CN1926237A - 用于治疗不育症的异二聚体促卵泡激素－Fc(FSH－Fc)融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供新的异二聚体融合蛋白，其包含第一多肽和第二多肽，第一多肽包括直接或间接地与新生Fc受体(FcRn)的结合伴侣连接的FSH的α亚基(αFSH)，第二多肽包括直接或间接地与FcRn结合伴侣连接的FSH的β亚基(βFSH)。在一个实施方案中，FcRn结合伴侣包含免疫球蛋白的Fc片段，例如IgG的Fc片段。也提供制备和使用本发明的融合蛋白的方法。本发明提供提高对象生育力的方法和治疗具有对FSH治疗有反应的疾病状态的对象的方法。

Description

用于治疗不育症的异二聚体促卵泡激素-Fc(FSH-Fc)融合蛋白

                             技术领域

本发明一般地涉及生殖疾病的治疗领域。更具体地，本发明涉及治疗不育症的异二聚体促卵泡激素-Fc融合蛋白。

                             背景技术

十对夫妇中就有一对受不育症影响，这导致数百万对夫妇在为怀孕而斗争。许多这些夫妇是不育症治疗的潜在候选者。促卵泡激素(FSH)，从尿中提取或重组产生，是专业人员使用的用于增强生育力的非胃肠给药的蛋白质产品，其从1960年代就已经临床使用。例如，FSH用于诱导排卵(OI)和用于受控的卵巢过度刺激(COH)。OI目的在于实现单个卵泡排卵，而COH目的在于获得多个卵母细胞用于各种体外辅助生殖技术(例如，用于体外生殖)。FSH也用于男性的促性腺素替代疗法。

由于其价格昂贵、需要专业医师的大量监测、缺少口服给药或其它非侵入性给药途径、和对象需要每日注射，FSH的使用受到限制。重组FSH受困于半衰期短和相应消弱的生物效能、必需频繁给药、和受限的临床实用性。例如，当用于诱导排卵时，重组人FSH(hFSH)必须每日肌肉内或皮下注射给药，通常给药8-12天或更长时间。这些治疗方案伴有许多副作用，包括局部刺激和不适，其导致依从性差和治疗效果减弱。因而，存在对与FSH治疗的传统形式相比较具有增加的半衰期和生物利用度的FSH形式的需要。

天然发现的促卵泡激素(FSH)是非共价连接的异二聚体蛋白，由α亚基和β亚基组成(Pierce JG and Parsons TF(1981)Ann Rev Biochem 50：465-95)。已经报道亚基装配对于FSH的生物活性(Jia XC and Hseuh AJW(1986)Endocrinology119：1570-7)以及对于β亚基的稳定性(Keene et al.(1989)J Biol Chem 264：4769-75)是必需的。

提高FSH治疗的一种方法是增加蛋白质的糖基化。其它方法包括使用FSH的的羧基端部分(CTP)的伸展形式(见例如美国专利No.5,338,835和U.S.2003/0211580A1)或FSH模拟物(见例如美国专利No.6,653,338)用于治疗不育症。然而，提高半衰期和生物活性的早期尝试还没有获得能优于现有治疗的治疗有效的药物。

也已经报道FSH的α和β亚基的单链融合体(单链FSH)是全活性的(Sugaharaet al.(1996)J Biol Chem 271：10445-8)。据报道，当单链FSH与人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧端肽相融合时，其具有增加的血清半衰期。(见Klein et al.(2003)HumReprod 18：50-6；Bouloux et al.(2001)Hum Reprod 16：1592-7；Duijkers et al.(2002)Hum Reprod 17：1987-93.)。

使用异二聚体FSH及其制剂伴有单链FSH不存在的稳定性和纯化问题。虽然重组FSH是已知的(见例如美国专利No.5,767,251)，但是直到本发明，保持α和β亚基以导致用于治疗目的的生物活性分子的方式相结合，尤其是异二聚体FSH的长效形式，一直是一个挑战。

创建由连接到感兴趣蛋白质或其片段的免疫球蛋白恒定区组成的融合蛋白已经被描述(参见，例如美国专利No.5,155,027、5,428,130、5,480,981和5,808,029)。这些分子通常同时具有与连接的感兴趣分子相关的生物活性和效应物功能，或者具有一些与免疫球蛋白恒定区相关的其它期望特性。包含免疫球蛋白的Fc部分的融合蛋白可赋予融合蛋白几种期望性质，包括提高的稳定性、增加的血清半衰期(参见Caponet al.(1989)Nature 337：525)以及与Fc受体如新生Fc受体(FcRn)的结合性(美国专利No.6,086,875、6,030,613和6,485,726)。

FcRn在成年上皮组织中有活性，并且在肠腔、肺气道、鼻表面、阴道表面、结肠和直肠表面表达(美国专利No.6,485,726)。由FcRn结合伴侣(例如IgG、Fc片段)组成的融合蛋白可通过FcRn有效地穿梭上皮屏障，因而提供了全身给予期望的治疗分子的非侵入性方式。另外，包含FcRn结合伴侣的融合蛋白被表达FcRn的细胞内吞和保护。这些融合蛋白不是被标记为降解，而是再次循环进入循环系统，因而增加了这些蛋白的体内半衰期。

如在U.S.2003/0235536 A1中描述的，FSH已经与Fc偶联。然而，其中描述了用于递送入非人灵长动物的中央气道的单链FSH-Fc融合蛋白。在β和α亚基端对端相连的单链中，单链FSH-Fc融合蛋白包含FSHβα-Fc，且融合蛋白的两条多肽链是相同的(见图1c)。如图1c所示，单链FSH-Fc形成同二聚体。

                             发明内容

本发明涉及异二聚体FSH的融合蛋白，其中FSH的α和β亚基各自与FcRn结合伴侣或Fc片段偶联。在一个实施方案中，本发明提供具有两个多肽链的融合蛋白，一条链至少含有αFSH，通过任选的连接子直接或间接地连接到免疫球蛋白的Fc片段，第二条链含有βFSH，也通过任选的连接子直接或间接地连接到免疫球蛋白的Fc片段。通过这些融合蛋白，本发明提供增加FSH半衰期的方法，因此，本发明还提供提高对象生育力同时降低给药频率的和/或治疗对FSH治疗有反应的疾病状态的有效手段。

与在U.S.2003/0235536 A1中所述的单链FSH-Fc融合蛋白相比较，本发明的异二聚体FSH-Fc融合蛋白(图1c)具有偶联到一个Fc链的FSH的α亚基、和偶联到另一个Fc链的FSH的β亚基，其中α和β亚基头对头和尾对尾排列，并且Fc链相似地头对头和尾对尾排列。例如正如内源性FSH所具有的，该两条链通过FSH的α和β亚基之间的相互作用互相结合。作为替代，或者除此之外，两个Fc链之间的结合，如例如通过二硫键，使FSH的α和β亚基互相接近，因而与单链FSH融合蛋白相比，增强了其生物活性。

在一个方面，本发明是包括两个结合多肽链的异二聚体融合蛋白，第一链包括偶联到新生Fc受体(FcRn)结合伴侣的促卵泡激素的α亚基(αFSH)，第二链包括偶联到FcRn结合伴侣的FSH的β亚基(βFSH)，其中αFSH的头部与βFSH的头部成匹配，各个FcRn结合伴侣的尾部匹配。

在一个方面，本发明是包括下式两个多肽链的融合蛋白：

              αFSH-L-Fc：βFSH-L-Fc

其中αFSH为FSH的α亚基，βFSH为FSH的β亚基，L为连接子或直接键合，Fc为免疫球蛋白的Fc片段，其中αFSH和βFSH的羧基端通过L直接或间接地连接到各自Fc的氨基端，并且其中冒号(：)表示融合蛋白的两个多肽链之间的结合，而且其中αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各个Fc片段的尾部匹配。

在一个方面，本发明是包括下式两个多肽链的融合蛋白：

             Fc-L-αFSH：Fc-L-βFSH

其中，αFSH为FSH的α亚基，βFSH为FSH的β亚基，L为连接子或直接键合，Fc为免疫球蛋白的Fc片段，其中αFSH和βFSH的氨基端通过L直接或间接地连接到各自Fc的羧基端，其中冒号(：)表示融合蛋白的两个多肽链之间的结合，而且其中αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各个Fc片段的尾部匹配。

在一个实施方案中，本发明的融合蛋白可包含至少一个标签(tag)结构。所述标签结构可以用于，例如帮助重组产生的多肽或蛋白的纯化或鉴定。例如，在一个实施方案中，异二聚体融合蛋白的一个多肽进一步包含组氨酸标签。

在一个方面，本发明是包含本发明的融合蛋白和药学接受的赋形剂的药物组合物。

在另一个方面，本发明是提高对象生育力的方法。根据本发明该方面的方法包括给予对象能有效增强对象生育力的量的本发明融合蛋白的步骤。

在一个方面，本发明是治疗具有对FSH治疗有反应的疾病状态的对象的方法。根据本发明该方面的方法包括施予对象有效量的本发明融合蛋白的步骤。

在一个方面，本发明为增加异二聚体FSH的半衰期的方法。根据本发明该方面的方法包括直接或间接地通过连接子将FSH的α亚基和β亚基分别偶联到FcRn结合伴侣的步骤，其中αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各个Fc片段的尾部匹配。

                             附图说明

图1为一组示意图，其描述：(a)用于创建单链FSH-Fc蛋白的DNA构建体，(b)用于创建异二聚体FSH-Fc蛋白的DNA构建体，和(c)单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc蛋白。

图2为单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc在还原和非还原条件下跑的SDS-PAGE凝胶图像。泳道1，还原的单链FSH-Fc；泳道2，还原的异二聚体FSH-Fc；泳道3，非还原的单链FSH-Fc；和泳道4，非还原的异二聚体FSH-Fc。

图3为描述用单次皮下给予1nmol/kg重组FSH、单链FSH-Fc或异二聚体FSH-Fc处理的21日龄雌性大鼠的卵巢重量的柱状图。给药后72小时测定卵巢重量。数据表示平均卵巢重量±标准偏差(SD)。n＝10/组。

图4为描述在单次口服0.3mg/kg剂量后新生大鼠血清中单链FSH-Fc(圆圈)和异二聚体FSH-Fc的水平(三角形)的图。n＝4/时间点。

图5为显示过量IgG对新生大鼠口服摄取单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc影响的SDS-PAGE凝胶图。泳道1，输入50,000cpm的单链FSH-Fc；泳道2，¹²⁵I-单链FSH-Fc；泳道3，在存在过量IgG下¹²⁵I-单链FSH-Fc；泳道4，输入50,000cpm的异二聚体FSH-Fc；泳道5，¹²⁵I-异二聚体FSH-Fc；泳道6，在存在过量IgG下¹²⁵I-异二聚体。

图6为一对描述每日单次口服(1nmol/kg)(a)重组FSH或单链FSH-Fc、和(b)单链FSH-Fc或异二聚体FSH-Fc处理14天后的二日龄雄性大鼠中睾丸重量的柱状图。数据表示平均睾丸重量±SD。n＝6-10/组。

图7为一对描述单次肺部给药45μg/kg之后食蟹猴(cynomolgus monkey)血清中(a)单链FSH-Fc和(b)异二聚体FSH-Fc的浓度-时间特征的图。每条曲线表示一只猴。

图8为一对描述单次肺部给药45μg/kg的(a)单链FSH-Fc和(b)异二聚体FSH-Fc之后食蟹猴血清中抑制素B浓度-时间特征的图。每条曲线表示一只猴。

                           具体实施方式

定义

亲和标签，如本文使用，指连接到另一个感兴趣分子上的分子，其能与特异性结合伴侣相互作用，用于分离或鉴定所述的另一个感兴趣分子。

如本文使用，蛋白质或肽或基本与本发明的融合蛋白相同的，类似物，指蛋白质或肽的相关氨基酸序列与给定序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。作为实例，这样的序列可以是来源于不同物种的变体，或它们可以是通过截短、缺失、氨基酸替换或加入而来源于给定序列。两种氨基酸序列之间的百分一致性通过标准比对算法确定，例如，在Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.，215：403-410中描述的Basic Local Aignment Tool(BLAST)；Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.，48：444-453的算法；Meyers et al.(1988)Comput.Appl.Biosci.，4：11-17的算法；或Tatusova et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.，174：247-250的算法等。这样的算法被整合入BLASTN、BLASTP和″BLAST 2 Sequences″程序中。当利用这样的程序时，可使用默认参数。例如，对于核苷酸序列而言，下述设置可用于″BLAST 2 Sequences″：程序BLASTN，匹配得分2，错配罚分-2，开放间隙和延伸间隙分别罚5分和2分，gap x_dropoff 50，期望10，字长11，滤器ON。对于氨基酸序列而言，可使用下述设置用于″BLAST 2 Sequences″：程序BLASTP，matrixBLOSUM62，开放间隙和延伸间隙分别罚11分和1分，gap x_dropoff 50，期望10，字长3，滤器ON。

生物利用度，如本文使用，指物质吸收入生物系统或在生理活性位点可利用的程度和/或速率。

DNA构建体，如本文使用，指单链或双链的DNA分子或这种分子的克隆，其经过人为介入而修饰为包含以一定方式组合的DNA片段，所述组合方式就整体而言不是天然存在的。DNA构建体包含对指导表达感兴趣多肽而必需的信息。DNA构建体可包含启动子、增强子和转录终止子。典型地，包含指导多肽分泌所必需信息的DNA构建体也包含至少一种分泌信号序列。

片段，如本文对肽、多肽或蛋白质所用，指包含至少2个连续氨基酸残基、至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、或至少200个连续氨基酸残基的肽或多肽或蛋白质的任意缺失或截短。

FSH，和除非另外指明而等同的，异二聚体FSH，指由α亚基(αFSH；FSHα)和β亚基(βFSH；FSHβ)组成的异二聚体促卵泡激素糖蛋白。FSH和异二聚体FSH指FSH天然存在形式及其重组类似物。在人中，α和β亚基由不同染色体上的不同基因编码。FSH和异二聚体FSH与单链FSH和单链FSH融合蛋白不同，并且与本发明的异二聚体FSH融合蛋白不同。

融合蛋白，如本文所用，指由来源于第一源的第一氨基酸序列共价或非共价地键合到来源于第二源的第二氨基酸序列而组成的任意蛋白质，其中第一和第二源不相同。不相同的第一源和第二源可包括两种不同的生物实体，或来自相同生物实体的两种不同蛋白质、或生物实体和非生物实体。融合蛋白可包括例如，来源于至少两种不同的生物源的蛋白质。生物源可包括任意非合成产生的核酸或氨基酸序列(例如，任意上述的基因组或cDNA序列、RNA序列、质粒或病毒载体、天然病毒体或突变体或类似物，本文将进一步描述)。合成源可包括由化学而不是由生物系统(例如氨基酸序列的固相合成)产生的蛋白质或核酸序列。融合蛋白也可包括来源于至少2个不同的合成源的蛋白质或来源于至少一个生物源和至少一个合成源的蛋白质。

连接，如本文对核酸序列所用，指第一核酸序列共价结合至第二核酸序列。第一核酸序列可直接结合或并列连接到第二核酸序列，或作为替代，插入序列或连接子部分可将第一序列共价结合至第二序列。连接，如本文对氨基酸序列所用，指第一氨基酸序列共价结合至第二氨基酸序列。第一氨基酸序列可直接结合或并列连接至第二氨基酸序列，或作为替代，插入序列或连接子部分可将第一氨基酸序列共价结合至第二氨基酸序列。连接也可指第一氨基酸序列非共价连接到第二氨基酸序列上。

中严谨性，如本文对核酸杂交所用，包括那些本领域技术人员基于例如DNA长度而易于确定的条件。基本条件由Sambrook et al.Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)设定，并包括使用硝酸纤维素滤膜的预洗涤溶液5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)，42℃下50％甲酰胺、6X SSC的杂交条件(或其它类似的杂交溶液，例如Stark′s溶液，在42℃下50％甲酰胺中)，和60℃、0.5X SSC、0.1％SDS的洗涤条件。

高严谨性，如本文对核酸杂交所用，包括那些本领域技术人员基于例如DNA长度而易于确定的条件。通常，这样的条件定义为如上的杂交条件，并在约68℃、0.2XSSC、0.1％SDS条件下洗涤。本领域技术人员将知道，必要时可根据因素例如探针长度调节温度和洗涤溶液盐浓度。

多肽，如本文所用，指氨基酸聚合物，而不涉及产物的具体长度；因而，肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义内。该术语不排除多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化、聚乙二醇化、添加脂质部分或添加任意有机或无机分子。包括在该定义内的是，例如，包含一个或多个氨基酸类似物(包括，例如，非天然氨基酸)的多肽和具有取代连接的多肽，以及本领域已知的、天然存在或非天然存在的其它修饰。

血清(或血浆)半衰期，缩写为“t_1/2”，如本文所用，指消除半衰期，即药剂的血清(血浆)浓度降低一半所花的时间。如本文使用的相关术语“增加的血清半衰期”，用于异二聚体FSH-Fc融合蛋白时，表示其以比单独的天然FSH(无论是内源性、重组或其合成形式)更慢的速率清除。

治疗，如本文所用，指下述的任一种：通过治疗降低任意对治疗有反应的障碍或疾病状态的严重性；预防一种或多种与这些障碍或疾病状态相关的症状；缩短这种异常的疾病过程的持续时间；给患有这些异常的对象提供有益效果，而不必治愈异常或障碍。如本文对FSH所用，治疗指下述的任一种：通过FSH治疗降低任意对治疗有反应的生殖障碍或疾病状态的严重性；预防与这些障碍或疾病状态相关的一种或多种症状；减少FSH异常的疾病过程的持续时间；给患有这些异常的对象提供有益效果(例如，增强生育力)，而不必治愈FSH异常或生殖障碍。

A.不育症的改善治疗

本发明一般地涉及与生殖系统相关的生殖障碍或疾病状态的改善治疗，尤其是，FSH异常的改善治疗。因而，本发明涉及异二聚体FSH的融合蛋白，其中FSH的α和β亚基各自分别地偶联到Fc片段或FcRn结合伴侣。与已知的在生殖和/或FSH疗法中使用的治疗剂相比，本发明的融合蛋白具有增加的稳定性和提高的半衰期。本发明的融合蛋白可以胃肠道外或非侵入式给药。虽然目前的FSH治疗剂通常通过皮下或肌肉内注射给药，本发明的融合蛋白可由更少侵入性方式给药，例如口服给药、鼻腔给药或肺部给药。目前的治疗需要每日注射，然而本发明可提供更低频率的胃肠道外、口服或肺部给药。

B.融合蛋白

本发明涉及异二聚体FSH的融合蛋白，其中FSH的α和β亚基分别偶联到FcRn结合伴侣或Fc片段。更具体地，在一个实施方案中，本发明提供具有两个多肽链的融合蛋白，一个链具有至少αFSH，通过任选的连接子直接或间接地连接到FcRn结合伴侣上，另一个链具有βFSH，也通过任选的连接子直接或间接地连接到FcRn结合伴侣上。在目标融合蛋白中，αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各自FcRn结合伴侣的尾部匹配。在本发明的一个实施方案中，在FSH亚基和各个FcRn结合伴侣之间存在连接子。

在本发明的另一个实施方案中，融合蛋白包含下式的两个多肽链：

                αFSH-L-Fc：βFSH-L-Fc

其中αFSH为FSH的α亚基，βFSH为FSH的β亚基，L为连接子或直接键合，Fc为免疫球蛋白的Fc片段，并且冒号(：)表示融合蛋白的两个多肽链之间的结合。在这个实施方案中，αFSH和βFSH的羧基端直接或间接地通过L连接到各自Fc的氨基端，而且其中αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各个Fc片段的尾部匹配。

在替代性实施方案中，融合蛋白包含下式的两个多肽链：

           Fc-L-αFSH：Fc-L-βFSH

其中，融合蛋白的所有方面如对前述实施方案所描述，不同在于αFSH和βFSH的氨基末端直接或间接地通过L连接到各自Fc的羧基端。

两个多肽链之间的结合可以是FSH的α和β亚基之间结合的结果和/或Fc片段或FcRn结合伴侣之间结合的结果。例如，在FSH的α和β亚基结合的情况下，相互作用可以是非共价相互作用，例如离子相互作用、疏水相互作用或亲水相互作用、范德华相互作用和/或氢键，例如亮氨酸拉链。非共价结合或相互作用可包括双亲性肽例如但不限于α螺旋的交错结合，载有相反电荷的氨基酸例如但不限于赖氨酸和天冬氨酸、精氨酸和谷氨酸的电荷-电荷相互作用。在一个实施方案中，非共价结合或相互作用包括亮氨酸拉链，其包含具有几个重复氨基酸的肽，其中每第7个氨基酸为亮氨酸残基(参见，例如Branden et al.(1991)Introduction To Protein Structure，Garland Publishing，New York)。在Fc片段之间相互作用的情况下，通常，它们是共价键，并且通常为一个或两个二硫键，如在免疫球蛋白的许多Fc片段中发现的。因此，在本发明的某些实施方案中，目标融合蛋白的Fc片段之间存在至少一个二硫桥。

在本发明的某些实施方案中，偶联到目标融合蛋白或其一个多肽链的可以是第二个连接子或作为替代的标签，其可用于辅助融合蛋白的纯化，例如FLAG标签、组氨酸标签(参见实施例1)、GST标签、麦芽糖结合蛋白标签或其它本领域已知的。

1.融合蛋白变异体

本发明融合蛋白的衍生物和类似物、抗本发明融合蛋白的抗体、和抗本发明融合蛋白的结合伴侣的抗体都包括在内，并可以通过替换、添加和/或缺失/截短或通过导入产生功能等同分子的化学修饰而改变它们的氨基酸序列来制备。本领域技术人员应当理解，任意蛋白质的序列中的某些氨基酸可替换为其它氨基酸，而没有不利地影响蛋白质的活性。

本发明融合蛋白的氨基酸序列或其编码DNA序列可进行多种改变，而没有它们的生物活性、功能或用途的明显损失。这种改变产生的衍生物、类似物或突变体以及这些衍生物的用途也都包括在本发明的范围内。在一个具体实施方案中，所述衍生物为功能上活性的，即能表现出与本发明融合蛋白相关的一种或多种活性，例如增强的生育力、增加的卵生成、增加的精子发生。

序列内氨基酸的替换物可以选自氨基酸所属类型的其它成员(参见表1)。而且，各种氨基酸通常替换为中性氨基酸，例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸(参见，例如MacLennan et al.(1998)Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67；Sasaki et al.(1998)Adv.Biophys.35：1-24)。

表1.氨基酸及其替换

原始残基	示例性替换	典型替换
			Ala(A)	Val，Leu，Ile	Val
Arg(R)	Lys，Gln，Asn	Lys
			Asn(N)	Gln	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser，Ala	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Gly(G)	Pro，Ala	Ala
His(H)	Asn，Gln，Lys，Arg	Arg
			IIe(I)	Leu，Val，Met，Ala，Phe，正亮氨酸	Leu
Leu(L)	正亮氨酸，IIe，Val，Met，Ala，Phe	IIe
			Lys(K)	Arg，1，4-二氨基-丁酸，Gln，Asn	Arg
Met(M)	Leu，Phe，IIe	Leu
			Phe(F)	Leu，Val，IIe，Ala，Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Gly
			Ser(S)	Thr，Ala，Cys	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr，Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp，Phe，Thr，Ser	Phe
			Val(V)	IIe，Met，Leu，Phe，Ala，正亮氨酸	Leu

2.异二聚体促卵泡激素

本发明的融合蛋白包括异二聚体FSH(还可称为“FSH异二聚体”)。美国专利No.5,767,251中描述了重组异二聚体FSH。在本发明的一个实施方案中，FSH是人FSH(hFSH)。含有FSH的β和/或α亚基的示例性库描述于确证性实施例中，并且人FSH的α和β亚基的核苷酸序列可从GenBank中公开获得，登录号分别为NM_000735和NM_000510。

3.免疫球蛋白

免疫球蛋白由共价结合的四个蛋白质链-两个重链和两个轻链组成。每个链进一步由一个可变区和一个恒定区组成。根据免疫球蛋白亚型(即，IgG、IgM、IgA、IgD、IgE)，重链恒定区由3或4个恒定区结构域(例如CH1、CH2、CH3、CH4)组成。某些亚型也可包括绞链区(例如IgG)。

在某些实施方案中，本发明的融合蛋白为分别偶联到新生儿Fc受体(FcRn)结合伴侣的FSH的α和β亚基。FcRn结合伴侣为可特异性地结合FcRn受体的任意分子，并随后通过FcRn受体主动运输FcRn结合伴侣。FcRn受体已经从包括人的几种哺乳动物中分离。人FcRn、大鼠FcRn、猴FcRn和小鼠FcRn的序列是已知的(Storyet al.(1994)J.Exp.Med.180：2377)。在相对低pH下，FcRn受体结合IgG(但不结合其它免疫球蛋白种类，例如IgA、IgM、IgD和IgE)，将IgG从内腔向浆膜方向跨细胞主动转运，然后在组织液中发现的相对较高pH下释放IgG。其表达于成年上皮组织中(美国专利Nos.6,030,613和6,086,875)，包括肺和肠上皮(Israel et al.(1997)Immunology 92：69)、肾脏近端的管状上皮(Kobayashi et al.(2002)Am.J.Physio.RenalPhysio.282：F358)、以及鼻上皮、阴道表面和胆道系统表面。

FcRn结合伴侣包含FcRn的配体，其模拟结合FcRn的IgG的Fc结构域部分(即，Fc、Fc结构域、Fc片段、Fc片段同源物和Fc模拟物)。因而，本发明的FcRn结合伴侣包括可特异性结合FcRn受体的任意分子，包括完整的IgG、IgG的Fc片段和包括FcRn受体的完全结合区的其它片段。在某些实施方案中，FcRn结合伴侣为非特异的IgG或IgG的FcRn结合片段。最典型的，FcRn结合伴侣对应IgG的Fc片段，即Fcγ。所述Fcγ可以是天然的或其可以被修饰以便于其具有比天然Fcγ更高的亲和力。这样的修饰可以包括某些参与FcRn接触的某些氨基酸残基的替换。结合至FcRn受体的IgG的Fc部分的区域已基于X-射线结晶学被描述(Burmeister et al.(1994)Nature 372：379)。Fc和FcRn的主要接触区靠近CH2和CH3结构域的连接处。Fc-FcRn接触都在单个Ig重链中。主要的接触位点包括CH2结果域的氨基酸残基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314，和CH3结构域的氨基酸残基385-387、428和433-436。免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或区域的氨基酸编号参考全部基于Kabat et al.1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Public Health，Bethesda，MD。可修饰Fcγ以便于它能具有比天然Fcγ更长的循环半衰期。这样的修饰可包括参与和FcRn以外的Fc受体相互作用的某些氨基酸残基的替换、参与糖基化的某些氨基酸残基的替换等。具体的示范性修饰在下文描述。

在本发明的另一些实施方案中，FcRn结合伴侣为Fc片段，指免疫球蛋白重链恒定区、其部分或其变异体。其可以是、或者来源于免疫球蛋白重链恒定区，包括，但不限于人免疫球蛋白重链恒定区、非人灵长类免疫球蛋白重链恒定区、牛免疫球蛋白重链恒定区、猪免疫球蛋白重链恒定区、鼠免疫球蛋白重链恒定区、羊免疫球蛋白重链恒定区或大鼠免疫球蛋白重链恒定区。

本发明的Fc片段或FcRn结合伴侣可包括整个重链恒定区或其片段或其类似物。重链恒定区可包含CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域和/或绞链区。在一个实施方案中，重链恒定区可包含绞链区、CH2结构域和CH3结构域。

免疫球蛋白可以重组或合成制备。免疫球蛋白可以从cDNA文库中分离。免疫球蛋白可以从噬菌体文库中分离(参见McCafferty et al.(1990)Nature 348：552)。免疫球蛋白可以由已知序列的基因洗牌(gene shuffling)而得到(Mark et al.(1992)Bio/Technol.10：779)。免疫球蛋白可以通过体内重组分离得到(Waterhouse et al.(1993)Nucl.Acid Res.21：2265)。免疫球蛋白可以是人源化免疫球蛋白(Jones et al.(1986)Nature 332：323)。

Fc片段可以由免疫球蛋白的CH2和CH3结构域和任选地免疫球蛋白的绞链区组成。Fc片段可以来自IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。在一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG、IgA或IgD。在一个实施方案中，所述Fc片段为IgG的Fc片段。所述Fc片段可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白为人IgG1。在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白为IgG2。在另一个实施方案中，所述Fc片段由SEQ ID NO：4的氨基酸编号145至氨基酸编号371的氨基酸序列，或其类似物组成。在一个实施方案中，所述Fc片段由包含SEQ ID NO.3的核苷酸446-1126的核酸序列编码。

FcRn结合伴侣或Fc片段可包含Fc变体。Fc变体指从天然Fc修饰的分子或序列，但仍旧包含补救受体(salvage receptor)、FcRn(WO 97/34631)的结合位点。天然的指还没有被人为修饰的Fc。WO 96/32478描述了示范性Fc变体，以及与补救受体的相互作用。因而，在一个实施方案中，术语″Fc变体″包含人源化非人天然Fc的分子或序列。而且，天然Fc包含可被去除的位点，因为它们提供了对于本发明的融合分子而言不需要的结构特征或生物活性。因而，Fc变体包含缺乏一个或多个天然Fc位点或某些残基的分子或序列，所述残基参与：(1)二硫键形成，(2)与选定的宿主细胞不相容，(3)在选定的宿主细胞中表达时的N-末端异质性，(4)糖基化，(5)与补体的相互作用，(6)结合Fc受体而不是补救受体，或(7)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

可根据本领域公知的方法例如定点突变等对IgG的Fc区域进行修饰，以得到将与FcRn结合的修饰IgG或其Fc片段或其部分。这样的修饰包括FcRn接触位点远处的修饰和接触位点内的修饰，其保留或甚至增强了与FcRn的结合。例如，在人IgG1Fc(Fcγ1)中的下述单个氨基酸残基可被替换而不明显丧失Fc对FcRn的结合亲合力：P238A，S239A，K246A，K248A，D249A，M252A，T256A，E258A，T260A，D265A，S267A，H268A，E269A，D270A，E272A，L274A，N276A，Y278A，D280A，V282A，E283A，H285A，N286A，T289A，K290A，R292A，E293A，E294A，Q295A，Y296F，N297A，S298A，Y300F，R301A，V303A，V305A，T307A，L309A，Q311A，D312A，N315A，K317A，E318A，K320A，K322A，S324A，K326A，A327Q，P329A，A330Q，A330S，P331A，P331S，E333A，K334A，T335A，S337A，K338A，K340A，Q342A，R344A，E345A，Q347A，R355A，E356A，M358A，T359A，K360A，N361A，Q362A，Y373A，S375A  D376A，A378Q，E380A，E382A，S383A，N384A，Q386A，E388A，N389A，N390A，Y391F，K392A，L398A，S400A，D401A，D413A，K414A，R416A，Q418A，Q419A，N421A，V422A，S424A，E430A，N434A，T437A，Q438A，K439A，S440A，S444A和K447A，其中例如P238A表示在第238位由丙氨酸替换野生型脯氨酸。除了丙氨酸外，其它的氨基酸可以在上述指出的位点替换野生型氨基酸。突变可以仅单个导入到Fc中，产生超过一百个不同于天然Fc的FcRn结合伴侣。此外，两个、三个或更多这些独立突变的组合可被一起导入，产生成百的更多FcRn结合伴侣。

某些上述的突变可以赋予FcRn结合伴侣新功能。例如，一个实施方案并入N297A、除去了高度保守的N-糖基化位点。该突变的作用为减少对免疫效应细胞的结合，并潜在地降低免疫原性，从而增强FcRn结合伴侣的循环半衰期，并致使FcRn结合伴侣不能结合FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIIA，而不影响对FcRn的亲和力(Routledge et al.(1995)Transplantation 60：847；Friend et al.(1999)Transplantation 68：1632；Shields et al.(1995)J.Biol.Chem.276：6591)。另外，至少三个人Fcγ受体表现出可识别较低绞链区内IgG上的结合位点，通常为氨基酸234-237。因此，新功能和可能降低的免疫原性的另一个实例可以来自该区域的突变，例如通过将人IgG1“ELLG”的氨基酸233-236替换为来自IgG2“PVA”的相应序列(具有一个氨基酸缺失)。已经表明FcγRI、FcγRII和FcγRIII，其介导多种效应物功能，当引入这样的突变时其将不结合IgG1(Ward and Ghetie(1995)TherapeuticImmunology 2：77 and Armour et al.(1999)Eur.J.Immunol.29：2613)。作为由上述突变引起的新功能的进一步实例，某些情况下对FcRn的亲和力可增加至超过野生型的亲和力。这一增加的亲和力可以反应“开”(on)速率的增加、“关”(off)速率的降低、或者同时“开”速率的增加和“关”速率的降低。被认为使对FcRn亲和力增加的突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields et al.(2001)J.Biol.Chem.276：6591)。

在某些实施方案中，FcRn结合伴侣或Fc片段为多肽，其包括序列PKNSSMISNTP(SEQ ID NO：11)和任选地包括选自HQSLGTQ(SEQ ID NO：12)、HQNLSDGK(SEQ ID NO：13)、HQNISDGK(SEQ ID NO：14)或VISSHLGQ(SEQ ID NO：15；美国专利No.5,739,277)的序列。

两个FcRn受体可结合单个Fc分子。晶体学数据表明每个FcRn分子结合Fc同二聚体的单个多肽。因而，将FcRn结合伴侣例如IgG的Fc片段连接至异二聚体FSH提供一种经口、鼻、眼部途径或经肺部途径递送FSH的手段。对于经鼻或经肺部途径递送而言，在一个实施方案中，融合蛋白作为气雾剂给药。

本领域技术人员理解，用于本发明融合蛋白的免疫球蛋白恒定区的部分可包括其突变体或类似物，或者可包括化学修饰的免疫球蛋白恒定区或其片段(例如聚乙二醇化)(参见，例如Aslam and Dent(1998)Bioconjugation：Protein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences，Macmillan Reference，London)，在一种情况下，突变体可以提供FcRn结合伴侣对FcRn的增强的结合。也包括在用于本发明融合蛋白的是免疫球蛋白恒定区的至少一部分的肽模拟物，例如Fc片段的肽模拟物或FcRn结合伴侣的肽模拟物，在一个实施方案中，使用噬菌体展示鉴定肽模拟物(参见，例如McCafferty et al.(1990)Nature 348：552；Kang et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4363；EP 0 589 877 B1)。

4.任选的连接子

本发明的融合蛋白可任选地包括至少一个连接子分子。在一个实施方案中，所述连接子由通过肽键连接在一起的氨基酸组成，其中所述氨基酸选自二十种天然存在的氨基酸。在多种实施方案中，所述连接子可包含1-5个氨基酸、1-10个氨基酸、1-20个氨基酸、10-50个氨基酸、50-100个氨基酸或100-200个氨基酸。在一个实施方案中，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和赖氨酸。在一个实施方案中，连接子大部分由空间无阻的氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸组成。

在一个实施方案中，所述连接子可包含序列Gn(等同地，-(Gly)n-)。在一个实施方案中，所述连接子可包含序列(GGS)n或(GGGGS)n。在每种情况下，n可以是整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。连接子的实例包括，但不限于GGG、SGGSGGS(SEQ ID NO：16)、GGSGGSGGSGGSGGG(SEQ ID NO：17)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(SEQ ID NO：18)和GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO：10；GS15)。

在一个实施方案中，所述连接子为8-氨基酸连接子EFAGAAAV(SEQ ID NO：9)。

非肽连接子也是可以的。例如，也可以使用烷基连接子，例如-NH-(CH2)m-C(O)-，其中m＝2-20。这些烷基连接子也可被任意非空间位阻基团进一步取代，所述基团例如低级烷基(例如C1-C6)、低级酰基、卤素(例如Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。示范性非肽连接子为PEG连接子。根据本发明有用的另外的连接子描述于美国专利6,660,843。

C.核酸构建体

本发明也涉及编码本发明的异二聚体FSH-Fc融合蛋白的核酸构建体。每个核酸序列包含编码FSH一个亚基，例如FSH的α亚基，的第一核酸序列，其可操作性连接至编码至少Fc片段或FcRn结合伴侣的第二核酸序列上。在一个实施方案中，编码FSH的α亚基的第一核酸序列可操作性连接至编码至少Fc片段或FcRn结合伴侣的第二核酸序列上，并且，编码FSH的β亚基的第三核酸序列可操作性连接至编码至少Fc片段或FcRn结合伴侣的第四核酸序列上(第二和第四核酸序列通常是相同的)。因此，本发明的核酸涉及编码目标融合蛋白的全部两个多肽链的核酸构建体。本发明的核酸可存在于单一的核酸构建体中或分开的构建体中。核酸序列也可包含本领域已知的另外的序列或元件(例如启动子、增强子、聚A序列、信号序列)。核酸序列可任选地包含编码连接子的序列，其位于编码FSH的α或β亚基的核酸序列和编码Fc片段或FcRn结合伴侣的核酸序列之间。

在一个实施方案中，每个核酸构建体由DNA组成。在另一个实施方案中，每个核酸构建体由RNA组成。所述核酸构建体可以是载体如病毒载体或质粒。病毒载体的实例包括，但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体和鼠白血病病毒载体。质粒的实例包括，但不限于例如pUC、pGEX、pcDNA3、pcDNA4、pcDNA6和pED.dC。在某些实施方案中，质粒为表达质粒。

在一个实施方案中，核酸构建体包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的核酸序列。

由于已知的遗传密码简并性，其中多于一个密码子可编码相同的氨基酸，DNA序列可以不同于SEQ ID NO：1和3中显示的序列，而仍编码具有SEQ ID NO：2和4的氨基酸序列的多肽。这样的变体DNA序列可由沉默突变引起(例如在PCR扩增中发生)，或者可以是天然序列人为突变的产物。因而，本发明提供编码本发明多肽的分离DNA序列，选自：(a)包含SEQ ID NO：1和3的核苷酸序列的DNA；(b)编码SEQ ID NO：2和4的多肽的DNA；(c)在中等严谨性条件下能够与(a)或(b)DNA杂交且编码本发明多肽的DNA；(d)在高严谨性件下能够与(a)或(b)DNA杂交且编码本发明多肽的DNA和(e)作为(a)、(b)、(c)或(d)中定义的DNA的遗传密码的结果的简并体且编码本发明多肽的DNA。当然，由这样的DNA序列编码的多肽也包括在本发明中。

在另一个实施方案中，本发明的核酸分子也包含与天然序列至少80％一致性的核苷酸序列。也包含其中核酸分子包含与天然序列至少90％一致性、至少95％一致性、至少98％一致性、至少99％一致性或至少99.9％一致性的序列的实施方案。在本文中，天然序列可以指可以在天然中发现的Fc、αFSH或βFSH的序列。百分一致性可通过观察和数学计算确定。作为替代，两个核酸序列的百分一致性可通过使用GAP计算机程序，版本6.0来比较序列信息而确定，所述程序公开于Devereux et al.(1984)Nucl.Acids Res.12：387，可以从University of Wisconsin Genetics ComputerGroup获得。GAP程序的优选的缺省参数包括：(1)用于核苷酸的一元比较矩阵(包含数值1表示一致性，和数值0表示不同)，和加权比较矩阵，见Gribskov and Burgess(1986)Nucl.Acids Res.14：6745，描述于Schwartz and Dayhoff，eds.1979，Atlas ofProtein Sequence and Structure，National Biomedical Research Foundation，pp.353-358；(2)每个间隙罚3.0分，每个间隙中的每个字符另外罚0.10分；和(3)末端间隙不罚分。也可以使用序列比较领域的技术人员使用的其它程序。

D.融合蛋白的合成

本发明的融合蛋白可以使用本领域已知的技术合成。例如，本发明的融合蛋白可以在细胞中重组合成(参见，例如Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，and Ausubel et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.)。

编码免疫球蛋白或其片段、或FSH或其片段的DNA序列可以从本领域已知的多种基因组、cDNA或RNA文库克隆。使用基于探针的方法来分离这样的DNA序列的技术属于常规技术，是本领域技术人员众所周知的。分离这种DNA序列的探针可以基于公开的DNA序列(参见，例如，Hieter et al.(1980)Cell 22：197-207)。可以使用由Mullis et al.(美国专利No.4,683,195)和Mullis(美国专利No.4,683,202)公开的聚合酶链式反应(PCR)方法。分离这种DNA序列的文库的选择和探针的选择都在本领域技术人员的水平内。作为替代，编码免疫球蛋白或其片段或FSH的DNA序列可以从本领域已知的包含免疫球蛋白或其片段或FSH的载体获得。

对于重组体生产而言，编码融合蛋白的多核苷酸序列插入到适当的表达媒介中，即，包含用于转录和翻译插入编码序列的必要元件的载体，或者在RNA病毒载体的情况下，包含用于复制和翻译的必要元件的载体。编码融合蛋白的核酸按正确读码框插入到载体中。

然后，表达载体被转染或以别的方式导入适当的靶细胞中，该靶细胞将表达该蛋白质，例如，融合蛋白。本领域已知的转染技术包括，但不限于脂质体转染、磷酸钙沉淀(Wigler et al.(1978)Cell 14：725)和电穿孔(Neumann et al.(1982)EMBO J.1：841)。可使用多种宿主表达载体系统在真核细胞中表达本文描述的融合蛋白。在一个实施方案中，真核细胞为动物细胞，包括哺乳动物细胞(例如CHO、BHK、COS、HeLa细胞)。当融合蛋白在真核细胞中表达时，编码所述融合蛋白的DNA也可以编码信号序列以允许分泌融合蛋白。本领域技术人员应当理解当翻译蛋白质时，信号序列被细胞切割，形成成熟的融合蛋白。多种信号序列是本领域已知的，例如小鼠Igk轻链信号序列。作为替代，当不含有信号序列时，融合蛋白可以通过裂解细胞而回收。

本发明的融合蛋白可以在转基因动物中合成，所述转基因动物例如啮齿动物、山羊、绵羊、猪或牛。术语“转基因动物”指已经将外来基因掺入其基因组的非人动物。因为这个基因存在于生殖组织中，其由亲体传给后代。外源基因被导入到单细胞的胚胎中(Brinster et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4438)。制备转基因动物的方法是本领域已知的，包括制备免疫球蛋白分子的转基因技术(Wagner et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6376；McKnight et al.(1983)Cell 34：335；Brinster et al.(1983)Nature 306：332；Ritchie et al.(1984)Nature 312：517；Baldassarre et al.(2003)Theriogenology 59：831；Robl et al.(2003)Theriogenology59：107；Malassagne et al.(2003)Xenotransplantation 10(3)：267)。

表达载体可以编码允许方便地纯化和鉴定重组蛋白的标签。实例包括，但不限于，载体pUR278(Ruther et al.(1983)EMBO J.2：1791)，其中编码本文所述融合蛋白的序列可以按正确读码框连接入具有lac z编码区的载体中，以产生杂合体蛋白质；pGEX载体可以用于表达具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的蛋白质。这些蛋白质通常是可溶性的，易于从细胞中通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠然后在存在游离谷胱甘肽下洗脱而纯化。所述载体包含切割位点(例如PreCission Protease^TM(Pharmacia，Peapack，N.J.)，其用于在纯化后方便除去标签。另外的标签包括FLAG、组氨酸标签(参见下述的实施例1)、麦芽糖结合蛋白标签和其它本领域已知的。

为了增加生产效率，可以设计多核苷酸编码本发明融合蛋白的多个单元，之间由酶切位点分开。所得多肽可以被切割(例如，用适当的酶处理)以回收多肽单元。这可以增加单个启动子驱动的多肽的产率。当使用适当的病毒表达系统时，由转录本内部的，例如，由内部核糖体进入位点(IRES)指导由mRNA编码的每个多肽的翻译。因而，多顺反子的构建体指导单个、大多顺反子mRNA的转录，依次由多顺反子mRNA指导多个、独立多肽的翻译。该方法消除了多蛋白质的产生和酶处理步骤，可显著地增加由单个启动子驱动的多肽的产率。

用于转化和转染的载体通常包含选择标志，其用于识别转化体和转染体。在细菌系统中，这可包含抗生素抗体基因，例如氨苄青霉素、杀稻瘟菌素或卡那霉素。用于培养哺乳动物细胞的选择标志包含赋予药物抗性的基因，所述药物例如新霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素、遗传霉素、zeocin和氨甲喋呤。选择标志可以是可扩增的选择标志。一种可扩增的选择标志是二氢叶酸还原酶基因(DHFR基因)或其cDNA(Simonsen and Levinson(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2495)。选择标志综述于Thilly(1986)Mammalian Cell Technology，Butterworth Publishers，Stoneham，Mass.，选择标志的选择在本领域普通技术人员的水平内。

选择标志可以和感兴趣基因同时导入到分离质粒中，或者它们可以导入到相同的质粒上。如果在相同的质粒上，选择标志和感兴趣基因可以在不同启动子或相同启动子的控制下，后一种排列产生了双顺反子信使。这种类型的构建体是本领域已知的(例如，美国专利No.4,713,339)。

表达系统的表达元件可在其强度和特异性方面变化。根据使用的宿主/载体系统，大量合适的转录和翻译元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子，可用于表达载体。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用启动子例如杆状病毒多角体启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可以使用来源于植物细胞的基因组的启动子(例如热休克启动子；用于RUBISCO的小亚基的启动子；用于叶绿素a/b结合蛋白的启动子)或者来自植物病毒的启动子(例如CaMV的35S RNA启动子；TMV的衣壳蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或者来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子、CMV启动子)；当产生包含多拷贝表达产物的细胞系时，可与适当的选择标志一起使用基于SV40-、BPV-和EBV-载体。

在使用植物表达载体的情况下，编码本发明融合蛋白的线性或非环化形式的序列的表达可由多种启动子中的任一种驱动。例如，可使用病毒启动子例如CaMV的35SRNA和19S RNA启动子(Brisson et al.(1984)Nature 310：511-514)、或者TMV的衣壳蛋白启动子(Takamatsu et al.(1987)EMBO J.6：307-311)；作为替代，可使用植物启动子例如RUBISCO的小亚基启动子(Coruzzi et al.(1984)EMBO J.3：1671-1680；Broglie et al.(1984)Science 224：838-843)或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B启动子(Gurley et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565)。这些构建体可使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等导入植物细胞中。对于这些技术的综述，参见，例如Weissbach & Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp.421-463；and Grierson & Corey(1988)Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。

在一种可用于制备本发明融合蛋白的昆虫表达系统中，Autographa califomica核形多角体病毒(AcNPV)被用作表达外源基因的载体。该病毒在秋粘虫(Spodopterafrugiperda)细胞中生长。编码序列可以克隆入病毒的非必需区域(例如多角体基因)，并置于AcNPV启动子(例如，多角体启动子)的控制之下。编码基因的成功插入将导致多角体基因的失活和非闭塞的(non-occluded)重组病毒(即缺少由多角体基因编码的蛋白质衣壳的病毒)的产生。然后，这些重组体病毒用于感染秋粘虫细胞，在其中表达插入的基因(参见，例如Smith等(1983)J.Virol.46：584；美国专利No.4,215,051)。这种表达系统的进一步实例可见于Ausubel et al.，eds(1989)CurrentProtocols in Molecular Biology，Vol.2，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience。

可用于表达本发明的融合蛋白的另一个系统为谷氨酰胺合成酶基因表达系统，也称为“GS表达系统”(Lonza Biologies PLC，Berkshire UK)。这种表达系统详细描述于美国专利No.5,981,216。

在哺乳动物宿主细胞中，可使用多种基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，编码序列可以连接到腺病毒转录/翻译调控复合物，例如晚期启动子和三重(tripartite)前导序列。然后，通过体内或体外重组，该融合基因可以插入到腺病毒基因组。插入病毒基因组中的非必需区域(例如区域E1或E3)将形成可在受感染宿主中生活并能表达多肽肽的重组病毒(参见，例如Logan & Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3655-3659)。作为替代，可使用痘苗病毒7.5K启动子(参见，例如Mackett et al.(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7415；Mackett et al.，(1984)J.Virol.49：857；Panicali et al.，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：4927)。

包含本发明融合蛋白的DNA构建体的宿主细胞可在适当的生长培养基中生长。如本文使用的术语“适当的生长培养基”指包含细胞生长需要的营养成分的培养基。细胞生长需要的营养成分可包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子。例如，所述培养基可包含小牛血清或胎牛血清。所述生长培养基通常将选择包含DNA构建体的细胞，这是通过例如，药物选择或必需营养物缺乏，其由DNA构建体上的或与DNA构建体共转染的选择标志互补。培养的哺乳动物细胞通常在商品含血清或无血清的培养基(例如MEM、DMEM)中生长。选择适于所用特定细胞系的培养基在本领域普通技术人员的水平内。

重组制备的本发明融合蛋白可以使用本领域已经建立的方法(例如亲合色谱法、体积排阻色谱、离子交换色谱)从培养基中分离。本发明的融合蛋白可用柱色谱例如蛋白质A柱，或者通过离子交换色谱从培养基中分离。将适当生长的转化或转染宿主细胞的培养基与细胞材料分离，并证实融合蛋白的存在。检测融合蛋白的一种方法是，例如将融合蛋白或融合蛋白的部分结合到识别本发明融合蛋白的特异性抗体(例如抗-Fc抗体)上。抗融合蛋白抗体可以是抗所述融合蛋白产生的单克隆或多克隆抗体。例如，所述融合蛋白可以包含免疫球蛋白恒定区部分。识别许多免疫球蛋白恒定区部分的抗体是本领域已知的，可商业获得。抗体可被用于ELISA或者蛋白质印迹以检测本发明融合蛋白的存在。

E.使用融合蛋白的方法

如本领域技术人员可知道的，本发明的融合蛋白具有许多用途，包括但不限于治疗患有生殖障碍的对象的方法和治疗需要提高生育力的对象的方法和/或用于治疗FSH异常的FSH疗法。

1.治疗具有生殖障碍的对象的方法

本发明涉及治疗具有生殖障碍障碍或FSH异常的对象的方法。这种异常描述于，例如，Harrison′s Principles of Intemal Medicine，15^th Ed.，E.Braunwald et al.，eds，McGraw-Hill，New York，2001。因而，通过施用本文提供的融合蛋白，本发明提供治疗对FSH治疗有反应的疾病状态的方法。这样的治疗通常涉及不育症或生殖障碍。因而，通过施用足以增强对象生育力的本发明融合蛋白，本发明提供提高对象生育力的方法。在一个实施方案中，该方法被用于提高体外生殖方案的功效。例如，通过刺激患者的卵泡成熟或卵产生，本发明的目标融合蛋白可增强体外生殖的成功率。通过向对象施用有效量的本发明融合蛋白以获得期望的增长，本发明也提供增加对象卵产生的方法或增加精子发生的方法。

如本文使用的，对象可以是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、马、羊、牛、猪、狗、猫或啮齿动物。在一个实施方案中，所述对象为人。

在本发明的一个实施方案中，提供增加异二聚体FSH的半衰期的方法。通过这个实施方案，FSH可以以比当前方法允许的更少的频次向对象给药。例如，本发明的FSH融合蛋白可以在8-12天的周期中仅给药一次、两次、或三次。

有很多测试可用于确定本发明给出的异二聚体FSH-Fc构建体的活性和其在上述治疗方法中的有用性。下文给出标准测试，在确认性实施例中对一些进行了详细描述，并对于方案的某些作了修改。

标准的体外测试包括：用于确定雌激素生成的大鼠塞托利细胞生物测试(Dorrington，JH and Armstrong，DT(1975)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：2677)；用于测量芳香酶活性的大鼠塞托利细胞生物测试(Padmanabhan V，Chappel SC，Beitins，IZ(1987)Endocrinology 121：1089-1098)；用于测量芳香酶活性的大鼠粒层细胞生物测试(Jia XC and Hsueh AJW(1986)Endocrinology 119：1570-1577；Dahl KD，等(1987)J Clin Endocrinol Metab 64：486-493)；和FSH受体结合/cAMP生成测试(Tano M，Minegishi T，Nakamura K，Karino S，Ibuki Y(1995)Fertil Steril64：1120-1124)。

标准的体内测试包括：在啮齿类动物中卵巢重量增加法，称之为Steelman Pohley测试(Steelman SL and Pohley FM(1953)Endocrinology 53：604-616)和睾丸重量增加法(Meachem SJ，McLachlan RI，deKretser DM，Robertson DM，Wreford NG(1996)Biol Reprod 54：36-44)；在非人灵长类动物中，雌激素生成(Klein J等(2002)FertilSteril 77：1248-1255)和抑制素水平(Weinbauer GF等(1994)J Endocrinol141：113-121)；和在人中，血清雌激素、血清抑制素和卵泡大小/数目(Porchet HC等(1994)Fertil Steril 61：687-695)。

本发明的融合蛋白可经由静脉内、皮下、肌肉内或者经由任意粘膜表面例如经口、舌下、颊面、鼻、直肠、阴道或经由肺部途径给药。融合蛋白可以植入生物聚合物固体载体内或与其连接，该载体允许缓慢释放融合蛋白。在一个实施方案中，融合蛋白为非胃肠道给药。在一个实施方案中，融合蛋白为口服给药。在一个实施方案中，融合蛋白经由肺部途径给药。

本发明的融合蛋白的剂量将根据对象和具体使用的给药途径而改变。剂量范围可以是0.1-100,000μg/kg体重。在一个实施方案中，剂量范围为0.1-1,000μg/kg。所述蛋白质可以连续给药或者在特定的时间间隔给药。可应用体外测试法来确定最佳剂量范围和/或给药时间表。如上面详述的，确定FSH活性的体外测试法是本领域已知的。另外，有效剂量可以从动物模型例如非人灵长类动物中得到的剂量效应曲线推知。

本发明还涉及包含目标融合蛋白和药学接受的载体或赋形剂的药物组合物。适当的药物载体的实例描述于E.W.Martin Remington′s Pharmaceutical Sciences。适当的赋形剂的实例可包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、人血清白蛋白、去污剂(例如Tween-20)、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸酯甘油酯、滑石粉、氯化钠、干脱脂乳、甘油、聚乙二醇、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物也可包含pH缓冲剂和润湿剂或乳化剂。

对于口服给药而言，药物组合物可以采取通过常规技术制备的片剂或胶囊的形式。所述组合物也可以制备成液体，例如糖浆或混悬液。所述液体可以包含混悬剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)、乳化剂(卵磷脂或阿拉伯胶)、非水载体(例如杏仁油、油性酯类、乙醇、或分馏的植物油)和防腐剂(例如对-羟基苯酸甲基或丙基酯或山梨酸)。该制剂也可包含香味剂、着色剂或甜味剂。作为替代，所述组合物也可制备为干产品，其用于与水或其它适当的介质重构。

对于颊面给药而言，所述组合物可采取根据常规方法的片剂或锭剂形式。

对于吸入给药而言，根据本发明应用的化合物可以以有有或无赋形剂的喷雾状气溶胶形式或任选有抛射剂的加压包装或喷雾器中的气溶胶喷雾形式方便地递送，所述抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其它适当的气体。在存在加压气溶胶的情况下，所述剂量单元可通过提供阀门来确定，该阀门可递送计量的量。例如在吸入器或吹入器中应用的明胶的、胶囊和药筒可配制为包含所述化合物和适当粉末基质的粉末混合物，所述基质例如乳糖或淀粉。如在U.S.2003/023553 A1中描述的方法可用于制备包含本发明融合蛋白的气溶胶，将其引入本文作为参考。

可配制所述药物组合物用于经由注射或输注的非胃肠道(例如静脉内或肌内)给药。用于注射或输注的制剂可以单位剂量形式存在于，例如安瓿中，或含有另外的防腐剂的多剂量容器中。所述组合物可采取这样的形式，如在油或水性介质中的混悬液、溶液或乳液，并包含剂型试剂例如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。作为替代，活性成分可以是用于与适当介质例如无热原水重构的粉末形式。

所述药物组合物也可配制为栓剂或保留灌肠剂用于直肠给药，例如包含常规的栓剂基质例如可可豆脂或其它甘油酯。

                           实施例

                           实施例1

           构建单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc融合分子

对于单链FSH-Fc构建体而言，使用标准的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人垂体mRNA文库(Clontech，Palo Alto，CA)中分离FSHβ，其具有其天然信号序列。从相同的人垂体mRNA文库中分离FSHα，但是其不含有它的信号序列。连接所述的两个FSH亚基形成连续的FSHβ-FSHα融合体，其中不含3′终止密码子。如前描述(U.S.2003/0235536 A1)使用标准的聚合酶链式反应(PCR)技术制备人IgG₁的Fc片段(铰链区，CH2和CH3结构域，氨基酸221-447，EU编码)。设计引物以在Fc片段的5′末端创建8-氨基酸连接子序列(EFAGAAAV；SEQ ID NO：9)。将人Fc PCR片段克隆入哺乳动物表达载体pED.dC(Genetics Institute，Cambridge，MA)中，其包含腺病毒主要晚期启动子和作为选择标志的小鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。然后将单链FSH分子克隆入含人类Fc序列的pED.dC，从而创建具有八氨基酸连接子的FSHβ-FSHα-Fc融合分子，所述连接子将FSH亚基连接至Fc(图1a)。

对于异二聚体FSH-Fc构建体而言，从相同的人垂体mRNA文库中分离FSHα和FSHβ亚基，每个都具有其天然的信号序列。来自pED.dC中Fc的8氨基酸连接子序列可替换为十五个氨基酸的连接子序列GS15((GGGGS)3；SEQ ID NO：10)代替。使用标准PCR技术用巨细胞病毒(CMV)启动子替换pED.dC中的腺病毒主要晚期启动子，以创建CMV启动子的5′和3′末端的限制性位点，其允许切除腺病毒的主要晚期启动子，并替换为CMV启动子。PCR反应的模板为pcDNA6/V5-His(Invitrogen，Carlsbad，CA)，包含CMV启动子和用于选择目的的杀稻瘟菌素基因的哺乳动物表达载体。来自pED.dC的GS15连接子/Fc片段也连接入pcDNA6/V5-His而创建具有独特选择标志的第二种载体。然后，将FSHα克隆入GS15-Fc-pED.dC载体，同时将FSHβ克隆入GS15-Fc-pcDNA6/V5-His。为了纯化的目的，6His标签序列被融合入pcDNA6/V5-His中FSHβ-Fc的3′末端(图1b)。

所得的编码FSHα-Fc的全长核苷酸和其氨基酸序列分别提供为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

SEQ ID NO：1

cctgcaggccacc atggattactacagaaaatatgcagctatctttctggtcacattgtcggtgtttctgcatgttctcc

attccgctcctgatgtgcaggattgcccagaatgcacgctacaggaaaacccattcttctcccagccgggtgccc

caatacttcagtgcatgggctgctgcttctctagagcatatcccactccactaaggtccaagaagacgatgttggtc

caaaagaacgtcacctcagagtccacttgctgtgtagctaaatcatataacagggtcacagtaatggggggtttc

aaagtggagaaccacacggcgtgccactgcagtacttgttattatcacaaatctggtggaggcggatccggt

ggaggcgggtccggcggtggagggagcgacaaaactcacacgtgcccgccgtgcccagctccggaact

gctgggcggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggt

cacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggag

gtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcacc

gtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagccccc

atcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccg

ggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg

gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctc

cttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgat

gcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctdccctgtctccgggtaaatga

在上述SEQ ID NO：1中，信号序列用下划线表示，GS15连接子序列的编码序列用粗体显示。FSHα的5′引物序列为：ggctagcctgcaggccaccatggattactacagaaaatatgc。(SEQ ID NO：5)。FSHα的3′引物序列是：

tccaccggatccgcctccaccagatttgtgataataacaagtact(SEQ ID NO：6)。

SEQ ID NO：2

MDYYRKYAAIFLVTLSVFLHVLHSAPDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMG

CCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACH

CSTCYYHKSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK

DTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR

WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR

DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK

LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

在上述SEQ ID NO：2中，信号序列被加了下划线，连接子序列用粗体显示。Fc片段为氨基酸编号132-358。

编码具有6His标签的FSHβ-Fc的所得全长核苷酸和其氨基酸序列分别提供为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

SEQ ID NO：3

cctgcaggccacc atgaagacactccagtttttcttccttttctgttgctggaaagcaatctgctgcaatagctgtgag

ctgaccaacatcaccattgcaatagagaaagaagaatgtcgtttctgcataagcatcaacaccacttggtgtgct

ggctactgctacaccagggatctggtgtataaggacccagccaggcccaaaatccagaaaacatgtaccttca

aggaactggtatacgaaacagtgagagtgcccggctgtgctcaccatgcagattccttgtatacatacccagtgg

ccacccagtgtcactgtggcaagtgtgacagcgacagcactgattgtactgtgcgaggcctggggcccagctac

tgctcctttggtgaaatgaaagaaggtggaggcggatccggtggaggcgggtccggcggtggagggag

cgacaaaactcacacgtgcccgccgtgcccagctccggaactgctgggcggaccgtcagtcttcctcttccccc

caaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacg

aagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcggg

aggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaa

ggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaag

ggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagc

ctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggag

aacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggac

aagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgc

agaagagcctctccctgtctccgggtaaacatcatcaccatcaccactga

在上述SEQ ID NO：3中，信号序列加下划线，6His标签用斜体显示，GS15连接子序列用粗体显示。用于FSHβ的5′引物序列为：ggctagcctgcaggccaccatgaagacactccagtttttct(SEQ ID NO：7)。用于FSHβ的3′引物序列为tccaccggatccgcctccaccttctttcatttcaccaaagga(SEQ ID NO：8)。

SEQ ID NO：4

MKTLQFFFLFCCWKAICCNSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLV

YKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDS

TDCTVRGLGPSYCSFGEMKEGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLG

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT

KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP

REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP

VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKH

HHHHH

在上面显示的的SEQ ID NO：4中，信号序列被加了下划线，His标签用斜体显示，GS15连接子联结子序列用粗体显示。Fc片段为氨基酸编号145-371。

                            实施例2

            单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc的表达和纯化

使用标准Superfect转染方案(Qiagen，Valencia，CA)将单链FSH-Fc转染入缺乏二氢叶酸还原酶的CHO DG44细胞。48小时后，在不含有核糖核苷和脱氧核糖核苷而含有5％透析FBS的MEMα中选择转染的细胞。为了获得较高的蛋白质表达水平，用高达200nM水平的甲氨蝶呤处理细胞。为了研究表达，将细胞接种入含有DMEM：F12+10％FBS的转瓶中，在将培养基改变为DMEM：F12+5μg/ml人胰岛素之前培养3天。每日收集条件化的培养基持续10天，然后用0.2μm滤器过滤，在4℃下储存直至纯化。使用标准蛋白A亲和色谱从细胞上清液中纯化单链FSH-Fc。加载含单链FSH-Fc的培养基后，用5-10柱体积的PBS(10mM磷酸盐pH7.4，2.7mMKCl和137mM NaCl)洗涤蛋白A柱，用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱结合的蛋白质。然后将洗脱的单链FSH-Fc透析入PBS，在-80℃储存于包含10％甘油的小份。在单个蛋白A色谱步骤之后，单链FSH-Fc纯度约90％(图2)。

使用标准Superfect转染方法通过共转染FSHα-Fc和FSHβ-Fc-6His表达载体进入CHO DG44细胞来表达异二聚体FSH-Fc。转染后四十八小时，在不含有核糖核苷和脱氧核糖核酸并含5％透析FBS和10μg/ml杀稻瘟菌素的MEMα中来选择仅包含FSHα-Fc和FSHβ-Fc表达载体的细胞。为了得到更高的表达水平，用高达50nM的甲氨蝶呤处理细胞。为了研究表达，将细胞接种入转瓶中，按照与收集单链FSH-Fc相同的方式收集包含分泌蛋白质的细胞上清液。因为FSHα-Fc和FSHβ-Fc被共转染，细胞上清液包含需要分离的FSHα-Fc同二聚体、FSHβ-Fc同二聚体和异二聚体FSH-Fc的混合物。按照上述用于单链FSH-Fc相同的方式使用蛋白A亲和色谱进行初步纯化。在蛋白A洗脱后，通过镍亲和色谱进一步纯化蛋白质。由于存在6His标签，FSHβ-Fc同二聚体和异二聚体FSH-Fc结合到镍亲和柱上。通过用咪唑梯度(0-500mM)洗脱使FSHβ-Fc同二聚体与异二聚体FSH-Fc相分离，异二聚体FSH-Fc在约30至90mM咪唑处洗脱。在蛋白A和镍亲和色谱步骤后，异二聚体FSH-Fc纯度约90％(图2)。

图1c显示单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc融合蛋白的示意图。在这一实例中，单链FSH-Fc为FSHα、FSHβ、和包含铰合部、CH2和CH3结构域的人IgG₁的Fc部分的融合分子。因而，单链FSH-Fc的Fc二聚体包含两个FSHα和两个FSHβ亚基。相比较而言，在该实施例中，异二聚体FSH-Fc以这种方式制备，使得Fc二聚体包含在一个Fc链上的单个FSHα亚基和在另一Fc链上的单个FSHβ亚基。因为在单链FSH-Fc分子中的另外FSH亚基，当在还原条件下(分别为约75kDa比50kDa)或在非还原条件下(分别为约150kDa比100kDa)于SDS-PAGE凝胶上分析时(图2)，单链FSH-Fc蛋白质大于异二聚体FSH-Fc蛋白质。在非还原条件下，单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc都主要形成Fc二聚体(图1c和图2)。

                           实施例3

                  啮齿动物药效学研究：皮下给药

为了确定单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc融合蛋白是否与人重组FSH具有相似的生物活性，给21日龄雌性大鼠(每组10只大鼠)皮下给药单一剂量的重组FSH(Follistim，Organon，West Orange，NJ)、单链FSH-Fc或异二聚体FSH-Fc的1nmol/kg PBS溶液。给药七十二小时后，测定每只大鼠的卵巢重量。Steelman SL andPohley FM(1953)Endocrinol 53：604-16。使用SigmaStat version 2.0分析统计(RockWare，Inc.，Golden，CO)。结果显示在图3中。

如在图3中显示的，与用载体处理的相比，用单一剂量的重组FSH处理的雌性大鼠的卵巢重量有显著增加(分别为14.3±1.7mg对12.1±1.0mg，p＝0.003)。然而，与载体和FSH处理组相比，单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc引起了卵巢重量的更大增加(分别为20.8±3.9mg和26.9±6.1mg；p＜0.001)。在该试验中，异二聚体FSH-Fc比单链FSH-Fc具有显著更高的活性(p＝0.016)。

                              实施例4

                        啮齿动物的药动学研究

在生命的第一个三周内，新生大鼠在小肠中表达高水平的FcRn。因而，这一系统可用于确定口服递送FcRn结合分子，例如Fc融合蛋白。口服给药十日龄新生大鼠(每组四只大鼠)包含5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂的0.3mg/kg单链FSH-Fc或异二聚体FSH-Fc的生理盐水。在给药后不同时间，用心脏穿刺收集血液，制备血清。在-20℃下储存血清直到用ELISA分析。使用抗FSH包被抗体(Fitzgerald Industries，Concord，MA)和偶联辣根过氧化物酶的抗-Fc检测抗体(Pierce Chemical Company，Rockford，IL)来进行三明治ELISA(sandwich ELISA)。用向给药大鼠使用的相同量的蛋白质创建ELISA的标准曲线。样品重复分析三次。使用WinNonlin version 4.1(Pharsight，Mountain View，CA)评价药动学参数。结果显示在图4中。

如在图4中所示的，口服给药后，在新生大鼠中测定高水平的单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc(分别为2.4μg/ml和3.8μg/ml，其为平均最大血清浓度)，两种蛋白质都具有长的终末(terminal)半衰期，分比为60小时和69小时。与图3中生物活性的结果结合，这些数据表明，与重组FSH相比，单链和异二聚体FSH-Fc具有较高的体内活性，可能由于融合蛋白长的半衰期。

                            实施例5

FcRn在新生大鼠中口服递送单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc中的作用

为了表明单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc的口服递送是由于FcRn结合和跨细胞作用(transcytosis)，对10日龄新生大鼠口服给予¹²⁵I-标记的单链FSH-Fc或异二聚体FSH-Fc和300-倍过量的未标记的人IgG₁(ICN，Irvine，CA)混合物的生理盐水溶液，其中含有5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂。根据制造商的方案，使用碘珠(Pierce)用¹²⁵I碘化钠(Perkin Elmer，Boston，MA)碘化单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc。在PD-10脱盐柱上从碘化的蛋白质中分离游离碘。给药两小时后，心脏穿刺收集血液，并制备血清。将100μl等分的血清与蛋白A tris丙烯酰胺珠(Pierce)在4℃下保温1小时。然后用PBS洗涤蛋白A珠两次，并用含10％β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液洗脱。煮沸样品，在4-20％SDS-PAGE凝胶上分析，干燥，并在StormPhosphorimager(Molecular Dynamics，Piscataway，NJ)上进行定量分析。结果显示在图5中。

在存在过量IgG₁下，单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc的口服递送大大减少(通过phosphorimage分析测定转运分别减少了83％和53％)。由于IgG₁为FcRn的天然配体，这提示单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc特异性结合FcRn，并由FcRn转运，并且该过程可因存在过量的IgG₁而被中断。

                              实施例6

                   啮齿动物的药效学研究：口服给药

对两日龄雄性大鼠(每组10只大鼠)口服给药1nmol/kg重组人FSH(Follistim，Organon)、单链FSH-Fc或异二聚体FSH-Fc的PBS，其中包含5mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂。对大鼠每天给药，连续14天，然后从每只动物中切除右侧睾丸，称重。Meachem SJ et al.，(1996)Biol Reprod 54：36-44。使用SigmaStat version 2.0(RockWare，Inc.)分析统计。结果显示在图6中。

如在图6中显示的，在该测定中，与赋形剂处理组相比，重组FSH组没有产生睾丸重量的增加(分别为49.1±8.1mg比55.4±8.1mg)，表明在该模型中，口服重组FSH没有活性(图6a)。相比较而言，与赋形剂处理组相比，单链FSH-Fc(图6a和图6b)和异二聚体FSH-Fc(图6b)处理的结果为睾丸重量显著增加(分别为113.0±19.8mg和139.6±11.9mg比58.6±10.4mg；p＜0.001)。与皮下给药试验类似，在该试验中，异二聚体FSH-Fc比单链FSH-Fc具有更显著地活性(p＝0.003)。

                             实施例7

                      食蟹猴中的药动学研究

我们以前已经显示了FcRn在食蟹猴和人肺部的表达，在肺部给药后，促红细胞生成素-Fc融合蛋白被吸收并保留活性(Spiekermann GM等(2002)J Exp Med196：300-310；Bitonti AJ et al.，(2004)Proc Natl Acad Sci USA 101：9763-9768)。因而，我们接下来想要确定在非人灵长类动物中单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc是否能通过肺部服药，并保留活性。

使用已批准的方法进行所有有关食蟹猴的研究，遵守NIH护理和使用研究动物的指南。在肺部给药之前，用氯胺酮和安定组合来麻醉动物，插入气管内插管。用Aeroneb Pro^TM喷雾器(Aerogen，Mountain View，CA)制备单链FSH-Fc(PBS溶液，pH7.4)和异二聚体FSH-Fc(PBS溶液，pH7.4，含有0.1％人血清白蛋白)的气雾剂，并通过气管内插管对食蟹猴给药(累积(deposited)剂量约45μg/kg)。Bird Mark7A呼吸器用于调节每只猴子呼吸的深度(20-40％肺活量)和速率(每分钟呼吸28-30次)，使得递送单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc靶向进入中央气道。气雾剂粒径为约4-5μm。肺部给药后，在各个时间点收集血样，制备血清。使用市售的FSH ELISA试剂盒(DRG International，Mountainside，NJ)根据制造厂家的使用说明来定量血清单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc水平。用对猴子给药使用的相同批次的单链FSH-Fc或异二聚体FSH-Fc绘制用于每次测定的标准曲线。使用WinNonlin version4.1(Pharsight)评价药动学参数。结果显示在表2和图7中。

表2.在以约45μg/kg累积剂量向食蟹猴肺部给药的单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc后评价的药动学参数

参数	单链FSH-Fc		异二聚体FSH-Fc
					猴1	猴2	猴3	猴4
	Cmax，ng/ml	91.4	93.9	68.7					130.5
t1/2，h					210	54.7	182	219
	AUC，hr*ng/ml	17489	13086	26526					53001

约45μg/kg的每种蛋白质的累积剂量导致单链FSH-Fc的最大血清浓度为91和94ng/ml，异二聚体FSH-Fc的最大血清浓度为69和131ng/ml(表2)。测定两种蛋白质的终末(terminal)半衰期，对单链FSH-Fc为55和210小时，对异二聚体FSH-Fc为182和219小时(表2)。这些半衰期显著地长于重组FSH的半衰期，其在人中(leCotonnec J-Y et al.，(1994)Fertil Steril 61：679-686)和在非人灵长类动物中(PorchetHC et al.，(1993)Drug Metab Dispos 21：144-150；Weinbauer GF et al.，(1994)JEndocrinol 141：112-121)为约24小时。因而，在治疗不育症中使用FSH-Fc融合蛋白的优点为将可能极大的降低给药频率。

                            实施例8

                      食蟹猴中的药效学测定

抑制素(inhibin)为FSH活性的药效学标记物。因此，在肺部给予单链FSH-Fc和异二聚体FSH-Fc后得到的血清样品也用于确定抑制素水平，按制造厂家的说明使用市售的ELISA试剂盒(Diagnostic Systems Laboratories，Webster，TX)。WeinbauerGF et al.，(1994)J Endocrinol 141：113-121。结果显示在图8中，约45μg/kg单链FSH-Fc的累积肺部剂量导致最大抑制素B浓度为1和1.6ng/ml，相当于上述基准水平以上1.2-和1.4-倍的刺激。相同的累积肺部剂量的异二聚体FSH-Fc导致最大抑制素B浓度为2.7和7.4ng/ml，相当于上述基线水平的7.1-和5.9-倍的刺激。用肺部异二聚体FSH-Fc处理14天后，抑制素B水平没有恢复到基线。

本文引用的全部出版物或专利申请以其全部内容和为了全部目的并入本文，其程度就像每个单独的出版物或专利或专利申请被具体而单独地指出以其全部内容和为了所有目的经引用而并入本文。当引入作为参考的出版物和专利或专利申请与本说明书包含的公开内容冲突时，本说明书意图代替和/或优于任意这些冲突的内容。

在所有情况下，所有成分的数字表示量、反应条件、和说明书与权利要求书中使用的那些应被理解为用术语“约”加以修饰。因此，除非另有说明，在说明书和附属的权利要求书中列出的数字参数为近似值，其可根据本发明寻求获得的期望性质而变化。在极少情况下，并且不试图限制将等同原则应用于权利要求书的范围，每个数字参数将根据有效数字的数目和常规约数方法来解释。

在不偏离本发明的精神和范围下，可以对本发明进行很多修饰和变化，其对本领域技术人员是显而易见的。本文描述的具体实施方案仅作为实施例来提供，并不意味着以任何方式进行限制。其意思是指说明书和实施例仅仅是示范性的，本发明真正的范围和精神由下面的权利要求来指示。

                                序列表

<110>森托尼克斯制药有限公司

<120>用于治疗不育症的异二聚体促卵泡激素-Fc(FSH-Fc)融合蛋白

<130>S1383.70012WO

<150>US 60/540,236

<151>2004-01-28

<160>18

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1090

<212>DNA

<213>人

<400>1

cctgcaggcc accatggatt actacagaaa atatgcagct atctttctgg tcacattgtc     60

ggtgtttctg catgttctcc attccgctcc tgatgtgcag gattgcccac aatgcacgct    120

acaggaaaac ccattcttct cccagccggg tgccccaata cttcagtgca tgggctgctg    180

cttctctaga gcatatccca ctccactaag gtccaagaag acgatgttgg tccaaaagaa    240

cgtcacctca gagtccactt gctgtgtagc taaatcatat aacagggtca cagtaatggg    300

gggtttcaaa gtggagaacc acacggcgtg ccactgcagt acttgttatt atcacaaatc    360

tggtggaggc ggatccggtg gaggcgggtc cggcggtgga gggagcgaca aaactcacac    420

gtgcccgccg tgcccagctc cggaactgct gggcggaccg tcagtcttcc tcttcccccc    480

aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga    540

cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca    600

taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt    660

cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa    720

caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga    780

accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct    840

gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg    900

gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg gactccgacg gctccttctt    960

cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg   1020

ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc   1080

gggtaaatga                                                          1090

<210>2

<211>358

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser

1               5                   10                  15

Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro

            20                  25                  30

Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro

        35                  40                  45

Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro

    50                  55                  60

Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu

65                  70                  75                  80

Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly

                 85                  90                 95

Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr

            100                 105                 110

Tyr His Lys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

        115                 120                 125

Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

    130                 135                 140

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

145                 150                 155                 160

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

                165                 170                 175

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

            180                 185                 190

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

        195                 200                 205

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

    210                 215                 220

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

225                 230                 235                 240

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

                245                 250                 255

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

            260                 265                 270

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

        275                 280                 285

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

    290                 295                 300

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

305                 310                 315                 320

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

                325                 330                 335

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

            340                 345                 350

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

        355

<210>3

<211>1147

<212>DNA

<213>人

<400>3

cctgcaggcc accatgaaga cactccagtt tttcttcctt ttctgttgct ggaaagcaat     60

ctgctgcaat agctgtgagc tgaccaacat caccattgca atagagaaag aagaatgtcg    120

tttctgcata agcatcaaca ccacttggtg tgctggctac tgctacacca gggatctggt    180

gtataaggac ccagccaggc ccaaaatcca gaaaacatgt accttcaagg aactggtata    240

cgaaacagtg agagtgcccg gctgtgctca ccatgcagat tccttgtata catacccagt    300

ggccacccag tgtcactgtg gcaagtgtga cagcgacagc actgattgta ctgtgcgagg    360

cctggggccc agctactgct cctttggtga aatgaaagaa ggtggaggcg gatccggtgg    420

aggcgggtcc ggcggtggag ggagcgacaa aactcacacg tgcccgccgt gcccagctcc    480

ggaactgctg ggcggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat    540

gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga    600

ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg    660

ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga    720

ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat    780

cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc    840

cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt    900

ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa    960

gaccacgcct cccgtgttgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt   1020

ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct   1080

gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaacatc atcaccatca   1140

ccactga                                                             1147

<210>4

<211>377

<212>PRT

<213>人

<400>4

Met Lys Thr Leu Gln Phe Phe Phe Leu Phe Cys Cys Trp Lys Ala Ile

1               5                   10                  15

Cys Cys Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys

            20                  25                  30

Glu Glu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly

        35                  40                  45

Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys

    50                  55                  60

Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg

65                  70                  75                  80

Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val

                85                  90                  95

Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys

            100                 105                 110

Thr Val Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys

        115                 120                 125

Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

    130                 135                 140

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

145                 150                 155                 160

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

                165                 170                 175

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

            180                 185                 190

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

        195                 200                 205

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

    210                 215                 220

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

225                 230                 235                 240

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

                245                 250                 255

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

            260                 265                 270

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

        275                 280                 285

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

    290                 295                 300

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

305                 310                 315                 320

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

                325                 330                 335

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

            340                 345                 350

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

        355                 360                 365

Pro Gly Lys His His His His His His

    370                 375

<210>5

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>5

ggctagcctg caggccacca tggattacta cagaaaatat gc                        42

<210>6

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>6

tccaccggat ccgcctccac cagatttgtg ataataacaa gtact                     45

<210>7

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>7

ggctagcctg caggccacca tgaagacact ccagtttttc t                         41

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸

<400>8

tccaccggat ccgcctccac cttctttcat ttcaccaaag ga                        42

<210>9

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>9

Glu Phe Ala Gly Ala Ala Ala Val

1               5

<210>10

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1               5                   10                  15

<210>11

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>11

Pro Lys Asn Ser Ser Met Ile Ser Asn Thr Pro

1               5                   10

<210>12

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>12

His Gln Ser Leu Gly Thr Gln

1               5

<210>13

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>13

His Gln Asn Leu Ser Asp Gly Lys

1               5

<210>14

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>14

His Gln Asn Ile Ser Asp Gly Lys

1               5

<210>15

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>15

Val Ile Ser Ser His Leu Gly Gln

1               5

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>16

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

1               5

<210>17

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>17

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1               5                   10                  15

<210>18

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>合成肽

<400>18

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

1               5                   10                  15

Gly Ser

Claims (29)

1.异二聚体融合蛋白，包含两个结合的多肽链，第一个链包含与FcRn结合伴侣偶联的促卵泡激素(αFSH)的α亚基，第二个链包含与FcRn结合伴侣偶联的FSH的β亚基(βFSH)，其中αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各自FcRn结合伴侣的尾部匹配。

2.权利要求1的融合蛋白，还包含FSH亚基和FcRn结合伴侣之间的连接子。

3.融合蛋白，其包含下式的两个多肽链：

αFSH-L-Fc:βFSH-L-Fc

其中αFSH为FSH的α亚基，βFSH为FSH的β亚基，L为连接子或直接键合，Fc为免疫球蛋白的Fc片段，其中αFSH和βFSH的羧基端通直接或间接地过L连接到各个Fc的氨基端，并且其中冒号(:)表示融合蛋白的两个多肽链之间的结合，而且其中αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各自Fc片段的尾部匹配。

4.融合蛋白，其包含下式的两个多肽链：

Fc-L-αFSH:Fc-L-βFSH

其中，αFSH为FSH的α亚基，βFSH为FSH的β亚基，L为连接子或直接键合，Fc为免疫球蛋白的Fc片段，其中αFSH和βFSH的氨基端直接或间接地通过L连接到各个Fc的羧基端，其中冒号(:)表示融合蛋白的两个多肽链之间的结合，而且其中αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各自Fc片段的尾部匹配。

5.权利要求1、3或4中任一项的融合蛋白，其中FSH为人FSH。

6.权利要求3或4的融合蛋白，其中Fc片段包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO：4的氨基酸编号145至氨基酸编号371列出的氨基酸序列具有至少80％一致性。

7.权利要求3或4的融合蛋白，其中Fc片段包含具有SEQ ID NO：4的氨基酸编号145至氨基酸编号371列出的氨基酸序列。

8.权利要求3或4的融合蛋白，其中Fc为IgG的Fc片段。

9.权利要求3或4的融合蛋白，其中L为直接键合。

10.权利要求2-4中任一项的融合蛋白，其中所述连接子为约1-20个氨基酸。

11.权利要求10的融合蛋白，其中所述连接子为约8-15个氨基酸。

12.权利要求11的融合蛋白，其中所述连接子具有氨基酸序列EFAGAAAV(SEQID NO：9)。

13.权利要求10的融合蛋白，其中所述连接子包含序列-(Gly)_n-，其中n为1-20的整数。

14.权利要求10的融合蛋白，其中所述连接子包含选自-(GGS)_n-或-(GGGGS)_n-的序列，其中n为约1-7的整数。

15.权利要求3或4的融合蛋白，其中两个多肽链之间的结合包含FSH的α和β亚基之间的结合。

16.权利要求3或4的融合蛋白，其中两个多肽链之间的结合包含两个Fc片段之间的结合。

17.权利要求16的融合蛋白，其中所述结合包含至少一个二硫键。

18.药物组合物，其包含权利要求1、3或4中任一项的融合蛋白和药学接受的赋形剂。

19.核酸，其编码权利要求1、3或4中任一项的融合蛋白的一个或两个多肽链。

20.载体，其包含权利要求19的核酸。

21.细胞，其包含一个或多个权利要求20的载体。

22.提高对象生育力的方法，所述方法包括向对象给予能有效增强对象生育力的量的权利要求1、3或4中任一项的融合蛋白。

23.权利要求22的方法，其中对象是不能生育的并且期望体外生殖。

24.权利要求22的方法，其中所述对象为人。

25.权利要求22的方法，其中通过静脉内、肌肉内、皮下、经口、含服、舌下、鼻、直肠、阴道、经由气雾剂、或经由肺部途径施用融合蛋白。

26.治疗具有对FSH治疗有反应的疾病状态的对象的方法，该方法包含向对象给予有效量的权利要求1、3或4中任一项的融合蛋白。

27.权利要求26的方法，其中所述对象为人。

28.权利要求26的方法，其中通过静脉内、肌肉内、皮下、经口、含服、舌下、鼻、直肠、阴道、经由气雾剂或经由肺部途径施用融合蛋白。

29.提高异二聚体FSH的半衰期的方法，直接或间接地通过连接子，将FSH的α亚基和β亚基的每个偶联到至少FcRn结合伴侣上，其中αFSH的头部与βFSH的头部匹配，各自FcRn结合伴侣的尾部匹配。

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