CN109957591A - 双靶向配体化力达霉素dtll的制备工艺改进和质量标准制定 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫融合蛋白DTLP的和双靶向配体化力达霉素DTLL的制备工艺改进和质量标准制定，主要包括：筛选高产的转化宿主菌株、改变发酵菌体起始密度，缩短诱导后发酵时间等表达条件；改用压力破碎法破碎菌体提取总的可溶性蛋白，大大提升了目的融合蛋白的提取产率；进行目的融合蛋白的中试发酵条件优化，为工业化规模生产提供前期数据和参考标准；优化了制备工艺，针对细菌内毒素进行去除，对冻干样品的稳定性进行了有效监测。

Description

双靶向配体化力达霉素DTLL的制备工艺改进和质量标准制定

技术领域：

本发明涉及生物制药领域，具体涉及新型抗肿瘤靶向药物的制备工艺方法改进和符合临床申报要求的更高质量控制标准的药物产品。

背景技术：

力达霉素(Lidamycin，LDM)也称C-1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株链霉菌(Streptomyces globisporus，菌种保藏号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物试验表明，LDM对小鼠结肠癌26有非常显著的疗效，对人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693等多种人移植瘤均有较好疗效[中国抗生素杂志1994，19(2)：164-168]。LDM由辅基蛋白(LDP)和烯二炔结构的发色团(AE)两部分组成，发色团是力达霉素分子的活性部分，辅基蛋白对发色团起稳定保护作用。LDM的发色团和辅基蛋白系通过非共价键结合，因而可在体外将其拆分与重建。LDM以其独特的分子结构，成为构建新型导向药物的理想“弹头”[中国医学科学院报2001，23(6)：563-567]。

本研究所根据力达霉素的结构和生物学特性,前期构建并制备了抗肿瘤治疗作用的双特异性寡肽-力达霉素强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE(专利公开号：CN101497666A)。该强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE由靶向EGFR的寡肽、力达霉素辅基蛋白、靶向HER2的寡肽以及力达霉素活性发色团四部分组成。前期的体内外试验初步证实，同LDM相比，其可特异性靶向肿瘤细胞而发挥高效抗肿瘤活性[Clin Cancer Res.2010Apr 1；16(7):2085-94]。

然而,之前的强化融合蛋白制备方法具有以下缺点和不足：采用渗透压震惊法提取细菌周质腔蛋白，每升发酵液提取融合蛋白低于10mg，产率低不适合于大规模工业发酵制备；融合蛋白Ec-LDP-Hr纯度较低，仅达到95.3％；缺乏融合蛋白Ec-LDP-Hr与LDM发色团的组装效率检测，不利于不同批次间产品质量差异的控制；融合蛋白产品未经去除内毒素处理；对产品稳定性未进行有效监测及制定客观精准的质量控制标准。这制约着产品的工业化制备，难以符合临床申报所需的高质量控制标准的要求，影响未来药物产品的临床应用。

为了解决上述问题，发明人在上述专利申请涉及的强化融合蛋白的基础上进行系统的制备工艺条件的优化，主要包括(1)筛选高产的转化宿主菌株、改变发酵菌体起始密度，缩短诱导后发酵时间等表达条件；(2)通过表达定位分析、氨基酸测序验证以及表达定量分析表明，每升发酵液最高可获得约30mg目的蛋白；(3)改用压力破碎法破碎菌体提取总的可溶性蛋白，大大提升了目的融合蛋白的提取产率；(3)将镍柱亲和纯化蛋白经过purifier凝胶层析再次纯化，大大提高了目的蛋白纯度(99.7％)，利于后续试验和药品质控；(4)进行目的融合蛋白的中试发酵条件优化，为工业化规模生产提供前期数据和参考标准；(5)优化了制备工艺，对分离发色团所得的含量和组装效率进行定量检测，并制定制备工艺标准；(6)针对细菌内毒素进行去除，使产品符合注射剂的内毒素含量标准；(7)对冻干样品的稳定性进行了有效监测。从而，对多项制备工艺步骤进行改进和客观分析评估，更符合临床申报所需的高质量控制标准的要求。

本发明中将作为药物的中间产品的免疫融合蛋白命名为DTLP，其为SEQ ID药物NO.1所示序列编码的蛋白质，将作为最终产品的双靶向配体化力达霉素命名为DTLL，其为SEQ ID药物NO.1所示序列编码的蛋白质与下述化学式(I)所示的发色团的组装产物。

发明内容

本发明涉及的制备工艺改进技术方案包括以下步骤：

融合蛋白DTLP在大肠杆菌中的发酵条件优化；融合蛋白DTLP的提取和纯化；融合蛋白DTLP的中试发酵条件优化；双靶向配体化力达霉素DTLL的组装制备；双靶向配体化力达霉素DTLL的内毒素去除；双靶向配体化力达霉素DTLL的稳定性监测。

具体而言，本发明的一个技术方案如下：

融合蛋白DTLP在大肠杆菌中的发酵条件优化：将菌株pET-Ec-LDP-Hr(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：CGMCC No.2846)培养基中培养，提取质粒转化至大肠杆菌宿主菌BL21starTM(DE3)、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLySs中，分别得到转化菌株。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导5小时后，离心收集1ml发酵液中菌体，制备全菌体蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分析融合蛋白在不同菌株中表达情况。结果表明融合蛋白DTLP在BL21starTM(DE3)菌株中表达最高。根据诱导剂IPTG浓度、开始诱导菌体密度OD600、发酵温度以及诱导时间作为变量筛选出最佳的发酵条件为：接种后37℃培养至菌体OD600＝0.6时加入终浓度0.1mM IPTG继续培养6小时后离心收集菌体。

融合蛋白DTLP的提取：按照pET系统操作手册(Novagen公司)分别制备全细胞组分、培养液上清组分、周质腔组分、细胞质可溶性组分、包涵体组分，然后进行SDS-PAGE电泳分析融合蛋白的定位情况。结果表明，融合蛋白DTLP主要以可溶性形式存在于周质腔以及胞质可溶性组分中。SDS-PAGE分析结果显示，菌体诱导表达后，每升发酵液可获得目的蛋白30mg左右。本发明中采用了压力破碎法进行目的蛋白提取，可以较大幅度的提升收集提取的目的蛋白的产量。

融合蛋白DTLP的纯化：采用高压均质法破碎菌体提取总可溶蛋白。菌体总蛋白采用亲和层析法进行纯化，使用GE公司Histrap Ni2+柱和Healthcare Superdex TM75凝胶分子筛柱，按照GE公司的说明书进行操作。通过对融合蛋白纯度的控制提升产品。

双靶向配体化力达霉素DTLL的组装制备：融合蛋白DTLP与力达霉素发色团以分子摩尔比1:5比例进行组装，得到双靶向配体化力达霉素DTLL。对双靶向配体化力达霉素DTLL中LDM发色团进行定量并计算组装效率。通过组装效率对强化组装过程进行精确定量控制，使产品保持批次间质量的一致性，保障质量控制标准。。

双靶向配体化力达霉素DTLL的内毒素去除：细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上存在的一种脂多糖类物质。人体对内毒素极为敏感，极微量内毒素就能够引起人体体温的上升。而由大肠杆菌表达的融合蛋白DTLL中内毒素的去除与含量检测是控制产品质量的重要环节。本实验采用修饰后的多粘菌素B(PMB)作为配体的树脂特异性的去除融合蛋白中的内毒素，并采用光度测定法检测样品中内毒素含量。通过对内毒素去除和检测对产品安全质量进行监测。

双靶向配体化力达霉素DTLL的稳定性监测：采用HPLC检测蛋白纯度和发色团含量检测，采用细胞ELISA法和MTS法检测双靶向配体化力达霉素DTLL对肿瘤细胞的亲和活性和细胞毒活性，比较不同批次间双特异性融合蛋白DTLP在影响因素试验、加速试验和长期试验中的亲和活性和细胞毒活性差异。

发明效果：

本发明的优点在于提供了双靶向配体化力达霉素DTLL制备工艺的优化，在前法研究的基础上提升了产量，提高了纯度和组装效率，为双靶向配体化力达霉素DTLL的工业化发酵生产和制备保存提供了理论依据和方法。

附图说明：

图1：双靶向配体化力达霉素DTLL制备工艺流程图。

图2：不同宿主菌株中融合蛋白DTLP表达水平比较。

图3：不同IPTG诱导浓度对融合蛋白DTLP表达水平影响。

图4：不同开始诱导菌体OD600对融合蛋白DTLP表达水平影响。图5：不同发酵温度对融合蛋白DTLP表达水平影响。

图6：不同诱导时间对融合蛋白DTLP表达水平影响。

图7:融合蛋白DTLP诱导表达产物定位分析。

图8：菌体可溶性组分与不可溶组分N端氨基酸测序结果。

图9：融合蛋白DTLP在菌体表达量的定量SDS-PAGE分析。

图10：融合蛋白DTLP经Ni2+亲和层析纯化过程的SDS-PAGE分析。

图11：融合蛋白DTLP经purifier系统分子筛分离纯化过程。

图12：纯化后融合蛋白DTLP的HPLC蛋白质纯度分析。

图13：融合蛋白DTLP在发酵罐不同发酵时间表达含量的SDS-PAGE分析。

图14：强化组装后双靶向配体化力达霉素DTLL中发色团含量的HPLC分析。

图15：影响因素试验对双靶向配体化力达霉素DTLL细胞亲和活性的比较，其中：—对照组；—4℃放置5天；

—4500lux光照5天；—75％相对湿度放置5天。

图16：影响因素试验对双靶向配体化力达霉素DTLL细胞毒作用

其中：—对照组；—4℃放置5天；

—4500lux光照5天；—75％相对湿度放置5天。

图17：加速试验对双靶向配体化力达霉素DTLL细胞亲和活性的比较

其中：—对照组；—3个月；—1个月。

图18：加速试验对双靶向配体化力达霉素DTLL细胞毒作用

其中：—对照组；—3个月；—1个月。

图19：长期试验对双靶向配体化力达霉素DTLL细胞亲和活性的比较

其中：—对照组；—-80℃放置6个月；—-20℃放置3个月；—4℃放置7天；—4℃放置1个月。

图20：长期试验对双靶向配体化力达霉素DTLL细胞毒作用

其中：—对照组；—-80℃放置6个月；—-20℃放置3个月；—4℃放置7天；—4℃放置1个月。

具体实施方式：

以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>融合蛋白DTLP在不同大肠杆菌宿主菌中的诱导表达

将表达载体pET-DTLP(本实验室构建，菌种保藏号：CGMCC No.2846)分别转化至BL21starTM(DE3)(购买于Novagen公司)、BL21(DE3)(购买于北京全式金生物技术有限公司)、BL21(DE3)pLySs中(购买于北京全式金生物技术有限公司)。从平板上挑取一个单克隆接种至10ml LB培养基(含有卡那霉素50μg/ml)中，37℃摇床振荡培养过夜。次日将10ml菌液转接至1L LB培养基(含有卡那霉素50μg/ml)中，37℃摇床继续振荡培养至OD600＝0.5加入终浓度为0.1mM IPTG诱导6小时。取1ml菌液在4℃、5,000g离心10分钟收集菌体并用PBS重悬，菌体在加入终浓度100μg/ml溶菌酶，37℃孵育10分钟，再加入含有1％SDS的5×蛋白上样缓冲液，沸水浴充分变性。收集获得多种表达载体pET-DTLP转化的不同类型的大肠杆菌宿主菌株的总蛋白样品，15％的SDS-PAGE电泳分析结果表明，DTLP融合蛋白在BL21starTM(DE3)中目的蛋白表达水平最高，并以此为起始表达菌株(图2)。进而对影响表达产量的各个条件：温度(28℃、30℃、37℃)、菌体起始密度(OD600＝0.1、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、1.8)、IPTG浓度(0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1mM)，诱导表达时间(3小时、4小时、5小时、6小时、7小时)分别进行了系统性的条件优化，最终确定最佳发酵表达条件为：在温度37℃培养，发酵至菌体起始密度OD600＝0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导6小时后以5000×g离心收集菌体。(图3-6)。前文专利中具体发酵条件为：温度37℃、菌体起始密度OD600＝2、IPTG终浓度为0.1mM、诱导时间8小时。因此，经优化后改变菌体起始密度，可以在更短时间内诱导表达出更多融合蛋白。

<实施例2>融合蛋白DTLP表达产物定位分析

按照pET系统操作手册中的步骤，分别制备全细胞组分、培养液上清组分、周质腔组分、细胞质可溶性组分和包涵体组分，15％SDS-PAGE分析结果表明，DTLP融合蛋白在经诱导的菌体在周质腔和胞质可溶性组分中表达分子量约为20kDa的蛋白，在包涵体组分中表达分子量约为25kDa的蛋白，而未经诱导的菌体则无此两条带(图7)。转印蛋白至PVDF膜后裁切相应条带进行N端氨基酸测序验证(图8)。测序结果验证20kDa处蛋白为目的融合蛋白DTLP，25kDa处蛋白可能为带有信号肽pelB序列、未能正确折叠的融合蛋白。SDS-PAGE分析菌体总蛋白含量，使用纯化后的DTLP蛋白使用BCA法定量后上样。考马斯亮蓝染色后以对应条带灰度值绘制标准曲线(y＝7.6158x-0.714；R2＝0.9907)，代入菌体总蛋白中对应条带灰度值，得到菌体中DTLP蛋白含量。换算后每升发酵液可得到29.63mg融合蛋白DTLP(图9)。而前文提及的专利未对诱导表达的融合蛋白进行定性和定量检测。

<实施例3>融合蛋白DTLP的提取与分离纯化

取保存于-80℃低温冰箱的重悬菌体(来自实施例1制备的产品)于冰上缓慢融化，加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM于冰上保存。

采用压力破碎法，以高压均质仪4℃16kPSI破碎菌液，4℃12,000×g离心30min，取离心上清溶液经0.45μm滤器过滤冰上保存。

过滤后上清液加入结合缓冲液调整至终浓度含20mM咪唑。，将破菌上清溶液通过镍柱进行亲和层析。分别流过含50mM、70mM、200mM的洗脱缓冲液，分步收集流出液。

将各部分的流出液各取50μl进行SDS-PAGE电泳(图10)分析，收集含目的蛋白的洗脱液并超滤置换(3K孔径，Millipore公司)缓冲环境为PBS(20mM，pH7.4)

粗提取蛋白使用purifier凝胶层析系统经预装分子筛色谱柱(GEHealthcare Superdex TM75 10/300GL)进行再次纯化分离。选择PBS缓冲液(20mM，pH7.4)作为色谱流动相，调整流速到1ml/min，在UV 280nm检测分离过程中蛋白流出情况(图11)。

通过分子筛色谱分离，收集保留体积在12ml的信号峰流出液，经HPLC检测蛋白纯度为99.7％(图12)。(对照例1)本发明中，同时采用压力破碎法和前文专利提及的渗透压震惊法，对比提取融合蛋白DTLP的产量。以100ml高渗溶液(30mmol/L Tris-Hcl，1mmol/LEDTA，20％蔗糖ph8.0)重悬菌体，室温下缓慢搅拌10min，离心后用80ml预冷的双蒸水重悬菌体，4度缓慢搅拌10min，离心收集上清液后经0.45μm滤膜过滤，按步骤3-5所示进行纯化，结果如表1所示。前文专利所使用的渗透压震惊法由于仅可以提取周质腔中蛋白，获得目的蛋白量很少；而本发明中采用了压力破碎法，可通过破碎菌体，提取总可溶性蛋白来提升目的融合蛋白产量。与较渗透压震惊法相比，提取总蛋白含量和融合蛋白含量均有明显优势。此外，经镍柱亲和层析纯化后蛋白通过使用purifier凝胶层析系统，进行再次纯化分离，较之前专利中的纯化方法(获得的蛋白纯度仅为95.3％)，大大提高了蛋白纯度(99.7％)，更利于后续试验和药品质控。

表1压力破碎法与渗透压震惊法提取融合蛋白DTLP含量比较

<实施例4>融合蛋白DTLP中试发酵条件优化

以2％种子菌分别接种到7L、30L、100L发酵罐中(均为New BrunswickTMBioreactor)，含LB培养基5L、13L、70L，分别进行中试发酵条件的筛选，以卡那霉素50μg/ml，转速200rpm，实时检测OD600和pH值。筛选条件分别为开始诱导菌体浓度(以OD600值为准)、IPTG诱导剂终浓度、诱导时间和诱导温度，发酵终止条件为菌体停止生长，具体条件于结果见表2。结果显示，含5L培养基的发酵罐虽然每升发酵液中菌体含量高，但诱导表达的目的融合蛋白含量较低，且纯化后蛋白收率同开始诱导菌体密度呈反比关系，证明菌体密度较低的条件更适合于融合蛋白的表达；而利用含70L培养基的发酵罐对诱导温度和诱导剂浓度条件进行筛选的结果表明，温度和诱导剂浓度不是影响菌体表达的主要因素，虽然大规模培养能够收集到大量菌体，却未能检测出目的融合蛋白DTLP的表达，可能是由于大量营养用于菌体剧烈生长导致。同时也提示我们简单的扩大培养可能更不利于发酵条件的控制和蛋白的表达。因此，只有在合适的发酵体系和恰当时机加入诱导剂IPTG可以在保证菌体密度水平的同时，将培养基营养更多地用于融合蛋白的表达。

根据上述筛选结论，我们进一步选用13L培养基发酵方案，在37℃培养，接种后OD600值到达0.4-0.5之间时加入诱导剂IPTG(终浓度0.1mM)。发酵程序设置补充氨水调整pH维持在7.0。诱导后每小时检测OD600至菌体停止生长(约4小时)并分别收集1ml发酵罐中发酵液，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析。如表2所示，每升发酵液可收集菌体2.54g，提取纯化后可获得每升2.61mg的融合蛋白DTLP，较最初5L的发酵方案的产量提升4倍以上。

表2中试发酵条件优化筛选每升发酵液纯化蛋白

*：—表示未检测到融合蛋白DTLP

发酵中试中，目的融合蛋白的表达量在诱导4小时后到达平台期(图13)。以30L发酵罐体系分别进行发酵操作三次平行试验(表3)，纯化后可获得融合蛋白DTLP 34.62mg±2.23mg。

表3三批次发酵中试提取纯化结果

(对照例2)本发明中，另取之前专利(专利公开号：CN101497666A)所获的制备工艺改进前的菌株，在上述相同条件下进行两次中试发酵试验。结果显示，两次发酵试验共获得菌体50g，破碎菌体后以Ni+亲和层析提取纯化，共获得粗提取融合蛋白12mg，平均可获得融合蛋白DTLP仅为6mg左右，是本发明最终纯化后获得DTLP(34.62mg)产量的1/6强。以上结果显示，相比于之前专利，本发明对筛选提取等制备工艺改进后，能够大幅度提升DTLP的产率和纯度，具有明显的效果和优势。

<实施例5>双靶向配体化力达霉素DTLL的组装制备

取高活性的力达霉素纯品(专利号：00121527.2)，配置成0.025mg/ml，0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml溶液，经C4柱Jupiter C4 250mm x 4.0mm300)检测，流动相为水：乙腈：三氟乙酸(75％：25％：0.025％)，检测350nm处的吸光值，根据发色团的积分峰面积绘制标准曲线公式y＝1054x-12.461。

另取高活性的力达霉素纯品(专利号：00121527.2)，经C4柱(Jupiter C4 150mmx10.0mm300)分离活性发色团，流动相为水：乙腈：三氟乙酸(75％：25％：0.025％)，检测350nm处的吸光值，收集发色团。

将实施例2纯化后得到的DTLP融合蛋白调整浓度到2mg/mL。按照力达霉素发色团：融合蛋白＝5：1分子摩尔比混合，混合物避光4℃旋转混合16小时充分组装。

组装后得到的混合液经3K孔径的超滤管浓缩，加入10mL 4℃预冷PBS缓冲液(20mM，pH7.4)继续超滤4-5次，至超滤下层溶液经HPLC检测无发色团信号，以完全去除多余未组装发色团。

取双靶向配体化力达霉素DTLL经BCA法检测蛋白浓度，将其配置成0.2mg/mL蛋白溶液。使用C4反相色谱柱(Jupiter C4 250mm x 4.0mm300)进行发色团含量检测。流动相为水：乙腈：三氟乙酸(75％：25％：0.025％)，检测350nm处的吸光值(图14)。

将检测的到的发色团峰自动积分面积代入标准曲线公式y＝1054x-12.461，得到样品融合蛋白DTLL中对应的等效力达霉素浓度的发色团含量并计算组装效率。计算公式为：组装效率(％)＝等效发色团的利达霉素浓度÷力达霉素分子质量/(融合蛋白浓度÷融合蛋白分子质量)。3次强化组装实验计算双靶向配体化力达霉素DTLL的组装效率为68.33％±7.12％。然而，之前的专利未对以上所述发色团的定量及组装效率进行检测。

<实施例6>双靶向配体化力达霉素DTLL的内毒素去除

细菌内毒素是革兰氏隐形菌细胞壁上存在的一种脂多糖类物质。人体对内毒素极为敏感，极微量内毒素就能够引起人体体温的上升。而由大肠杆菌表达的融合蛋白DTLL中内毒素的去除与含量检测是控制产品质量的重要环节。本实验采用修饰后的多粘菌素B(PMB)作为配体的树脂特异性的去除实施例3的融合蛋白中的内毒素，并采用光度测定法检测样品中内毒素含量。

内毒素去除和检测试剂购买于南京金斯瑞生物科技有限公司(ToxinEraserTM内毒素去除试剂盒/Cat.No.L00338；ToxinSensorTM Chromogenic LAL Endotoxin AssayKit/Cat.No.L00350)。按试剂盒说明书处理层析柱后，避光4℃条件下将双靶向配体化力达霉素DTLL上样，并补充无热源PBS缓冲液冲洗。收集2倍上样体积的流出液待测。

除内毒素前后样品经BCA定量后分别稀释样品1μg/ml待检测。

取内毒素标准溶液分别配制成0.1EU/mL、0.05EU/mL、0.025EU/mL和0.01EU/mL。分别取四支标准品溶液、三支待测样品与除内毒素后样品加100μL无内毒素水后，加入无内毒素处理的试管。

另按试剂盒说明书操作，取反应完成后的样品200μl加入96孔板，使用酶标仪在545nm处检测吸光度，并使用蒸馏水调零。根据标准溶液吸光度绘制标准曲线y＝3.081x-0.0075(R2＝0.99476)，将样品吸光度代入获得内毒素含量，乘以稀释倍数获得样品内毒素含量。

去除内毒素试验结果(表4)显示，1mg双靶向配体化力达霉素DTLL样品去除内毒素后含内毒素为6.3±0.047EU。根据中国药典关于生物制品中注射剂内毒素限值计算公式L＝K/M(K＝5EU/(kg·h))，结合双靶向配体化力达霉素DTLL在昆明小鼠最大耐受剂量为0.438mg/kg，计算得到内毒素限值L＝5EU/(kg·h)÷0.438mg/kg＝11.416EU/mg。样品去除内毒素后，符合药典关于内毒素含量的相关规定。而前文专利未针对内毒素进行有效地检测和去除，不利于进行后续的药品研究、工业化规模生产和临床应用。

综合<实施例1>至<实施例>相关制备工艺方法得到双靶向配体化力达霉素DTLL的发酵、制备相关指标如表5所示。

表4双靶向配体化力达霉素DTLL样品内毒素含量测定结果(n＝3)

表5每升发酵液制备双靶向配体化力达霉素DTLL的质量标准(n＝3)

<实施例7>双靶向配体化力达霉素DTLL稳定性的影响因素试验评价

pH值测定：实施例4的产品加蒸馏水配置成0.1mg/ml溶液，使用METTLER TPLEDOSevenEasy pH计检测样品溶液pH值。

发色团含量测定：实施例4的产品加蒸馏水配置成0.1mg/mL溶液。使用C4反相色谱柱(Jupiter C4 250mm x 4.0mm300)经HPLC进行发色团含量检测，上样体积100μl。色谱条件：流动相25％乙腈/75％水；流速1mL/min；在UV 340nm波长下检测发色团含量。检测结果经自动积分，计算有效发色团和芳构化发色团的比例。

蛋白纯度测定：实施例4的产品加蒸馏水配置成0.1mg/mL溶液，使用分子筛凝胶色谱柱(Phenomenex BioSep-Sec-s 3000)经HPLC进行蛋白纯度测定，上样体积100μl。选择PBS缓冲液(20mM，pH7.4)作为色谱流动相，调整流速至1ml/min；在UV 280nm检测蛋白纯度。检测结果经自动积分，采用面积归一化法计算纯度。

ELISA法检测细胞亲和活性测定：取对数生长期的MIA-paca-2细胞以30000个细胞/孔密度接种于96孔板中，37℃、5％CO2条件下培养24小时至细胞完全贴壁并铺满孔底。用预冷的0.05％戊二醛固定细胞后封闭，PBST洗三次后，在37℃孵育不同浓度的双靶向配体化力达霉素DTLL样品2小时，PBST洗后37℃分别孵育His一抗和标有辣根过氧化物酶的二抗各2小时，最后加入底物反应液100μL(TMB显色液)和终止液100μl(H2SO4，2mol/L)，用酶标仪测定450nm处吸光度。

细胞毒活性测定：取对数生长期的MIA-paca-2细胞以5000个细胞/孔密度接种于96孔板中，37℃、5％CO2培养24小时后吸弃培养液，加入以培养液稀释的不同浓度的双靶向配体化力达霉素DTLL样品，继续培养48小时后，每孔加入MTS反应液20μl，37℃继续培养1小时后，在酶标仪上测定450nm处的吸光值。每次实验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔，按下面公式计算细胞的存活率：细胞存活率＝(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％

高温试验：实施例4的产品在包装条件下，开口置密封容器中，在40℃温度下放置5天取样，考察上述项目1-5内容。

高湿度试验：实施例4的产品在包装条件下，开口置于干燥器中，下部放置氯化钠饱和溶液(相对湿度75％)，在25℃温度下放置5天取样，考察上述项目1-5内容，同时通过准确称量试验前后供试品的重量，考察供试品的吸湿潮解性能。

强光照射试验：实施例4的产品在包装条件下，开口放在装有日光灯的光照箱中，于照度4500lx的条件下放置5天取样，考察上述项目1-5内容。

影响因素试验结果显示，高温、高湿度、强光照射均对双靶向配体化力达霉素DTLL的亲和活性与细胞毒活性造成不同水平的降低。样品高湿度试验检测吸湿增重15.70％(表6)。高温试验组融合蛋白的亲和活性与对照组相比有显著降低(P<0.5)(图15)，蛋白纯度相较对照组降低至29.4％(表7)；高湿度试验组与强光照射试验组在细胞毒活性与对照组相比有显著降低(P<0.5)(图16)，发色团含量分别从对照组80.4％降低至35.3％和25.7％(表7)。

表6高湿度试验样品吸湿增重结果

表7影响因素试验测定发色团含量和蛋白纯度结果

但是，前文专利未涉及药品影响因素试验的相关内容，未监测高温、高湿度、强光照射等因素对DTLL的亲和活性与细胞毒活性是否造成改变，不利于进行后续的药品研究、工业化规模生产和临床应用。

<实施例8>双靶向配体化力达霉素DTLL稳定性的加速试验稳定性评价

实施例4的产品在包装条件下，扣紧瓶口，置于干燥器中，下部放氯化钠饱和溶液(相对湿度75％)，密闭容器置于25℃的恒温箱中，分别在第1个月、3个月末取样一次，按稳定性考察项目(<实施例6>步骤1-5)进行检测。

加速试验结果显示，在实验组条件下保存1个月和3个月以对双靶向配体化力达霉素DTLL的亲和活性与细胞毒活性降低，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)(图17；图18)。1个月后有效发色团含量降低至18.83％±3.13％；3个月后有效发色团含量降低至7.57％±1.39。蛋白质纯度检测均未检测到与标准品出峰时间一致的蛋白峰(表8)。而前文专利未涉及DTLL加速试验的稳定性监测的相关内容。

表8加速性试验测定发色团含量和蛋白纯度结果

*：－代表未检测到出峰时间一致的蛋白峰

<实施例9>双靶向配体化力达霉素DTLL稳定性的长期试验稳定性评价

用3批样品进行稳定性考察。长期实验考察4℃7天、4℃1个月、-20℃3个月、-80℃6个月条件下供试品放置的稳定性，按稳定性考察项目(<实施例6>步骤1-5)进行检测。

长期试验结果显示，4℃保存7天和一个月样品细胞亲和活性和细胞毒活性均有显著性降低(P<0.05)(图19；图20)，其蛋白质纯度和有效发色团含量均有显著性降低(表9)。而-20℃3个月条件保存对样品活性和纯度有影响但未见显著性差异。-80℃6个月条件下保存对样品活性和纯度基本无影响。前文专利未涉及DTLL产品加速试验的稳定性监测的相关内容。

表9长期实验测定发色团含量和蛋白纯度结果

结论：与之前制备方法相比，本发明中对于融合蛋白DTLP的制备工艺进行改进，明显由以前每升发酵液不足10mg的产量提升至每升发酵液可得到29.63mg，提高了DTLP的纯度高达99.7％；进而通过中试发酵的条件优化，最终以30L发酵罐条件进行三次平行试验，以提供未来工业化规模生产的最佳优化条件；获得了具备稳定组装效率68.33％的双靶向配体化力达霉素DTLL；此外，本发明中的DTLL药品，经内毒素去除后符合中国药典相关规定，同时系统监测了DTLL的冻干样品的稳定性等。本发明对多项制备工艺步骤进行优化改进和客观分析评估，使其制备工艺流程具有严格的质量控制标准，更适合进行DTLP的工业化发酵生产和DTLL的稳定组装制备，符合临床申报所需质控的更高要求。

序列表

<110> IDC170213

<120> 双靶向配体化力达霉素DTLL的制备工艺改进和质量标准制定

<141> 2017-12-11

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 182

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ala Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg

1 5 10 15

Glu Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Ser Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp

35 40 45

Gly Gln Ser Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr

50 55 60

Tyr Tyr Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn

65 70 75 80

Pro Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser

85 90 95

Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly

100 105 110

Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly

115 120 125

Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Asp Val Gly Tyr Cys

145 150 155 160

Thr Asp Arg Ser Cys Ala Lys Trp Pro Glu Trp Leu Gly Val Leu Glu

165 170 175

His His His His His His

180

Claims (6)

1.SEQ ID NO.1所编码的融合蛋白DTLP的表达方法，其包括：

(1)当发酵罐或者培养瓶不大于3L时，采用含有将表达载体pET-DTLP的BL21starTM(DE3)为初始菌株，制备8-10ml种子液，接种至0.8L-1.5L的LB培养基中，培养基中含有卡那霉素50μg/ml，37℃摇床继续振荡培养至OD600＝0.5-0.6加入终浓度为0.1mM IPTG诱导6-8小时；或

(2)当发酵罐25L-35L时，采用含有将表达载体pET-DTLP的BL21starTM(DE3)为初始菌株，制备种子液，接种至12L-15L的LB培养基中，所述培养基含有卡那霉素50μg/ml，37℃发酵培养至OD600＝0.4-0.6加入终浓度为0.1mM IPTG诱导3.5-4.5小时。

2.双靶向配体化力达霉素DTLL的制备流程工艺改进方法，其包括权利要求1的(1)或者(2)，进一步包括采用压力破碎法破碎菌体提取总可溶蛋白。

3.权利要求2的工艺改进方法，其进一步包括发色团的制备和组装、内毒素去除和检测步骤。

4.权利要求2的工艺改进，其新增了检测蛋白粗提取物蛋白质含量、纯化后免疫融合蛋白DTLP蛋白质含量、DTLP蛋白质纯度；DTLL的最终产量、组装效率以及内毒素含量的步骤。

5.权利要求4的工艺改进方法，其进一步包括DTLL的稳定性检测。

6.权利要求5的工艺改进方法，其中双靶向配体化力达霉素DTLL的稳定性检测包括：影响因素考察、加速试验考察和长期实验考查；还包括DTLL的pH值、蛋白质纯度、力达霉素发色团含量测定、细胞亲和活性与细胞毒活性测定。