CN105567733A - CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法 - Google Patents

CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法，其包括如下步骤：(1)构建表达质粒：分别构建表达凝血酶a-亚基和b-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒；(2)细胞转染：使用上述重组表达载体质粒转染CHO细胞；(3)对上述CHO细胞进行驯化培养，收集上清液。本发明的方法高效稳定地成功表达了有酶活性的双亚基融合蛋白，即CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白。

Description

CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法。
背景技术
凝血酶为医用止血的重要制剂，目前来源于天然蛇毒提取。已知存在多种凝血酶，可以切割纤维蛋白原α-链，使其转化为纤维蛋白，造成血凝。
其中，有的凝血酶为单链蛋白，有的为双链糖蛋白。如XinChen等人、肖昌华等人、孙狄等人从五步蛇(Agkistrodonacutus)的蛇毒中分离出含有两条肽链的凝血酶。这些凝血酶分子量均在30KDa左右，结构高度相似，均有止血功效。
但是，由蛇毒中提取凝血酶不但工艺复杂、收率低，而且大大受限于原料。原料价格也推高了产品价格，影响产品经济效益和病人收益。
中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovary，CHO细胞)是一种实验室常见的贴壁细胞系，广泛用于生物制品的表达，诞生于70年代末，因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法，其能够有效表达凝血酶。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法，其包括如下步骤：
(1)构建表达质粒：分别构建表达凝血酶a-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒、以及表达凝血酶b-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒；
(2)细胞转染：使用上述重组表达载体质粒转染CHO细胞；
(3)对上述CHO细胞进行驯化培养，收集上清液。
优选地，所述步骤(1)的具体操作如下：
将凝血酶a亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过限制性内切酶BamHI和XbaI将凝血酶a亚基连His-tag片段酶切得到；同时用BamHI和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和新霉素表达盒的质粒，即pAPZ-Fc1质粒，然后通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶a-Fc载体质粒，再将得到的质粒用BglII线性化后用于转染；
将凝血酶b亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过BglII和NheI将此凝血酶b亚基连His-tag的DNA片段酶切得到；同时用BamHI和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和万古霉素表达盒的质粒，即pAPZ-Fc2质粒，然后通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶b-Fc载体质粒，再将得到的质粒用BglII线性化后用于转染。
优选地，所述步骤(2)的具体操作如下：
S1.取对数期生长的CHO细胞，离心后重悬在DMEM-F12培养基中，该培养基中加入谷氨酰胺、1％胎牛血清、1％大豆蛋白胨SoyPeptoneUF、1mM丁酸钠，密度为2×106细胞/毫升；
S2.准备转染试剂，将PEI制成1mg/ml的水溶液，按比例将下列试剂混合：16μgDNA、60μlPEI、加入150mM氯化钠溶液至500μl，漩涡搅拌10秒，在室温孵育10分钟；上述DNA中，凝血酶a-亚基DNA与凝血酶b-亚基DNA的比例为1:1；
S3.将上述混合物加入CHO细胞，摇动培养4小时；
S4.将培养基换成CD-CHO培养基，继续培养3天；
S5.将细胞计数后稀释，接种入96孔板，加入含有新霉素或万古霉素的选择培养基；
S6.持续培养直到抗性克隆形成，每7天换液一次。
本发明采用DNA重组技术，将双亚基凝血酶与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段融合，并在CHO细胞进行表达。采用该方法，本发明高效稳定地成功表达了有酶活性的双亚基融合蛋白，即CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白。
附图说明
图1是表达a-亚基的质粒结构。
图2是表达b-亚基的质粒结构。
图3是融合蛋白的检测结果，其中，1-2道为凝血酶a亚基-Fc，3-4道为凝血酶b亚基-Fc，M为蛋白Marker)。
图4是不同培养条件下凝血酶表达水平的对比。
图5是不同PEI/DNA比例下凝血酶表达水平的对比。
图6是不同DNA用量下凝血酶表达水平的对比。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明的技术方案进行描述，但本发明并不限于以下实施例。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行操作，或按照制造厂商所建议的条件。为了使技术方案更为清楚，除非特别指出，以下实施例中对本领域的一些常规技术操作进行了省略说明，但可理解的是，本领域技术人员熟知这些技术手段，并且是可实现的。
实施例1表达质粒的构建
分别构建表达凝血酶a-亚基和b-亚基的表达质粒。
表达a-亚基的质粒结构如图1所示，其中，凝血酶a亚基(连信号肽共152个氨基酸)序列采用Genbank序列Q9IAM1；His-Tag序列为“CATCATCATCATCATCAT”，置于凝血酶信号肽序列之后；其中，表达新霉素的表达盒可筛选转染阳性的细胞。
凝血酶a亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过限制性内切酶BamHI和XbaI将凝血酶a亚基连His-tag片段酶切得到；同时用BamHI和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和新霉素表达盒的质粒(pAPZ-Fc1质粒)。通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶a-Fc载体质粒，得到的质粒用BglII线性化后用于转染。
表达b-亚基的质粒结构如图2所示，其中，凝血酶b-亚基(连信号肽共146个氨基酸)的序列采用Genbank序列Q8JIW1；His-Tag序列为“CATCATCATCATCATCAT”，置于凝血酶信号肽序列之后；其中，表达万古霉素的表达盒可筛选转染阳性的细胞。
凝血酶b亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过BglII和NheI将此凝血酶b亚基连His-tag的DNA片段酶切得到；同时用BamHI和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和万古霉素表达盒的质粒(pAPZ-Fc2质粒)。通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶b-Fc载体质粒，得到的质粒用BglII线性化后用于转染。
实施例2细胞转染
为了表达融合蛋白，进行细胞转染，具体步骤如下：
1.取对数期生长的CHO细胞，离心后重悬在DMEM-F12培养基中(加2mM谷氨酰胺，加入1％(v/v)胎牛血清(FBS)、1％(w/v)大豆蛋白胨SoyPeptoneUF、1mM丁酸钠)，密度为2×106(2e6)细胞/毫升。
2.准备转染试剂，将PEI(聚乙烯亚胺)制成1mg/ml的水溶液。按比例将下列试剂混合：
16μg质粒DNA
60μlPEI(1mg/ml)
加入150mM氯化钠溶液至500μl，漩涡搅拌10秒，在室温孵育10分钟。
上述DNA中，凝血酶a-亚基DNA与凝血酶b-亚基DNA的比例为1:1。
3.将上述混合物加入CHO细胞，摇动培养4小时。
4.将培养基换成CD-CHO培养基，继续培养3天。
5.将细胞计数后稀释，接种入96孔板，加入含有新霉素或万古霉素的选择培养基。
6.持续培养直到抗性克隆形成，每7天换液一次。
实施例3融合蛋白的检测
将上述表达质粒(即，凝血酶a-亚基的表达质粒和b-亚基的表达质粒)分别转染入CHO细胞，经驯化培养后收集上清液。上清液中蛋白经SDS-PAGE胶分离，转膜后使用抗His-Tag抗体WESTERNBLOTTING检测，可看到蛋白条带(如图3所示)，其中，1-2道为凝血酶a亚基-Fc，3-4道为凝血酶b亚基-Fc，M为蛋白Marker)。Fc段单体蛋白分子量为30KDa左右，凝血酶亚基连His-Tag后分子量13-15kDa。WESTERNBLOTTING可以检测到分子量在50KDa以上的条带，这说明表达质粒可以在CHO细胞中表达出凝血酶-Fc融合蛋白。
实施例4蛋白酶活性检测
采用凝血酶降解纤维蛋白原检测凝血酶-Fc融合蛋白的活性。
向20mMTris、pH7.4、0.5mg/mL的人纤维蛋白酶原溶液中，加入不同稀释倍数的样品，一小时后观察溶液浑浊情况，作为检测凝血酶功能的依据。凝血酶表达量用样品稀释前的相对水平表示。具体方法如下：
在96孔板第一行加入未稀释样品，每行10个孔。向下一行进行连续3倍稀释。第8行即稀释约3000倍。每孔加入人纤维蛋白酶原溶液，孵育1小时后观察溶液浑浊情况。计数每行出现浑浊的孔数，用Reed-Muench法计算出的数值代表凝血酶表达量。
检测结果显示，凝血酶亚基与Fc融合后，可以形成有功能的凝血酶，凝血酶a-亚基的表达质粒和b-亚基均成功表达，并正确组合，生成有酶活性的凝血酶。

Claims (3)

1.一种CHO细胞表达凝血酶-Fc融合蛋白的方法，其包括如下步骤：
(1)构建表达质粒：分别构建表达凝血酶a-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒、以及表达凝血酶b-亚基与人IgG1单克隆抗体不变区Fc段的重组表达载体质粒；
(2)细胞转染：使用上述重组表达载体质粒转染CHO细胞；
(3)对上述CHO细胞进行驯化培养，收集上清液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作如下：
将凝血酶a亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过限制性内切酶BamHI和XbaI将凝血酶a亚基连His-tag片段酶切得到；同时用BamHI和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和新霉素表达盒的质粒，即pAPZ-Fc1质粒，然后通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶a-Fc载体质粒，再将得到的质粒用BglII线性化后用于转染；
将凝血酶b亚基连His-tag片段的DNA序列编码经过合成并克隆到pUC18载体，然后通过BglII和NheI将此凝血酶b亚基连His-tag的DNA片段酶切得到；同时用BamHI和NheI酶切得到含人IgG1重链恒定区Fc片段和万古霉素表达盒的质粒，即pAPZ-Fc2质粒，然后通过酶切得到的两段DNA片段进行凝胶纯化再连接，形成pAPZ-凝血酶b-Fc载体质粒，再将得到的质粒用BglII线性化后用于转染。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作如下：
S1.取对数期生长的CHO细胞，离心后重悬在DMEM-F12培养基中，该培养基中加入2mM谷氨酰胺、1％胎牛血清、1％大豆蛋白胨SoyPeptoneUF、1mM丁酸钠，密度为2×106细胞/毫升；
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