CN1285613C - 抗肿瘤大鼠轻链单域抗体－力达霉素强化融合蛋白vl－ldp－ae - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抗肿瘤大鼠轻链单域抗体-力达霉素强化融合蛋白VL-LDP-AE，它含有抗肿瘤大鼠单克隆抗体3A5的轻链氨基酸序列和和力达霉素的辅基蛋白的氨基酸序列以及与力达霉素辅基蛋白相结合的烯二炔类发色团，是一种新型高效小型化的免疫导向药物。

Description

抗肿瘤大鼠轻链单域抗体-力达霉素强化融合蛋白VL-LDP-AE

技术领域：

本发明涉及一种强化的重组蛋白VL-LDP-AE，它含有抗肿瘤大鼠单克隆抗体3A5的轻链氨基酸序列和和力达霉素的辅基蛋白的氨基酸序列以及与力达霉素辅基蛋白相结合的烯二炔类发色团，是一种新型高效小型化的免疫导向药物。

背景技术：

恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的疾病。全球每年死于癌症的人数高达600万，仅我国每年新增肿瘤患者人数就达100万。在这些恶性肿瘤中，消化道癌症和呼吸道癌症在我国发病率最高，主要有胃、肝、肺、食管、大肠癌等，而且随着人类生存环境的日益恶化，这类肿瘤的发生率呈逐年上升的趋势。

针对上述肿瘤，目前临床上采用的治疗方案主要有：外科手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、介入放射治疗、免疫治疗、导向治疗等。其中导向治疗是利用对肿瘤有特殊亲和力的抗体或化合物为“载体”，或利用物理作用如磁进行导向，或通过肿瘤血管特异性碘油导向等，与有杀伤肿瘤作用的“弹头”(如放射性核素、化疗药物、毒蛋白等)制成偶联物，达到较多杀伤肿瘤而较少损害正常组织的目的。单克隆抗体作为“载体”由来已久，但是完整抗体分子量大约是150kDa，对肿瘤组织的渗透能力受到限制，导致单抗偶联物较难穿过细胞外间隙到达实体瘤的深部。因此，分子小型化已成为研究单抗导向药物的发展趋向。

在抗体研究领域，继小型化单克隆抗体F(ab)₂片段、Fab片段、scFv片段之后，1989年Ward等人提出了单域抗体(single domain antibodies，dAbs)的概念，与单克隆抗体相比，单域抗体有很多优点：首先，单域抗体的分子量相当于完整单抗的1/12，由于分子小，免疫原性弱，不易引起人体对外源抗体的免疫反应，同时单域抗体对实体瘤的渗透力强，有助于加快药物的肿瘤靶向性和血液清除率。此外，可以用基因工程手段进行发酵生产，降低成本。

本发明采用的3A5杂交瘤株是用肝癌细胞BEL7402免疫LOU/C大鼠，取其脾细胞与大鼠骨髓瘤细胞融合，经ELISA筛选和2次极限稀释法得到的分泌稳定的杂交瘤细胞株。

该杂交瘤所分泌的3A5抗体的特异性已经确证。酶标交叉检测表明：该抗体对人肝癌有较强的特异性结合，而对正常人胚肺细胞和小鼠正常肝细胞无交叉反应。人体各器官组织切片的免疫组织化学检测表明，大鼠抗体3A5对临床肝癌、肠癌均有强阳性反应。对人体的重要器官如中枢神经系统、心脏、肝、脾、肺、甲状腺、肾小球细胞、血液等均无反应[江敏等，抗肝癌单克隆抗体3A5特性及其平阳霉素偶联物的抗肿瘤活性，中华微生物学和免疫学杂志，1991，11：230]。此外，李军智等还对3A5抗体及其Fab片段在动物体内的分布进行了研究[抗人肝癌单克隆抗体和Fab片段在裸鼠体内分布及药物偶联物的疗效比较，中国医学科学院学报，1994，16(5)：326-333]。刘小云等对抗体片段的抗肿瘤效果进行了探索研究[平阳霉素与单克隆抗体Fab’片段偶联物的抗肿瘤作用，药学学报，2000，35(9)：649-653]。这些研究不仅再次证明3A5对人肿瘤细胞具有阳性反应，而且3A5-C1027偶联物及其片段和平阳霉素的偶联物依然都保持了对靶细胞的反应性，还直接证明了3A5抗体在移植肿瘤裸鼠中的靶向作用。

本发明选用的弹头药物是力达霉素，力达霉素(lidamycin，LDM，又称C1027)是从我国湖北潜江县土壤分离得到的一株放线菌(Streptomyces globisporus菌种保存号为：CGMCC No.0704)产生的，对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物试验表明LDM对小鼠结肠癌26，移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693等多种人体移植肿瘤均有显著疗效(中国抗生素杂志1994，19(2)：164-168)。LDM包括两个部分：一为烯二炔结构的发色团(active enediyne，AE)，具有极强的细胞毒作用，但是不稳定；一为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(lidaprotein，LDP)，对发色团的稳定性起保护作用。发色团与辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合是特异的，并且经过拆分后可以重建。以往的研究表明，力达霉素与单克隆抗体Fab’片段构建的免疫偶联物具有较强的抗肿瘤作用(中国医学科学院学报2001，23(6)：563-567)。但由于单克隆抗体Fab’片段来源于小鼠腹水，其分离纯化困难，成本较高，不宜扩大生产。本发明所说抗肿瘤大鼠轻链单域抗体-力达霉素VL-LDP-AE，可以用基因工程手段进行发酵生产，成本较低，便于开发研究。力达霉素具有独特的可拆分重建的分子结构特点，便于DNA重组以及分子强化；另一方面，LDM分子量只有kDa，大大低于目前已知的其它免疫毒素融合蛋白。

已知目前在导向药物研究中，全抗分子的大分子量成为其应用于实体瘤治疗的主要障碍。本领域内关于抗体小型化的研究日益增多，但是所涉及的抗体通常是来自小鼠，尚未见到有关大鼠单域抗体的报道，更未见到有关大鼠抗体片段和毒素融合蛋白的相关研究。而本发明所涉及的抗体片段是首次用于毒素融合的大鼠轻链单域抗体片段，可在探索新物种抗体片段应用方面作出贡献。而与其他小型化片段相比，本发明抗体片段的靶点包括肝癌和肠癌在内的消化道肿瘤，不同于诸如基质金属蛋白酶等与肿瘤侵袭转移有关的蛋白酶靶点，具有更确切的治疗应用价值。基于以上所述，本发明进行了探索，构建并得到了以力达霉素为“弹头”药物，单抗3A5的VL片段为“载体”制备得到可用于肿瘤治疗的高效、小型化的导向药物VL-LDP-AE，实现了将LDM的低分子量、分子可拆分和强效抗肿瘤作用的优势与单域抗体的迅速靶向和渗透优势相结合的目的。

发明内容：

本发明所说的强化融合蛋白VL-LDP-AE是由大鼠抗肿瘤轻链单域抗体VL、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾形成的融合蛋白VL-LDP(分子量约为26.1kDa)以及活化型烯二炔发色团AE(分子量为843Da)构成的，编码VL-LDP的基因全长714bp(序列表SEQ ID No1)，编码328个氨基酸(序列表SEO ID No2)，其制备技术路线为：

所述的强化融合蛋白VL-LDP-AE，其中的VL基因全长336bp，编码112个氨基酸；LDP基因全长345bp，编码115个氨基酸；二者之间的柔性肽基因15bp，编码5个氨基酸；羧基端的组氨酸六聚体尾基因为18bp，编码6个氨基酸；终止密码子为3bp。

具体内容包括：抗肿瘤大鼠单克隆抗体VL基因的克隆构建；力达霉素辅基蛋白LDP/抗肿瘤大鼠单克隆抗体VL基因的克隆构建；融合蛋白VL-LDP在大肠杆菌BL21(DE3)star^TM中的表达；融合蛋白VL-LDP的亲和层析纯化及其分离制备；强化融合蛋白VL-LDP-AE的制备分离；融合蛋白VL-LDP的免疫学活性检测；强化融合蛋白VL-LDP对肝癌和结肠癌细胞形态的影响检测；强化融合蛋白VL-LDP-AE抑制血管生成检测；强化融合蛋白VL-LDP-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用检测；强化融合蛋白VL-LDP-AE的动物试验性治疗方案。

实验研究结果表明，本发明所说强化融合蛋白VL-LDP-AE对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，半数克隆抑制浓度IC₅₀为1.02×10^-11M；能明显抑制bFGF刺激鸡尿囊膜新生血管生成；

体内有显著疗效，在0.4、0.3、0.2mg/kg剂量下，可明显抑制H22皮下瘤的生长，在0.4mg/kg剂量时疗效尤其显著，其第21天的抑制率达到83.3％；能够明显延长试验动物的生存时间。

本发明的药物组合物含有治疗有效量的上述强化融合蛋白为活性成分，以及含有一种或多种药学上可接受的载体。

本发明的化合物(强化融合蛋白)和药物组合物可用于制备抗肿瘤新型抗体导向药物。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有重量比为0.5％-95％的活性成分。

发明效果：

本发明的优点与积极效果在于，应用基因工程和分子强化相结合的技术路线制备获得的强化融合蛋白VL-LDP-AE是一种新型高效小型化免疫导向药物，是首次将大鼠抗体的轻链可变区用于肿瘤靶向毒素融合蛋白，且所说融合蛋白的肿瘤靶向性好，抑制肿瘤生长的同时能够显著延长肿瘤接种小鼠的中位生存时间，具有良好的临床应用前景。

附图说明：

图1：RT-PCR扩增得到的VL片段

其中：1-VL的RT-PCR扩增片段            2-DNA分子量标准

图2：VL和VL-lDP重组克隆载体的限制性内切酶分析

其中：1-pET30a(+)VL/NdeI+XhoI         2-重组质粒pET30a(+)VL

      3-pET30a(+)VL-LDP/NdeI+EcoRI    4-重组质粒pET30a(+)VL-LDP

      5-DNA分子量标准

图3：VL蛋白经金属螯合层析纯化的SDS-PAGE分析

其中：1-未上亲和层析柱前样品

      2-亲和层析纯化后的VL

      3-蛋白质分子量标准

图4：融合蛋白VL-LDP经金属螯合层析纯化的SDS-PAGE分析

其中：1-未上亲和层析柱前样品

      2-亲和层析纯化后的VL-LDP

      3-蛋白质分子量标准

图5：ELISA分析融合蛋白和不同肿瘤细胞的免疫反应性

其中：■ VL-LDP

     

VL

      □ 3A5

图6：强化融合蛋白VL-LDP-AE对肝癌细胞Bel-7402的杀伤活性

其中：  Fv-LDP-AE

      ◆  LDM

图7：强化融合蛋白VL-LDP-AE对肝癌细胞和结肠癌细胞的形态学影响

其中：A：以PBS处理的Bel 7402肝癌细胞

      B：以VL-LDP-AE处理的Bel 7402肝癌细胞

      C：以PBS处理的HT29结肠癌细胞

      D：以VL-LDP-AE处理的HT29结肠癌细胞

图8：强化融合蛋白VL-LDP-AE对bFGF刺激鸡胚尿囊膜血管生成的抑制作用

其中：A：仅以PBS处理的鸡胚尿囊膜血管

      B：以bFGF为刺激物，PBS处理后的鸡胚尿囊膜血管

      C：以bFGF为刺激物，VL-LDP-AE(0.4μg/鸡胚)处理后的鸡胚尿囊膜血管

      D：以bFGF为刺激物，LDM(0.4μg/鸡胚)处理后的鸡胚尿囊膜血管

图9：强化融合蛋白VL-LDP-AE一次给药对小鼠体内肝癌H22生长的抑制作用

其中：◆对照                  ■VL-LDP-AE 0.4组

      △VL-LDP-AE 0.2组       □VL-LDP-AE 0.1组

      ▲LDM 0.05组

图10：强化融合蛋白VL-LDP-AE一次给药对荷瘤小鼠的生存时间的延长作用

其中：●对照                   VL-LDP-AE 0.4组

      ◆VL-LDP-AE 0.2组      

 VL-LDP-AE 0.1组

      ▲MMC组                 ■ LDM 0.05组

实施方案：

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>.抗肿瘤大鼠单克隆抗体VL基因的克隆构建

抗肿瘤大鼠杂交瘤细胞3A5用含15％胎牛血清的RPMI 1640培养液于37℃，5％ CO₂培养箱中常规培养。取对数生长期的杂交瘤细胞，用Promega公司的总RNA提取试剂盒和PolyATtract^mRNA Isolation Systems试剂盒制备得到mRNA，利用引物1：5’-catatggacattgtgatgacrcaatccccagtctccctgcct-3’和引物2：5’-tttcaggtccagcttggttcc-3’(上海生工合成)，用TAKARA one step RNA PCR试剂盒获得V_L基因片段(图1)，连接到T-Vector(Promega公司的pGEM^-T VectorSystems试剂盒)中，转化到DH5a中，经菌体PCR、双酶切反应验证阳性克隆。以T7启动子为引物进行测序。

<实施例2>力达霉素辅基蛋白LDP/抗肿瘤大鼠单克隆抗体VL基因的克隆构建

本发明选用载体pEFL质粒是含有LDP的pET-30a(+)(专利申请号：03150240，公开号：1475506)。将载体质粒、含ScFv的重组质粒分别用NdeI和EcoRI/或EcoRI和XhoI双酶切获得酶切片段，经琼脂糖凝胶电泳分离回收。将上述两个片段亚克隆到经NdeI和XhoI酶切的表达载体pET30a(+)中，经酶切鉴定，成功插入了scFv外源片段，将获得的重组表达质粒pEFL转入宿主菌BL21(DE3)star^TM的感受态细胞中，筛选获得重组转化子并提取转化子。用T7通用引物测序，结果表明该融合基因与预期相符(图2)， 并且于2004年 10月9日将转化子以pEFLL保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心，保藏中心的登记入册编号为CGMCC No1227。本发明使用的表达质粒pET-30a(+)，在其多克隆位点的3’端融合有一段编码组氨酸六聚尾(His6-Tag)的基因序列，经翻译表达后，His6-Tag便于融合蛋白的表达鉴定和分离纯化。

<实施例3>.融合蛋白VL-LDP在大肠杆菌BL21(DE3)star^TM中的表达

本发明使用的表达载体是大肠杆菌表达体系E.coli BL(DE3)star^TM为Invitrogen公司产品。以构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)star^TM获得重组转化菌，从LB平板上挑取单克隆菌落接种到含50μg/ml的卡那霉素的LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养过夜。次日按1％接种量转种。37℃，振荡培养至OD₆₀₀约0.8，向培养物中加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，诱导6个小时，收集诱导表达的菌体，4℃，3000rpm离心15分钟。超声波破菌仪破菌。10000rpm离心15分钟，弃上清。沉淀用包涵体洗涤液I(0.05M Tris-HCl，pH8.0，5mM EDTA，1M NaCl，0.05％Triton X-100，5％甘油)洗涤二次，离心收集包涵体，按照每克包涵体沉淀加入200ml包涵体溶解液(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，8M Urea，pH7.9)进行溶解。

<实施例4>.融合蛋白VL-LDP的亲和层析纯化及其分离制备

采用Novagen公司的His·bind纯化试剂盒于变性条件下纯化蛋白质。经预处理亲和柱后，以3体积含8M尿素Binding buffer平衡层析柱，再以变性蛋白样品上柱后，依次以10倍体积的Binding buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，5mM咪唑，8M Urea，pH7.9)，6体积的Washingbuffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，60mM咪唑，8M Urea，pH7.9)洗涤层析柱，最后以6体积的Elute buffer(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1M咪唑，8M Urea，pH7.9)洗脱，收集洗脱组分得到纯化后的融合蛋白(图3，图4)，继而进行复性，将蛋白上样到平衡后的Sephrose 6B复性柱上，所用的复性缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，1MUrea，5mM EDTA，0.2mM GSSG，2mM GSH，0.4M L-Arg，pH8.0)进行蛋白复性，紫外监测收集蛋白峰，再经超滤浓缩、更换PBS(PH7.4)超滤，得到高浓度的目的蛋白。

<实施例5>.强化融合蛋白VL-LDP-AE的制备分离

取LDM冻干品(专利申请号：001215272，公开号：1284566)10mg，加5ml冷甲醇振摇5分钟，-20℃放置1h，中间振摇1次，在0℃，12000rpm/min，离心20分钟，上清液富含AE，沉降物为肽链，重复提取2次。自然蒸发浓缩甲醇溶液，上述操作需要4℃低温、避光条件下进行。取一定体积和浓度的VL-LDP溶于0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，加5倍分子量的AE甲醇溶液(体积比1∶50)，混和震摇，室温放置12小时，将混和液以PD-10柱(商业化的SephadexG-25柱，Pharmacia产品)层析分离，经A280nm紫外监测后弃过量未结合的AE，收集强化融合蛋白VL-LDP-AE。

<实施例6>.融合蛋白VL-LDP的免疫学活性检测

取对数生长期的Bel-7402细胞按照5×10³个/孔的密度铺96孔板，培养24小时，经4℃预冷0.05％戊二醛固定、1％的BSA封闭后，每孔加入不同浓度的融合蛋白，37℃孵育后，用抗His抗体为一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗，每孔加入100μl OPD反应底物进行显色，酶标仪测定492nm处吸光值(图5)。结果表明VL抗体片段对H22、Bel-7402肿瘤细胞具有较高的特异性，对KB、PG的结合较弱，其结合特异性和3A5全抗一致。

<实施例7>.强化融合蛋白VL-LDP-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用检测

用克隆形成法测定，取对数生长期的HT29细胞加入96孔培养板，每孔50个细胞/0.2ml，培养24h。10倍稀释各检测样品，每浓度设3个平行孔，每孔50μl，37℃温育1h，无血清PRMI1640培养液洗2次，加入新鲜培养液，继续培养7天，第7天于镜下计数细胞集落。结果(图6)表明VL-LDP-AE对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，半数克隆抑制浓度IC₅₀为1.02×10^-11M。

<实施例8>.强化融合蛋白VL-LDP-AE对肝癌Bel7402和结肠癌HT29细胞形态的影响

取对数生长期的BEL7402、HT29细胞加入加有玻璃片的6孔培养板，每孔30000个细胞/2ml，培养24h。1000倍稀释组装偶联物，每孔加药50μl，对照组加入等体积生理盐水，37℃温育4-5h，预冷的PBS洗2次，加入甲醛∶乙醇(v/v＝3∶1)固定液，固定10分钟，常规苏木素伊红染色，脱水透明封片。观察染色结果发现，经VL-LDP-AE处理后，细胞的核仁增大，核内发生多颗粒性凝集，发生细胞凋亡的细胞形态学变化(图7)。

<实施例9>.强化融合蛋白VL-LDP-AE抑制血管生成检测

以鸡胚尿囊膜法检测其对血管生成的抑制作用，将新鲜受精的白皮来航鸡种蛋气室端朝上，在37℃，60％湿度的恒温室中孵育7天，消毒鸡蛋外壳，用针刺入气室壳，将2ml空气吸入气室内以使鸡胚尿囊膜与血管卵膜分离，同时以砂轮磨壳小心剥去外壳形成一个2×2cm²小窗，立即用透明胶带封好，于37℃，60％湿度的恒温室中继续孵育24h。孵育第九天时，吸取10μl bFGF滴加于预先准备好的二甲基纤维素载体盘中，同时加入不同浓度的强化融合蛋白VL-LDP-AE，，将该盘置于大血管及胚心远端，封窗，继续于37℃，60％湿度的的培养箱中孵育48h后观察结果(图8)。VL-LDP-AE能明显抑制bFGF刺激鸡尿囊膜新生血管生成。

<实施例10>.强化融合蛋白VL-LDP-AE的动物试验性治疗方案

根据剂量初筛结果设计动物试验治疗的给药方式和剂量。领取体重为18-22g的昆明小鼠60只，随机分为6组，每组10只。试验第0天，取小鼠肝癌H22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为7.5×10⁶/ml，按0.2ml/只，接种于昆明小鼠腋窝皮下。

试验A：于接种肿瘤3天后给予生理盐水、游离LDM以及三个剂量组的VL-LDP-AE，尾静脉注射给药1次，试验B：于接种肿瘤后3和10天给予生理盐水、游离LDM以及三个剂量组的VL-LDP-AE，尾静脉注射给药共2次，试验期间每3-4天测定肿瘤大小，以公式V＝1/2ab²(a：肿瘤长径，b：肿瘤短径)计算肿瘤体积和抑瘤率。

表1  VL-LDM强化融合蛋白一次给药对肝癌接种小鼠的肿瘤生长抑制作用

试验组	剂量/mg·kg-1	小鼠数目		体重变化/g	肿瘤体积(X±SD)/cm3	抑制率(％)
							第0天	第22天
		对照组VL-LDMVL-LDMVL-LDMVL-LDPLDMVL-LDP+LDMMMC	0.40.20.10.80.050.051						1010101010101010	1010101010101010	+19.3+8.2+8.3+12.2+20.1+7.5+6.4+19.1	14.3±0.21.0±0.32.4±0.43.6±0.316.6±0.55.4±0.44.2±0.411.5±0.6	-83.367.556.3-65.771.416.4

^*，P＜0.01vs.LDM

试验A第21天的结果表明(表1)，强化融合蛋白VL-LDP-AE体内有显著疗效，在0.4、0.3、0.2mg/kg剂量，可明显抑制H22皮下瘤的生长，从(图9)中可以看到，VL-LDP-AE在0.4mg/kg剂量时疗效尤其显著，其第21天的抑制率达到83.3％。

试验B的结果表明，二次给药后强化融合蛋白VL-LDP-AE能够明显延长试验动物的生存时间(图10)。试验治疗期间动物的体重无明显变化，一般状况良好，表明动物可耐受所有剂量。

       表2  一次给药和二次给药对动物中位生存期的影响(天)

从表2中可以看出，二次给药时0.4mg/kg剂量组的强化融合蛋白显著延长试验动物的生存时间。

                       序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>抗肿瘤大鼠轻链单域抗体-力达霉素强化融合蛋白VL-LDP-AE

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>1

<211>714

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>

<223>

<400>1

atggacattg tgatgactca atccccagtc tccctgcctg tcagccctgg aggtcaagtc    60

tctatctctt gccggtcaag tcagagcctt gtatacagtg atggaaacac ccacttgtat    120

tggtttctgc agaagccagg ccagtctcca cagctcctca tctatcgggt ttccaacaga    180

ttttctgggg tgccagacag gttcactggc agtgggtcag ggacagattt caccctcaag    240

atcagcagag tagagcctga ggacttggga atttattact gcttacaaag tacacatctt    300

ccgtacacgt ttggagctgg aaccaagctg gacctgaaac tcgagggtgg aggcggttca    360

gaattcgcgc ccgccttctc cgtcagtccc gcctcgggtc tgagtgacgg acagagcgtg    420

tcggtcagcg gtgccgccgc cggcgagacc tactacatcg cccagtgcgc tccggtcggt    480

ggccaggacg cgtgcaaccc ggcgaccgcg acgtccttca ccacggacgc gtccggagcg    540

gcgtcgttca gcttcgtcgt gcgcaagtcg tacacgggcg ccacgcccga aggcacgccg    600

gtcggcagcg tcgactgcgc cacggccgcc tgtaacctcg gcgccggcaa ctccgggctc    660

gacctcggcc acgtggctct gaccttcggc ctcgagcacc accaccacca ccac*         714

<140>

<141>

<160>1

<170>

<210>2

<211>714

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>

<223>

<400>2

atg gac att gtg atg act caa tcc cca gtc tcc ctg cct gtc agc  45

Met Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Pro Val Ser

1               5                   10                  15

cct gga ggt caa gtc tct atc tct tgc cgg tca agt cag agc ctt  90

Pro Gly Gly Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

                20                  25                  30

gta tac agt gat gga aac acc cac ttg tat tgg ttt ctg cag aag  135

Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr His Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys

                35                  40                  45

cca ggc cag tct cca cag ctc ctc atc tat cgg gtt tcc aac aga  180

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg

                50                  55                  60

ttt tct ggg gtg cca gac agg ttc act ggc agt ggg tca ggg aca  225

Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr

                65                  70                  75

gat ttc acc ctc aag atc agc aga gta gag cct gag gac ttg gga  270

Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly

                80                  85                  90

att tat tac tgc tta caa agt aca cat ctt ccg tac acg ttt gga  315

Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Thr His Leu Pro Tyr Thr Phe Gly

                95                  100                 105

gct gga acc aag ctg gac ctg aaa ctc gag ggt gga ggc ggt tca  360

Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser

                110                 115                 120

gaa ttc gcg ccc gcc ttc tcc gtc agt ccc gcc tcg ggt ctg agt  405

Glu Phe Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser

                125                 130                 135

gac gga cag agc gtg tcg gtc agc ggt gcc gcc gcc ggc gag acc  450

Asp Gly Gln Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr

                140                 145                 150

tac tac atc gcc cag tgc gct ccg gtc ggt ggc cag gac gcg tgc  495

Tyr Tyr Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys

                155                 160                 165

aac ccg gcg acc gcg acg tcc ttc acc acg gac gcg tcc gga gcg  540

Asn Pro Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala

                170                 175                 180

gcg tcg ttc agc ttc gtc gtg cgc aag tcg tac acg ggc gcc acg  585

Ala Ser Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr

                185                 190                 195

ccc gaa ggc acg ccg gtc ggc agc gtc gac tgc gcc acg gcc gcc  630

Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala

                200                 205                 210

tgt aac ctc ggc gcc ggc aac tcc ggg ctc gac ctc ggc cac gtg  675

Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Val

                215                 220                 225

gct ctg acc ttc ggc ctc gag cac cac cac cac cac cac          714

Ala Leu Thr Phe Gly Leu Glu His His His His His His

                230                 235         238

Claims (9)

1.一种强化融合蛋白VL-LDP-AE，其特征在于它是由大鼠抗肿瘤单域抗体VL、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾形成的融合蛋白VL-LDP以及活化型烯二炔发色团AE构成的，其中所述的融合蛋白由序列表SEQ IDNo2所示的氨基酸序列组成。

2.一种制备如权利要求1所述强化融合蛋白VL-LDP-AE的方法，其特征在于所说方法主要采用DNA重组和分子强化两条技术路线，具体步骤为：

A.构建序列表SEQ ID No1所示力达霉素辅基蛋白LDP与大鼠抗肿瘤单域抗体VL的融合基因；

B.融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pEFLL的构建；

C.融合蛋白VL-LDP在保藏编号为CGMCC No1227的大肠杆菌中的诱导表达；

D.融合蛋白VL-LDP的亲和层析纯化及分离；

E.强化融合蛋白VL-LDP-AE的制备及分离。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是运用基因工程技术分别克隆得到力达霉素辅基蛋白LDP基因和大鼠抗肿瘤单域抗体VL基因，将二者与编码一段柔性小肽的DNA序列相连构建成VL-spacer-LDP形式的融合基因，同时在spacer区引入特异性酶切位点。

4.如权利要求2或3所述的制备方法，其特征是将所得到的融合基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)中，构建重组表达质粒pEFLL。

5.如权利要求2所述的制备方法，其特征是将pEFLL转化入大肠杆菌宿主菌中，经IPTG诱导表达获得包涵体形式的融合蛋白VL-LDP，并进行条件优化获得最佳表达。

6.如权利要求2所述的制备方法，其特征是通过亲和层析纯化融合蛋白VL-LDP再进行透析复性，浓缩冻干，制备功能性融合蛋白。

7.如权利要求2所述的制备方法，其特征是将纯化分离得到的融合蛋白VL-LD与经甲醇提取制备的力达霉素发色团的活性型烯二炔AE，按一定分子比和时间进行分子强化，获得强化融合蛋白VL-LDP-AE。

8.一种以权利要求1所述强化融合蛋白VL-LDP-AE为有效成分与药学上可接受的一种或多种载体组成的药物组合物。

9.如权利要求1所述强化融合蛋白VL-LDP-AE在制备抗肿瘤新型抗体导向药物中的应用。

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