RU2811427C1 - Способ получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка и используемый в нём штамм-продуцент - Google Patents
Способ получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка и используемый в нём штамм-продуцент Download PDFInfo
- Publication number
- RU2811427C1 RU2811427C1 RU2022123601A RU2022123601A RU2811427C1 RU 2811427 C1 RU2811427 C1 RU 2811427C1 RU 2022123601 A RU2022123601 A RU 2022123601A RU 2022123601 A RU2022123601 A RU 2022123601A RU 2811427 C1 RU2811427 C1 RU 2811427C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gfap
- protein
- recombinant human
- insdqualifier
- insdseq
- Prior art date
Links
- 101000888419 Homo sapiens Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000051520 human GFAP Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 21
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 claims abstract description 86
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 claims abstract description 73
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 39
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 11
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 101100392339 Homo sapiens GFAP gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 8
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000013578 denaturing buffer Substances 0.000 claims description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 13
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 13
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 11
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 10
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 10
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 3
- 208000016988 Hemorrhagic Stroke Diseases 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 102100025038 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 Human genes 0.000 description 3
- 101710186825 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- OPQRFPHLZZPCCH-PGMHBOJBSA-N [(z)-[5-chloro-1-[(2,5-dichlorophenyl)methyl]-2-oxoindol-3-ylidene]amino] acetate Chemical compound C12=CC=C(Cl)C=C2C(=N/OC(=O)C)/C(=O)N1CC1=CC(Cl)=CC=C1Cl OPQRFPHLZZPCCH-PGMHBOJBSA-N 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 2
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 239000003150 biochemical marker Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 101150057627 trxB gene Proteins 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 32-alpha-galactosyl-3-alpha-galactosyl-galactose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(CO)OC(O)C2O)O)OC(CO)C1O DBTMGCOVALSLOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N D-Cellobiose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-CUHNMECISA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N D-maltotriose Natural products OC1C(O)C(OC(C(O)CO)C(O)C(O)C=O)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 RXVWSYJTUUKTEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 102100021238 Dynamin-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- -1 GSH amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 108700005000 Glial Fibrillary Acidic Proteins 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010063907 Glutathione Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100036442 Glutathione reductase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101000817607 Homo sapiens Dynamin-2 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229940076189 RNA modulator Drugs 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000013090 Thioredoxin-Disulfide Reductase Human genes 0.000 description 1
- 108010079911 Thioredoxin-disulfide reductase Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 101150024831 ahpC gene Proteins 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000000104 diagnostic biomarker Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Natural products OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 208000030173 low grade glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N mannotriose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)C(O)C1O FYGDTMLNYKFZSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 201000011475 meningoencephalitis Diseases 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000001722 neurochemical effect Effects 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 101150022503 phoR gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001814 protein method Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 210000005042 type III intermediate filament Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N β-1,4-galactotrioside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@@H](O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-BYLHFPJWSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм E. сoli Origami 2 (DE3) pET28ahGFAP для получения рекомбинантного глиального фибрилярного кислого белка (GFAP) человека для применения в диагностических целях, полученный путем трансформации штамма E. сoli Origami 2 (DE3) плазмидой pET28a-hGFAP, представленной на фиг.2. Также предложен способ получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка с использованием указанного штамма. Изобретение обеспечивает возможность получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 6 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, а именно к области биотехнологии, генетической инженерии и медицины, в частности, к способу получения рекомбинантного глиального фибрилярного кислого белка (GFAP) человека для применения в диагностических целях.
Глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP - от англ. Glial Fibrillary Acid Protein) является важным диагностическим биомаркером черепно-мозговых травм [1-3] и основным цитоскелетным белком нейроглиальных клеток центральной нервной системы (ЦНС), который выполняет множество функций. GFAP участвует в поддержании формы астроглии, в пролиферации клеток, синаптогенезе, играет важную роль в межклеточной коммуникации (нейрон-астроглия), вовлечен в процессы восстановления ЦНС после травм (формирование глиальных рубцов) и поддержания гематоэнцефалического барьера [4].
В норме GFAP является внутриклеточным белком, а его появление во внеклеточном пространстве свидетельствует о повреждении глиальных клеток, что может быть вызвано повреждением ЦНС. Примечательно, что GFAP обладает высокой специфичностью в отношении повреждения именно клеток астроглии, что позволяет использовать его в качестве специфического биохимического маркера повреждений головного мозга (детектируемого в плазме крови), возникающих при черепно-мозговых травмах (ЧМТ) [5]. При этом, GFAP может быть обнаружен в образцах крови вскоре после ЧМТ [6]. Известно, что в случае легкой и умеренной ЧМТ уровни GFAP демонстрируют заметное повышение через восемь часов после травмы [7,8]. Кроме того, оценка концентрации GFAP в крови больного позволяет оценить тяжесть ЧМТ и ее исход [9,10]. Показано, что GFAP может быть важным биомаркером для дифференциации между геморрагическим и ишемическим инсультом, которые имеют разные механизмы возникновения и требуют противоположных стратегий лечения. Известно, что при геморрагическом инсульте концентрация GFAP в крови увеличивается стремительно, GFAP появляется в крови в течение первых двух часов, а максимальный его уровень наблюдается между 6 и 12 часами после начала геморрагического инсульта. В то же время, при ишемическом инсульте уровень GFAP в крови повышается существенно позднее (24 - 48 ч) [6,11]. Кроме того, описаны случаи менингоэнцефалита, связанного с аутоиммунной реакцией на GFAP [12].
Таким образом, GFAP (α изоформа) является важным прогностическим белком, который может найти применение в диагностике (в составе тест-систем) патологических состояний ЦНС [13-17]. Серьезным препятствием для широкого применения GFAP в клинике в качестве биохимического маркера является сложность в получении этого белка в качестве контроля / антигена для проведения иммуноферментного анализа (ИФА) [18].
По своей структуре GFAP относится к нейрофиламентам (промежуточные филаменты III типа). GFAP подразделяется на 10 изоформ, среди которых клиническое значение имеет альфа или 1-изоформа (GFAP-α) [4]. Мономерная форма GFAP состоит из 432 аминокислотных остатков, имеет молекулярную массу 50-52 кДа. GFAP состоит из 3-х доменов: головного, стержневого и хвостового. Головной и хвостовой домены не имеют определенной структуры, в то время как стержневой домен содержит четыре основных альфа-спиральных сегмента [19]. Полимеризация GFAP начинается с димеризации мономеров, которые в свою очередь полимеризуются по типу «голова к хвосту», образуя протяженные (сотни нм) филаменты [20]. В связи с склонность белка GFAP к полимеризации, получение его полноразмерной водорастворимой формы, включающей все 3 домена, представляется сложной задачей. Известны рекомбинантные фрагменты GFAP человека, включающие преимущественно стрежневую часть белка, с редуцированным хвостовым или головным доменом. Например, был получен ряд дериватов GFAP, включающий 292-432 аминокислотные остатки белка [21], 60-383 аминокислотные остатки [22], 256-357 аминокислотные остатки [23]. Получение редуцированной формы GFAP упрощает процесс очистки этого белка из-за меньшей склонности дериватов к полимеризации, однако недостатком этого подхода является ограничение числа эпитопов, способных распознаваться антителами тест-систем. В клетках зародыша пшеницы синтезирован полноразмерный GFAP человека, при этом в виде химерной конструкции, содержащей GST-tag на N-конце белка [24,25]. Недостатком этого способа экспрессии белков является высокая стоимость и малые объемы синтеза целевого белка. Для создания необходимых количеств тест-систем на GFAP, необходимо получение доступного рекомбинантного GFAP человека в достаточном количестве. В настоящее время наработка рекомбинантного GFAP человека возможна в прокариотических и эукариотических клетках. При этом, синтез GFAP в бактериальной системе экспрессии имеет несколько важных преимуществ: экономичность и широкая возможность оптимизации экспрессии целевого белка.
Известен способ визуализации астроглиального вала в диагностике низкодифференцированных глиом [26], в ходе которого получают иммуногенный рекомбинантный GFAP человека, иммунизируют им мышь линии Balb/C, выделяют В-лимфоциты селезенки этой мыши и сливают с клетками миеломы мыши линии Sp 2/0-Ag14, получают гибридомы. Тестируют супернатанты полученных гибридом иммунохимически на наличие анти-GFAP антител, из них отбирают клон гибридных клеток, продуцирующий анти-GFAP антитела, способные распознавать GFAP in vivo. Очищают анти-GFAP антитела из супернатанта отобранного клона и ковалентно связывают с липосомальными наноконтейнерами, содержащими диагностическую метку. Антитела отобранного клона гибридных клеток модифицируют по ε-аминогруппам остатков лизина и инкубируют с раствором stelths-липосом. Полученную наносистему вводят в сосудистое русло пациента и визуализируют астроглиальный вал по расположению диагностической метки в тканях головного мозга.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина [27], в ходе которого клонируют кДНК hGFAP в вектор рЕТ28а с последующей экспрессия в штамме Е. coli (DE3 BL21), что позволяет выделять рекомбинантный GFAP иммунохимически идентичный нативному антигену. Получаемые к рекомбинантному GFAP поликлональные и моноклональные антитела идентичны антителам, получаемым к нативному антигену. На основе рекомбинантного GFAP и антител полученных к нему может быть разработан твердофазный сэндвич вариант ИФА для количественного определения концентрации GFAP в биологических жидкостях человека.
Технической проблемой является необходимость расширения арсенала средств получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка.
Технический результат состоит в обеспечении возможности рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка.
Технический результат достигается за счет штамма E. сoli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина под № ВКМ B-3635D и являющегося продуцентом рекомбинантного глиального фибрилярного кислого белка (GFAP) человека для применения в диагностических целях.
Технический результат также достигается тем, что в способе получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка, в ходе которого клонируют ген GFAP человека в вектор в вектор рЕТ28а с последующей экспрессией в штамме Е. coli, согласно изобретению используют штамм-продуцент E. сoli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина под № ВКМ B-3635D, причем осадок бактериальных клеток штамм-продуцента E.сoli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP ресуспендируют в фосфатном буфере и разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора на льду, клеточный дебрис, содержащий тельца включений E. сoli с рекомбинантным GFAP человека, собирают центрифугированием, а полученный осадок растворяют в денатурирующим буферном растворе, содержащем мочевину, Tris-HCl и имидазол, после чего полученный раствор фильтруют и наносят на хроматографическую колонку, предварительно уравновешенную фосфатным буфером, затем осуществляют адсорбцию рекомбинантного GFAP человека на Ni-NTA-агарозе, после чего хроматографическую колонку промывают буферным раствором, содержащем мочевину, Tris-HCl и имидазол, далее полученный раствор белка подвергают ступенчатому диализу, в результате чего происходит разбавление мочевины и ренатурация белка GFAP.
Создана генно-инженерная конструкция и бактериальный продуцент полноразмерного рекомбинантного GFAP человека, который практически полностью идентичен натуральному белку.
Разработана методика получения и очистки рекомбинантного GFAP человека из бактериального продуцента, включающая в себя несколько стадий хроматографий, диализа, ферментативной обработки и концентрирования.
Полученный рекомбинантный GFAP человека пригоден в качестве антигена для иммунизации животных (для получения поликлональных и моноклональных антител) и в качестве антигена для проведения иммуноферментного анализа.
Заявляемое изобретение поясняется фигурами.
Фигура 1. Получение кДНК гена GFAP человека из клеток глиобластомы человека U-257. M - маркер молекулярных весов (п.н.).
Фигура 2. Схема клонирования гена GFAP человека в вектор pET28a по сайтам рестрикции NdeI и EcoRI. ATG - старт транскрипции, RBS - последовательность связывания рибосом, KanR - устойчивость к канамицину, ori - точка начала репликации плазмидной ДНК ColE1, f1 ori - начало репликации ДНК бактериофага f1, rop - регуляторный белок Rop (модулятор РНК).
Фигура 3. Индукция экспрессии GFAP в различных штаммах E.coli: 1 - BL21(DE3), 2 - C41(DE3), 3 - Origami 2 при внесении в культуральную среду индуктора ИПТГ (+). M - маркер молекулярных весов (кДа). К - контроль, нетрансформированные плазмидой pET28a-hGFAP клетки BL21(DE3).
Фигура 4. Очистка рекомбинантного GFAP человека. 1 - клетки E.coli Origami 2 (DE3), 2 - E.coli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP индукция экспрессии ИПТГ, 3 - водорастворимая фракция белков продуцента GFAP, 4 - водонерастворимая фракция белков продуцента GFAP, 5 несвязавшаяся с Ni-NTA агарозой фракция белков продуцента GFAP, 6 - элюат GFAP, 7 - диализованный GFAP. M - маркер молекулярных весов (кДа).
Заявляемое изобретение поясняется примерами.
Пример 1. Получение бактериального продуцента GFAP человека
Ген GFAP человека (SEQ ID NO:1) был получен с помощью ПЦР, ген-специфических праймеров (прямой: 5’-TTTT CATATG GAGAGGAGACGCATCACCTCCGC-3’ (NdeI), обратный: 5’-TTTT GAATTC TTACATCACATCCTTGTGCTCCTGCTTG-3’ (EcoRI)) и кДНК, полученной путем обратной транскрипции (с помощью набора MMLV-RT, «Евроген», Россия) из тотальной РНК клеток (U-251) глиобластомы человека (Фиг.1).
Полученный ген GFAP человека был клонирован в экспрессирующий вектор pET28а по сайтам рестрикции NdeI и EcoRI. Таким образом, в экспрессирующем векторе pET28a перед 5’-концом гена GFAP человека расположена последовательность, кодирующая His-tag и протеолитический сайт, узнаваемый тромбином, что позволяет после обработки тромбином чистого белка GFAP получить белок практически полностью идентичный человеческому (Фиг.2). Корректность генетической конструкции проверялась с помощью секвенирования («Евроген», Россия). Для трансформации бактериальных клеток использовали конструкцию, в которой последовательность клонированного фрагмента ДНК полностью совпадает с кодирующей последовательностью гена GFAP человека в GenBank (NM_001131019).
Плазмидой pET28a-hGFAP (SEQ ID NO:2) была проведена трансформация (стандартным Ca2+ методом) нескольких штаммов E. coli: BL21(DE3), C41(DE3) и Origami 2 (DE3) («Novagen», США), для оценки уровня экспрессии целевого белка. Показано, что наиболее высокий уровень синтеза GFAP наблюдается в клетках C41(DE3) и Origami 2 (DE3), в которых до 20% от тотального белка бактерий приходится на целевой белок (Фиг.3). Для дальнейших работ был использован продуцент на основе штамма Origami 2 (DE3).
В ходе экспрессии синтезирована химерная форма белка GFAP человека (SEQ ID NO:3), содержащая на N-конце His-tag (HHHHHH положение 5-10), сайт узнавания протеазой - тромбином (LVPRGS положение 14-19). После обработки тромбином на N-конце белка GFAP человека остаются гетерологичные аминокислоты GSH.
Пример 2. Условия культивирования продуцента рекомбинантного белка GFAP
При разработке методов культивирования продуцента GFAP человека, основное внимание было уделено получению условий, при которых происходит максимальная экспрессия целевого белка.
Штамм E.coli Origami 2 (DE3) является производной формой штамма K-12, который имеет мутации в генах тиоредоксин-редуктазы (trxB) и глутатион-редуктазы (gor), что в значительной степени усиливает образование дисульфидных связей в цитоплазме E. coli. Origami 2 (DE3) несет хромосомную копию гена РНК-полимеразы T7 фага λ под контролем промотора lacUV5. Этот штамм используют для улучшения синтеза белков эукариот, имеющих критически важные для стабильности структуры дисульфидные связи, а также при синтезе токсичных для бактерий белков, для которых в других штаммах не удается добиться приемлемого уровня синтеза. Генотип: Δ(ara-leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F′[lac+ lacIq pro] (DE3) gor522::Tn10 trxB (StrR, TetR).
Проводили трансформацию штамма E.coli Origami 2 (DE3) плазмидой pET28a-hGFAP с помощью стандартного Ca2+ метода [28]. Полученные трансформанты использовали для приготовления затравочной культуры. Одной колонией E.coli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP заражали 200 мл питательной среды LB, содержащей канамицин (Km) в концентрации 25 мкг/мл, и растили на качалке (120 об/мин) в течении 16 часов при +37°С. Полученной затравочной культурой заражали 2 л питательной среды LB, содержащей канамицин (Km) в концентрации 25 мкг/мл, в ферментере Ф-301 (ИБП РАН, Россия) при +37°С и интенсивной аэрации. Экспрессию GFAP индуцировали добавлением в среду культивирования изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ, при оптической плотности культуры 0.6 о.е. (λ=600 нм). После индукции температуру снижали до +30°С и культивировали еще в течение 4 ч, после чего бактерии собирали центрифугированием (4000 об/мин, 20 мин), полученный осадок продуцента замораживали при -20°С и хранили до выделения белка.
Пример 3. Оценка генетической стабильности продуцента рекомбинантного белка GFAP
Для проверки генетической стабильности ночную культуру E.coli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP высевали на агаризованную среду LB с канамицином (устойчивость к которому несет плазмида pET28a-hGFAP) и без него и подсчитывали число колоний, выросших на чашках при высеве из одного и того же разведения.
Одну из колоний трансформированных клеток E.coli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP, выросших на чашке с LB-агаром и Km, засевали в 50 мл жидкую питательную среду LB с Km (25 мкг/мл). Культуру выращивали в термостатируемой качалке («Biosan», Финляндия) при +37°С, при 200 об/мин в течении 16 ч, затем отбирали 50 мкл культуры, проводили серию разведений (до 10000 кратного) в стерильном LB и высевали по 50 мкл на чашку с LB-агаром и Km (25 мкг/мл) и без него. Спустя 16 ч роста клеток при +37°С проводили подсчет количества колоний на чашках в присутствии или отcутствии антибиотика. Приблизительно равное количество колоний на чашках Петри с антибиотиком и без него свидетельствует о генетической стабильности культуры-продуцента. Напротив, снижение количества колоний на чашке Петри с антибиотиком, по сравнению с чашкой без антибиотика, свидетельствует о снижении количества клеток содержащих плазмиду, обеспечивающую устойчивость к соответствующему антибиотику. Всего таким образом было проведено 10 пассажей исходной трансформированной колонии E.coli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP, результаты которых представлены в таблице 1. Полученные данные свидетельствуют о генетической стабильности продуцента Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP.
| Таблица 1. Генетическая стабильность Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP. | ||
| Пассаж | Среднее количество колоний на агаризованной среде с антибиотиком | Среднее количество колоний на агаризованной среде без антибиотика |
| 1 | 440 | 436 |
| 2 | 390 | 392 |
| 3 | 510 | 513 |
| 4 | 538 | 542 |
| 5 | 702 | 697 |
| 6 | 621 | 613 |
| 7 | 582 | 591 |
| 8 | 612 | 602 |
| 9 | 653 | 660 |
| 10 | 574 | 568 |
Пример 4. Получение полноразмерного рекомбинантного GFAP человека
Присутствие His-tag в структуре белка GFAP упрощает процедуру очистки рекомбинантного белка благодаря тому, что этот домен специфически связывается с Ni-NTA-агарозой. Осадок (~ 5 г) бактериальных клеток продуцента GFAP (E. сoli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP) ресуспендировали в 50 мл фосфатного буфера (1xPBS) и разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Т (Россия) на льду. Клеточный дебрис, содержащий тельца включений E. сoli с рекомбинантным GFAP человека, собирали центрифугированием при 10000g в течение 30 мин. Полученный осадок растворяли в 50 мл денатурирующего буфера: 8 М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 10 мМ имидазола. Полученный раствор фильтровали через шприцевой фильтр 0.2 мкм («Teknokroma», Испания) и с помощью перистальтического насоса наносили на хроматографическую колонку («BioRad», США) с 10 мл Ni-NTA-агарозы («Invitrogen», США), которая предварительно была уравновешена тем же буфером. Адсорбцию рекомбинантного GFAP на Ni-NTA-агарозе проводили при комнатной температуре. Затем колонку промывали 100 мл раствора: 8 М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.5), 20 мM имидазол. Элюцию белка проводили 20 мл буфера: 8М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.5), 250 мM имидазол. Полученный раствор белка подвергали ступенчатому диализу (в диализном мешке с отсечение 3.5 кДа) по схеме указанной в Табл.2, в результате чего происходит разбавление мочевины и ренатурация белка GFAP.
| Таблица 2. Схема диализа и ренатурации рекомбинантного GFAP человека. | ||||
| Стадия диализа | Состав диализного буфера | Объем диализного буфера, мл | Длитель-ность, ч | t, °C |
| 1 | 8 М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20 | 300 | 1 | 22 |
| 2 | 6 М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДTT, 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20 | 300 | 1 | 22 |
| 3 | 4 М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДTT, 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20 | 300 | 1 | 22 |
| 4 | 2 М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДTT, 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20 | 300 | 1 | 22 |
| 5 | 1 М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДTT, 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20 | 300 | 1 | 22 |
| 6 | 0.5 М мочевина, 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДTT, 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20 | 300 | 1 | 22 |
| 7 | 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20. | 1000 | 16 | 4 |
Ренатурированный препарат (7 стадия диализа) белка GFAP концентрировали с помощью мембранного концентратора SPIN-X («Corning», США), обрабатывали тромбином (~ 2 ед.) для отщепления пептида с карбоксильного конца белка (SEQ ID NO:4). Затем, реакционную смесь пропускали через колонку с Ni-NTA агарозой (уравновешенной буфером 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20), для связывания пептидов с His-tag (отщепленного и непроцессированного GFAP).
Затем обработанный тромбином белок GFAP пропускали через гель-фильтрационную колонку с носителем Superdex 200 («GE Healthcare», США), уравновешенную буфером 15 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 мМ ЭДТА, 0.1 мМ ДTT, 0.05% CHAPS, 0.05% Твин20, для удаления примесей тромбина (мол. вес. ~ 36 кДа). После гельфильтрационной колонки белок концентрировали с помощью мембранного концентратора SPIN-X («Corning», США) с отсечением по молекулярному весу 30 кДа, до концентрации 0.5 мг/мл. Чистоту конечного препарата GFAP оценивали с помощью электрофореза в 12.5% полиакриламидном геле (в присутствии додецилсульфата Na), которая составила ≥ 95%, а молекулярный вес ~ 52 кДа (Фиг.4). Таким образом, с 2 л бактериальной культуры E. coli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP (оптической плотностью 1.5 о.е., λ = 600 нм) удается получить до 4 мг чистого рекомбинантного GFAP человека.
Полученный рекомбинантный GFAP человека подходит для использования в качестве стандарта или калибратора при иммуноферментном анализе (ИФА). Антиген состоит из полноразмерного GFAP человека (SEQ ID NO:5). Следует заметить, что GFAP, будучи фибриллярным белком, при длительном хранении в водных растворах склонен к олигомеризации, образуя водонерастворимые агрегаты. При многократном (более 3 раз) замораживании/размораживании раствор GFAP также способен необратимо агрегировать. В связи с этим, необходима стабилизация рекомбинантного белка для его длительного хранения.
Наиболее оптимальным способом хранения рекомбинантного GFAP является лиофильно-высушенная форма. Лиофилизированный препарат GFAP получают по технологии, включающей как минимум 4 стадии: 1) очистка белка с помощью аффинной хромотографии на Ni-NTA-агарозе и гельфильтрации; 2) концентрирование фракций белка GFAP до концентрации 0.5 мг/мл и диализ (по вышеописанной схеме); 3) введение, по крайней мере, одного стабилизатора; 4) белок в комплексе со стабилизатором/ стабилизаторами замораживают в жидком азоте, 5) процесс лиофилизации проводят при - 20°С до образования сухого порошка GFAP.
Стабилизаторы используют для повышения стабильности рекомбинантного GFAP на длительный срок хранения (не менее одного года), при температуре от +4 до -20°С, в зависимости от срока хранения. Известно, что манноза выполняет функцию сохранения вторичной структуры пептидов и белков [29]. Применение маннозы, в качестве стабилизатора включает, но не ограничивает использование других стабилизаторов. Стабилизаторы могут быть выбраны из группы, состоящей из: 1) одного или более моно- или полисахаридов, или сахарных спиртов (мальтоза, глюкоза, лактоза, трегалоза, сахароза, маннит, инозит, галактоза, рибоза, ксилоза, манноза, сахароза, целлобиоза, рафиноза и мальтотриоза), 2) аминокислот (аланин, глицин и др.), 3) нейтральных белков (бычий сывороточный альбумин и т.п.). В связи с тем, что GFAP является олигомерным белком, для предотвращения его агрегации используют растворы неионных детергентов: 0.05% CHAPS и 0.05% Tween 20. Наличие восстановителя 0.1 мМ дитиотреитола (ДTT) в растворе GFAP препятствует окислению консервативного остатка цистеина (С294), который играет важную роль в полимеризации этого белка.
Лиофилизированный препарат GFAP (в комплексе со стабилизаторами) расфасовывают в стерильные стеклянные флаконы (в зависимости от применения по дозам от 100 до 1000 мкг), герметично закупоривают и хранят при температуре от +4 до -20°С.
Непосредственно перед использованием сухой порошок лиофилизированного GFAP растворяют в деионизованной воде в требуемой концентрации (менее 1 мг/мл, для предотвращения агрегации). Приготовленный раствор белка используют сразу для иммунизации или нанесения на планшет (в качестве стандарта) для проведения ИФА.
Пример 5. Применение рекомбинантного GFAP в качестве стандарта для ИФА
Полученные рекомбинантный GFAP человека может быть использован в качестве антигена (положительного стандарта) при проведении ИФА. Растворы рекомбинантного GFAP человека (в различных разведениях, с концентрацией от 0.25 до 25 нг/мл) вносят в соответствующие лунки микропланшета для ИФА (в объеме 100 - 300 мкл). В качестве отрицательного контроля используется буфер для разведения, который вносится в соответствующие лунки (в таких же объемах, что и положительный контроль GFAP). Затем проводится инкубация микропланшета при комнатной температуре 25°С в течение 2 часов, на орбитальном шейкере, установленном на 300 оборотов/мин, в ходе которого происходит связывание антигена со стенками планшета. Возможно нанесение стандартов GFAP на микропланшеты с антителами на GFAP (в случае проведения «сэндвич» - ИФА). Далее производят промывку лунок микропланшета 3 раза буфером для промывок (по 350 мкл на лунку). Затем вносят по 100-200 мкл антител против GFАР в каждую лунку и проводят инкубацию при комнатной температуре (22-25°С) в течение 1 часа, на орбитальном шейкере, установленном на 300 оборотов/мин. Промывают лунки микропланшета 3 раза буфером для промывок (по 350 мкл на лунку). Затем во все лунки добавляют по 100-200 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой. Затем проводят инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре, на орбитальном шейкере со скоростью 300 оборотов/мин. После промывают лунки микропланшета 3 раза буфером для промывок (по 350 мкл на лунку). Затем добавляют по 100 мкл раствора субстрата в каждую лунку, при этом избегают попадания прямых солнечных лучей на микропланшет. Проводят инкубацию в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку. В течение 5 - 15 минут после остановки реакции проводят оценку оптической плотности образцов при длине волны 450 нм осуществляют на микропланшетном ридере. По результатам полученных данных для стандартов GFAP строится калибровочная кривая, которая используется для количественной оценки содержания антигена в исследуемых биологических образцах.
Пример 6. Применение рекомбинантного GFAP в качестве антигена при иммунизации животных
Полученный полноразмерный GFAP человека (в чистом виде или в комплексе с полным/неполным адъювантом Фрейнда) может быть использован для иммунизации животных. Для кроликов оптимален внутрикожный (область загривка) способ введения GFAP (по 50 - 100 мкг белка в комплексе с адъювантом на животного), в 2 этапа (1-й, 14-й или 17-й день иммунизации) с целью последующего получения поликлональных антител из сыворотки крови. Для мышей оптимален внутримышечный (область бедра) способ введения GFAP (5 - 20 мкг белка в комплексе с адъювантом на животного), в 2 этапа (1-й, 14-й или 21-й день иммунизации), с целью последующего создания гибридом и получения моноклональных антител.
Источники литературы:
1. Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of GFAP and UCH-L1, CA3067055A1, publ. 13.06.2019.
2. Method for diagnosing traumatic brain injury, US2019302127, publ. 03.10.2019.
3. Diagnostic technique of craniocerebral injury using protein biomarkers, RU2741227C1, publ. 21.01.2021.
4. Middeldorp, J., & Hol, E. M. (2011). GFAP in health and disease. Progress in neurobiology, 93(3), 421-443. https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2011.01.005
5. Pelinka, L. E., Kroepfl, A., Schmidhammer, R., Krenn, M., Buchinger, W., Redl, H., & Raabe, A. (2004). Glial fibrillary acidic protein in serum after traumatic brain injury and multiple trauma. The Journal of trauma, 57(5), 1006-1012.
6. Foerch, C., Niessner, M., Back, T., Bauerle, M., De Marchis, G. M., Ferbert, A., Grehl, H., Hamann, G. F., Jacobs, A., Kastrup, A., Klimpe, S., Palm, F., Thomalla, G., Worthmann, H., Sitzer, M., & BE FAST Study Group (2012). Diagnostic accuracy of plasma glial fibrillary acidic protein for differentiating intracerebral hemorrhage and cerebral ischemia in patients with symptoms of acute stroke. Clinical chemistry, 58(1), 237-245. https://doi.org/10.1373/clinchem.2011.172676.
7. Papa, L., Brophy, G. M., Welch, R. D., Lewis, L. M., Braga, C. F., Tan, C. N., Ameli, N. J., Lopez, M. A., Haeussler, C. A., Mendez Giordano, D. I., Silvestri, S., Giordano, P., Weber, K. D., Hill-Pryor, C., & Hack, D. C. (2016). Time Course and Diagnostic Accuracy of Glial and Neuronal Blood Biomarkers GFAP and UCH-L1 in a Large Cohort of Trauma Patients With and Without Mild Traumatic Brain Injury. JAMA neurology, 73(5), 551-560. https://doi.org/10.1001/jamaneurol.2016.0039
8. Vos, P. E., Jacobs, B., Andriessen, T. M., Lamers, K. J., Borm, G. F., Beems, T., Edwards, M., Rosmalen, C. F., & Vissers, J. L. (2010). GFAP and S100B are biomarkers of traumatic brain injury: an observational cohort study. Neurology, 75(20), 1786-1793. https://doi.org/10.1212/WNL.0b013e3181fd62d2
9. Herrmann, M., Vos, P., Wunderlich, M. T., de Bruijn, C. H., & Lamers, K. J. (2000). Release of glial tissue-specific proteins after acute stroke: A comparative analysis of serum concentrations of protein S-100B and glial fibrillary acidic protein. Stroke, 31(11), 2670-2677. https://doi.org/10.1161/01.str.31.11.2670
10. Сосновский Е.А., Пурас Ю.В., Талыпов А.Э. Биохимические маркеры черепно-мозговой травмы. Нейрохирургия. 2014;(2):83-91. https://doi.org/10.17650/1683-3295-2014-0-2-83-91
11. Yang, Z., & Wang, K. K. (2015). Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends in neurosciences, 38(6), 364-374. https://doi.org/10.1016/j.tins.2015.04.003
12. Allen, A., Gulhar, S., Haidari, R., Martinez, J., Bekenstein, J., DeLorenzo, R., Tang, Y., & Oh, U. (2020). Autoimmune glial fibrillary acidic protein astrocytopathy resulting in treatment-refractory flaccid paralysis. Multiple sclerosis and related disorders, 39, 101924. Advance online publication. https://doi.org/10.1016/j.msard.2019.101924
13. Micro-rna, autoantibody and protein markers for diagnosis of neuronal injury, US20130022982, publ. 24.01.2013.
14. Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of GFAP and UCH-L1, CA3067055A1, publ. 13.06.2019.
15.Method for diagnosing traumatic brain injury, US2019302127, publ. 03.10.2019.
16. Diagnostic technique of craniocerebral injury using protein biomarkers, RU2741227C1, publ. 21.01.2021
17. Methods for aiding in diagnosing and evaluating a traumatic brain injury in a human subject using a combination of GFAP and UCH-L1, US11016105B2, publ. 25.05.2021.
18. Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., & Lee, Y. L. (2000). Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000). Neurochemical research, 25(9-10), 1439-1451. https://doi.org/10.1023/a:1007677003387
19. Viedma-Poyatos, Á., de Pablo, Y., Pekny, M., & Pérez-Sala, D. (2018). The cysteine residue of glial fibrillary acidic protein is a critical target for lipoxidation and required for efficient network organization. Free radical biology & medicine, 120, 380-394. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2018.04.007
20. Perng, M. D., Wen, S. F., Gibbon, T., Middeldorp, J., Sluijs, J., Hol, E. M., & Quinlan, R. A. (2008). Glial fibrillary acidic protein filaments can tolerate the incorporation of assembly-compromised GFAP-delta, but with consequences for filament organization and alphaB-crystallin association. Molecular biology of the cell, 19(10), 4521-4533. https://doi.org/10.1091/mbc.e08-03-0284
21. Recombinant Human GFAP protein (ab151370) https://www.abcam.com/recombinant-human-gfap-protein-ab151370.html
22. Glial fibrillary acidic protein (GFAP), human, recombinant https://shop.hytest.fi/product/glial-fibrillary-acidic-protein-gfap-human-recombinant
23. Recombinant Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) http://www.cloud-clone.com/products/RPA068Hu01.html
24. Recombinant Human GFAP protein (ab114149) https://www.abcam.com/recombinant-human-gfap-protein-ab114149.html
25. Recombinant Human GFAP GST (N-Term) Protein https://www.novusbio.com/products/gfap-full-length-recombinant-protein_h00002670-p01.
26. Method of imaging of astroglial bank in diagnosing of high-grade gliomaS RU2437159C1, publ. 20.12.2011.
27. Pavlov Konstantin Alexandrovich. Obtaining and immunochemical analysis of recombinant gliofibrillar acidic protein: dissertation... PhD: 03.00.04 / Pavlov Konstantin Aleksandrovich; [Place of protection: State. scientific center of social and fate. psychiatry them. V.P. Serbian Ministry of Health of the Russian Federation].- Moscow, 2009.- 120 p.: ill. RSL OD, 61 09-3/903.
28. Green M. R., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. - 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2012.
29. Rahim A., Peters G.H.J., Jalkanen K.J., Westh, P. (2013) Effects of mannose, fructose, and fucose on the structure, stability, and hydration of lysozyme in aqueous solution. Current Physical Chemistry. 3(1), 113-125.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3"
fileName="/Users/fedorivanov/Downloads/ Seq List St26.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.2.0"
productionDate="2023-04-17">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022123601</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-09-05</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>GFAP</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
автономное образовательное учреждение высшего образования
"Московский физико-технический институт (национальный
исследовательский университет)"</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Federal State Autonomous Educational Institution
of Higher Education "Moscow Institute of Physics and Technology
(National Research University)"</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ получения рекомбинантного
человеческого глиального фибриллярного кислого белка и используемая в
нём генетическая конструкция</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1333</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1333</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>cagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggagaggagacgcatcacc
tccgctgctcgccgctcctacgtctcctcaggggagatgatggtggggggcctggctcctggccgccgtc
tgggtcctggcacccgcctctccctggctcgaatgccccctccactcccaacccgggtggatttctccct
ggctggggcactcaatgctggcttcaaggagacccgggccagtgagcgggcagagatgatggagctcaat
gaccgctttgccagctacatcgagaaggttcgcttcctggaacagcaaaacaaggcgctggctgctgagc
tgaaccagctgcgggccaaggagcccaccaagctggcagacgtctaccaggctgagctgcgagagctgcg
gctgcggctcgatcaactcaccgccaacagcgcccggctggaggttgagagggacaatctggcacaggac
ctggccactgtgaggcagaagctccaggatgaaaccaacctgaggctggaagccgagaacaacctggctg
cctatagacaggaagcagatgaagccaccctggcccgtctggatctggagaggaagattgagtcgctgga
ggaggagatccggttcttgaggaagatccacgaggaggaggttcgggaactccaggagcagctggcccga
cagcaggtccatgtggagcttgacgtggccaagccagacctcaccgcagccctgaaagagatccgcacgc
agtatgaggcaatggcgtccagcaacatgcatgaagccgaagagtggtaccgctccaagtttgcagacct
gacagacgctgctgcccgcaacgcggagctgctccgccaggccaagcacgaagccaacgactaccggcgc
cagttgcagtccttgacctgcgacctggagtctctgcgcggcacgaacgagtccctggagaggcagatgc
gcgagcaggaggagcggcacgtgcgggaggcggccagttatcaggaggcgctggcgcggctggaggaaga
ggggcagagcctcaaggacgagatggcccgccacttgcaggagtaccaggacctgctcaatgtcaagctg
gccctggacatcgagatcgccacctacaggaagctgctagagggcgaggagaaccggatcaccattcccg
tgcagaccttctccaacctgcagattcgagaaaccagcctggacaccaagtctgtgtcagaaggccacct
caagaggaacatcgtggtgaagaccgtggagatgcgggatggagaggtcattaaggagtccaagcaggag
cacaaggatgtgatgtaagaattc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>6626</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..6626</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgttt
agaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggct
ttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaagcttgtcgacggagc
tcgaattcttacatcacatccttgtgctcctgcttggactccttaatgacctctccatcccgcatctcca
cggtcttcaccacgatgttcctcttgaggtggccttctgacacagacttggtgtccaggctggtttctcg
aatctgcaggttggagaaggtctgcacgggaatggtgatccggttctcctcgccctctagcagcttcctg
taggtggcgatctcgatgtccagggccagcttgacattgagcaggtcctggtactcctgcaagtggcggg
ccatctcgtccttgaggctctgcccctcttcctccagccgcgccagcgcctcctgataactggccgcctc
ccgcacgtgccgctcctcctgctcgcgcatctgcctctccagggactcgttcgtgccgcgcagagactcc
aggtcgcaggtcaaggactgcaactggcgccggtagtcgttggcttcgtgcttggcctggcggagcagct
ccgcgttgcgggcagcagcgtctgtcaggtctgcaaacttggagcggtaccactcttcggcttcatgcat
gttgctggacgccattgcctcatactgcgtgcggatctctttcagggctgcggtgaggtctggcttggcc
acgtcaagctccacatggacctgctgtcgggccagctgctcctggagttcccgaacctcctcctcgtgga
tcttcctcaagaaccggatctcctcctccagcgactcaatcttcctctccagatccagacgggccagggt
ggcttcatctgcttcctgtctataggcagccaggttgttctcggcttccagcctcaggttggtttcatcc
tggagcttctgcctcacagtggccaggtcctgtgccagattgtccctctcaacctccagccgggcgctgt
tggcggtgagttgatcgagccgcagccgcagctctcgcagctcagcctggtagacgtctgccagcttggt
gggctccttggcccgcagctggttcagctcagcagccagcgccttgttttgctgttccaggaagcgaacc
ttctcgatgtagctggcaaagcggtcattgagctccatcatctctgcccgctcactggcccgggtctcct
tgaagccagcattgagtgccccagccagggagaaatccacccgggttgggagtggagggggcattcgagc
cagggagaggcgggtgccaggacccagacggcggccaggagccaggccccccaccatcatctcccctgag
gagacgtaggagcggcgagcagcggaggtgatgcgtctcctctccatatggctgccgcgcggcaccaggc
cgctgctgtgatgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaatta
tttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgag
atctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcct
atatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgt
gggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcg
gcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagc
gtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagaga
gtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctctta
tcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcg
gcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctga
ttggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgc
cgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcg
gtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgcca
ttgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaa
cagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccag
caaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaat
atctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttca
acaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcg
ctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacg
acgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggg
gcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgccc
gtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccg
attcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatg
taagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctc
cttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgta
ggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcg
gcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaa
acgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctg
tcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagc
gaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccg
tgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcagga
tgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgattt
ttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttc
atcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaat
cccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaa
gccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatc
gcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctc
tgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtc
agggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagt
gtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaat
accgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctg
cgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaat
caggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgc
gttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagagg
tggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctg
ttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatag
ctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaacccccc
gttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttat
cgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttctt
gaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagtt
accttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttg
tttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtc
tgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacat
aaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaat
tccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaa
tctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaa
tgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcat
tttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtat
tagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattc
gattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatg
aataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctgga
aagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataa
ccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgatac
caggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaa
aatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaaga
attaattcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatt
tccccgaaaagtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaa
atcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgaga
tagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagg
gcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcg
aggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccgg
cgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggt
cacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca</I
NSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>451</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..451</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGR
RLGPGTRLSLARMPPPLPTRVDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAA
LNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLA
AYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRT
QYEAMASSNMHEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQM
REQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIP
VQTFSNLQIRETSLDTKSVSEGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM</INSDSeq_sequence
>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>20</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..20</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MGSSHHHHHHSSGLVPRGSH</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>432</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..432</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q11">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Homo sapiens</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTR
VDFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAELNQLRAKEPTKLADVYQAE
LRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLATVRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERK
IESLEEEIRFLRKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNMHEAEEWYRS
KFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLRGTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALA
RLEEEGQSLKDEMARHLQEYQDLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSV
SEGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (2)
1. Рекомбинантный штамм E. сoli Origami 2 (DE3) pET28ahGFAP для получения рекомбинантного глиального фибрилярного кислого белка (GFAP) человека для применения в диагностических целях, полученный путем трансформации штамма E. сoli Origami 2 (DE3) плазмидой pET28a-hGFAP, представленной на фиг.2.
2. Способ получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка, в ходе которого клонируют ген GFAP человека в вектор рЕТ28а с последующей экспрессией в штамме Е. coli, отличающийся тем, что используют штамм по п.1, причем осадок бактериальных клеток штамм-продуцента E. сoli Origami 2 (DE3) pET28a-hGFAP ресуспендируют в фосфатном буфере и разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора на льду, клеточный дебрис, содержащий тельца включений E. сoli с рекомбинантным GFAP человека, собирают центрифугированием, а полученный осадок растворяют в денатурирующим буферном растворе, содержащем мочевину, Tris-HCl и имидазол, после чего полученный раствор фильтруют и наносят на хроматографическую колонку, предварительно уравновешенную фосфатным буфером, затем осуществляют адсорбцию рекомбинантного GFAP человека на Ni-NTA-агарозе, после чего хроматографическую колонку промывают буферным раствором, содержащем мочевину, Tris-HCl и имидазол, далее полученный раствор белка подвергают ступенчатому диализу, в результате чего происходит разбавление мочевины и ренатурация белка GFAP, после чего ренатурированный белок GFAP концентрируют, обрабатывают тромбином, пропускают через колонку с Ni-NTA агарозой, затем пропускают через гель-фильтрационную колонку, после чего белок концентрируют.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2811427C1 true RU2811427C1 (ru) | 2024-01-11 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2437159C1 (ru) * | 2010-04-26 | 2011-12-20 | Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | Способ визуализации астроглиального вала в диагностике низкодифференцированных глиом |
| CN103937826B (zh) * | 2014-04-04 | 2016-04-06 | 东华大学 | 一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2437159C1 (ru) * | 2010-04-26 | 2011-12-20 | Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО РГМУ Росздрава) | Способ визуализации астроглиального вала в диагностике низкодифференцированных глиом |
| CN103937826B (zh) * | 2014-04-04 | 2016-04-06 | 东华大学 | 一种中枢神经系统中特异表达miR-505的载体的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ПАВЛОВ К. А. Получение и иммунохимическии анализ рекомбинантного глиофибриллярного кислого протеина. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва-2009. 22 с. CHEKHONIN, V.P. et al. Cloning and expression of rat GFAP cDNA in Escherichia coli. Bull Exp Biol Med 143, 68-71 (2007). https://doi.org/10.1007/s10517-007-0019-9. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10400229B2 (en) | Bacterial hyaluronidase and process for its production | |
| JP2015231378A (ja) | 短い生物学的活性を示す神経毒 | |
| JPH05507209A (ja) | チオレドキシンおよびチオレドキシン様分子に対するペプチドおよび蛋白融合 | |
| JP2008531046A (ja) | 動物由来産物不含方法およびボツリヌス毒素を精製するための方法 | |
| EP3262061B1 (en) | Peptides for facilitating secretion and uses thereof | |
| CN108291248A (zh) | 对atp结合位点进行突变的血管内皮抑制素突变体 | |
| KR20150074016A (ko) | 돼지의 부종병을 예방하는 백신 | |
| Charbonnier et al. | Overexpression, refolding, and purification of the histidine-tagged outer membrane efflux protein OprM of Pseudomonas aeruginosa | |
| JPH10505752A (ja) | システイン・プロテアーゼあるいはその断片を含む連鎖球菌を識別するための方法および組成物 | |
| RU2811427C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного человеческого глиального фибриллярного кислого белка и используемый в нём штамм-продуцент | |
| JP2003512048A (ja) | ヘリコバクターカタラーゼのｃ−末端部分を含むポリペプチド断片 | |
| Yuan et al. | Expression and purification of bioactive high-purity recombinant mouse SPP1 in Escherichia coli | |
| Codolo et al. | Structure and immunomodulatory property relationship in NapA of Borrelia burgdorferi | |
| JP2012147772A (ja) | 組換えプラスミドベクターおよびそれを用いたタンパク質の製造方法 | |
| CN108300725B (zh) | 可溶性单链抗体超抗原融合基因及蛋白和其制备与应用 | |
| WO1992005276A1 (en) | A method for over-expression and rapid purification of biosynthetic proteins | |
| RU2430161C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pQe30_PS-CFP2/Turbo YFP_MBP7, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК PS-CFP2/Turbo YFP_MBP7, ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3)/pQe30_PS-CFP2/Turbo YFP_MBP7 - ПРОДУЦЕНТ УКАЗАННОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА PS-CFP2/Turbo YFP_MBP7 | |
| JP6624542B2 (ja) | ヒトｈｍｇｂ１結合剤およびヒトｈｍｇｂ１除去装置 | |
| Ng et al. | Cloning, expression, purification and preliminary X-ray diffraction studies of a novel AB5 toxin | |
| Alaksandr et al. | Efficient matrix-assisted refolding of the recombinant anti-staphylococcal truncated endolysin LysKCA and its structural and enzymatic description | |
| RU2583307C2 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pET22b(+)/slurp-2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК SLURP-2, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3) pET22b(+)/slurp-2- ПРОДУЦЕНТ БЕЛКА SLURP-2 ЧЕЛОВЕКА | |
| JP6474727B2 (ja) | 抗菌薬の標的としての鞭毛及びニードル複合体（インジェクトソーム）のループ | |
| Shingarova et al. | Deletion variants of autotransporter from Psychrobacter cryohalolentis increase efficiency of 10FN3 exposure on the surface of Escherichia coli cells | |
| WO2008029807A1 (fr) | Nouveau polypeptide ayant une cytotoxicité contre le cancer, procédé pour cribler le polypeptide et utilisation du polypeptide | |
| Tungekar et al. | Understanding in-vivo refolding of antibody fragments (Fab): Biosimilar Ranibizumab a case study |