CN108929866A - 枯草芽孢杆菌ggt蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定 - Google Patents

枯草芽孢杆菌ggt蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定 Download PDF

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Abstract

本发明涉及枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能，即在抗疮痂链霉菌中的应用。本发明还提供了来自于枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽。本发明发现了已知的枯草芽孢杆菌GGT蛋白在降解后具有抗疮痂链霉菌的活性，并进一步从枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物中鉴定出了抗菌肽序列，为马铃薯疮痂病的生物防治工作提供了新的思路。

Description

枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定
技术领域
本发明属于植物保护与生物防治领域，涉及一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定。
背景技术
马铃薯作为我国的主要粮食作物被广泛种植，仅次于水稻、小麦和玉米，近年来逐渐成为很多省份的重要经济来源，而优质的马铃薯种薯则是这一经济来源的基础。马铃薯疮痂病主要在土壤中进行传播，在马铃薯种植过程中极易感染，近年来由疮痂链霉菌引起的马铃薯疮痂病日益严重，直接影响马铃薯的品质，使马铃薯产业产生了巨大的经济损失。
病原微生物造成的植物病害严重地阻碍了我国农业的发展。化学农药的大量使用不仅会对环境造成严重的污染，还会使人类的健康受到威胁。近年来，越来越多的生防菌株被研究并初步应用到植物病害的生物防治中，取得了较好的防效，发展前景广阔。
大部分生防菌株依靠自身产生的活性物质实现对病原菌的抑制，其中抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)就是一类比较有代表性的活性物质，也是生物体先天免疫系统的重要组成部分。多年以来，人们从不同种类的生物体中发现了大量的未知抗菌肽，它们是一类带正电荷的两亲性小分子抗菌肽。这种小分子抗菌肽对细菌和病毒均具有抵抗作用，从而使病原不能够侵入细胞内部。此外它们还具有清除体内突变细胞的功能。
芽孢杆菌是一种理想的生防微生物，对高温、紫外线和酸碱环境均具有一定的耐受性，能够有效抑制多种病原菌，对病害起到良好的防治效果。目前，已出现多种芽孢杆菌与生物防治相关的报道，包括蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、多粘芽孢杆菌(Bacilluspolymyxa)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。此外，芽孢杆菌产生的抗菌物质如多肽、多糖、次生代谢物、抗菌蛋白等，是其拮抗病原菌的主要物质基础。但由于芽孢杆菌的种类众多，其生防效果及产生的抗菌物质均存在较大差异，因此来自于芽孢杆菌的抗菌物质仍有待进一步开发。
γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase，GGT)分布非常广泛，从细菌到哺乳动物体内都有存在。该酶能催化3种类型的反应：转肽反应、自转肽反应和γ-谷氨酰基的水解反应。GGT在临床检测中可作为生物标志物，已经用作肝脏和其他疾病的常规检测指标。该酶在生物催化合成中也有相当重要的应用，利用此酶可以合成多种含γ-谷氨酰基的化合物。GGT蛋白具有信号肽，为细胞外分泌表达，在翻译后修饰过程中会自发进行剪切成为大小两个亚基，分子量分别约为40kDa和20kDa。在芽孢杆菌的培养过程中，在上清液中能够长时间检测到该酶及其降解片段的大量存在，但并没有关于该酶及其降解片段与抑菌活性相关的报道。
发明内容
本发明的第一目的是鉴定枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能，其降解产物具有对疮痂链霉菌具有抗菌活性。
本发明的第二目的是提供一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽。
本发明的第三目的是提供另一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物具有对疮痂链霉菌的抑菌活性。
二、一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述的枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
三、一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
上述的枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
首先对枯草芽孢杆菌的培养液上清进行硫酸铵沉淀和离子交换层析，对于分离到的蛋白质组分，检测其对疮痂链霉菌的抗菌活性。具有抗菌活性的蛋白质组分进行SDS-PAGE电泳，切取蛋白质条带进行质谱测序。测序结果经数据库比对分析确认蛋白质组分为γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的组成部分，从而推测枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物具有抗菌活性。
随后通过抗菌肽在线预测的方法分析枯草芽孢杆菌的GGT蛋白质序列，预测得到多种抗菌肽，选取3种抗菌肽进行多肽合成和活性测试，最终确认2条对疮痂链霉菌具有抑菌活性的抗菌肽SEQ ID NO:1(IQKDLAKTFKLIRSNGTDAF)和SEQ ID NO:2(ATIISSVLQTILYHIEYGMELKAAVE)。
采用上述技术方案的积极效果：本发明发现了已知的枯草芽孢杆菌GGT蛋白在降解后具有抗疮痂链霉菌的活性，并进一步从枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物中鉴定出了抗菌肽序列，为马铃薯疮痂病的生物防治工作提供了新的思路。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌抑菌物质的阴离子交换层析图谱，P1、P2、P3：分别为三个洗脱峰；
图2为枯草芽孢杆菌不同分离组分对疮痂链霉菌的活性测试，CK：对照，1：培养液上清，2：硫酸铵沉淀组分，3：离子交换层析洗脱峰P1，4：离子交换层析洗脱峰P2，5：离子交换层析洗脱峰P3；
图3为离子交换洗脱峰P2的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白质分子量Marker，1：离子交换洗脱峰P2，b3：离子交换洗脱峰P2中的目的蛋白质条带；
图4为蛋白质条带b3进行Maldi-TOF质谱测序分析得到的质谱图；
图5为质谱测序结果进行Mascot比对得到的最优结果：γ-谷氨酰转肽酶，GenBank登录号为KIU12867.1；
图6为在线预测获得的3种GGT蛋白的抗菌肽在三维结构中的定位，AE26、LT30、IF20分别为预测的抗菌肽，都为α-螺旋；
图7为3种预测抗菌肽对疮痂链霉菌的抗菌活性测试结果；
图8为枯草芽孢杆菌GGT蛋白两个亚基的重组表达蛋白在不同时间内的降解情况，M：蛋白质分子量Marker，1-9：分离纯化1-9小时后的蛋白质样品，GGT-A：GGT蛋白大亚基(36-402氨基酸)，GGT-B：GGT蛋白小亚基(403-587氨基酸)。
图9为枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的抗菌活性测试结果，1：降解0小时的GGT蛋白样品，2：降解9小时后的GGT蛋白样品。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，绝不限制本发明的范围。
本发明中生物材料的来源：
1、所用的枯草芽孢杆菌BU412于2016年3月23日中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2016142；
2、疮痂链霉菌，普城沙雷氏菌BU09的分离鉴定及其对疮痂链霉菌的防治效果，安徽农业科学，2017年第45卷11期，123-124页，作者：张竹君，刘权，该菌种一直保存在黑龙江八一农垦大学，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
3、抗菌肽为委托上海楚肽生物科技有限公司合成。
实施例1
枯草芽孢杆菌GGT蛋白的分离纯化与质谱鉴定。
将枯草芽孢杆菌BU412接种至YME液体培养基(麦芽糖10g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖4g/L、pH 7.5)进行过夜培养，12000g离心收集上清，使用80％的硫酸铵沉淀得到蛋白组分，使用20mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液溶解沉淀，经过0.22μm的滤膜过滤，使用AKTA蛋白纯化仪进行阴离子交换层析，使用的纯化柱为GE公司的Q hp阴离子交换柱(柱体积为5mL)。使用20mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液上样并平衡，以0.5M NaCl，20mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液进行0-100％的线性梯度洗脱，根据吸收峰收集蛋白组分P1-P3(图1)，使用牛津杯法测定各分离组分对疮痂链霉菌的抗菌活性(图2)。对于具有抗菌活性的蛋白组分P2进行SDS-PAGE电泳检测(图3)。
切取图3中的蛋白条带，将胶条送交上海中科新生命生物科技有限公司进行Maldi-TOF质谱测序(图4)，经Mascot软件搜索NCBI数据库，发现该蛋白条带属于γ-谷氨酰转肽酶(gamma-glutamyltransferase，GGT，Genbank登录号为KIU12867.1)(图5)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例2
枯草芽孢杆菌GGT蛋白中抗菌肽的预测。
将GGT蛋白(Genbank登录号为KIU12867.1)的氨基酸序列在CAMPR3数据库上进行抗菌肽区域的在线预测，发现GGT的多条多肽具有构成抗菌肽的可能，结合这些多肽在GGT蛋白三维结构中的二级结构和定位(图6)，从中选择3条多肽(表1)在APD数据库进行在线分析。结果表明，3条多肽均能形成具有疏水面的α螺旋，可能具有抗菌肽的活性。根据3条多肽链氨基酸的个数，分别命名为LT30、AE26和IF20。此外，从PDB数据库中查询GGT蛋白的三维结构并使用Pymol软件对这3条肽链进行了空间定位(图6)。
表1预测的GGT蛋白抗菌肽的序列
实施例3
预测抗菌肽的合成与活性检测。
利用固相多肽合成技术合成3条枯草芽孢杆菌的GGT蛋白的候选抗菌肽，合成的多肽N端乙酰化，C端酰胺化，纯度达到95％以上。多肽以50mM终浓度溶解于20mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中。使用牛津杯法测定这3条多肽对疮痂链霉菌的抗菌活性。结果显示，多肽LT30对疮痂链霉菌不具有抑制效果，AE26和IF20对疮痂链霉菌具有抑制作用，其中IF20的效果要优于AE26(图7)。
实施例4
枯草芽孢杆菌GGT蛋白的自然降解。
将γ-谷氨酰转肽酶中两个亚基(GGT-A、GGT-B)的编码基因交由华大基因有限公司进行全基因合成，并亚克隆到pET28a载体中，转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取阳性克隆获得GGT-A和GGT-B两个亚基的表达菌。两种表达菌分别经过培养和IPTG诱导，收集菌体并合并后，进行超声波破碎，使用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化和脱盐后，加入等体积的枯草芽孢杆菌培养液上清(0.22μm的滤膜过滤除菌)进行自然降解试验，每小时取样进行SDS-PAGE电泳检测蛋白质的降解情况，共取样9次。结果显示(图8)，GGT-A大亚基降解较快，1-5小时期间大部分降解，9小时基本完全降解；GGT-B小亚基降解相对较慢，5小时后开始明显降解，9小时大部分降解。
实施例5
枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的抗菌活性检测
取实施例4中GGT蛋白纯化后自然降解9小时的样品，通过抑菌圈法对疮痂链霉菌进行抗菌活性测试，以降解0小时的样品作为对照。结果显示，未降解的GGT蛋白样品不具有对疮痂链霉菌的抗菌活性，而降解9小时后的GGT蛋白样品具有对疮痂链霉菌的抗菌活性(图9)。
本发明发现了已知的枯草芽孢杆菌GGT蛋白在降解后具有抗疮痂链霉菌的活性，并进一步从枯草芽孢杆菌GGT蛋白的降解产物中鉴定出了抗菌肽序列，为马铃薯疮痂病的生物防治工作提供了新的思路。
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物的新功能及其抗菌肽鉴定
<141> 2018-06-11
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 1
Ile Gln Lys Asp Leu Ala Lys Thr Phe Lys Leu Ile Arg Ser Asn Gly
1 5 10 15
Thr Asp Ala Phe
20
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
Ala Thr Ile Ile Ser Ser Val Leu Gln Thr Ile Leu Tyr His Ile Glu
1 5 10 15
Tyr Gly Met Glu Leu Lys Ala Ala Val Glu
20 25
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 3
Leu Ala Ser Glu Ile Gly Ala Asp Val Leu Lys Lys Gly Gly Asn Ala
1 5 10 15
Ile Asp Ala Ala Val Ala Ile Gln Phe Ala Leu Asn Val Thr
20 25 30
<210> 4
<211> 587
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 4
Met Lys Arg Thr Trp Asn Val Cys Leu Thr Ala Leu Leu Ser Val Leu
1 5 10 15
Leu Val Ala Gly Ser Val Pro Phe His Ala Glu Ala Lys Lys Leu Pro
20 25 30
Lys Ser Tyr Asp Glu Tyr Lys Gln Val Asp Val Gly Lys Asp Gly Met
35 40 45
Val Ala Thr Ala His Pro Leu Ala Ser Glu Ile Gly Ala Asp Val Leu
50 55 60
Lys Lys Gly Gly Asn Ala Ile Asp Ala Ala Val Ala Ile Gln Phe Ala
65 70 75 80
Leu Asn Val Thr Glu Pro Met Met Ser Gly Ile Gly Gly Gly Gly Phe
85 90 95
Met Met Val Tyr Asp Gly Lys Thr Lys Asp Thr Thr Ile Ile Asp Ser
100 105 110
Arg Glu Arg Ala Pro Ala Gly Ala Thr Pro Asp Met Phe Leu Asp Glu
115 120 125
Ser Gly Lys Ala Ile Pro Phe Ser Glu Arg Val Thr Lys Gly Thr Ala
130 135 140
Val Gly Val Pro Gly Thr Leu Lys Gly Leu Glu Glu Ala Leu Asp Lys
145 150 155 160
Trp Gly Thr Arg Ser Met Lys Gln Leu Ile Thr Pro Ser Ile Lys Leu
165 170 175
Ala Glu Lys Gly Phe Pro Ile Asp Ser Val Leu Ala Asp Ala Ile Ser
180 185 190
Asp Tyr Gln Glu Lys Leu Ser Arg Thr Ala Ala Lys Asp Val Phe Leu
195 200 205
Pro Asn Gly Glu Pro Leu Lys Glu Gly Asp Thr Leu Ile Gln Lys Asp
210 215 220
Leu Ala Lys Thr Phe Lys Leu Ile Arg Ser Asn Gly Thr Asp Ala Phe
225 230 235 240
Tyr Lys Gly Lys Phe Ala Lys Thr Leu Ser Asp Thr Val Gln Asp Phe
245 250 255
Gly Gly Ser Met Thr Glu Lys Asp Leu Glu Asn Tyr Asp Ile Thr Ile
260 265 270
Asp Glu Pro Ile Trp Gly Asp Tyr Gln Gly Tyr Gln Ile Ala Thr Thr
275 280 285
Pro Pro Pro Ser Ser Gly Gly Ile Phe Leu Leu Gln Met Leu Lys Ile
290 295 300
Leu Asp Asp Phe Asn Leu Ser Gln Tyr Asp Val Arg Ser Trp Glu Lys
305 310 315 320
Tyr Gln Leu Leu Ala Glu Thr Met His Leu Ser Tyr Ala Asp Arg Ala
325 330 335
Ser Tyr Ala Gly Asp Pro Glu Phe Val Asn Val Pro Leu Lys Gly Leu
340 345 350
Leu His Pro Asp Tyr Ile Lys Glu Arg Gln Gln Leu Ile Asn Leu Asp
355 360 365
Gln Val Asn Lys Lys Pro Lys Ala Gly Asp Pro Trp Lys Tyr Gln Glu
370 375 380
Gly Ser Ala Asn Tyr Lys Gln Val Glu Gln Pro Lys Asp Lys Val Glu
385 390 395 400
Gly Gln Thr Thr His Phe Thr Val Ala Asp Arg Trp Gly Asn Val Val
405 410 415
Ser Tyr Thr Thr Thr Ile Glu Gln Leu Phe Gly Thr Gly Ile Met Val
420 425 430
Pro Asp Tyr Gly Val Ile Leu Asn Asn Glu Leu Thr Asp Phe Asp Ala
435 440 445
Lys Pro Gly Gly Ala Asn Glu Val Gln Pro Asn Lys Arg Pro Leu Ser
450 455 460
Ser Met Thr Pro Thr Ile Leu Phe Lys Asp Asp Lys Pro Val Leu Thr
465 470 475 480
Val Gly Ser Pro Gly Gly Ala Thr Ile Ile Ser Ser Val Leu Gln Thr
485 490 495
Ile Leu Tyr His Ile Glu Tyr Gly Met Glu Leu Lys Ala Ala Val Glu
500 505 510
Glu Pro Arg Ile Tyr Thr Asn Ser Met Ser Ser Tyr Arg Tyr Glu Asp
515 520 525
Gly Val Pro Lys Asp Val Leu Ser Lys Leu Asn Gly Met Gly His Lys
530 535 540
Phe Gly Thr Ser Pro Val Asp Ile Gly Asn Val Gln Ser Ile Ser Ile
545 550 555 560
Asp His Glu Asn Gly Thr Phe Lys Gly Val Ala Asp Ser Ser Arg Asn
565 570 575
Gly Ala Ala Ile Gly Ile Asn Leu Lys Arg Lys
580 585

Claims (5)

1.枯草芽孢杆菌GGT蛋白降解产物在抗疮痂链霉菌中的应用。
2.一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求2所述的枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
4.一种枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.权利要求4所述的枯草芽孢杆菌GGT蛋白的抗菌肽在抑制疮痂链霉菌中的应用。
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