CN1687119A - 表皮生长因子受体靶向短肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种强化的基因工程融合蛋白SG－LDP－AE，其主要通过融合蛋白的基因工程构建和分子强化两步技术路线制备而成，所说融合蛋白对肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，在体外能与表达表皮生长因子受体(EGFR)的肿瘤细胞特异性结合，动物实验证明，其对小鼠移植性肝癌H22有非常显著的疗效，使用可耐受剂量，其抑制率可达95.8％(p＜0.001)，显示了靶向药物的小型化与高效化的特点，可望成为一种用于临床治疗肿瘤的新型靶向药物。

Description

表皮生长因子受体靶向短肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程融合蛋白

技术领域：

本发明涉及一种强化的基因工程重组融合蛋白及其制备方法和在抗肿瘤靶向药物中的应用。

背景技术：

恶性肿瘤是一种严重威胁人类生命和健康的疾病。其中，消化道癌症和呼吸道癌症在我国发病率最高，主要有胃癌、肝癌、肺癌、食管癌、大肠癌等，而且随着人类生存环境的日益恶化，这类肿瘤的发生率呈逐年上升趋势。

针对上述肿瘤，目前临床采用的治疗方案主要有：外科手术治疗、放射治疗、化学药物治疗、介入放射学治疗、免疫学治疗和导向治疗等。所说靶向治疗，是利用对肿瘤有特异性亲和力的抗体或化合物；或者利用有物理导向作用的磁性；或者通过肿瘤血管特异性导向的碘油作为载体，与具杀伤肿瘤作用的“弹头”(放射性核素、化疗药物、毒蛋白等)制成偶联物，以达到较多杀伤肿瘤而较少损害正常组织的目的。单克隆抗体作为“载体”由来已久，但是完整抗体分子量大约为150kDa，对肿瘤组织的渗透能力有限，导致单抗偶联物较难穿过细胞外间隙到达实体瘤的深部。因此，分子小型化已成为单抗靶向药物发展的必然趋势。

表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)由53个氨基酸组成，分子量为6045KDa。EGF的生物活性十分广泛，虽然其名为表皮生长因子，但后来的研究表明，它对多种来源的上皮细胞都有促增殖活性，并与创伤愈合有关。EGF还可作为肿瘤促进因子增强病毒或致癌物的致癌作用。许多转化细胞分泌TGF-α并表达表皮生长因子(EGFR)形成自泌机制。EGFR的激活已经显示有助于增强肿瘤的生长和发展的进程，包括促进增生，血管生成，肿瘤的侵袭/转移，和抑制凋亡。肿瘤细胞中EGFR的表达与疾病的发展、低存活率、低治疗效果以及对细胞毒、化疗药物耐受的发展都有关系。已经在许多种肿瘤包括前列腺癌，乳腺癌，胃癌，结肠癌和子宫癌中观察到EGFR的高水平表达。抑制EGFR和EGFR的相关通路，包括使用抗EGFR胞外配体结合域的单抗和针对于EGFR的酪氨酸激酶活性的抑制剂等治疗策略已进入临床实验。酪氨酸激酶抑制剂ZD1839和OSI-774目前正进行III期临床研究。2004年2月12日，美国FDA批准了抗EGFR单抗Erbitux^TM(cetuximab，又称为IMC-C225)用于治疗晚期结肠癌患者。Erbitux是一个同时含有人和鼠基因片段的基因工程嵌合抗体，它是以肿瘤细胞表面的EGFR为靶点而起作用，干扰肿瘤细胞的生长。

力达霉素(lidamycin，LDM，又称C1027)是从我国湖北潜江县土壤分离得到的一株放线菌(Streptomyces globisporu，s菌种保藏号为：CGMCC No.0704)产生的对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物试验表明，LDM对小鼠结肠癌26，移植于裸鼠的人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693等多种肿瘤均有显著疗效(中国抗生素杂志1994，19(2)：164-168)。LDM包括两个部分：一部分为烯二炔结构的发色团(activeenediyne，AE)，具有极强的细胞毒作用，但是不稳定；另一部分为110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(lidaprotein，LDP)，对发色团的稳定性起保护作用。发色团与辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合是特异的，并且经过拆分后可以重建(中国医学科学院学报2001，23(6)：563-567)。力达霉素具有独特的可拆分重建的分子结构特点，便于DNA重组以及分子强化；另一方面，LDM辅基蛋白LDP分子量只有10.5kDa，当LDP与不同来源的生长因子制备得到的融合蛋白，其分子量仅为15-20kDa，将大大低于目前已知的其它免疫毒素融合蛋白。本发明构建的以力达霉素为“弹头”药物，以EGFR靶向特异性结合短肽SG为“载体”的高效、小型化的强化融合蛋白SG-LDP-AE，迄今尚未见有相关报道。

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤药物强化融合蛋白SG-LDP-AE。

本发明的另一目的在于提供所说强化融合蛋白SG-LDP-AE制备方法。

本发明的又一目的在于提供一种强化融合蛋白SG-LDP-AE在肿瘤靶向治疗中的应用。

发明内容：

为了提高融和蛋白的效果，本实验室对“载体”和“弹头”进行了研究和选择，所用的“弹头”药物是力达霉素；选用的EGFR靶向特异性结合短肽SG是在构建表达载体时，将与EGFR特异结合的短肽GE7基因序列的上游加入一段大肠杆菌分泌表达信号肽基因片段，在此基因片段和短肽片段之间引入一个酶切位点NcoI。其中所述短肽GE7是依据配体和受体相互结合的原理，采用电脑图象模拟设计合成的，它可与表达EGFR的肿瘤细胞特异结合(《中国科学(C辑)》1998，28(6)：554-562)。在表达载体进行分泌表达时，切除信号肽后在短肽GE7的N端留下两个氨基酸Met和Ala，从而得到短肽SG。该短肽是第一个用于与力达霉素融合的EGFR靶向特异性结合短肽，可以为探索新物种靶点特异性结合片段应用方面作出贡献。

本发明所说的强化融合蛋白SG-LDP-AE是由EGFR靶向结合的短肽SG、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端的组氨酸六聚体尾形成的融合蛋白SG-LDP(分子量约为13.9kDa)与活化型烯二炔发色团AE(分子量为843Da)构成的，编码SG-LDP的基因全长492bp，编码141个氨基酸。其中SG基因全长54bp，编码18个氨基酸(在SG基因前有66bp的信号肽基因序列)；LDP基因全长330bp，编码110个氨基酸；二者之间的柔性肽基因15bp，编码5个氨基酸；羧基端的组氨酸六聚体尾基因为18bp，编码6个氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的组氨酸六聚体尾基因之间的XhoI酶切位点基因为6bp，编码2个氨基酸，终止密码子为3bp。

具体步骤如下：

A.EGFR靶向结合的短肽SG与力达霉素辅基蛋白LDP的融合基因构建：

含EGFR靶向结合的短肽SG与力达霉素辅基蛋白LDP融合基因的表达载体pET30SGLDP的构建，是运用基因工程技术，分别克隆得到EGFR靶向结合的短肽SG基因和力达霉素辅基蛋白LDP基因，将二者与编码一段柔性小肽的DNA序列相连构建成SG-spacer-LDP形式的融合基因，同时在SG基因前引入一段信号肽序列，该信号肽序列之后引入特异性酶切位点。

B.融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pET30SGLDP的构建：

将融合基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)中，构建重组表达质粒pET30SGLDP。

C.融合蛋白SG-LDP在大肠杆菌pET30SGLDP(保藏编号：CGMCC No.1320)中的诱导表达：

融合蛋白SG-LDP在大肠杆菌BL21(DE3)star^TM中的诱导表达包括将pET30SGLDP转化入大肠杆菌宿主菌中，经IPTG诱导表达获得分泌型活性融合蛋白SG-LDP。

D.融合蛋白SG-LDP的亲和层析纯化及分离：

融合蛋白SG-LDP的亲和层析纯化及其分离制备是通过亲和层析纯化融合蛋白SG-LDP，再进行透析，浓缩，制备功能性融合蛋白。

E.强化融合蛋白SG-LDP-AE的制备及分离：

强化融合蛋白SG-LDP-AE的制备分离，是将纯化分离得到的融合蛋白SG-LDP与经甲醇提取制备的力达霉素发色团的活性型烯二炔AE，以分子比为50∶1和强化时间为12小时，室温下进行分子强化，获得强化融合蛋白SG-LDP-AE。

通过融合蛋白SG-LDP对不同肿瘤细胞的免疫学活性检测以及强化融合蛋白SG-LDP-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用检测结果表明，强化融合蛋白SG-LDP-AE在治疗肿瘤的应用中优选治疗EGFR高表达的肿瘤细胞或Her2高表达的肿瘤细胞。

EGFR高表达的肿瘤细胞包括人肝癌Bel-7402，人口腔鳞状上皮KB细胞，人结肠癌HT-29细胞，子宫颈癌HeLa等细胞。

本发明的优点与积极效果在于，所说强化融合蛋白SG-LDP-AE稳定性好，不易脱落，可以应用基因工程手段进行发酵生产，成本低廉。以EGFR靶向结合的短肽为载体，分子量小，免疫原性弱，不易引起人体对外源抗体的免疫反应，副作用小，同时短肽作为靶受体的配基，对实体瘤的渗透力强，有助于迅速到达靶肿瘤细胞，充分发挥力达霉素对肿瘤细胞的强烈杀伤作用。本发明的强化融合蛋白SG-LDP-AE是一种新型高效小型化的靶向药物，是第一个将EGFR靶向结合的短肽SG用于与力达霉素融合的抗肿瘤靶向药物，该融合蛋白的肿瘤靶向性好，具有良好的临床应用前景。

附图说明：

图1：重组质粒pET-GLDP的限制性内切酶分析

其中：1.DNA Marker DL15000      2.pET-30a(+)

3.pET-GLDP                      4.pET-30a(+)/NdeI+XhoI

5.pET-GLDP/NdeI+XhoI            6.PCR扩增的GLDPgene

7.DNA Marker DL2000

图2：重组质粒pET-SGLDP的限制性内切酶分析

其中：1.MarkerDL15000+2000      2.PCR扩增的SGLDP gene

3.pET-30a(+)/NdeI+XhoI          4.pET-30a(+)

5.pET-SGLDP/NdeI+XhoI           6.pET-SGLDP

图3：表达载体pET-SGELDP在大肠杆菌BL21(DE3)star^TM中诱导表达的SDS-PAGE分析

其中：1.空载体诱导前全菌蛋白组分

2.空载体诱导后全菌蛋白组分

3.37℃表达菌株诱导后全菌蛋白组分

4.28℃表达菌株诱导后全菌蛋白组分

5.蛋白Marker(分子量分别为97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)

6.空载体诱导前培养基中蛋白组分

7.空载体诱导后培养基中蛋白组分

8.37℃表达菌株诱导后培养基中蛋白组分

9.28℃表达菌株诱导后培养基中蛋白组分

图4：表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析

其中：1.蛋白Marker(分子量分别为97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)

2.诱导前细胞全菌蛋白组分

3.诱导前培养基中蛋白组分

4.诱导后细胞全菌蛋白组分

5.诱导后培养基中蛋白组分

6.周质空间蛋白组分

7.可溶蛋白组分

8.不可溶蛋白组分

图5：金属螯合层析分离纯化融合蛋白SG-LDP的SDS-PAGE分析

其中：1.蛋白Marker(分子量分别为97.4kDa，66.2kDa，43kDa，31kDa，20kDa，14.4kDa)

2.诱导后培养基中蛋白组分

3.硫酸铵沉淀后透析后样品

4.未结合组分

5.第一次洗涤组分

6.第二次洗涤组分

7.第一次洗脱组分

8.第二次洗脱组分

9.第三次洗脱组分

图6A：SG-LDP对不同肿瘤细胞的免疫结合活性分析

其中：◆Bel-7402              ■MCF-7

      △MCF-7/Her2            ×KB

      *Hela                   ●HT-29

图6B：LDP对不同肿瘤细胞的免疫结合活性分析

其中：◆Bel-7402              ■MCF-7

      △MCF-7/Her2            ×KB

      *Hela                   ●HT-29

图7：强化融合蛋白对Bel-7402细胞的体外细胞毒作用

其中：■LDM

      ◆SG-LDP-AE

      ◆

图8A：LDM对MCF-7细胞体外细胞毒作用

其中：■MCF-7

      ◆MCF-7/Her2

图8B：强化融合蛋白对MCF-7/Her2细胞的体外细胞毒作用

其中：■MCF-7

      ◆MCF-7/Her2

      ◆

图9：强化融合蛋白SG-LDP-AE对小鼠肝癌H22的生长抑制作用

其中：◆对照                  ■SG-LDP-AE 0.2mg/kg

      △SG-LDP-AE 0.4mg/kg    ×SG-LDP-AE 0.8mg/kg

      *LDM 0.05mg/kg          ●SG-LDP 1.6mg/kg

      |MMC 1mg/kg

实施方式：

以下所举实施例，对于本发明而言只是说明性的，而非限制性的。

实施例1.含EGFR靶向结合的短肽SG/力达霉素辅基蛋白LDP基因的表达载体pET30SGLDP的构建

L1上游5’GA  CAT ATG AAC CCC GTG GTG GGC TAC ATC GGT GAA CGT CCT CAG

             Nde I

         TAT CGT GAC CTG GGT GGA GGC GGT TCA GCG CCC GCC TTC TCC GTC3’

R1下游5’GTTA  CTC GAG GCC GAA GGT CAG AGC CAC GTG3’

               Xho I

L2上游5’GAATCCA  CAT ATG AAA TAC CTG CTG CCG ACC GCT GCT GCT GGT CTG

                  Nde I

        CTG CTC CTC GCT GCC CAG CCG GCG ATG GCC ATG GCC AAC CCC GTG

        GTG GGC TAC3’

R2下游5’GTTA  CTC GAG GCC GAA GGT CAG AGC CAC GTG3’

                Xho I

以质粒pIJ1027GRGDS(含有LDP基因，由本实验室构建，本实验室可向公众提供并出具相关证明)为模板，以引物L1和R1(上海生物工程公司合成)按常规PCR反应条件进行扩增，得到长约0.4kb的GLDP基因片段。将PCR扩增反应产物GLDP进行1％琼脂糖凝胶电泳，经染色后用BioDev公司的玻璃奶试剂盒回收GLDP基因片段。将此基因片段用Nde I/XhoI双酶切用T4DNA连接酶和经过Nde I/Xho I双酶切的质粒pET-30a(+)连接得到质粒pET30GLDP，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，37℃培养后挑取单克隆，小量培养后提取质粒进行Nde I/Xho I双酶切鉴定(图1)。将能切下约0.4kb基因片段的重组表达质粒转入宿主菌BL21(DE3)star^TM(Invitrogen公司产品)的感受态细胞中，筛选获得重组转化子并提取转化子。用T7通用引物测序，结果表明，该融合基因与预期相符(上海博雅北京分公司进行序列测定)。

以质粒pET30GLDP为模板，以引物L2和R2(上海生物工程公司合成)按常规PCR反应条件进行扩增，得到长约0.5kb的SG-LDP基因片段。其余操作同上，得到表达质粒pET30SGLDP，进行酶切鉴定(图2)。将能切下约0.5kb基因片段的重组表达质粒转入宿主菌BL21(DE3)star^TM(Invitrogen公司产品)的感受态细胞中，筛选获得重组转化子并提取转化子。用T7通用引物测序，结果表明，该融合基因与预期相符(上海博雅北京分公司进行序列测定)。SG基因全长54bp，编码18个氨基酸(在SG基因前有66bp的信号肽基因序列)；LDP基因全长330bp，编码110个氨基酸；二者之间的柔性肽基因15bp，编码5个氨基酸；羧基端的组氨酸六聚体尾基因为18bp，编码6个氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的组氨酸六聚体尾基因之间的XhoI酶切位点基因为6bp，编码2个氨基酸。本发明使用的表达质粒pET-30a(+)，在其多克隆位点的3’端融合有一段编码组氨酸六聚尾(His×6-Tag)的基因序列，经翻译表达后，His×6-Tag便于融合蛋白的表达鉴定和分离纯化。

实施例2.融合蛋白SG-LDP在大肠杆菌BL21(DE3)star^TM中的诱导表达

本发明使用的表达载体是大肠杆菌表达体系E.coli BL21(DE3)star^TM，为Invitrogen公司产品。以构建好的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)star^TM获得重组转化菌，从LB平板上挑取单克隆菌落接种到含50μg/ml的卡那霉素的LB培养基中，37℃，180rpm振荡培养过夜。次日按2-3％接种量转种，37℃，振荡培养2-3小时至OD₆₀₀约0.8-1.0，向培养物中加入终浓度为0.05mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导8个小时。15％的SDS-PAGE分析结果(图3)表明，在培养液中经诱导的大肠杆菌约14kDa处有明显的外源蛋白表达条带，表达量占培养基组分的70％以上，而培养液中未经诱导的菌体则无此带，细胞浆中也有少量的外源蛋白的表达。说明表达的蛋白主要存在于培养液上清中。在37℃和28℃的诱导温度下均有外源蛋白的表达，且在37℃的诱导温度下表达量比28℃的诱导温度下表达量高。然后分别从全菌蛋白、培养液上清、细胞周质、胞浆中制备样品，同时以带空载体的pET-30a的菌株的样品和未进行诱导的重组表达菌体样品作为阴性对照。进行SDS-PAGE和Western-blot检测(图4)(半干电转，电转条件为：恒电流0.85mA/cm2，时间约2小时)。一抗为抗His-Tag单抗(Novagen公司产品)，二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG(Santa Cruz公司产品)，进行显色反应(Western Blotting Luminol Reagent为Santa Cruz公司产品)，也证实在14kDa处有带his-tag尾的外源蛋白的表达，并且外源蛋白主要在培养液上清中表达。将最终挑选出的最优表达融合蛋白的转化菌株，其中含有能表达融合蛋白SG-LDP的质粒pET30SGLDP，命名为pET30SGLDP，于2005年3月3日送交位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号：1320。

实施例3.融合蛋白SG-LDP的亲和层析纯化及其分离制备

收集诱导表达的菌体发酵液上清，以113g/L的浓度在4℃，缓慢搅拌的条件下加入硫酸铵。4℃静止放置1小时，4℃，10000g离心20分钟，收集上清。将上清在4℃，缓慢搅拌的条件下加入硫酸铵，使其终浓度为390g/L。4℃静止放置半小时，4℃，10000g离心20分钟，收集沉淀。每100ml发酵液所得沉淀用2ml 1×Ni-NTA Binding Buffer(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl，10mM imidazole，pH8.0)溶解后用相同溶液透析。

将Ni-NTA His-Bind树脂(Novagen)装入层析柱中，用1×Ni-NTA Binding Buffer平衡将透析后的样品用0.45um的滤膜过滤后缓慢加入层析柱中。收集流出液，流速为10-15ml/小时；用8倍柱床体积的1×Ni-NTA Binding Buffer洗涤层析柱，收集流出液，流速为20-30ml/小时；用4倍柱床体积的1×Ni-NTA Elution Buffer(50mM NaH₂PO₄，300mMNaCl，200mM imidazole，pH8.0)洗脱结合到层析柱上的目的蛋白，收集流出液，流速为10-15ml/小时；将各部分流出液各取50ul和50ul 2×上样缓冲溶液(100mM Tris-HCl，pH6.8，4％SDS，5％2-ME，20％甘油，0.2％溴酚兰)混合沸水浴5分钟以变性蛋白，-20℃保存以备电泳分析。进行SDS-PAGE电泳分析(图5)。收集含目的蛋白的洗脱液，将含目的蛋白的洗脱液用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM KH₂PO₄pH7.4)溶液透析，再经超滤浓缩得到高浓度的目的蛋白。

实施例4.强化融合蛋白SG-LDP-AE的制备分离

取LDM冻干品(专利申请号：001215272，公开号：1284566)10mg，加5ml冷甲醇振摇5分钟，-20℃放置1小时，中间振摇1次，在0℃，12000rpm/min，离心20分钟，上清液富含AE，沉降物为肽链，重复提取2次。自然蒸发浓缩甲醇溶液，上述操作需要在4℃、避光条件下进行。取一定体积和浓度的SG-LDP溶于0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)中，加5倍分子量的AE甲醇溶液(体积比50∶1)，混和振摇，室温放置12小时，将混和液以PD-10柱(商业化的Sephadex G-25柱，Pharmacia产品)层析分离，经A280nm紫外监测后弃过量未结合的AE，收集强化融合蛋白SG-LDP-AE。

实施例5.融合蛋白SG-LDP的免疫学活性检测

取对数生长期的肿瘤细胞按照2×10⁴个/孔的密度铺96孔板，培养24小时，经4℃预冷0.05％戊二醛固定15分钟、1％的BSA封闭后，每孔加入倍比稀释的融合蛋白，37℃孵育1-2小时后，先后用抗His抗体为一抗(Novagen公司产品，1∶2000倍稀释)，HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗(Santa Cruz公司产品，1∶2500倍稀释)37℃分别孵育半小时后，每孔加入100μl OPD底物反应液(邻苯二胺∶底物缓冲液∶H₂O₂＝4mg∶10ml∶15ul)暗处进行显色10分钟，酶标仪测定492nm处吸光值。结果表明，靶向融合蛋白SG-LDP和不同的高水平表达EGFR的肿瘤细胞如KB，7402，HeLa，HT-29等都有较强的免疫结合活性，而力达霉素辅基蛋白LDP对上述肿瘤细胞几乎没有免疫结合活性(图6A，6B)。

实施例6.强化融合蛋白SG-LDP-AE对肿瘤细胞的细胞毒作用的MTT检测

取对数生长期的细胞消化、计数，3×10³个/孔铺于96井板，在37℃含5％CO₂的培养箱中培养24小时后吸弃上清，加入以RPMI1640稀释的不同浓度的药物，200ul/井，每个药物浓度设3个平行井。继续培养48-72小时后，每井加入以PBS溶解的MTT(2mg/ml)50ul，37℃继续培养4小时后，吸弃上清，加入150ul DMSO，室温下摇床振摇15分钟，酶标仪上测定560nm的光吸收值。每次实验均设无药对照井和无细胞空白井各3井。按下列公式计算细胞的存活率及样品的IC₅₀值。

结果表明，SG-LDP-AE对高表达EGFR的KB，7402，HeLa，HT-29等肿瘤细胞有强烈的杀伤作用，IC₅₀值分别为8.9×10^-11M、4.04×10^-11M、1.14×10^-9M、1.19×10^-9M(图7)，而LDM的IC₅₀分别为3.66×10^-11M、6.98×10^-12M、1.74×10^-10M、1.92×10^-10M，和LDM相比，其IC₅₀略高，其原因为SG-LDP-AE体外的发色团包装效率要比天然的LDM的发色团包装效率差。

对低表达EGFR的MCF-7细胞转染Her2基因后用MTT法检测细胞毒作用，以未转染的MCF-7细胞作为对照，发现LDM对两株瘤细胞的细胞毒作用变化不大(图8A)，其IC₅₀值分别为1.02×10^-10(转染前)和6.6×10^-11(转染后)；而SG-LDP-AE对转染Her2基因后的MCF-7细胞的细胞毒作用要比未转染的MCF-7细胞的细胞毒作用强(图8B)，其IC₅₀值分别为3.42×10^-9(转染前)和5.6×10^-11(转染后)，提示SG-LDP-AE可能对高表达Her2的肿瘤细胞也具有潜在的协同作用，而使其对高表达Her2的肿瘤细胞更敏感。

实施例7.强化融合蛋白SG-LDP-AE的动物试验性治疗方案

根据剂量初筛结果，设计动物试验治疗的给药方式和剂量。取体重为18-22g的昆明小鼠60只，随机分组，每组10只。取小鼠肝癌H22腹水，以生理盐水稀释成细胞数为7.5×10⁶个/ml，0.2ml/只，接种于昆明小鼠腋窝皮下。种瘤一天后，对照组静脉注射生理盐水，其余各组分别给予SG-LDP-AE，LDM，SG-LDP，丝裂霉素(MMC)。均为尾静脉注射，0.2ml/只。实验期间，每3天测量一次肿瘤长径a和肿瘤短径b，并记录动物体重。以公式V＝1/2ab²计算瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，并计算抑制率。如图9，表1所示。

表1.强化融合蛋白SG-LDP-AE对小鼠肝癌H22的生长抑制作用(实验第21天)

Group    Dose       No.of mice    Body wt.(g)  Tumor-size(cm³)    Inhibition

         (mg/kg)    Start/end     Start/end    X±s               rate(％)

Control      -       10/10        40.639        8.74±5.40      -

LDM          0.05    10/10        30.483        0.98±1.21      88.8**

SG-LDP-AE    0.8     10/10        25.462        0.36±0.66      95.8**

             0.4     10/10        29.829        1.81±2.05      79.3*

SG-LDP       1.6     10/10        39.533        6.39±3.24      26.9

MMC          1       10/10        36.157        5.82±4.06      33.4

*P＜0.05 vs.control；**P＜0.01 vs.control。

试验A第21天的结果表明(表1)，强化融合蛋白SG-LDP-AE体内有显著疗效，在0.4mg/kg、0.8mg/kg剂量，可明显抑制H22皮下瘤的生长，从(图9)中可以看到，SG-LDP-AE在0.8mg/kg剂量时疗效尤其显著，其第21天的抑制率达到95.8％。

                                  序列表

<110>中国医学科学院医药生物技术研究所

<120>表皮生长因子受体靶向短肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程融合蛋白

<140>

<141>

<160>2

<170>

<210>1

<211>492

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)…(66)

<223>

<400>1

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg    60

atggccatgg cgaaccccgt ggtgggctac atcggtgaac gtcctcagta tcgtgacctg    120

ggtggaggcg gttcagcgcc cgccttctcc gtcagtcccg cctcgggtct gagtgacgga    180

cagagcgtgt cggtgtcggt cagcggtgcc gccgccggcg agacctacta catcgcccag    240

tgcgctccgg tcggtggcca ggacgcgtgc aacccggcga ccgcgacgtc cttcaccacg    300

gacgcgtccg gagcggcgtc gttcagcttc gtcgtgcgca agtcgtacac gggctccacg    360

cccgaaggca cgccggtcgg cagcgtcgac tgcgccacgg ccgcctgtaa cctcggcgcc    420

ggcaactccg ggctcgacct cggccacgtg gctctgacct tcggcctcga gcaccaccac    480

caccaccact ga                                                        492

<210>2

<211>141

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>

<223>

<400>2

atg aaa tac ctg ctg ccg acc gct gct gct ggt ctg ctg ctc ctc    45

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu

gct gcc cag ccg gcg atg gcc atg gcg aac ccc gtg gtg ggc tac    90

Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Asn Pro Val Val Gly Tyr

                            1               5

atc ggt gaa cgt cct cag tat cgt gac ctg ggt gga ggc ggt tca    135

Ile Gly Glu Arg Pro Gln Tyr Arg Asp Leu Gly Gly Gly Gly Ser

    10                  15                  20

gcg ccc gcc ttc tcc gtc agt ccc gcc tcg ggt ctg agt gac gga    180

Ala Pro Ala Phe Ser Val Ser Pro Ala Ser Gly Leu Ser Asp Gly

    25                   30                 35

cag agc gtg tcg gtg tcg gtc agc ggt gcc gcc gcc ggc gag acc    225

Gln Ser Val Ser Val Ser Val Ser Gly Ala Ala Ala Gly Glu Thr

    40                  45                  50

tac tac atc gcc cag tgc gct ccg gtc ggt ggc cag gac gcg tgc    270

Tyr Tyr Ile Ala Gln Cys Ala Pro Val Gly Gly Gln Asp Ala Cys

    55                  60                  65

aac ccg gcg acc gcg acg tcc ttc acc acg gac gcg tcc gga gcg    315

Asn Pro Ala Thr Ala Thr Ser Phe Thr Thr Asp Ala Ser Gly Ala

    70                  75                  80

gcg tcg ttc agc ttc gtc gtg cgc aag tcg tac acg ggc tcc acg    360

Ala Ser Phe Ser Phe Val Val Arg Lys Ser Tyr Thr Gly Ser Thr

    85                  90                  95

ccc gaa ggc acg ccg gtc ggc agc gtc gac tgc gcc acg gcc gcc    405

Pro Glu Gly Thr Pro Val Gly Ser Val Asp Cys Ala Thr Ala Ala

    100                 105                 110

tgt aac ctc ggc gcc ggc aac tcc ggg ctc gac ctc ggc cac gtg    450

Cys Asn Leu Gly Ala Gly Asn Ser Gly Leu Asp Leu Gly His Vak

    115                 120                 125

gct ctg acc ttc ggc ctc gag cac cac cac cac cac cac tga        492

Ala Leu Thr Phe Gly Leu Glu His His His His His His

    130                 135                 140

Claims (10)

1.一种强化融合蛋白SG-LDP-AE，其特征在于它是由与表皮生长因子受体EGFR靶向结合的短肽SG、力达霉素辅基蛋白LDP和羧基端组氨酸六聚体尾形成的分子量为13.9kDa的融合蛋白SG-LDP以及分子量为843Da的活化型烯二炔发色团AE构成的，SG-LDP基因全长492bp，编码141个氨基酸。

2.如权利要求1所述的强化融合蛋白SG-LDP-AE，其特征在于其中的SG基因全长54bp，编码18个氨基酸，在SG基因前有66bp的信号肽基因序列；LDP基因全长330bp，编码110个氨基酸；二者之间的柔性肽基因15bp，编码5个氨基酸；羧基端的组氨酸六聚体尾基因为18bp，编码6个氨基酸；SG-LDP基因和羧基端的组氨酸六聚体尾基因之间的XhoI酶切位点基因为6bp，编码2个氨基酸，终止密码子为3bp。

3.一种制备如权利要求1所述强化融合蛋白SG-LDP-AE的方法，其特征在于所说方法主要采用DNA重组和分子强化的技术路线，具体步骤如下：

A.EGFR靶向结合的短肽SG与力达霉素辅基蛋白LDP的融合基因构建；

B.融合蛋白大肠杆菌重组表达质粒pET30SGLDP的构建；

C.融合蛋白SG-LDP在保藏编号为CGMCC No.1320的大肠杆菌pET30SGLDP中的诱导表达；

D.融合蛋白SG-LDP的亲和层析纯化及分离；

E.强化融合蛋白SG-LDP-AE的制备及分离。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤A中SG基因前运用基因工程技术引入一段信号肽序列。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤A中运用基因工程技术分别克隆得到EGFR靶向结合的短肽SG基因和力达霉素辅基蛋白LDP基因，将二者与编码一段柔性小肽的DNA序列相连构建成SG-spacer-LDP形式的融合基因，同时在SG基因前的信号肽序列后引入特异性酶切位点。

6.如权利要求3或5所述的制备方法，其特征是步骤B中将所得到的融合基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET-30a(+)中，构建重组表达质粒pET30SGLDP。

7.如权利要求3或6所述的制备方法，其特征是将pET30SGLDP转化入大肠杆菌宿主菌中，经IPTG诱导表达获得分泌型活性融合蛋白SG-LDP。

8.如权利要求3或7所述的制备方法，其特征是通过亲和层析纯化融合蛋白SG-LDP，再进行透析，浓缩，制备功能性融合蛋白。

9.如权利要求3或8所述的制备方法，其特征是将纯化分离得到的融合蛋白SG-LDP与经甲醇提取制备的力达霉素发色团的活性型烯二炔AE，以分子比为50∶1和强化时间为12小时，室温下进行分子强化，获得强化融合蛋白SG-LDP-AE。

10.强化融合蛋白SG-LDP-AE在制备新型抗肿瘤靶向药物中的应用。

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