CN1332242A - 一种尖吻蝮蛇毒凝血酶及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明经阴离子交换剂柱层析法分离纯化及快速蛋白纯化工作站程序再纯化,从我国特产尖吻蝮(Agkistrodonacutus)蛇毒中得到纯度在97%以上的尖吻蝮蛇毒凝血酶Ⅱ;经测定,该酶Ⅱ由A、B两个亚基(链)组成,其中,A亚基含有125个氨基酸,B亚基含有123个氨基酸;与现有蛇毒凝血酶(如Reptilase)相比,它是一个全新的新型酶止血剂。经药理、毒理、药代等研究表明,它是一个见效快,副作用小的、安全有效的新型止血剂。
Description
本发明所属的技术领域：
本发明属于生化医药领域。进一步，本发明涉及尖吻蝮蛇毒凝血酶II，该蛇毒凝血酶II具有临床上的止血功能。本发明的研究背景：
本发明系从我国特产的尖吻蝮(Agkistrodon acutus，俗称五步蛇，百步蛇)蛇毒中分离纯化得到的单一组份，它有两个同功酶，经理化测定，尖吻蝮蛇毒凝血酶II由两个亚基组成，分子量为27000。经氨基酸序列测定，A链由125个氨基酸组成，B链由123个氨基酸组成。经药效试验具有显著或非常显著促凝血效应及止血作用，适用于各种出血疾病的预防和治疗。
在国外，Holleman等(Holleman，W.H.等，1976 J.Biol.Chem.，251：1663.)用亲和层析法自巴西矛头蝮(Bothrope jararaca)蛇毒中分离纯化得到了蛇毒凝血酶(Hemocoagulase，Reptilase，Batroxbin)，经Itoh.N.等(Itoh，N等，J.Biol-Chem.262：3132-3135，1987)测定，Batroxobin为单链，由230个氨基酸组成，分子量为3100。V.Klobusitzky(1936)首先发现并将该酶制剂(含至少两个以上组份)研制成止血剂-Reptilase，并申请专利(参见Reptilase使用说明书)。我国进口的药物“立止血”(Reptilase)，即是由瑞士巴塞尔素高大药厂生产。我国每年进口数百万支“立止血”，每年在我国的年销售额据估计可达3—4亿人民币以上。
“立止血”的原料为巴西矛头蝮蛇毒，在我国没有该蛇的分布，并且，该产品为复合组份组成(说明书包含两个组份，而据我们的实际测定则有三个以上的组份)(莫伟楠等，《中国大药房》，1996，7(3)：137)。按照医药制剂的一般要求，药品的成份以单体为好，且纯度越高越好。本发明人从我国特产的尖吻蝮(与矛头蝮属不同属、种)蛇毒中分离纯化得到高纯度(97％以上)的单一组份尖吻蝮蛇毒凝血酶II。
经药理试验，本发明人发现该蛇毒凝血酶II具有促凝及止血效果，且该效果优于“立止血”(Reptilase)。对该蛇毒凝血酶II的毒理与药代动力学研究表明，该蛇毒凝血酶II完全可以应用于临床。
本发明的目的是提供一种高纯度的单体止血剂尖吻蝮蛇毒凝血酶II；该蛇毒凝血酶II具有临床上的止血作用。本发明的技术方案：
本发明的工艺流程如下：
注射用尖吻蝮蛇毒凝血酶II……→鉴定蛇毒凝血酶II的特征并进行其他研究。
具体而言，本发明的工艺流程包括如下步骤：
1.蛇毒用Tris-Hcl缓冲液溶解，离心沉淀，取上清液经阴离子交换柱层析，用Tris-Hcl缓冲液Nacl直线梯度洗脱，可同时得到四个以上蛇毒凝酶样酶(Thrombin like enyemy)组份；
2.将其中2个中的蛇毒凝血酶II组份再经阴离子交换柱层析两次以上纯化或用快速蛋白纯化工作站程序纯化得精制蛇毒凝血酶II溶液，经毛细管区带电泳、HPLC(反相)色谱、核磁共振、测得纯度在97—99％，由两个亚基组成。其得率为5—8％，(国外一般为0.5—1.0％)可生产成品2000支/g蛇毒，其产率是比较高的。
在生产尖吻蝮蛇毒凝血酶II的同时，还可以生产具有治疗血栓功能的降纤酶和具有止血功能的尖吻蝮蛇毒凝血酶I，这可使宝贵的蛇毒原料得以充分利用。
3.将精制的蛇毒凝血酶II再经脱盐得蛇毒凝血酶II原液；
4.将所得的蛇毒凝血酶II原液再分别配方(加赋形剂)，过滤、分装、冷冻干燥、封盖即得注射用蛇毒凝血酶II成品。
5.鉴定蛇毒凝血酶II的特征：
(1)用This-HCl pH7.2—8.8缓冲液溶解，经阴离子交换剂柱层析，用上述缓冲液pH7.2—8.8缓冲液氯化钠直线梯度洗脱可同时得到4个以上粗分蛇毒凝血酶样酶组份；
(2)将所得的蛇毒凝血酶II粗组份再经阴离子交换剂两次以上柱层析纯化，用pH7.2—8.8缓冲液，氯化钠直线梯度两次以上洗脱纯化或用快速蛋白纯化仪程序纯化得精制蛇毒凝血酶II溶液；
(3)该酶的特征鉴定：
A.经毛细管区带电泳，可得其相对含量为97％以上；
B. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见两条亚基蛋白带，分子量分别为15000、13000；
C.用4mg/ml人(或牛)纯血纤维蛋白原测定其酶活力，其比活力＞80 U/mg。经蛋白测序，为两个亚基，A链由125个氨基酸组成(序列如SEQ ID NO1所示)，B链由123个氨基酸组成(序列如SEQ ID NO2所示)。A亚基和B亚基的配对如图1所示。
与之相比较，Reptilase为单链，由230个氨基酸组成。
因此，尖吻蝮蛇毒凝血酶II也与尖吻蝮蛇毒凝血酶I不同，是一
个全新的止血剂，从目前技术它还不可能用克隆生产。
6.与“立止血”(Reptilase)的比较研究：
将上述由本发明得到的蛇毒凝血酶II与商业可得的“立止血”(Reptilase)进行比较研究。
用家兔32只(雌雄各半)分为4组，每组8只，1、3组为尖吻蝮蛇毒凝血酶II，1、3U/kg体重剂量，2、4组用“立止血”1、3U/kg体重剂量作比较试验，分别在用药后10分、20分、1小时、3小时、7小时、12小时和24小时由耳静脉取血测定全血凝血时间。
研究表明，本发明得到的蛇毒凝血酶II见效快(10分钟即有显著促凝血作用，而Reptilase则需在20分钟时才有显著促凝作用)，其促凝作用显著强于Reptilase，并且无明显副作用。
再经造模作大鼠、家兔止血试验，实验结果表明0.8U/mg体重剂量即有显著止血作用。表明本发明得到的蛇毒凝血酶II具有与“立止血”(Reptilase)相同的临床功能。
应说明的是，在本发明的操作过程中，粗分所得蛇毒凝血酶II和再纯化时的溶液用水是超纯水；溶解蛇毒所用的缓冲液是0.05-0.10M Tris-HCl缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液；粗分所用阴离子交换剂是DEAE—SephadexA-50或QAE—Sephadex A-25，粗分所用氯化钠梯度为0—1.0M；纯化方法，其特征在于两次以上柱层析纯化所用阴离子交换剂是Q—Sepharose、DEAE—Sephadex A-50；两次以上柱层析纯化洗脱所用缓冲液为0.3-0.9M。用AKTA或Backman快速蛋白纯化工作站，所用柱为Q-柱，其洗脱方法按设定程序进行。并且，全工序操作应在10±2℃的GMP环境中进行。本发明的有益效果：
本发明提供了一种尖吻蝮蛇毒凝血酶II；该凝血酶是从尖吻蝮蛇毒中分离纯化得到，具有临床上可以应用的止血功能，是单一组份，具有止血性能好、可替代同类药物的效果。
本发明的实施例：
以下叙述本发明的实施例。需要说明的是，本发明的实施例对本发明只有说明作用而没有限制作用。
实施例一、990903批尖吻蝮蛇毒凝血酶II的生产：
将DEAE—Sephadex A-50(SIGMA St.Louis，MO 63178U.S.A.)80g用0.05MpH7.8Tris-Hcl缓冲液浸泡12小时以上，装柱(4×110cm2)，再平衡。同时将尖吻蝮蛇毒3g溶于上述缓冲液10ml中溶解后经2000转/分离心10分钟，取上清液上柱。用上述缓冲液于储存瓶及梯度瓶各1500ml，储存瓶Nacl浓度为1M，梯度瓶Nacl浓度为0，进行Nacl0—1.0M一次直线梯度洗脱，洗脱液用自动部分收集器收集，每管8—10ml，每小时7—8管。收集液在280nm下测定光吸收值，以光吸收值与管数作图确立其蛋白峰数，每个峰的收集液合并得粗分组份。然后对各粗分组份测定其凝血酶样酶活力，一般5—8峰具有该酶活力，5、6峰为去纤酶(降纤酶)，7、8峰为蛇毒凝血酶，取7峰(约80—100ml)经G—25脱盐冻干约100mg，再上Q-Sepharose柱(3×110cm2)，用Nacl(0—0.6M)一次直线梯度洗脱，收集液按上法测定其光吸收值，并按峰收集洗脱液于广口瓶中，测定酶活力及电泳图谱，确立其所要的组份，一般分为3个峰，峰2为蛇毒凝血酶II(约70ml)，再经G—25脱盐得冻干粉约60—80mg(纯度约90—94％)。将冻干粉用0.05pH8.0 Tris—Hcl缓冲液配成10mg/ml，用AKTA或Backman快速蛋白纯化工作站纯化，Q6一柱(6ml)每次上样1ml，洗脱程序为0—30—60％洗脱，由电脑程序绘图及接收所需组份。将6—8次程序分离收集液合并约20ml，再经Sephadex G—25脱盐，冷冻干燥得冻干粉约50mg，经检测比活力为60U/mg，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为15000、13000道尔顿的两个亚基，经反相色谱测定纯度为98％，毛细管电泳测定其纯度为97％。最后经配方、超滤、分装、冻干、压盖得注射用蛇毒凝血酶II成品2800支，即每克粗毒得933支。
实施例二、990904批尖吻蝮蛇毒凝血酶II生产实例：
将上例用DEAE—Sephadex A-50再生后装柱(4×110cm2)用0.08M pH8.8Tris-Hcl缓冲液平衡8小时。同时将尖吻蝮蛇毒3.0g溶于溶于上述缓冲液10ml中溶解后经2000转/分离心10分钟，取上清液上柱。
用上述缓冲液于储存瓶及梯度瓶各1500ml，储存瓶Nacl浓度为1M，梯度瓶Nacl浓度为0，进行Nacl0-1.0M一次直线梯度洗脱，洗脱液用自动部分收集器收集，每管8—10ml，每小时7—8管。收集液在280mn下测定光吸收值，以光吸收值与管数作图确立其蛋白峰数，每个峰的收集液合并得粗分组份。
然后，对各粗分组份测定其凝血酶样酶活力，一般情况下，5—8峰具有该酶活性，5、6峰为降纤酶，7、8峰为蛇毒凝血酶。
取7峰(约80ml)经G—25柱(3×110cm2)层析脱盐，冻干粉为90mg，再经Q—Sepharose柱(3×110cm2)层析，用Nacl(0—0.6M)一次直线梯度洗脱，收集液按上述测定其光吸收值，按峰收集洗脱液于广口瓶中，测定酶活力及电泳图谱，确立其所要组份，一般分为三个峰，峰2为蛇毒凝血酶II(约65ml)，再经G—25柱(3×110cm2)层析脱盐冻干，得冻干粉约65mg(纯度90—93％)。
将冻干粉用0.08M，pH8.2 Tris-HCl缓冲液配成10mg/ml浓度，用AKTA(amershampharmacia biotech U.S.A.)或Backmam(U.S.A.)生产的快速蛋白纯化工作站纯化，用Q6-柱(6ml)，每次上样1ml，洗脱程序为0—60％洗脱，由电脑程序绘图及收集所需组份。
将各次程序分离收集液合并约30ml，再经G-25脱盐，冷冻干燥得冻干粉45mg，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为13000、15000道尔顿的两个亚基，经毛细管区带电泳，反相高效液相色谱分析，纯度为97.2％，酶比活力为70U/mg。
最后加赋形剂配方，超滤、分装、冻干、压盖得每瓶1单位注射用尖吻蝮蛇毒凝血酶II成品3000支，即每克粗毒得1000支成品。
附：本发明涉及的氨基酸序列SEQ ID NO1(尖吻蝮蛇毒凝血酶II亚基A的氨基酸序列)：
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1.一种尖吻蝮蛇毒凝血酶II，其特征是该酶II是从我国特产的尖吻蝮的蛇毒中分离纯化得到，具有止血功能，且由A和B两个亚基组成；
2.权利要求1的尖吻蝮蛇毒凝血酶II，其中所说的止血功能是指该酶II可用于临床上哺乳动物的止血；
3.权利要求1的尖吻蝮蛇毒凝血酶II，其中所说的止血功能是指该酶II可用于临床上人的止血；
4.权利要求1的尖吻蝮蛇毒凝血酶II，其中所说的A和B两个亚基(链)分别由125个和123个氨基酸组成，且具有如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；
5.一种具有临床止血功能的药物组合物，其特征是该药物组合物含有具有止血功能的尖吻蝮蛇毒凝血酶II；
6.权利要求5的药物组合物，其中所说的药物组合物还含有药学上可接受的载体和/或赋形剂；
7.一种生产尖吻蝮蛇毒凝血酶II的方法，其特征是该方法包括如下步骤：
(1)尖吻蝮蛇毒用缓冲液溶解，离心沉淀，并经阴离子交换剂柱层析，用缓冲液洗脱，可同时得到去纤酶(降纤酶)和蛇毒凝血酶粗分组份；
(2)将所得的蛇毒凝血酶II粗组份再分别经阴离子交换剂柱层析及快速蛋白纯化工作站程序，纯化得精制蛇毒凝血酶II溶液；
(3)将精蛇毒凝血酶II溶液经脱盐得蛇毒凝血酶II原液；
(4)将所得蛇毒凝血酶II原液进行配方、过滤、分装和冷冻干燥。
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