CN1232537C - 一种重链可变区单域抗体强化融合蛋白vh－ldp－ae - Google Patents

一种重链可变区单域抗体强化融合蛋白vh－ldp－ae Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种强化融合蛋白VH-LDP-AE，通过构建抗IV型胶原酶抗体重链可变区单域(VH)基因与力达霉素辅基蛋白(LDP)基因的融合基因并在大肠杆菌CAMS/HLDFP中高效表达制备活性融合蛋白VH-LDP，进一步将VH-LDP与力达霉素的活性发色团AE进行分子重建，得到强化融合蛋白VH-LDP-AE，它在体外具有强烈肿瘤细胞杀伤作用，在体内试验对小鼠移植性肝癌22有非常显著的疗效，抑瘤率达到95.9%，是迄今已构建的最小的单域抗体强化融合蛋白，在肿瘤靶向性免疫治疗药物的小型化方面达到一个新水平，具有良好的应用前景。

Description

一种重链可变区单域抗体强化融合蛋白VH-LDP-AE
技术领域：
本发明涉及的强化融合蛋白VH-LDP-AE，是一种具有强烈肿瘤细胞杀伤活性和抗肿瘤疗效的新型、小型、高效肿瘤靶向性治疗剂。
背景技术：
IV型胶原酶降解IV型胶原等细胞外基质组分，破坏基底膜及细胞外基质的完整性，与肿瘤生长、侵袭和转移的关系甚为密切。在人类前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等肿瘤细胞和组织中均存在IV型胶原酶高表达，抑制其活性可以抑制肿瘤的生长和转移。单域抗体(single domain antibody)是抗体的最小功能结合单位，相当于人抗体的重链或轻链可变区(VH/VL)，其分子量为11-13kD，约为完整抗体分子量(150kD)的十二分之一，是继全抗、抗原结合片段(Fab)、单链抗体(scFv)之后的新一代治疗抗体。单域抗体具有传统抗体和小分子药物的双重优势：首先，不仅有更好的实体瘤细胞间隙穿透性，在肿瘤中更加均衡的生物分布，还具更低的免疫源性，从而在肿瘤靶向性治疗中显示更好的疗效；其次，小分子不仅可与标准的抗体靶标结合，还可与传统抗体不能到达的靶标如受体裂缝或酶活性位点相结合；第三，应用细菌和酵母发酵就可进行低成本大规模生产，避免了在哺乳动物细胞中的生产瓶颈。单域抗体作为肿瘤靶向药物的载体具有诱人的前景。
高活性的“弹头”药物力达霉素(LDM)，亦称C-1027或C1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株由球孢链霉菌(Streptiomyces globisporus，菌种保藏编号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物实验表明，LDM对小鼠结肠癌26有非常显著的疗效，对移植裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693等多种人体移植肿瘤均有较好疗效[中国抗生素杂志1994，19(2)：164-168]。LDM由两部分分子组成：一为烯二炔结构的发色团(active enediyne，AE)，具有细胞毒作用，但不稳定；另一为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP)，对发色团的稳定起保护作用。发色团和辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合具有特异性和牢固性，LDM的辅基蛋白和发色团可以拆分和进行分子重建。LDM以其独特的分子结构可以成为构建新型单抗导向药物的理想“弹头”药物[中国医学科学院学报2001，23(6)：563-567]。
小型化、高效化是解决当前单抗治疗剂所遇到问题的主要有效途径。本发明所涉及的VH-LDP-AE是以抗IV型胶原酶单抗3G11的重链可变区(VH)单域抗体为载体，强效抗肿瘤抗生素LDM为“弹头”，采用DNA重组和分子重建技术相结合而制备的肿瘤导向免疫融合蛋白。研究表明，VH-LDP-AE在体外对肿瘤细胞有强烈的杀伤活性，体内实验对小鼠移植性肝癌22有非常显著的疗效，并且与羟基喜树碱或5-氟尿嘧啶联用对人结肠癌HT-29细胞的增殖抑制作用存在明显的协同作用。本发明所说的单域抗体融合蛋白VH-LDP-AE的分子量为26.2kD，是迄今已知的分子量最小的体内试验有显著疗效的抗肿瘤免疫融合蛋白。本发明所说的单域抗体强化融合蛋白VH-LDP-AE目前亦未见有相关报道。
发明内容：
本发明涉及的单域抗体强化融合蛋白VH-LDP-AE系由抗IV型胶原酶单抗3G11的重链可变区单域VH、力达霉素辅基蛋白LDP和力达霉素活性发色团AE组成，分子量为26.2kD，其融合蛋白VH-LDP的基因编码序列和氨基酸组成如序列表所示。
本项发明的技术方案包括以下步骤：
1、抗IV型胶原酶抗体重链可变区单域VH基因和力达霉素辅基蛋白LDP基因的克隆和重组表达质粒pET-VH-LDP的构建：重组质粒pKFv1027和pIJ1027GRGDS分别含有VH基因和LDP基因，由本实验室构建(本实验室可向公众提供并出具相关证明)。pGEM-T载体为美国Promega公司产品，大肠杆菌菌种E.coli.DH5α本实验室保存，大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)为本实验室保存的Invitrogen公司的产品。PCR引物由上海生工公司合成，分别引入相应酶切位点。
VH 5’端引物(PH1)：
5’GATA  CATATG  CAGGTGAAGCTGCAGCAGTCT3’：
          NdeI               VH
VH3’端引物(PH2)：
5’CATA GGATCCGCCACCGCC TGAGGAGACGGTGACCGTGGT3’
         BamHI     spacer                VH
LDP 5’端引物(PLD1)：
GATA  GGATCC  GCGCCCGCCTTCTCCGTCAGT3’
         BamHI          LDP
LDP 3’端引物(PLD2)：
GTTA  CTCGAG  GCCGAAGGTCAGAGCCACGTG3’
         XhoI             LDP
以重组质粒pKFv1027为模板，PH1为5’端引物，PH2为3’端引物，进行PCR扩增，获得C末端带有一段编码GGGGS序列的spacer小肽的重链可变区单域抗体VH基因；同时以重组质粒pIJ1027GRGDS为模板，PLD1为5’端引物，PLD2为3’端引物，进行PCR扩增，获得LDP基因片段。PCR反应体系为：94℃预变性2分钟，然后94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，进行25个循环的扩增反应，最终一个循环后在72℃保温10分钟。
两种PCR产物利用博大泰克公司的DNA片段玻璃奶回收试剂盒纯化回收后，按Promega公司pGEM-T载体试剂盒提供的方法与pGEM-T载体相连，转化大肠杆菌DH5α，筛选出重组克隆质粒，经上海生工公司测序确定序列正确后分别命名为pGEM-T-VH、pGEM-T-LDP。将质粒pGEM-T-LDP进行BamHI/XhoI双酶切，释放出的LDP基因片段亚克隆至pET-30a(+)载体，得到重组质粒pET-LDP。然后将pGEM-T-VH进行NdeI/BamHI双酶切，释放出的VH基因片段与进行同样双酶切的质粒pET-LDP连接，得到VH基因和LDP基因的融合基因重组表达质粒pET-VH-LDP，并进行酶切鉴定(图1)和序列测定。结果表明，融合基因重组表达质粒pET-VH-LDP的酶切结果和测序结果与预期完全一致，融合蛋白的基因编码序列为732bp，由243个氨基酸组成，序列正确。
本发明在力达霉素辅基蛋白LDP基因3’端引入了XhoI酶切位点，恰好可以利用质粒pET-30a(+)多克隆位点3’端的6个连续组氨酸标签肽(His6-Tag)的密码子，使得表达蛋白的3’端融合有His6-Tag，便于纯化和鉴定。
2、融合蛋白VH-LDP在大肠杆菌BL21starTM(DE3)中的诱导表达：本发明使用的大肠杆菌表达菌株BL21starTM(DE3)为Invitrogen公司产品。以构建好的重组质粒pET-VH-LDP转化大肠杆菌BL21starTM(DE3)，得到重组转化菌。挑取单克隆接种到含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃震荡过夜；次日按1∶50接种，37℃震荡培养至OD600为0.7，向培养物中加入终浓度为0.05mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导培养3小时，按pET系统操作手册(Novagen，第九版)分别制备全细胞蛋白组分、培养液上清组分、细胞周质腔组分、可溶性细胞质和不可溶性细胞质(包涵体)组分，然后在变性条件下进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分析外源蛋白表达情况。结果表明，经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白，表达量占全菌总蛋白的30％以上，且表达产物存在于细菌不可溶的包涵体中(图2)。
用Western blot检测方法对表达蛋白进行进一步确认，将电泳后的凝胶在Bio-Rad电转槽中进行半干电转，条件为：恒电流0.65mA/cm2，时间为1小时50分钟。电转结束后的聚偏二氟乙烯膜(PVDF)与用封闭液2000倍稀释的一抗即抗His6-Tag单抗孵育，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行显色分析，结果表明，重组菌株表达的确为C-末端带有His6-Tag的重组融合蛋白VH-LDP(图2)。将表达VH-LDP融合蛋白的重组转化菌株命名为CAMS/HLDFP，已于2004年04月09日送交中国专利局指定的菌种保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市海淀区中关村北一条13号保藏(保藏编号：CGMCC No.1130，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli)。
3、融合蛋白VH-LDP的纯化和复性：采用Novagen公司的His·Bind纯化试剂盒于变性条件下纯化融合蛋白样品，按试剂盒说明书进行操作。对包涵体蛋白样品和亲和层析柱进行预处理后，样品上柱，依次以10倍柱床体积的含6M尿素的结合缓冲液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)，6体积含6M尿素的洗涤缓冲液(60mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗涤层析柱，最后以含6M尿素的洗脱缓冲液(100mM EDTA，0.5M NaCl，20mMTris-HCl pH 7.9)进行洗脱，收集洗脱组分获得纯化的融合蛋白VH-LDP(图3)。融合蛋白VH-LDP的理论分子量为25.4kD。
对纯化后的融合蛋白VH-LDP进行复性：将纯化后的样品用含6M尿素的洗脱缓冲液稀释至15μM，加入2-巯基乙醇至终浓度为10mM，室温放置30分钟，然后将样品装入透析袋，用至少50倍样品体积的复性液I(50mM Tris-HClpH 8.0，1mM EDTA，200mM NaCl，6M尿素)透析过夜。再用与复性液I同样组分但尿素浓度依次为3M、2M、1M、0.5M、0M的50倍体积的缓冲液进行分步透析，在尿素浓度为1M的阶段加入750μM的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和400mM的L-精氨酸。将最后一次透析所得样品用50倍体积磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)透析，每12小时更换一次透析液，共两次。以上透析操作均于4℃进行。将透析后的样品以10,000g，4℃离心30分钟，收集上清。将上清样品进行浓缩后得到活性融合蛋白VH-LDP，置于-20℃备用。
4、融合蛋白VH-LDP的免疫学活性：以酶联免疫吸附分析方法(ELISA)进行测定。首先进行IV型胶原酶的包被或细胞的固定：将IV型胶原酶以PBS配制成10μg/ml的溶液，以100μl/井包被96孔板，然后置4℃过夜；将对数生长期的人肝癌Bel-7402细胞或人口腔鳞癌KB细胞按2×104/井的密度接种于96孔培养板，培养24小时后PBS洗3次，加4℃预冷的0.05％的戊二醛固定15分钟。然后将包被好的IV型胶原酶板或固定好的细胞96孔板用PBS洗3次后，加入含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS 200μl/井，4℃封闭过夜。PBS洗3次后，加入倍比稀释的待测样品50μl/井，37℃温育2小时。再以含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)200μl/井洗板3次，加入1∶1500倍稀释的抗His6-Tag单克隆抗体50μl/井，37℃反应1小时。以PBST洗板3次，50μl/井加入1：2000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG，37℃反应1小时。最后以PBST洗板6次，100μl/井加入邻苯二胺(OPD)底物反应液，室温暗处反应10分钟。以2M硫酸100μl/井终止反应，在酶标仪上测定490nm吸光值。结果表明，和单抗3G11的单链抗体3G11-scFv类似，融合蛋白VH-LDP对IV型胶原酶(图4)、人肝癌Bel-7402细胞(图5)、人口腔鳞癌KB细胞(图6)的免疫反应均呈阳性。
5、融合蛋白VH-LDP对IV型胶原酶活性的抑制作用：采用明胶酶谱法。取对数生长期的人纤维肉瘤HT-1080细胞，按1×105/孔加于24孔培养板中，37℃，5％CO2培养24小时。然后吸弃培养液，加入1ml无血清RPMI 1640培养液轻轻冲洗2次。每孔加入120μl无血清RPMI 1640培养液和30μl样品，对照孔加入30μl PBS，继续培养24小时。吸取培养液，500g离心5分钟，取上清进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕后，取出凝胶，用蒸馏水漂洗3次。将凝胶放入100ml 2.5％的曲拉通X-100(TritonX-100)中，于摇床上低速摇动30分钟。然后以蒸馏水漂洗2次，换100ml新的2.5％的TritonX-100溶液，低速摇动30分钟。蒸馏水漂洗2次，加入100ml明胶酶缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，200mM NaCl，10mM CaCl2，1μM ZnCl2)，37℃孵育16-18小时。考马斯亮蓝R250染色，乙酸∶甲醇∶水(10∶45∶45)脱色后观察负染明胶条带。结果表明，免疫融合蛋白VH-LDP对肿瘤细胞分泌的IV型胶原酶的活性有明显的抑制作用，能够使人纤维肉瘤HT-1080细胞分泌的92kD MMP-9和72kD MMP-2的IV型胶原酶负染条带明显减弱，并且呈浓度依赖性(图7)。
6、强化融合蛋白VH-LDP-AE的制备：取高活性LDM冻干品(本实验室制备保存并可向公众提供)10mg，加5ml冷甲醇振摇5分钟，-20℃放置1小时，中间振摇1次；在0℃，12000转/分钟离心20分钟，上清液含发色团，沉降物为肽链，重复提取2次。发色团甲醇液蒸发浓缩，-70℃储存。发色团不稳定，实验需低温(4℃)、避光进行。然后取VH-LDP融合蛋白溶于PBS中，加入5倍分子量的发色团-甲醇溶液(体积比为50∶1)，混合振摇，室温放置12小时。最后将混合液进行PD-10柱(商业化的Sephadex G-25柱，Pharmacia产品)层析，经A280nm和A343nm紫外监测后收集强化融合蛋白VH-LDP-AE(图8)。VH-LDP-AE的理论分子量为26.2kD。
7、强化融合蛋白VH-LDP-AE对体外培养的肿瘤细胞的细胞毒作用：以噻唑蓝(MTT)法进行测定。取对数生长期的细胞消化、计数，3000/井铺于96孔板，在37℃含5％CO2的培养箱中培养24小时后加入不同浓度的药物，每个药物浓度设3个平行孔。继续培养72小时，每孔加入50μl无血清RPMI 1640培养液溶解的MTT(2mg/ml)，37℃继续培养4小时，轻轻吸去培养液，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，室温下摇床振摇15分钟，酶标仪上测定560nm光吸收值。每次试验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔。按公式：细胞存活率＝(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100％计算细胞的存活率及半数抑制浓度(IC50)值。强化融合蛋白VH-LDP-AE对HT-1080细胞、KB细胞、人巨细胞肺癌PG细胞均由有强烈的杀伤作用，其IC50值均小于10-11M(表1)。
表1、VH-LDP-AE对肿瘤细胞的杀伤作用
组别                       IC50(M)
  HT-1080   KB   PG
  LDMVH-LDP-AE   2.21×10-12   1.08×10-12   6.30×10-12
  7.65×10-13   4.35×10-14   1.49×10-13
8、强化融合蛋白VH-LDP-AE对小鼠移植性肝癌22肿瘤模型的治疗作用：领取生长状态良好的体重为18-22克的昆明小鼠随机分组，每组10只。实验第0天，取小鼠肝癌22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为7.5×106/ml，按0.2ml/只接种于昆明小鼠腋窝皮下。实验第1天(24小时后)开始治疗，对照组静脉注射生理盐水0.2ml/只。其余各组分别给予不同剂量的强化融合蛋白VH-LDP-AE，0.05mg/kg的LDM，1mg/kg的丝裂霉素(MMC)。均为尾静脉注射，0.2ml/只。试验期间，每三天测量一次肿瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V＝0.5ab2计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，并计算抑瘤率。
强化融合蛋白VH-LDP-AE的治疗结果表明，0.25mg/kg和0.125mg/kg两个剂量的VH-LDP-AE均能显著抑制或延迟小鼠移植性肿瘤H22的生长，并且表现出比0.05mg/kg耐受剂量游离力达霉素更强的肿瘤生长抑制作用，显示VH-LDP-AE提高了力达霉素的治疗效果(图9)。在实验第14天的结果显示，两个剂量的VH-LDP-AE的抑瘤率分别为95.9％和88.1％，均显著强于LDM组的79.6％抑瘤率，而常用肿瘤化疗药丝裂霉素的抑瘤率仅为51.5％(表2)。在实验治疗期间，动物体重有所增加，一般状况良好，表明动物可耐受所给剂量。
表2、VH-LDP-AE对小鼠移植性肝癌22的生长抑制作用
组别 剂量(mg/kg) 小鼠数量 体重(g)   肿瘤体积(cm3)x±s 抑制率(％)
开始/结束 开始/结束
  Control   10/10   18.89/33.20   4.60±1.48
  LDM   0.05   10/10   19.77/26.28   0.94±0.53   79.6ΔΔ
VH-LDP-AE   0.250.125   10/1010/10   19.27/23.5019.01/27.59   0.19±0.210.55±0.24   95.9**ΔΔ88.1*ΔΔ
  MMC   1   10/10   18.82/29.29   2.23±2.15   51.5Δ
*与LDM相比，P＜0.05，**与LDM相比P＜0.01；
Δ与空白对照相比P＜0.05，ΔΔ与空白对照相比P＜0.01.
9、VH-LDP-AE与抗肿瘤药物联用对肿瘤细胞的增殖抑制作用：用MTT法进行检测。取对数生长期的人结肠癌HT-29细胞，用胰酶-EDTA进行消化后，按4000/井加入96井板，24小时后加入药物。首先加入不同浓度的羟基喜树碱或5-氟尿嘧啶各20μl，8小时后加入不同浓度的VH-LDP-AE，然后继续在37℃、5％CO2孵箱中培养72小时。加入2mg/ml MTT 50μl，于37℃继续培养4小时。吸去上清，加入150μl二甲基亚砜，10分钟后于570nm处测定吸光度值。肿瘤药理中，药物相互作用用药物相互作用指数CDI进行评价，CDI值小于1表示存在协同作用，CDI值小于0.7表示存在非常显著的协同作用。1μM羟基喜树碱和3ng/ml强化融合蛋白VH-LDP-AE联用时，其CDI＜0.7，说明二者能协同抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖(图10)；5-氟尿嘧啶和VH-LDP-AE联合应用，其中10μM 5-氟尿嘧啶和3ng/ml强化融合蛋白对HT-29细胞增殖的CDI＜0.7，说明5-氟尿嘧啶和VH-LDP-AE联用存在明显的协同作用(图11)。单抗药物的应用常常与已知抗肿瘤药物联用，本结果表明，强化融合蛋白VH-LDP-AE与羟基喜树碱或5-氟尿嘧啶联用存在明显的协同作用。
发明效果：
本发明的优点与积极效果在于：应用基因重组和分子重建相结合的方法，制备了抗IV型胶原酶单抗3G11的重链可变区单域抗体与抗肿瘤抗生素力达霉素的强化融合蛋白VH-LDP-AE，不仅保留了完整抗体对IV型胶原酶的结合和抑制活性，还具有强烈的肿瘤细胞杀伤活性，在体内实验中也显示了良好的抗肿瘤疗效。它是迄今为止已报道分子量最小的具强烈抗肿瘤作用的单域抗体融合蛋白，在肿瘤靶向免疫治疗药物的小型化方面达到一个新水平，具有良好的应用前景。
附图说明：
图1：重组表达质粒pET-VH-LDP的限制性内切酶分析
其中：1-DNA分子量标准(DL15,000)  2-质粒pET-30a(+)
      3-重组质粒pET-VH-LDP       4-pET-30a(+)/NdeI+XhoI
      5-pET-VH-LDP/NdeI+XhoI     6-pET-VH-LDP/NdeI+BamHI
      7-pET-VH-LDP/BamHI+XhoI    8-DNA分子量标准(DL2,000)
图2：融合蛋白VH-LDP表达产物的SDS-PAGE(左)和Western Blot(右)分析
其中：1-低分子量蛋白标准
2-BL21starTM(DE3)/pET-30a(+)菌株经IPTG诱导后的全菌蛋白
3-重组菌株CAMS/HLDFP未经IPTG诱导的全菌蛋白
4-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的全菌蛋白
5-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的培养上清组分
6-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的细胞周质腔组分
7-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的可溶性细胞质组分
8-重组菌株CAMS/HLDFP经IPTG诱导后的不可溶包涵体组分
图3：融合蛋白VH-LDP经金属螯合层析纯化的SDS-PAGE分析
其中：1-低分子量蛋白标准
      2-全菌蛋白样品
      3-上柱前样品
      4-不与亲和层析柱结合的杂蛋白
      5-6-经结合缓冲液洗涤下来的杂蛋白
      7-经洗涤缓冲液洗涤下来的杂蛋白
      8-9-经洗脱缓冲液洗脱下来的融合蛋白VH-LDP
图4：融合蛋白VH-LDP对IV型胶原酶的免疫反应性
其中：○融和蛋白VH-LDP；
      ▲抗IV型胶原酶单链抗体蛋白3G11-scFv
图5：融合蛋白VH-LDP对人肝癌Bel-7402细胞的免疫反应性
其中：○融和蛋白VH-LDP；
      ▲抗IV型胶原酶单链抗体蛋白3G11-scFv
图6：融合蛋白VH-LDP对人口腔鳞癌KB细胞的免疫反应性
其中：○融和蛋白VH-LDP；
      ▲抗IV型胶原酶单链抗体蛋白3G11-scFv
图7：融合蛋白VH-LDP对人纤维肉瘤HT-1080细胞的明胶酶谱分析
其中：1-PBS                      2-25μM VH-LDP融合蛋白
      3-50μM VH-LDP融合蛋白     4-100μM VH-LDP融合蛋白
      5-20μM3G11-scFv
图8：强化融合蛋白VH-LDP-AE的制备
其中：▲280nm光吸收值          ■343nm光吸收值
图9：强化融合蛋白VH-LDP-AE对小鼠肝癌22生长的抑制作用
其中：□对照组    ▲LDM组    △VH-LDP-AE 0.25mg/kg组
      ×VH-LDP-AE 0.125mg/kg组  +丝裂霉素1mg/kg组
图10：强化融合蛋白VH-LDP-AE和羟基喜树碱联用对HT-29细胞增殖作用的影响
其中■羟基喜树碱
    ●羟基喜树碱+VH-LDP-AE(1ng/ml)
    ▲羟基喜树碱+VH-LDP-AE(3ng/ml)
    *CDI＜0.9；**CDI＜0.8；***CDI＜0.7
图11：强化融合蛋白VH-LDP-AE和5-氟尿嘧啶联用对HT-29细胞增殖作用的影响
其中：■5-氟尿嘧啶
      ●5-氟尿嘧啶+VH-LDP-AE(1ng/ml)
      *CDI＜0.9；**CDI＜0.8；***CDI＜0.7
                        序列表
<110>中国医学科学院医药生物技术研究所
<120>一种重链可变区单域抗体强化融合蛋白VH-LDP-AE
<160>2
<210>1
<211>732
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>抗IV型胶原酶重链可变区基因和力达霉素辅基蛋白基因的重组融合序列
<400>1
atgcaggtga agctgcagca gtctggaact gaagtggtaa agcctggggc ttcagtgaag    60
ttgtcctgca aggcttctgg ctacatcttc acaagttatg atatagactg ggtgaggcag    120
acgcctgaac agggacttga gtggattgga tggatttttc ctggagaggg gagtactgaa    180
tacaatgaga agttcaaggg cagggccaca ctgagtgtag acaagtcctc cagcacagcc    240
tatatggagc tcactaggct gacatctgag gactctgctg tctatttctg tgctagaggg    300
gactactata ggcgctactt tgacttgtgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca    360
ggcggtggcg gatccgcgcc cgccttctcc gtcagtcccg cctcgggtct gagtgacgga    420
cagagcgtgt cggtgtcggt cagcggtgcc gccgccggcg agacctacta catcgcccag    480
tgcgctccgg tcggtggcca ggacgcgtgc aacccggcga ccgcgacgtc cttcaccacg    540
gacgcgtccg gagcggcgtc gttcagcttc gtcgtgcgca agtcgtacac gggctccacg    600
cccgaaggca cgccggtcgg cagcgtcgac tgcgccacgg ccgcctgtaa cctcggcgcc    660
ggcaactccg ggctcgacct cggccacgtg gctctgacct tcggcctcga gcaccaccac    720
caccaccact ga                                                        732
<210>2
<211>243
<213>人工序列
<212>PRT
<220>
<223>抗IV型胶原酶重链可变区单域抗体和力达霉素辅基蛋白的融合序列
<400>2
Met Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly
  1               5                  10                  15
Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser
             20                  25                  30
Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp
         35                  40                  45
Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys
     50                  55                  60
Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65                   70                  75                  80
Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
                 85                  90                  95
Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala
        115                 120                 125
Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly Gln Ser Val Ser
    130                 135                 140
Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr Tyr Tyr Ile Ala Gln
145                 150                 155                 160
Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys Asn Pro Ala Thr Ala Thr
                165                 170                 175
Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala Ala Ser Phe Ser Phe Val Val
            180                 185                 190
Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser
        195                 200                 205
Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly
    210                 215                 220
Leu Asp Leu Gly His Val Ala Leu Thr Phe Gly Leu Glu His His His
225                 230                 235                 240
His His His

Claims (8)

1、一种强化融合蛋白VH-LDP-AE，其特征是所说VH-LDP-AE系由抗IV型胶原酶单抗3G11的重链可变区单域VH、力达霉素辅基蛋白LDP和力达霉素活性发色团AE组成，其分子量为26.2kD，融合蛋白VH-LDP的基因编码序列为SEQ ID No.1。
2、一种制备如权利要求1所述的强化融合蛋白VH-LDP-AE的方法，其特征是所说方法包括以下步骤：
a)抗IV型胶原酶抗体重链可变区单域VH基因和力达霉素辅基蛋白LDP基因的克隆及重组表达质粒pET-VH-LDP的构建；
b)融合蛋白VH-LDP在大肠杆菌中的诱导表达；
c)融合蛋白VH-LDP的纯化及复性；
d)融合蛋白VH-LDP的生物学活性测定；
e)强化融合蛋白VH-LDP-AE的制备。
3、如权利要求2所述的制备方法，其特征是运用基因工程技术分别克隆得到力达霉素辅基蛋白LDP基因和抗IV型胶原酶抗体重链可变区单域VH基因并将LDP基因亚克隆至大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)，构建重组质粒pET-LDP；然后将VH基因连入pET-LDP中，构建融合基因重组表达质粒pET-VH-LDP。
4、如权利要求2所述的制备方法，其特征是将pET-VH-LDP转化入大肠杆菌宿主菌中，经IPTG诱导表达获得包涵体形式的融合蛋白VH-LDP。
5、如权利要求2所述的制备方法，其特征是通过亲和层析纯化融合蛋白VH-LDP，再通过分步透析复性、超滤浓缩制备活性融合蛋白VH-LDP。
6、如权利要求2所述的制备方法，其特征是ELISA法检测融合蛋白VH-LDP对IV型胶原酶和肿瘤细胞的免疫反应性，明胶酶谱法测定融合蛋白VH-LDP对人纤维肉瘤HT-1080细胞分泌IV型胶原酶活性的抑制作用。
7、如权利要求2所述的制备方法，其特征是融合蛋白VH-LDP与经甲醇提取法制备的力达霉素活性发色团AE进行分子组装，获得强化融合蛋白VH-LDP-AE。
8、如权利要求1所述的强化融合蛋白VH-LDP-AE在制备抗肿瘤导向药物中的应用。
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