T-scFv，阳性克隆测序正确后命名为18T-scFv，扩增后进行NdeI/EcoRI双酶切，释放scFv基因片段。

质粒pET30sngrldp(保藏号CGMCCNo.2010)为模板，P7为5’端引物，P8为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件：94℃变性2min后，94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1mi n，25个循环，最后一个循环结束后在72℃延伸10min，得到长约330bp的LDP基因扩增产物。将LDP基因扩增产物进行EcoRI/XhoI双酶切，得到LDP基因片段。将scFv基因片段与LDP基因片段同时与pGEMT(Takara公司)进行连接，经转化筛选后得到质粒pGEMT-scFv-LDP。

扩增后进行MluI/XhoI双酶切，释放约1100bp的scFv-LDP基因片段与进行同样双酶切的pCANTAB 5E-scFv载体连接、转化大肠杆菌HB2151，筛选阳性克隆，提取质粒，得重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv-LDP并进行酶切鉴定和序列测定。结果表明，融合基因重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv-LDP的酶切结果和测序结果与预期完全一致，融合蛋白的基因编码序列为1176bp，由392个氨基酸组成，序列正确(图1b)。

其中scFv-LDP的蛋白质序列如SEQ ID NO：3所示，其中，1-23位为信号肽；24-145位为轻链可变区；146-160位为(G4S)₃；161-266位为重链链可变区；267-271位为G4S；272-273位为谷氨酸、苯丙氨酸； 274-383位为力达霉素辅基蛋白；384-385位为亮氨酸、谷氨酸；386-391位为6个组氨酸纯化标签。

ScFv-LDP的DNA序列如SEQ ID NO：4所示，其中：1-69位为信号肽；70-435位为轻链可变区基因序列；436-480位为(G4S)₃；481-798位为重链链可变区基因序列；799-813位为G4S；814-819位为EcoRI酶切位点；820-1149位为力达霉素辅基蛋白基因序列；1150-1155位为XhoI酶切位点；1156-1173位为6个组氨酸纯化标签；1174-1176位为终止密码子。

所得到的scFv-LDP基因的5’端引入了MluI酶切位点，3’端引入了XhoI酶切位点，利于与pCANTAB 5E载体连接，恰好可利用上步构建的6个连续组氨酸标签肽(His₆-Tag)的密码子，使得表达蛋白的3’端融合有His₆-Tag，便于纯化和鉴定。

4.1Fab-LDP的表达

将前述1中获得的含有质粒pCANTAB 5E-anti-CD20Fab-LDP的大肠杆菌HB2151的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素(Amp)100μg/ml的2×YT培养基中，在恒温摇瓶箱中37℃，200rpm，振荡培养过夜；移入500ml含Amp 100μg/ml的2×YT培养基(1L的2×YT培养基含1.6％胰化蛋白胨、1.0％酵母抽提物、0.5％氯化钠，PH 7.4)中，37℃，200rpm，振荡培养8h后，在低温高速真空离心机上6000rpm、4℃离心10分钟收集菌体，将菌体重新悬浮于1000ml含Amp 100μg/ml及1mM IPTG的2×YT培养基，30℃，200rpm，振荡培养4h；8,000rpm、4℃离心10分钟收集菌体，冷冻于-20℃冰箱备用。

将冻存的菌体化冻，加入50ml细菌周质腔蛋白提取液(三羟甲基氨基甲烷25mmol/L，乙二胺四乙酸1mmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF)0.1mmol/L，蔗糖20％(w/w，NaCl 200mmol/L，pH 7.5)，振荡混匀，置于4℃轻摇1h。12000rpm，4℃离心20分钟，取上清。将提取物用PBS透析12h后，在快速蛋白层析仪(FPLC)上进行纯化，用结合缓冲液(0.01mol/LNaH₂PO₄，0.01mol/L Na₂HPO₄，0.005％NaN₃，pH 7.0)平衡亲和层析柱，上样，再用结合缓冲液冲洗基线，至基线稳定后，用洗脱缓冲液(0.1mmol/L Glycine，pH 3.0)洗脱，洗脱液用中和缓冲液(1mol/L Tris-HCl，0.05％NaN₃，pH 8.2)中和pH值。然后用12％SDS-PAGE分析外源蛋白表达情况，结果表明，经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白，且Fab-LDP的表达产物主要存在于细菌可溶性周质腔中(图2a)。

4.2用Western印迹法确认Fab-LDP

将4.1获得到的蛋白进行电泳，电泳后的凝胶在Bio-Rad电转槽中进行半干电转，条件为：恒电流0.7mA/cm²，时间为5小时。电转结束后的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)与用封闭液10倍稀释的一抗即抗LDP单抗(保藏编号CGMCC No.1849)孵育，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行显色分析，结果表明，重组菌株表达的确为C-末端带有LDP的重组融合蛋白Fab-LDP(图2b)。将该含有质粒pCANTAB5E-anti-CD20Fab-LDP的表达融合蛋白Fab-LDP的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)命名为IHPAYZ，于2009年06月17日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No.3125。

5.1scFv-LDP(即anti-CD20(scFv)-LDP)的表达：

以3中获得到重组质粒pCANTAB 5E-anti-CD20(scFv)-LDP转化大肠杆菌HB2151，得到重组转化菌。挑取单克隆接种于50mL 2×YT培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃，200rpm振荡培养过夜；离心收集菌体，将菌体重悬于100mL 2×YT培养基(含100μg/mL氨苄青霉素及1mMIPTG)，30℃，振荡培养4h；离心收集菌体，将菌体于-20℃冷冻。分别制备全细胞蛋白组分、培养液上清组分、细胞周质腔组分、可溶性细胞质和不可溶性细胞质(包涵体)组分，然后在变性条件下进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析外源蛋白表达情况。结果表明，经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白，表达量占全菌总蛋白的30％以上，达到30mg/L。且表达产物主要存在于细菌不可溶的包涵体中(图2c)。

5.2用Wes tern印迹法确认scFv-LDP

将4.3中的蛋白进行电泳，电泳后的凝胶在Bio-Rad电转槽中进行半干电转，条件为：恒电流0.65mA/cm²，时间为1小时50分钟。电转结束后的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)与用封闭液2000倍稀释的一抗即抗His₆-Tag单抗(天根生化科技有限公司目录号AB102-01)孵育，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行显色分析，结果表明，重组菌株表达的确为C-末端带有His₆-Tag的重组融合蛋白scFv-LDP(即Anti-CD20(scFv)-LDP)(图2d)。将该含有pCANTAB5E-anti-CD20(scFv)-LDP质粒的表达scFv-LDP的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)命名为IMBPAYZ，于2009年06月17日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号：CGMCC No.3100。

5.3scFv-LDP的纯化和复性

采用Novagen公司的His·Bind纯化试剂盒于变性条件下纯化融合蛋白scFv-LDP样品，按试剂盒说明书进行操作。对包涵体蛋白样品和亲和层析柱进行预处理后，样品上柱，依次以10倍柱床体积的含6M尿素的结合缓冲液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)，6倍柱体积的含6M尿素的洗涤缓冲液(60mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl pH 7.9)洗涤层析柱，最后以含6M尿素的洗脱缓冲液(100mMEDTA，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)进行洗脱，收集洗脱组分获得纯化的融合蛋白scFv-LDP(图2e)。

将上述纯化后的样品用含6M尿素的洗脱缓冲液稀释至15μM，加入2-巯基乙醇至终浓度为10mM，室温放置30分钟，然后将样品装入透析袋，用至少50倍样品体积的复性液I(50mM Tr s-HCl pH 8.0，1mMEDTA，200mM NaCl，6M尿素)透析过夜。再用与复性液I同样组分但尿素浓度依次为3M、2M、1M、0.5M、0M的50倍体积的缓冲液进行分步透析，在尿素浓度为1M的阶段加入750μM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和400mM的L-精氨酸。将最后一次透析所得样品用50倍体积磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)透析，每12小时更换一次透析液，共两次。以上透析操作均于4℃进行。将透析后的样品以10000g，4℃离心30分钟，收集上清。将上清样品进行浓缩后得到活性融合蛋白scFv-LDP，置于-80℃备用。

6.1Fab-LDP的免疫学活性

通过流式细胞仪测定Fab-LDP的免疫荧光结合活性。将1×10⁶个Raji细胞重悬于含有不同浓度的FITC标记的抗CD20Fab片段(Inhibition of human B-cell lymphoma by an anti-CD20antibody andits chimeric(Fab’)₂fragment via induction of apoptosis.YinxingLiu，ZhenpingZhu et.a l.Cancer Letters 205(2004)143-153)或Fab-LDP的100L PBS溶液中，4℃放置1h，2000g，离心10分钟，弃上清液，PBS洗3次，FACS测定抗CD20Fab片段或Fab-LDP结合Raji细胞的阳性率。证明相同浓度的抗CD20Fab片断及Fab-LDP与Raji细胞的结合活性基本相同，Fab-LDP融合蛋白保留了与靶抗原特异性结合的能力(图3a)。

6.2融合蛋白scFv-LDP的免疫学活性。

以酶联免疫吸附分析方法(ELISA)测定scFv-LDP的免疫学活性。首先进行下述的Raji和Daudi细胞固定：在96孔培养板中加入0.01％的多聚赖氨酸，200μl/孔，4℃湿盒中包被过夜。弃去包被液，PBS洗1次。将对数生长期的Raji或daudi细胞，以生理盐水调整细胞数为2×10⁶个/ml，并以50μl/孔加至培养板。800g离心5分钟后，弃去上清液，并在培养板中加入4℃预冷的0.05％的戊二醛，50μl/孔，于4℃固定细胞15分钟。固定好细胞的96孔板用PBS洗3次后，用含1％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液200μl/孔、4℃封闭过夜。PBS洗3次，加入倍比稀释的待测样品，50μl/孔，每个浓度设三个平行孔，37℃温育2h。PBST洗板3次，然后加入1∶1500倍稀释的anti-His tag单克隆抗体，50μl/孔，37℃反应1h。PBST洗板3次，然后加入1∶2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，50μl/孔，37℃反应1h。PBST洗板6次，然后加入OPD邻苯二胺底物反应液100μl/孔，室温暗处反应10分钟。以2MH₂SO₄ 100μl/孔终止反应，在酶标仪上测定490nm吸光值。

结果表明，scFv-LDP对Raji、Daudi淋巴瘤细胞的免疫反应呈阳性，抗体的相对亲和力约为4×10^-7M、8×10^-7M，但明显低于Fab 8×10^-8M的亲和力(Inhibition of human B-cell lymphoma by an anti-CD20antibody and its chimeric(Fab’)₂ fragment via induction ofapoptosis.YinxingLiu，ZhenpingZhu et.al.Cancer Letters205(2004)143-153)，证明scFv-LDP(即anti-CD20scFv-LDP)保留了单抗对CD20抗原部分结合活性(图3b、c)。

7.力达霉素的制备及其活性型发色团AE的相对含量测定

7.1力达霉素的制备

将力达霉素产生菌(CGMCC NO.0135)冷干管中加0.7ml无盐水，使之形成菌悬液，用白金耳接种于高氏1号斜面培养基培养，28℃，7-10天，表面生长白色气生菌丝，取一小块接种于一级种子100ml/500ml三角瓶培养(发酵培养基成分为：淀粉1％，玉米浆0.5％，血胨0.5％，葡萄糖0.5％，MgSO₄0.02％，KI 0.06％，玉米面1.5％，CaCO₃ 0.4％，自来水配制，pH 7.0，15磅消毒)，28℃，旋转摇床培养48h，在转种5％于1000ml/5000ml立瓶中作为二级种子，以相同发酵培养基培养，28℃，往返摇床培养18h，上200L发酵罐，装量为100L，接种量2％，加0.03％泡敌为消沫剂，罐压0.04，28℃，搅拌400转/分，气流1/1，pH 6.5-7.0，发酵96h，得到所需发酵液。取发酵液10L，离心取上清，以HCl调至pH 4.0，加(NH₄)₂SO₄ 4.5Kg于8℃搅拌3h，析出的力达霉素离心分离(4℃，8000转/分，15min)，所得的沉淀物加200ml冷水溶解，透析，再离心除去不溶物，上清液经羟基磷灰石柱吸附，0.001M磷酸缓冲液(pH6.8)洗脱，活性部分冷冻干燥，得粗制品1500mg。粗制品溶于水，经Sephadex G-75柱层析，活性部分冷冻干燥后，得到145mg抗肿瘤高活性的力达霉素白色粉末精制品。

7.2活性型发色团AE的相对含量测定

与LDM蛋白部分相比，发色团分子量较小，其理论含量仅占力达霉素的7.4％。由于AE是LDM发挥作用的活性部分，辅基蛋白仅有保护AE的功能，因此一般通过测定AE在发色团总量中的相对含量，即可以确定LDM制品的活性高低。

采用HPLC对LDM进行分析可以测得AE占发色团总量的百分比值，具体方法为：

将如上述制备的LDM制品溶于HPLC流动相(乙腈∶水为23∶77)，在FPLC快速蛋白色谱仪上经Waters径向加压C4半制备柱分离，洗脱液为乙腈∶水(23∶77)，自动收集器收集，用HPLC C4分析柱检测收集到的各组分。

分析结果显示，本发明人制备的LDM，其AE组分占LDM发色团总量的90.63％。通过分析确定该LDM制品符合LDM的质量控制标准，为AE高含量的LDM精制品，将该LDM制品冻干，置于-80℃冰箱保存，以便用于强化融合蛋白Fab-LDM、scFv-LDM的制备。

7.3.强化融合蛋白Fab-LDM、scFv-LDM的制备。

取高活性LDM冻干品10mg，加5ml冷甲醇振摇5分钟，-20℃放置1小时，中间振摇1次；在0℃，12000转/分钟离心20分钟，上清液含发色团AE，沉降物为肽链，重复提取2次。将含有发色团AE的甲醇液蒸发浓缩，-70℃储存。发色团AE不稳定，实验需低温(4℃)、避光进行。

然后取Fab-LDP及scFv-LDP融合蛋白分别溶于PBS中，加入5倍摩尔分子量的发色团-甲醇溶液(体积比为50∶1)，混合振摇，室温放置12小时。最后将混合液进行PD-10柱层析，经A280nm和A343nm紫外监测后收集强化融合蛋白Fab-LDM及scFv-LDM。

8.1Fab-LDM对体外培养的肿瘤细胞的特异性的细胞毒作用

以噻唑蓝(MTT)法进行测定细胞毒作用。取对数生长期的Raji或Daudi细胞、计数，2×10⁴个/孔铺于96孔板，在37℃含5％CO₂的培养箱中培养12小时后加入不同浓度的药物，每个药物浓度设3个平行孔。继续培养48小时，2000rpm/分钟离心10分钟，弃上清。每孔加入20μl PBS溶解的MTT(5mg/ml)，37℃继续培养4小时，2000rpm/分钟离心10分钟，轻轻弃去上清，加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，室温下摇床振摇5分钟，酶标仪上测定546nm光吸收值。每次试验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔。按下述公式计算细胞的存活率及半数抑制浓度(IC₅₀)值：细胞存活率＝(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％。

结果发现强化融合蛋白Fab-LDM对Raji、Daudi细胞的IC₅₀值分别为0.9×10^-10M和0.8×10^-10M，对无特异性CD20抗原的K562细胞的IC₅₀值为3.0×10^-10M，而力达霉素对Raji、Daudi细胞的IC₅₀值分别为3.1×10^-10M和2.9×10^-10M，对无特异性CD20抗原的K562细胞的IC₅₀值为2.8×10^-10M，表明Anti-CD20(Fab)-LDM较好的保留了力达霉素的细胞毒作用，并对肿瘤细胞有选择性杀伤作用(图4a)。

8.2scFv-LDM对体外培养的肿瘤细胞的特异性的细胞杀伤作用

以噻唑蓝(MTT)法进行测定细胞杀伤作用。取对数生长期的Raji或Daudi细胞、计数，10⁴个/孔铺于96孔板，在37℃含5％CO₂的培养箱中培养24小时后加入不同浓度的药物，每个药物浓度设3个平行孔。继续培养72小时，2000rpm/分钟离心10分钟，弃上清。每孔加入50μl无血清RPMI 1640培养液溶解的MTT(2mg/ml)，37℃继续培养4小时，2000rpm/分钟离心10分钟，轻轻吸去上清，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，室温下摇床振摇15分钟，酶标仪上测定560nm光吸收值。每次试验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔。按下述公式计算细胞的存活率及半数抑制浓度(IC₅₀)值：

细胞存活率＝(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％。

结果发现强化融合蛋白scFv-LDM对Raji细胞、Daudi细胞的IC₅₀值分别为1.21×10^-11M、6.24×10^-11M，对无特异性CD20抗原的MCF7细胞的IC₅₀值为3.39×10^-9(图5b)，均有强烈的杀伤作用，本试验结果表明Anti-CD20(scFv)-LDM较好的保留了力达霉素的细胞毒作用，并对肿瘤细胞有选择性杀伤作用。

9.1Fab-LDM对早期裸鼠移植性CD20+B细胞淋巴瘤模型的治疗作用

将生长状态良好的体重为16-18克的5周龄BALB/c裸鼠随机分组，经Cs照射后，24h内接种于裸鼠腋窝皮下Raji细胞2×10⁷个/只，饲养7天，尾静脉注射给药，9天后再次注射给药，观察Fab-LDM对裸鼠皮下淋巴瘤的治疗作用，绘制小鼠肿瘤的生长曲线。对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只。其余各组分别给予不同剂量的强化融合蛋白Fab-LDM、LDM及4pmol/kg的抗CD20Fab，均为尾静脉注射，0.2ml/只。试验期间，每三天测量一次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝0.5ab²计算瘤体积，并计算抑瘤率(图5a)。强化融合蛋白Fab-LDM的治疗结果表明，2pmol/kg、4pmol/kg二个剂量组的Fab-LDM均能显著抑制或延迟裸鼠移植性淋巴瘤的生长，均表现出比相应剂量游离力达霉素更强的肿瘤生长抑制作用，提高了力达霉素的治疗效果。在实验第39天的结果显示，4pmol/kg和2pmol/kg两个剂量组的Fab-LDM的抑瘤率分别为88％和73％，强于相应剂量LDM组49％和69％的抑瘤率。在实验治疗期间，动物体重有所增加，一般状况良好，表明动物可耐受所给剂量。

表1.Fab-LDM对早期裸鼠移植性CD20+B细胞淋巴瘤的生长抑制作用

*与LDM相比，P＜0.05，^□与空白对照相比P＜0.05，^□□与空白对照相比P＜0.01。

9.2Fab-LDM对晚期裸鼠移植性CD20⁺B细胞淋巴瘤模型的治疗作用

将生长状态良好的体重为16-18克的5周BALB/c裸鼠随机分组，经Cs照射后，24h内接种于裸鼠腋窝皮下Raji细胞2×10⁷个/只，25天后尾静脉注射给药，9天后再次注射给药，观察Fab-LDM对裸鼠皮下淋巴瘤的治疗作用，绘制小鼠肿瘤的生长曲线(图5b)。对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只。其余各组分别给予不同剂量的强化融合蛋白Fab-LDM及 LDM，均为尾静脉注射，0.2ml/只。试验期间，每三天测量一次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝0.5ab²计算瘤体积，并计算抑瘤率。强化融合蛋白Fab-LDM的治疗结果表明，2pmol/kg、4pmol/kg二个剂量组的Fab-LDM均能显著抑制或延迟裸鼠移植性淋巴瘤的生长，并且均表现出比相应剂量游离力达霉素更强的肿瘤生长抑制作用，显示出Fab-LDM对晚期淋巴瘤良好的治疗效果。在实验第47天的结果显示，4pmol/kg和2pmol/kg两个剂量组的Fab-LDM的抑瘤率分别为79.2％和67.5％，强于相应剂量LDM组52.1％和65％的抑瘤率(表2)。在实验治疗期间，动物体重有所增加，一般状况良好，表明动物可耐受所给剂量。

表2.Fab-LDM对晚期裸鼠移植性CD20⁺B细胞淋巴瘤的生长抑制作用

*与LDM相比，P＜0.05，^□与空白对照相比P＜0.05，^□□与空白对照相比P＜0.01.9.3scFv-LDM对裸鼠移植性CD20⁺B细胞淋巴瘤模型的治疗作用

将生长状态良好的体重为16-18克的5-6周龄BALB/c裸鼠随机分组，经C s照射后，24h内接种于裸鼠腋窝皮下Raji细胞2×10⁷个/只，饲养14天，尾静脉注射给药，9天后再次注射给药，观察scFv-LDM对裸鼠皮下淋巴瘤的治疗作用，绘制小鼠肿瘤的生长曲线(图5c)。对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只。其余各组分别给予不同剂量的强化融合蛋白scFv-LDM，0.05mg/kg的LDM及0.4mg/kg的抗CD20Fab均为尾静脉注射，0.2ml/只。试验期间，每三天测量一次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝0.5ab²计算瘤体积，并计算抑瘤率。强化融合蛋白scFv-LDM的治疗结果表明，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg三个剂量的scFv-LDM均能显著抑制或延迟裸鼠移植性淋巴瘤的生长，并且0.2mg/kg、0.3mg/kg组表现出比0.05mg/kg耐受剂量游离力达霉素更强的肿瘤生长抑制作用，提高了力达霉素的治疗效果。结果显示，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg三个剂量的scFv-LDM的抑瘤率分别为51.4％、70.5％和79.3％，且0.2mg/kg和0.3mg/kg剂量组强均于LDM组的68.6％抑瘤率(表3)。

表3.scFv-LDM对裸鼠移植性CD20⁺B细胞淋巴瘤的生长抑制作用

*与LDM相比，P＜0.05，**与LDM相比P＜0.01；

^□与空白对照相比P＜0.05，^□□与空白对照相比P＜0.01.

发明效果：

本发明的优点与积极效果在于：应用基因重组和分子重建相结合的方法，制备了两种anti-CD20Fab及anti-CD20scFv与抗肿瘤抗生素力达霉素的强化融合蛋白Fab-LDM、scFv-LDM，不仅保留了单抗对CD20抗原的结合性，还具有强烈的肿瘤细胞特异性的杀伤活性，在体内实验中也显示了良好的抗肿瘤疗效。在肿瘤靶向免疫治疗药物的小型化方面达到一个新水平，具有良好的应用前景。

序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所，

天津的医学科学院血研所

<120>抗CD20抗体片段与力达霉素的融合蛋白、制备方法及其用途

<130>IDC090069

<160>16

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>554

<212>PRT

<213>Fab-LDP

<400>1

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala

20 25 30

Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala

35 40 45

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser

50 55 60

Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile

115 120 125

Lys Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Asp Gln Leu Lys Ser Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

145 150 155 160

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

165 170 175

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

180 185 190

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gln

195 200 205

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser

210 215 220

Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Asn

225 230 235 240

Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

245 250 255

Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

260 265 270

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met

275 280 285

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

290 295 300

Arg Trp Asn Tyr Gly Asn Phe Gly Gly Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly

305 310 315 320

Gln Gly Ile Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

325 330 335

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

340 345 350

Ala Leu Gly Cys Leu Va Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

355 360 365

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

370 375 380

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

385 390 395 400

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

405 410 415

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

420 425 430

Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Phe Ser Val

435 440 445

Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly Gln Ser Val Ser Val Ser Val

450 455 460

Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr Ile Ala Gln Cys Ala Pro

465 470 475 480

Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn Pro Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr

485 490 495

Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser

500 505 510

Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys

515 520 525

Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp Leu

530 535 540

Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly Ala Cys

545 550

<210>2

<211>1755

<212>DNA

<213>Fab-LDP

<400>2

atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaac 60

gcgtacgctg acatcgagct cactcagtct ccagcaatcc tgtctgcatc tccaggggag 120

aaggtcacaa tgacttgcag ggccagctca agtgtaagtt acatgctctg gtaccagcag 180

aagccaggat cctcccccaa accctggatt tatgccacat cccacctggc ttctggagtc 240

cctactcgct tcagtggcag tgggtctggg acctcttact ctctcacaat cagcagagtg 300

gaggctgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga ctagtaaccc acccacgttc 360

ggtgctggga ccaaggtgga gatcaaacgg cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420

ttcccgccat ctgatgacca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg tcaggtgaag 720

ctgcagcagt caggggctga gctggtgaag cctggggcct cagtgaagat gtcctgcaag 780

gcttctggct acacatttat cagttacaat atgcactggg taaagcagac acctggacag 840

ggcctggaat ggattggagg tatttatcca ggaaatggtg atacttccta caatcagaaa 900

ttcaaaggca aggccacatt gactgcagac aaatcctcca gcgcagccta catgcagctc 960

agcagcctga catctgagga ctctgcggtc tattactgtg caagatggaa ctatggtaac 1020

ttcggggggg gtactatgga ctactggggc caagggatca cggtcaccgt ctcctcagcc 1080

tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 1140

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 1200

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 1260

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 1320

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtcg acaagaaagt tgagcccaaa 1380

tcttgtgaca aaactcacac aggtggcggt ggcagcgcgc ccgccttctc cgtcagtccc 1440

gcctcgggtc tgagtgacgg acagagcgtg tcggtgtcgg tcagcggtgc cgccgccggc 1500

gagacctact acatcgccca gtgcgctccg gtcggtggcc aggacgcgtg caacccggcg 1560

accgcgacgt ccttcaccac ggacgcgtcc ggagcggcgt cgttcagctt cgtcgtgcgc 1620

aagtcgtaca cgggctccac gcccgaaggc acgccggtcg gcagcgtcga ctgcgccacg 1680

gccgcctgta acctcggcgc cggcaactcc gggctcgacc tcggccacgt ggctctgacc 1740

ttcggcgcat gctga 1755

<210>3

<211>390

<212>PRT

<213>ScFv-LDP

<400>3

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Val Phe Ser

1 5 10 15

Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala

20 25 30

Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

35 40 45

Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro

50 55 60

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp

65 70 75 80

Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp

85 90 95

Lys Ser Ser Ser Ala Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu

100 105 110

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Asn Tyr Gly Asn Phe Gly

115 120 125

Gly Gly Thr Met Asp Trp Gly Gln Gly Ile Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Leu

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala

195 200 205

Thr Ser His Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp

225 230 235 240

Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr Phe

245 250 255

Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Glu Phe

260 265 270

Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly Gln

275 280 285

Ser Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr

290 295 300

Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn Pro Ala

305 310 315 320

Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser Phe Ser

325 330 335

Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly Thr Pro

340 345 350

Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly Ala Gly

355 360 365

Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Glu

370 375 380

His His His His His His

385 390

<210>4

<211>1176

<212>DNA

<213>ScFv-LDP

<400>4

atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaac 60

gcgtacgctc aggtgaagct gcagcagtca ggggctgagc tggtgaagcc tggggcctca 120

gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggctac acatttatca gttacaatat gcactgggta 180

aagcagacac ctggacaggg cctggaatgg attggaggta tttatccagg aaatggtgat 240

acttcctaca atcagaaatt caaaggcaag gccacattga ctgcagacaa atcctccagc 300

gcagcctaca tgcagctcag cagcctgaca tctgaggact ctgcggtcta ttactgtgca 360

agatggaact atggtaactt cggggggggt actatggact actggggcca agggatcacg 420

gtcaccgtct cctcaggagg cggtggctcg ggtggcggtg gatccggcgg tggcggttcg 480

gacatcgagc tcactcagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 540

atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgctct ggtaccagca gaagccagga 600

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tcccacctgg cttctggagt ccctactcgc 660

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 720

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg actagtaacc cacccacgtt cggtgctggg 780

accaaggtgg agatcaaagg tggaggcggt tcagaattcg cgcccgcctt ctccgtcagt 840

cccgcctcgg gtctgagtga cggacagagc gtgtcggtgt cggtcagcgg tgccgccgcc 900

ggcgagacct actacatcgc ccagtgcgct ccggtcggtg gccaggacgc gtgcaacccg 960

gcgaccgcga cgtccttcac cacggacgcg tccggagcgg cgtcgttcag cttcgtcgtg 1020

cgcaagtcgt acacgggctc cacgcccgaa ggcacgccgg tcggcagcgt cgactgcgcc 1080

acggccgcct gtaacctcgg cgccggcaac tccgggctcg acctcggcca cgtggctctg 1140

accttcggcc tcgagcacca ccaccaccac cactga 1176

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>Anti-CD20Fab’上游引物P1

<400>5

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc 30

<210>6

<211>39

<212>DNA

<213>CD20Fab’下游引物P2

<400>6

cgcgctgcca ccgccacctg tgtgagtttt gtcacaaga 39

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>LDP上游引物P3

<400>7

acaggtggcg gtggcagcgc gcccgccttc tccgtc 36

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>LDP下游引物P4

<400>8

gcgcgcatgc tcagccgaag gtcagagcca c 31

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>重链可变区(VH)5’端引物PH1

<400>9

caaacgcgta cgctcaggtg aagctg 26

<210>10

<211>58

<212>DNA

<213>重链可变区(VH)3’端引物PH2

<400>10

accgccggat ccaccgccac ccgagccacc gcctcctgag gagacggtga ccgtgatc 58

<210>11

<211>58

<212>DNA

<213>轻链可变区(VL)5’端引物PL1

<400>11

ggctcgggtg gcggtggatc cggcggtggc ggttcggaca tcgagctcac tcagtctc 58

<210>12

<211>58

<212>DNA

<213>轻链可变区(Vt)3’端引物PL2

<400>12

gagcatgctc agtggtggtg gtggtggtgc tcgagtttga tctccacctt ggtcccag 58

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>引物P5

<400>13

cagcatatga acgcgtacgc tcaggtgaag 30

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>引物P6

<400>14

cgcgaattct gaaccgcctc cacctttgat ctccaccttg gt 42

<210>15

<211>32

<212>DNA

<213>引物P7

<400>15

cggaattcgc gcccgccttc tccgtcagtc cc 32

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>引物P8

<400>16

ccgctcgagt cagccgaagg tcagagccac gtg 33

Claims

1.融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.强化融合蛋白，其是在权利要求1所述的融合蛋白上功能性地

结合有式(I)所示结构的发色团AE：

3.核酸分子，其是编码权利要求1所述的融合蛋白的基因，其选自下述序列之一：

(a)SEQ ID NO：2所示的编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(b)因为密码子简并性而分别与SEQ ID NO：2不同、但是编码与SEQ ID NO：1所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。

4.载体，其可操作地连接有权利要求3所述的核酸分子。

5.权利要求4的载体，所述载体是质粒。

6.宿主菌，其包含权利要求4所述的载体。

7.权利要求6的宿主菌，其是保藏号为CGMCC No.3125，于2009年06月17日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的名为IHPAYZ的大肠埃希氏菌。

8.制备权利要求2所述的强化融合蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)将抗CD20抗体的Fab基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到质粒pCANTAB 5E中，得到重组表达质粒pCANTAB5E-Fab-LDP，

(b)在大肠杆菌HB2151中的诱导表达SEQ ID NO：1所示的融合蛋白Fab-LDP，

(c)纯化及复性步骤(b)中获得的融合蛋白，

(d)使步骤(c)中获得的融合蛋白与权利要求2中所述的式(I)的发色团组装，

9.药物组合物，其中含有药学有效量的权利要求1所述的融合蛋白或者权利要求2所述的强化融合蛋白，任选地，还含有药学上允许的佐剂。

10.权利要求1所述的融合蛋白或者权利要求2所述的强化融合蛋白在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途。

11.权利要求10的用途，所述药物用于靶向杀伤淋巴瘤细胞。

12.权利要求11的用途，其中的淋巴瘤是裸鼠淋巴瘤或者人B细胞淋巴瘤。