CN110256578B - 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用 - Google Patents

植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110256578B
CN110256578B CN201910549741.8A CN201910549741A CN110256578B CN 110256578 B CN110256578 B CN 110256578B CN 201910549741 A CN201910549741 A CN 201910549741A CN 110256578 B CN110256578 B CN 110256578B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fusion protein
subunit
cholera toxin
plant
proinsulin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910549741.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110256578A (zh
Inventor
王跃驹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ruicheng Biotechnology (Shandong) Co.,Ltd.
Original Assignee
王跃驹
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 王跃驹 filed Critical 王跃驹
Priority to CN201910549741.8A priority Critical patent/CN110256578B/zh
Publication of CN110256578A publication Critical patent/CN110256578A/zh
Priority to PCT/CN2020/089982 priority patent/WO2020259110A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110256578B publication Critical patent/CN110256578B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用。本发明利用植物例如生菜作为重组蛋白质生产的有效表达平台，利用简单以及高效的表达体系生产生物活性物质。随后将生产该活性物质的叶片冻干制成胶囊。此胶囊可以在常温保存而保持生物活性。利用Western Blot蛋白杂交法确定降糖活性蛋白成功表达。生物活性测试结果表明利用该平台技术生产的降糖胶囊显著降低了狗血液中的血糖浓度。

Description

植物生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与胰岛素原的融合蛋白速效 口服降糖胶囊的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用。
背景技术
糖尿病是以慢性高血糖为特征的常见病、多发病，是由体内胰岛素分泌或作用缺陷，或二者同时存在而引起的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱。临床上主要有胰岛素依赖型(IDDM，I型)和非胰岛素依赖型(NIDDM，II型)两种类型。随着生活水平提高，无论在发达国家还是在发展中国家，糖尿病的发病率都在逐年上升。糖尿病作为一种严重的非传染性慢性疾病现已成为全世界各国密切关注的重大公共卫生问题之一，是全球范围内继心血管和肿瘤疾病之后的第三号杀手。
2016年4月8日，国家卫生计生委宣传司官网上发表的一篇名为《中国糖尿病防治情况》的文章援引《中国居民营养与慢性病善报告》(2015年)的数据称，2012年中国18岁以上居民糖尿病患病率为9.7％，其中城市与农民的患病率分别为12.3％与8.4％，患者人数约为1亿，18岁以上居民对糖尿病的知晓率为36.1％、治疗率为33.4％，控制率为30.6％。另外，2017年5月22日新近发布的《中国糖尿病膳食指南(2017)》援引2013年《美国医学会杂志》(JAMA)的研究结果称，中国成人糖尿病率的患病率已达11.6％。所有的糖尿病病例中，胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM，又称1型糖尿病，以往称“少年发病型糖尿病”)约占5～10％的比例，该型糖尿病患者因为内源性胰岛素分泌不足，从而需要长期的胰岛素治疗；另一种更常见的糖尿病是非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM，又称2型糖尿病，以往称“成年发病型糖尿病”)占90％以上的比例，也可使用胰岛素进行治疗。因此，虽然越来越多的口服降糖药应用于临床，胰岛素在糖尿病的治疗中仍然发挥着重要的作用。
根据Pharmarket数据库，2016年全国22个重点城市样本医院内甘精胰岛素、门冬胰岛素与精蛋白锌胰岛素的用药金额分别为5.46亿元、4.45亿元与2.60亿元。但目前糖尿病治疗领域仍存在着诸多尚待解决的重要问题，而且还存在一些副作用和限制。
Humalog是有礼来公司研发的一种赖脯胰岛素。赖脯胰岛素(Insulin Lispro)是由礼来制药公司于1996年推出的超短效人胰岛素类似物，用于糖尿病管理中的血糖控制。2000年，FDA将其适应证扩展至年龄3岁以上的儿童与年龄65以上成人的高血糖治疗。此外，赖脯胰岛素还与磺酰脲类药物联合用药。目前，赖脯胰岛素在美国、欧盟、加拿大、日本与中国等世界各国均有销售。赖脯胰岛素是基因工程产品，即将人胰岛素β-链上28位脯氨酸与29位赖氨酸互换而成的作用强度与人胰岛素相当，降糖效果相同，只是起效更加迅速且持续时间更短。赖脯胰岛素的作用机制同门冬胰岛素，15～20分钟内起效，30～60分钟达峰值，降糖作用持续4～5小时。可作为常规可溶性胰岛素的替代物，发挥速效降糖作用，属超短效胰岛素，也可与精蛋白结合作为中效制剂。
尽管Humalog在治疗糖尿病上有诸多优点，但它由于多肽类药物本身的性质以及人体对其产生的各种屏障，其常规给药途经一直以注射为主。本发明将CTB与Humalog融合表达，可以实现在口服给药，减轻病患长期频繁注射带来的痛苦。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了植物生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用。本发明对具有降糖作用的活性多肽进行结构改造和修饰，使其获得可通过肠道进行吸收并在体内达到有效治疗浓度的特性，并通过植物来生产该活性物质。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列。并且制成口服降糖胶囊。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白，其具有：
(Ⅰ)、如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或
(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或
(III)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列。
本发明还提供了编码所述融合蛋白的核苷酸，具有
(Ⅰ)、如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或
(Ⅱ)、如SEQ ID 2所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或
(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或
(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(V)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。
在上述研究的基础上，本发明还提供了表达载体，包括所述的核苷酸以及待转化载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述待转化载体为叶绿体表达载体。
此外，本发明还提供了所述的表达载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：分别将所述人霍乱毒素B亚基与Humalog胰岛素原的融合蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
步骤2：将所述核苷酸序列克隆到pUC57载体中，获得pHuma。
此外，本发明还提供了所述的表达载体或植物在表达人霍乱毒素B亚基与Humalog胰岛素原的融合蛋白或制备包含所述融合蛋白的药物中的应用；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为降糖的口服制剂。
本发明还提供了宿主，转化有所述表达载体的植物或微生物；所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。
在上述研究的基础上，本发明还提供了药物，包括所述的融合蛋白以及药学上可接受的辅料。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物为降糖的口服制剂。
本发明还提供了一种植物作为宿主表达人霍乱毒素B亚基与Humalog胰岛素原的融合蛋白的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎、提取，获得人霍乱毒素B亚基与Humalog胰岛素原的融合蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：
步骤1：准备转化用载体；
步骤2：准备微粒子弹；
步骤3：基因枪轰击；
步骤4：转换后培养、再生为植株。
本发明还提供了一种植物作为宿主制备降糖的药物的方法，将所述的表达载体用基因枪轰击叶片，在植物叶绿体中表达后获得再生植株，将植物叶片冻干粉碎、提取，获得人霍乱毒素B亚基与Humalog胰岛素原的融合蛋白，灌装。
在本发明的一些具体实施方案中，所述基因枪轰击包括如下步骤：
步骤1：准备转化用载体；
步骤2：准备微粒子弹；
步骤3：基因枪轰击；
步骤4：转换后培养、再生为植株。
植物叶绿体表达技术是利用基因枪轰击、同源重组的方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物叶绿体中，获得该基因植物叶绿体中高效表达的技术。与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。
本发明利用植物叶片，生产口服降糖胶囊。该降糖产品不需要注射，减轻病患的痛苦。生菜不含有植物有毒物质，而且本产品不需蛋白纯化流程，可以大大缩短生产周期和生产成本。
本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，叶绿体可以高效的表达活性蛋白。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其它植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统大规模生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示载体pHuma示意图；
图2示western-blot结果。
具体实施方式
本发明公开了一种植物生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了植物生产口服降糖胶囊的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列。并且制成口服降糖胶囊。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了植物作为宿主在表达人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列的应用。优选的，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。本发明还提供了一种表达载体，包括人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列序列以及载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列密码子优化为植物偏好的密码子。
在本发明的一些具体实施方案中，所述优化的人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列序列如SEQ ID No.1所示；所述优化的人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为植物叶绿体载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：
步骤1：将人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列的密码子优化为植物偏好的密码子；
步骤2：由金斯瑞进行基因合成克隆到pUC57载体中，获得pHuma克隆载体；
具体的，为了提供外源蛋白在植物中的高效表达，本发明将人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。并由金斯瑞克隆到pUC57载体中，获得pHuma载体(图1)。
本发明还提供了所述的表达载体在表达人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列中的应用。
将本发明提供的表达载体用基因枪轰击植物叶片，再生为植株后收获植物叶片并制成口服降糖胶囊。
本发明利用植物叶片，生产口服降糖胶囊。该降糖产品不需要注射，减轻病患的痛苦。生菜不含有植物有毒物质，而且本产品不需蛋白纯化流程，可以大大缩短生产周期和生产成本。
本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，叶绿体可以高效的表达活性蛋白。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其它植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统大规模生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列。
本发明提供的植物生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1叶绿体表达载体的构建
为了将外源蛋白在植物中的高效表达，将人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。
实施例2转化材料准备
将植物种子用无菌水浸泡过夜，用70％乙醇浸泡1分钟后用无菌水冲洗1次；再用2％NaClO(加0.1％Tween-20)处理15分钟，每5分钟轻柔混匀1次，无菌水冲洗4-5次；用无菌滤纸吸干后种植于1/2MS培养基上(含3％蔗糖、0.7％琼脂粉、pH值为5.8)，置于光照培养箱中25℃，16h光照8h黑暗培养，约3周可用于转化。
实施例3基因枪准备
称取50-60mg金粉(0.6μm)于干燥的1.5mL灭菌EP离心管。加入1mL无水乙醇，涡旋2分钟。加入1mL无菌水，涡旋1分钟，室温放置1分钟，10,000rpm离心2分钟，去上清。加入1mL50％甘油，重悬金粉，-20℃冻存。
甘油保存状态的金粉悬液涡旋5分钟使金粉重悬。取50μL金粉悬液于无菌1.5mL离心管，涡旋1分钟。加入10μg质粒DNA，涡旋30秒。加入50μL 2.5MCaCl2，涡旋30秒。加入20μL0.1M亚精胺，混合物涡旋5分钟，冰上静置2分钟。加60μL预冷的无水乙醇，手指轻弹使之重悬，14,000rpm离心10秒，去上清，重复一次。加入50μL无水乙醇重悬，备用。
实施例4基因枪轰击
根据样品数量取一定数量的载体膜、可裂膜、阻挡网(注意：载体膜、可裂膜需每枪更换，阻挡网同一个样品可共用)于无水乙醇中浸泡15分钟，用无菌水冲洗2次，自然晾干，备用。将晾干的载体膜放入无菌铁环中，压平。将制备好的子弹涡旋充分混匀，取10μL子弹于载体膜中央，自然晾干。把微粒发射装置移出轰击室，旋下盖子，加入阻挡网，把微粒载片安装在固定槽中(有微粒的一面朝下)，旋上盖子，将微粒发射装置放回轰击室。
实施例5转化后培养及筛选
1.暗培养：将轰击后的生菜叶片剪下，切成10～20mm2的叶盘置于RMOL培养基(不加抗生素)中25℃暗培养2天。
2.筛选培养：将暗培养结束的材料转移至筛选培养基(抗生素浓度为50μg/mL)中进行筛选培养。
3.生根培养：将芽转移至生根培养基(抗生素浓度为100μg/mL)中诱导生根。
实施例6 Western blot检测目的蛋白表达情况
采用液氮研磨、变性裂解提取植物蛋白，将裂解上清和5×上样缓冲液(使用前加入β-巯基乙醇至终浓度为5％)按4:1的比例混合(如200μl蛋白裂解上清与50μl5×上样缓冲液混合)，混匀，95℃加热6min，同时处理阴性对照及阳性对照；电泳电压积层胶80V，分离胶120V，待目的蛋白跑至分离胶中间位置后，停止电泳，回收下槽电泳液，拆开电泳装置，按照负极(黑色)、海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜(事先用甲醇活化15s、ddH2O洗涤后浸泡于1×转移缓冲液中)或NC膜(不需活化)、滤纸、海绵、正极(透明)的顺序放置，排气泡后组装，放入电泳槽(注黑色对应电泳槽黑色一面放入)，加满转移缓冲液，将整个电泳槽放入冰水混合液中，90V电泳1.0h；电泳快结束时配制5％脱脂奶粉(封闭液)，将转移后的膜放入封闭液中室温封闭至少1h，4℃孵育一抗过夜(一抗稀释于5％脱脂奶粉中，稀释比参考说明书)；使用PBST或TBST洗涤15min×3次，室温孵育二抗1～2h，PBST或TBST洗涤15min×3次，采用DAB试剂盒进行显色，拍照，分析目的蛋白表达情况，结果表明目标蛋白在生菜中正常表达，见图2。
实施例7人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白序列活性检测
在持续七周的稳定期后，将狗随机分为两个治疗组，每组3只，分别接收含有降糖蛋白(实施例5制得的人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白)及不含降糖蛋白两种实验胶囊中的一种，做第一次重复。再次将狗随机分组，接受另一种不同的实验饮食，做第二次重复。重复I和II至少持续2周，在每次重复结束后检测血糖反应。
在血糖检测开始前，狗禁食24小时。剃去导管插入部位的毛，无菌处理，导管插入右头静脉。大约间隔5分钟采集两基线样品。在采集最后一个基线样品后，立即给狗喂相当其体重1％的饮食并含有1片或3片降糖胶囊，至多允许其吃15分钟。如果在15分钟内狗不吃实验饮食，则当天不检测其血糖反应，次日重新检测。在进食后10、20、30、45、60、120、180和240分钟，采集额外的血液样品。血液样品1300×g离心15分钟，在采集后两小时内将每个时间点1ml血浆之两等分样品冻存。应用己糖激酶方法测定血浆葡萄糖浓度(mg/dl)。
表1狗血液中糖浓度的实验结果
Figure BDA0002105062040000091
注：*示具有显著差异(P＜0.05)；**示具有极显著差异(P＜0.01)。
实施例8动物毒性试验
将7周大小的实验用小白鼠随机分为三个治疗组，每组10只，分别接收含有降糖蛋白(按照体重喂食500ng/g)(本发明得到的人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白)，及不含降糖蛋白两种实验胶囊中的一种，接受相同的实验饮食。连续喂食10天，每次喂食后实进行观察，每天需要连续观察6小时以上，并没有看小鼠处于兴奋状态还是抑制状态，没有出现行动迟缓等现象，也没有出现腹泻等情况。证明人霍乱毒素B亚基(CTB)与Humalog胰岛素原的融合蛋白口服安全性高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 王跃驹
<120> 植物生产人霍乱毒素B亚基(CTB)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用
<130> MP1907674
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> CTB与Humalog胰岛素原的融合蛋白(Fusion protein of CTB andHumalog proinsulin)
<400> 1
Met Ile Lys Leu Lys Phe Gly Val Phe Phe Thr Val Leu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Ala Tyr Ala His Gly Thr Pro Gln Asn Ile Thr Asp Leu Cys Ala Glu
20 25 30
Ser His Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Lys Ile Phe Ser Tyr
35 40 45
Thr Glu Ser Leu Ala Gly Lys Arg Glu Met Ala Ile Ile Thr Phe Lys
50 55 60
Asn Gly Ala Ile Phe Gln Val Glu Val Pro Ser Ser Gln His Ile Asp
65 70 75 80
Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Ala
85 90 95
Tyr Leu Thr Glu Ala Lys Val Glu Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys
100 105 110
Thr Pro His Ala Ile Ala Ala Ile Ser Met Ala Asn Gly Pro Gly Pro
115 120 125
Arg Arg Lys Arg Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala
130 135 140
Leu Leu Ala Leu Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln
145 150 155 160
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
165 170 175
Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp
180 185 190
Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser
195 200 205
Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val
210 215 220
Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
225 230 235 240
Cys Asn
<210> 2
<211> 726
<212> DNA
<213> CTB与Humalog胰岛素原的融合蛋白(Fusion protein of CTB andHumalog proinsulin)
<400> 2
atgattaaac ttaaattcgg tgtatttttc actgttttat tatcttctgc ttatgctcat 60
ggaactcctc aaaatattac agatctttgt gctgaatctc ataatactca aatctataca 120
cttaatgata aaatttttag ttatactgaa tctttagctg gaaaaagaga aatggctatt 180
attactttta aaaatggtgc tatttttcaa gtagaagttc cttcttctca acatattgat 240
tctcaaaaga aagctattga acgtatgaaa gatactcttc gaattgctta tcttacagaa 300
gctaaagtag aaaaactttg tgtttggaat aacaaaacac ctcatgctat tgctgctatt 360
tctatggcta atggtcctgg acctagacga aaaagaatgg ctttatggat gcgacttctt 420
cctcttcttg ctcttcttgc tttatggggt cctgatcctg ctgctgcttt tgtaaatcaa 480
catctttgtg gatctcatct tgtagaagct ttatatcttg tttgtggtga aagaggattt 540
ttctatacta aacctacaag acgagaagct gaagatcttc aagtaggtca agttgaatta 600
ggtggaggac ctggtgctgg atctttacaa cctttagctt tagaaggttc tttacaaaaa 660
cgaggaattg ttgaacaatg ttgtacttct atttgttctt tatatcaatt agaaaattat 720
tgtaat 726

Claims (2)

1.转导表达载体的植物在表达人霍乱毒素B亚基与Humalog胰岛素原的融合蛋白或制备包含所述融合蛋白的药物中的应用；所述植物为生菜；
所述人霍乱毒素B亚基与Humalog胰岛素原的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述表达载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：分别将所述人霍乱毒素B亚基与Humalog胰岛素原的融合蛋白的密码子优化为植物偏好的密码子，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
步骤2：将所述核苷酸序列克隆到pUC57载体中，获得pHuma。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为降糖的口服制剂。
CN201910549741.8A 2019-06-24 2019-06-24 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用 Active CN110256578B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910549741.8A CN110256578B (zh) 2019-06-24 2019-06-24 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用
PCT/CN2020/089982 WO2020259110A1 (zh) 2019-06-24 2020-05-13 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910549741.8A CN110256578B (zh) 2019-06-24 2019-06-24 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110256578A CN110256578A (zh) 2019-09-20
CN110256578B true CN110256578B (zh) 2021-04-23

Family

ID=67920866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910549741.8A Active CN110256578B (zh) 2019-06-24 2019-06-24 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN110256578B (zh)
WO (1) WO2020259110A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110256578B (zh) * 2019-06-24 2021-04-23 王跃驹 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用
WO2023154777A2 (en) * 2022-02-10 2023-08-17 Ice Bear Therapeutics Spc Methods of producing human analog insulins and derivatives thereof in a mammalian cell

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1629288A (zh) * 2003-12-15 2005-06-22 浙江大学 表达ctb和人胰岛素融合蛋白的重组家蚕杆状病毒及其应用
CN1740325A (zh) * 2004-08-25 2006-03-01 浙江大学 一种融合基因、其表达的蛋白及其制备方法
CN103820477A (zh) * 2014-01-15 2014-05-28 浙江大学 CTB、人胰岛素和谷氨酸脱羧酶3p531片段融合蛋白及其应用
US8999380B2 (en) * 2012-04-02 2015-04-07 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
CN108699548A (zh) * 2015-11-16 2018-10-23 宾夕法尼亚州立大学托管会 将生物包封于植物细胞中的治疗性蛋白质靶向递送至目标细胞类型以治疗疾病

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110256578B (zh) * 2019-06-24 2021-04-23 王跃驹 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1629288A (zh) * 2003-12-15 2005-06-22 浙江大学 表达ctb和人胰岛素融合蛋白的重组家蚕杆状病毒及其应用
CN1740325A (zh) * 2004-08-25 2006-03-01 浙江大学 一种融合基因、其表达的蛋白及其制备方法
US8999380B2 (en) * 2012-04-02 2015-04-07 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
CN103820477A (zh) * 2014-01-15 2014-05-28 浙江大学 CTB、人胰岛素和谷氨酸脱羧酶3p531片段融合蛋白及其应用
CN108699548A (zh) * 2015-11-16 2018-10-23 宾夕法尼亚州立大学托管会 将生物包封于植物细胞中的治疗性蛋白质靶向递送至目标细胞类型以治疗疾病

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession number CAA24996，Version CAA24996.1;MEKALANOS, J.J.等;《Genbank》;19950330;第1页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110256578A (zh) 2019-09-20
WO2020259110A1 (zh) 2020-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Franke et al. Ricin and Ricinus communis in pharmacology and toxicology-from ancient use and “Papyrus Ebers” to modern perspectives and “poisonous plant of the year 2018”
Azevedo et al. Isolation and intracellular localization of insulin-like proteins from leaves of Bauhinia variegata
CN110256578B (zh) 植物生产人霍乱毒素b亚基(ctb)与胰岛素原的融合蛋白速效口服降糖胶囊的应用
CN103222988B (zh) 一种美洲大蠊提取物及其制备方法和应用
Paula et al. Insulin-like plant proteins as potential innovative drugs to treat diabetes—The Moringa oleifera case study
CN113512096B (zh) 一种鲈鱼弹状病毒重组g2蛋白及其应用
CN110218259B (zh) 植物生产胰高血糖素样肽-1短肽与转铁蛋白的融合蛋白制造口服降糖胶囊的应用
Anwer et al. Detection of immunoactive insulin in Spirulina
CN105367664B (zh) 激活GLP-1受体和Amylin受体双功能作用的融合蛋白制备及其用途
Venâncio et al. A protein with amino acid sequence homology to bovine insulin is present in the legume Vigna unguiculata (cowpea)
CN101020715A (zh) 鹿茸神经生长因子(deer ngf)提取及其制备方法
CN110256580B (zh) 植物生产口服杜拉鲁肽与纳豆激酶降糖胶囊的应用
CN102618552A (zh) 一种重组艾塞那肽的生产工艺
CN104151435A (zh) 一种防治幽门螺杆菌的含分子内佐剂的重组基因、蛋白及生物制品
WO2020259109A1 (zh) 植物生产的epo与转铁蛋白的融合蛋白及其应用
CN110256581B (zh) 植物生产口服索玛鲁泰（Semaglutide）与蚓激酶的融合蛋白降糖胶囊的应用
CN104945490B (zh) 分离的植物防御素多肽及其制备方法和在治疗肺癌中的用途
CN110204620B (zh) 植物作为宿主在表达mglp融合蛋白中的应用
Ma et al. Expression and purification of optimized rolGLP-1, a novel GLP-1 analog, in Escherichia coli BL21 (DE3) and its good glucoregulatory effect on type 2 diabetic mice
CN101580846A (zh) 一种用于防治肝硬化的人源细胞珠蛋白及其制备方法
CN110256579A (zh) 植物生产人胰岛素与转铁蛋白长效口服降糖胶囊的应用
CN105884901A (zh) 具持续控制血糖含量功能的重组人血清白蛋白/胰高糖素类肽融合蛋白
CN111171144B (zh) 一种抗猪流行性腹泻病毒的抗体制备及应用
CN106916206A (zh) 文蛤多肽及其制备方法与应用
CN110241132B (zh) 植物作为宿主在表达Dulaglutide中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210517

Address after: Room 607, block C-1, lattice Plaza, Qilu innovation Valley, high tech Zone, Jinan City, Shandong Province

Patentee after: Ruicheng Biotechnology (Shandong) Co.,Ltd.

Address before: Apartment 2, 4410 weatherhill street, Corvallis, Oregon, USA

Patentee before: Wang Yueju