CN110184249A - 通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法 - Google Patents

通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶的方法，以该菌株为出发菌株，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1‑10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20‑40℃，100‑300rpm，发酵培养48h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ‑谷胺酰转肽酶，所述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，所述无机盐浓度比为1：5‑5：1的MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O混合物。该发酵工艺方法通过优化培养基种类和浓度，获得了较高活性和抑菌作用的γ‑谷胺酰转肽酶。该制备工艺简单、条件易控制,适合工业化生产。

Description

通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法
技术领域
本发明涉及一种异源二聚体酶制备方法，特别是涉及一种γ-谷胺酰转肽酶制备方法，应用于生物工程技术领域。
背景技术
γ-谷氨酰转肽酶(γ-Glutamyl transpeptidase,GGT)是包含一个大亚基(～40kDa)和一个小亚基(～20kDa)的异源二聚体酶，能够催化γ-谷氨酰类物质(如谷胱甘肽)的γ-谷氨酰键的断裂，并且转移γ-谷氨酰基到其他的氨基酸或肽类物质。在生物体内，GGT主要的生理功能是参与γ-谷氨酰循环，为细胞转运氨基酸类物质。GGT广泛存在于细菌、真菌、植物和哺乳动物中，不同生物中的GGT存在位置不同：在细菌中，GGT位于周质空间或者是分泌到胞外环境中；在哺乳动物细胞内，GGT绑定在血浆膜的外表面；在植物细胞中，GGT存在非原质体和液泡中。
γ-谷氨酰转肽酶作为催化β-谷氨酰基部分向受体转移的酶，具有多种生化功能，主要用于合成多种食品及医药功能性γ-谷氨酰基化合物，如L-茶氨酸，具有镇静减压、增强免疫力和预防肿瘤等重要作用，但在生鲜农产品防腐保鲜的报道较少。γ-谷氨酰转肽酶的生产方法有多种，有化学合成法、基因重组法和微生物发酵法，但是，通过化学法合成具有副产物多，合成周期大、产量较少等缺点；而微生物发酵法是目前最常见的方法之一，与其他方法相比，该法具有生产条件可工业化、生长周期相对较短等优点。目前我国通过微生物发酵法制备γ-谷胺酰转肽酶存在生产成本高及提取工艺复杂等缺点，难以实现大规模工业化生产和应用，这成为亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用优化发酵工艺中的培养基处方，获得高活性具有抑菌作用的γ-谷氨酰转肽酶，本发明发酵工艺方法通过优化培养基种类和浓度，获得了较高活性和抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶，制备工艺简单，条件易控制，成本低，适合工业化生产。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用枯草芽孢杆菌株进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
取液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按1-10％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株的菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为20-40℃，控制摇瓶转速为100-300rpm，进行发酵培养至少48h，得到发酵液；优选上述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，优选上述无机盐为质量浓度比为1:5-5:1的MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O的混合盐；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶。
作为本发明优选技术方案，在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述麦芽糖的浓度范围为20-80g/L，所述酵母浸膏浓度范围为10-40g/L，玉米粉浓度范围为1-30g/L。作为本发明最佳技术方案，在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度范围为10g/L。
作为本发明优选技术方案，在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述MgSO4·7H2O浓度范围为0.5-5g/L，K2HPO4·3H2O浓度范围为1-5g/L。作为本发明最佳技术方案，在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L。
作为本发明优选技术方案，在所述步骤(1)中配制发酵原液时，接种量为6％v/v。
作为本发明优选技术方案，在所述步骤(1)中进行发酵时，控制发酵条件为28-40℃，发酵原液的初始pH为5.5-7.5。作为本发明最佳技术方案，在所述步骤(1)中进行发酵时，控制发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200-300rpm，发酵原液的初始pH为6.0-6.5。
作为本发明优选技术方案，本发明方法所制备的具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的活性达到1600±31U/L,所制备的具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶抑制荔枝胶孢炭疽菌抑菌率达36.36±2.20％。
γ-谷氨酰转肽酶的来源不同，酶的化学性质差异很大，其生长条件也有一定差异。在不控制发酵条件下，γ-谷氨酰转肽酶合成与细胞生长部分相关，细胞生长的对数期和稳定期都能进行酶的合成，在稳定期后期酶的合成量达到最大，葡萄糖的存在抑制酶的合成；培养温度对γ-谷氨酰转肽酶合成的影响分析表明，低温延长了细胞的延滞期和对数期，不能够刺激细胞γ-谷氨酰转肽酶合成；高温下会导致γ-谷氨酰转肽酶合成后快速降解，37℃为最适产酶温度。发酵过程pH控制对γ-谷氨酰转肽酶合成具有显著的影响，酸性环境能够刺激酶的合成，碱性环境抑制酶的合成，最适的产酶pH值为6。溶解氧的提高能够促进细胞的生长，但在稳定期，过高的溶氧会导致γ-谷氨酰转肽酶的稳定性降低；低溶氧条件有利于酶的合成却使得细胞生长处于氧限制状态。谷氨酸的添加能够抑制γ-谷氨酰转肽酶的合成，而γ-谷氨酰转肽酶的抑制剂仅使胞外的谷氨酸浓度降低，结合胞外聚谷氨酸的链长随γ-谷氨酰转肽酶活性增加不断减少，推测γ-谷氨酰转肽酶在细胞中的作用为从末端水解聚谷氨酸，为细胞在稳定生长提供谷氨酸。
枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)是芽孢杆菌属的一种，是一种嗜温性的好氧革兰氏阳性杆状细菌，可以产生大量丰富蛋白质、氨基酸衍生物等，在医药、食品、农牧等领域有着广泛应用。本发明优选采用枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CF-3(保藏号CCTCC M2016125)是从豆腐乳中分离鉴定出的一株生防细菌，能够产生γ-谷氨酰转肽酶，该酶具有抑制采后病原微生物的作用，前期未有针对γ-谷氨酰转肽酶发酵工艺优化，提高γ-谷氨酰转肽酶的产量的研究，导致该菌和具有抑菌作用的γ-谷氨酰转肽酶在实际生产中应用受限。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明枯草芽孢杆菌CF-3产γ-谷胺酰转肽酶抑菌制剂对荔枝胶孢炭疽菌的生长有抑制作用；
2.本发明可产生γ-谷胺酰转肽酶抑菌制剂涂布于真菌培养皿中，用无菌的打孔器在培养3-5d的炭疽菌平板上取长势一致的一圈打取直径为6mm菌块放入平板中央，放入28℃生化培养箱中培养4天后观察抑菌效果并用十字交叉法测量菌落直径，检测到该制剂对荔枝胶孢炭疽菌菌丝生长有抑制作用，抑制率为62.42％，其中γ-谷氨酰转肽酶对荔枝胶孢炭疽菌的抑菌率占总抑制率的58.25％；
3.本发明方法工艺简单，易于控制，成本低，具备很好的应用前景。
附图说明
图1为CF-3培养基优化前后获得的γ-谷氨酰转肽酶对荔枝胶孢炭疽菌的抑菌率对比图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
实施例1：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G1。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响，可知本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G1活性为1600±31(U/L)。
测试本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶作为生防细菌CF-3菌剂，对荔枝胶孢炭疽菌进行抑制实验观察，测试γ-谷胺酰转肽酶具有的抑菌作用。
用实施例一中的枯草芽孢杆菌CF-3发酵液制作而得的枯草芽孢杆菌γ-谷氨酰转肽酶制剂，含量：γ-谷胺酰转肽酶酶活为16000U/G。
将融化的PDA培养基冷却到40-50℃左右倒平板，每个平板20mL。冷却后取蒸馏水和γ-谷胺酰转肽酶抑菌制剂涂布于真菌培养皿中，用无菌的打孔器在培养3-5d的炭疽菌平板上取长势一致的一圈打取直径为6mm荔枝胶孢炭疽菌块放入平板中央。放入28℃生化培养箱中培养4天后观察抑菌效果并用十字交叉法测量菌落直径，结果表明，枯草芽孢杆菌CF-3产γ-谷氨酰转肽酶优化后对荔枝胶孢炭疽菌总抑制率、γ-谷胺酰转肽酶抑制率及其他物质总抑制率均比优化前有显著提高(p<0.05)，因此对γ-谷氨酰转肽酶的优化是有意义的，可以显著提高对荔枝胶孢炭疽菌的抑菌活性。
参见图1 CF-3培养基优化前后获得的γ-谷氨酰转肽酶对荔枝胶孢炭疽菌的抑菌率对比图，可知，枯草芽孢杆菌CF-3产γ-谷氨酰转肽酶优化后对荔枝胶孢炭疽菌表现出较强的抑制作用，总抑制率为62.42±2.10％，γ-谷胺酰转肽酶抑制率为36.36±2.20％及其他物质总抑制率为26.06±3.35％，可以看出γ-谷胺酰转肽酶抑制率作用较大(p<0.05)，优化后γ-谷氨酰转肽酶对荔枝胶孢炭疽菌的抑菌率占总抑制率的58.25％。
本实施例通过筛选培养基的成分，优化麦芽糖、酵母膏、玉米粉和无机盐的种类和浓度，优化发酵条件，最终确定麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L，发酵条件为37℃，初始pH为6.0，转速200pm，接种量为6％v/v。可获得生产较高活性的γ-谷氨酰转肽酶，对发酵工艺生产γ-谷氨酰转肽酶的产业化具有一定的指导意义。
实施例2：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为20g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G2。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G2进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例3：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为80g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G3。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G3进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例4：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为10g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G4。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G4进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例5：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为40g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G5。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G5进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例6：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为1g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G6。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G6进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例7：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为30g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G7。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G7进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例8：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为0.5g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G8。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G8进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例9：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为5g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G9。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G9进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例10：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为1g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G10。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G10进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例11：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为5g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G11。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G11进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例12：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G4。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G4进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例13：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为40℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为6.0，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G13。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G13进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例14：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为5.5，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G14。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G14进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
实施例15：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，采用保藏号为CCTCC M 2016125的枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
作为本发明优选技术方案，一种制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
制备液体培养基，其中麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度为10g/L，MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L；取50ml液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按6.0％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株Bacillus subtilis CF-3菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200rpm，发酵原液的初始pH为7.5，进行发酵培养48h后，得到发酵液；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷氨酰转肽酶G15。
实验测试分析：
对本实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶G15进行活性测定，参见表1不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响。
本发明上述实施例制备的γ-谷氨酰转肽酶活性测定：
取粗酶液0.5mL加入1mL酶反应体系，酶反应体系采用硼砂-氢氧化钠缓冲液，pH10.0，硼酸根浓度为0.2mol/L，5mmol/L L-γ-Glu-pNA，20mmol/L的甘氨酰甘氨酸，在37℃进行恒温水浴反应10min，加入0.1mol/L的盐酸3ml终止反应。
表1.本发明上述实施例不同培养基种类和浓度对γ-谷氨酰转肽酶活的影响
实验组 γ-谷氨酰转肽酶活性(U/L)
γ-谷氨酰转肽酶G1 1600±31
γ-谷氨酰转肽酶G2 380±25
γ-谷氨酰转肽酶G3 800±20
γ-谷氨酰转肽酶G4 750±18
γ-谷氨酰转肽酶G5 890±24
γ-谷氨酰转肽酶G6 1020±12
γ-谷氨酰转肽酶G7 880±16
γ-谷氨酰转肽酶G8 1100±17
γ-谷氨酰转肽酶G9 870±22
γ-谷氨酰转肽酶G10 1200±16
γ-谷氨酰转肽酶G11 1150±24
γ-谷氨酰转肽酶G12 1200±19
γ-谷氨酰转肽酶G13 1400±26
γ-谷氨酰转肽酶G14 1350±25
γ-谷氨酰转肽酶G15 1000±15
上述实验结果表明，优化后成分与浓度的培养基和优化发酵条件后发酵生产的γ-谷氨酰转肽酶的酶活明显提升，上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的前提下，还可以做若干改进，这些也视为本发明的保护范围之内。本发明上述实施例通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，所涉及的微生物菌株为一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis CF-3，保藏号为CCTCC M 2016125。本发明以该菌株为出发菌株，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1-10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20-40℃，100-300rpm，发酵培养48h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得γ-谷胺酰转肽酶，所述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，所述无机盐浓度比为1：5-5：1的MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O混合物。本发明上述实施例发酵工艺方法通过优化培养基种类和浓度，获得了较高活性和抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶，制备工艺简单、条件易控制,适合工业化生产。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种通过发酵工艺制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：采用枯草芽孢杆菌株进行发酵，制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶。
2.一种权利要求1所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)微生物发酵过程：
取液体培养基置于三角瓶中，以枯草芽孢杆菌株与液体培养基的体积比为菌体种子的接种量，按1-10％v/v的接种量接入枯草芽孢杆菌株的菌体种子，在三角瓶中得到发酵原液，进行摇瓶发酵，发酵条件为20-40℃，控制摇瓶转速为100-300rpm，进行发酵培养至少48h，得到发酵液；所述液体培养基包括麦芽糖、玉米粉、酵母膏和无机盐，所述无机盐为质量浓度比为1:5-5:1的MgSO4·7H2O和K2HPO4·3H2O的混合盐；
(2)γ-谷胺酰转肽酶的分离和纯化过程：
将在所述步骤(1)中制备的发酵液经过离心除去菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶。
3.根据权利要求2所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述麦芽糖的浓度范围为20-80g/L，所述酵母浸膏浓度范围为10-40g/L，玉米粉浓度范围为1-30g/L。
4.根据权利要求3所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述麦芽糖的浓度为60g/L，所述酵母浸膏浓度为32.4g/L，玉米粉浓度范围为10g/L。
5.根据权利要求2所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述MgSO4·7H2O浓度范围为0.5-5g/L，K2HPO4·3H2O浓度范围为1-5g/L。
6.根据权利要求5所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)配制的发酵原液中，所述MgSO4·7H2O浓度为1g/L，K2HPO4·3H2O浓度为2g/L。
7.根据权利要求2所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中配制发酵原液时，接种量为6％v/v。
8.根据权利要求2所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中进行发酵时，控制发酵条件为28-40℃，发酵原液的初始pH为5.5-7.5。
9.根据权利要求8所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中进行发酵时，控制发酵条件为37℃，控制摇瓶转速为200-300rpm，发酵原液的初始pH为6.0-6.5。
10.根据权利要求1所述制备具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的方法，其特征在于：所制备的具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶的活性达到1600±31U/L,所制备的具有抑菌作用的γ-谷胺酰转肽酶抑制荔枝胶孢炭疽菌抑菌率达36.36±2.20％。
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