DE69733309T2

DE69733309T2 - Heterodimerebildende hybrid-proteine

Info

Publication number: DE69733309T2
Application number: DE69733309T
Authority: DE
Inventors: K. Robert CAMPBELL; A. Bradford JAMESON; C. Scott CHAPPEL
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1996-02-20
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2017-02-21
Also published as: WO1997030161A1; EP0894141B1; US7291339B2; US20010014333A1; DK0894141T3; NO321777B1; HUP9900619A2; US6663867B2; JP2008019258A; EE04025B1; EA002474B1; JP4140927B2; NO983799D0; EE9800256A; CZ291212B6; EA199800744A1; CA2245877C; BG64510B1; BG102705A; AU2125297A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hybridprotein, das zwei co-exprimierte Aminosäuresequenzen umfaßt, die ein Dimer bilden, die jeweils umfassen:

a) mindestens eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem homomeren Rezeptor, einer Kette eines heteromeren Rezeptors, eines Liganden, und Fragmenten davon; und
b) eine Untereinheit eines heterodimeren Proteinhormons oder Fragmente davon; wobei (a) und (b) direkt oder über einen Peptidlinker verbunden sind; und bei jedem Paar die zwei Untereinheiten (b) unterschiedlich und in der Lage sind, unter Bildung eines dimeren Komplexes zu aggregieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Protein-Protein-Wechselwirkungen sind für die normalen physiologischen Funktionen von Zellen und vielzelligen Organismen essentiell. Viele Proteine in der Natur zeigen neue oder optimale Funktionen, wenn sie mit einer oder mehreren anderen Proteinketten komplexiert sind. Dies wird durch verschiedene Ligand-Rezeptor-Kombinationen gezeigt, die zur Regulierung der Zellaktivität beitragen. Gewisse Liganden wie der Tumornekrosefaktor α (TNFα), TNFβ oder menschliches chorionisches Gonadotropin (hCG) kommen als Komplexe mit vielen Untereinheiten vor. Einige dieser Komplexe enthalten vielfache Kopien derselben Untereinheit. TNFα und TNFβ (hier gemeinsam als TNF bezeichnet) sind Homotrimere, die durch drei identische Untereinheiten gebildet werden (1-4). Andere Liganden sind aus nicht identischen Untereinheiten zusammengesetzt. Zum Beispiel ist hCG ein Heterodimer (5-7). Rezeptoren können auch als Komplexe mit vielen Ketten vorkommen oder funktionieren. Zum Beispiel übertragen die Rezeptoren für TNF ein Signal, nachdem sie sich zusammengelagert haben, um Dimere zu bilden (8,9). Liganden für diese Rezeptoren fördern die Aggregation von zwei oder drei Rezeptorketten und bieten damit einen Mechanismus der Rezeptoraktivierung. Zum Beispiel aktiviert die von TNF vermittelte Aggregation die TNF-Rezeptoren (10-12).
Die Modulierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen kann ein nützlicher Mechanismus bei der therapeutischen Intervention bei verschiedenen Krankheiten und pathologischen Zuständen sein. Lösliche bindende Proteine, die mit Liganden wechselwirken können, können potentiell den Liganden von dem Rezeptor wegsequestrieren und damit die Aktivierung des speziellen Rezeptorwegs reduzieren. Alternativ kann die Sequestrierung des Liganden seine Eliminierung oder seinen Abbau verzögern, wodurch die Dauer seiner Wirkung und eventuell seine scheinbare Aktivität in vivo erhöht wird. Im Falle von TNF wurden die löslichen TNF-Rezeptoren primär mit der Inhibierung der TNF-Aktivität assoziiert (13-17).
Lösliche bindende Proteine können bei der Behandlung von Krankheiten des Menschen von Nutzen sein. Zum Beispiel wurde von löslichen TNF-Rezeptoren gezeigt, daß sie in Tiermodellen für Arthritis eine Wirksamkeit haben (18,19).
Da TNF drei Bindungsstellen für seinen Rezeptor hat (10-12) und die Dimerisierung des Zelloberflächenrezeptors ausreichend ist für die biologische Aktivität (8,9), ist es wahrscheinlich, daß die Bindung eines einzigen löslichen Rezeptors an TNF die Möglichkeit offenlassen wird, daß dieser 1:3-Komplex von löslichem Rezeptor:TNF (Trimer) noch binden und ein Paar von Zelloberflächen-TNF-Rezeptoren aktivieren kann. Um einen inhibitorischen Effekt zu erzielen, würde man erwarten, daß zwei der Rezeptorbindungsstellen auf dem TNF-Trimeren von dem löslichen bindenden Protein besetzt oder blockiert sein müssen. Alternativ könnte das bindende Protein die ordnungsgemäße Orientierung von TNF an der Zelloberfläche blockieren.
Allgemein gesagt wurde der Bedarf zur Synthese von Proteinen, die zwei Rezeptor-Ketten (oder Liganden-Ketten) enthalten, als dimere hybride Proteine gesehen. Vgl. Wallach et al., US-Patent 5,478,925.
Die primär verwendete Strategie für die Herstellung von dimeren oder multimeren hybriden Proteinen, die bindende Domänen von extrazellulären Rezeptoren enthalten, war die Fusion dieser Proteine mit der konstanten Region der schweren Kette eines Antikörpers.
Diese Strategie führte zum Beispiel zu der Konstruktion von CD4-Immunadhäsinen (20). Dies sind hybride Moleküle, die aus den ersten beiden (oder allen vier) Immunglobulinähnlichen Domänen von CD4 bestehen, fusioniert mit der konstanten Region der schweren und leichten Ketten eines Antikörpers. Diese Strategie für die Herstellung von hybriden Molekülen wurde an die Rezeptoren für TNF angepaßt (10, 16, 21) und führte zur Herstellung von Konstrukten mit einer höheren in vitro-Aktivität als die monomeren löslichen bindenden Proteine.
Es wird allgemein angenommen, daß sich die höhere in vitro-Wirksamkeit der dimeren Fusionsproteine in eine höhere in vivo-Aktivität übersetzen sollte. Eine Untersuchung unterstützt dies, die eine mindestens 50-fach höhere Aktivität für ein p75(TBP2)-Ig-Fusionsprotein beim Schutz von Mäusen vor den Folgen einer intravenösen LPS-Injektion offenbart (16).
Diese Strategie hat jedoch trotz der weit verbreiteten Verwendung von Immunglobulin-Fusionsproteinen mehrere Nachteile. Einer ist, daß gewisse Fc-Domänen von Immunglobulinen an der Effektorfunktion des Immunsystems teilnehmen. Diese Funktionen können bei einem speziellen therapeutischen Ansatz unerwünscht sein (22).
Eine zweite Einschränkung betrifft spezielle Fälle, bei denen es erwünscht ist, heteromere Fusionsproteine zu produzieren, zum Beispiel lösliche Analoga der heteromeren IL-6-Rezeptoren oder Typ I-Interferonrezeptoren. Obwohl es zahlreiche Methoden für die Produktion von bifunktionellen Antikörpern gibt (z.B. durch Co-Transfektion oder Hybridomfusionen), ist die Effizienz der Synthese stark beeinträchtigt durch das Gemisch an Homodimeren und Heterodimeren, das üblicherweise entsteht (23). Kürzlich gab es mehrere Berichte, die die Verwendung von Leucin-Reißverschlußmotiven zur Steuerung des Zusammenbaus von Heterodimeren beschreiben (24-26). Dies scheint ein vielversprechender Ansatz für Forschungszwecke zu sein, aber die verwendeten nicht nativen oder intrazellulären Sequenzen können wegen ihrer Antigenität nicht geeignet sein für chronische Anwendungen in der Klinik. Die Wirksamkeit des Zusammenbaus und die Stabilität nach dem Zusammenbau können auch Einschränkungen sein.
Andererseits wurde im speziellen Fall der TNF-Rezeptoren bei gewissen Modifikationen des p55-TNF-Rezeptors gefunden, daß sie die Homodimerisierung und die Signalübertragung in der Abwesenheit von Liganden erleichtern (27, 28). Es wurde gefunden, dass ein cytoplasmatischer Bereich des Rezeptors, als "tote Domäne" bezeichnet, als Homodimerisierungsmotiv dienen kann (28, 30). Als eine Alternative zu einem Immunglobulin-Hybridprotein könnte die Fusion der extrazellulären Domäne des TNF-Rezeptors mit seiner cytoplasmatischen toten Domäne möglicherweise in einem sezernierten Protein resultieren, das in der Abwesenheit von TNF dimerisiert. Solche Fusionsproteine wurden in der Internationalen Patentanmeldung WO 95/31544 offenbart und beansprucht.
Eine weitere dritte Strategie, die für die Herstellung von Dimeren von löslichen TNF-Rezeptoren verwendet wurde, war die chemische Verknüpfung von monomeren Proteinen mit Polyethylenglycol (31).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Alternative zur Gewinnung solcher dimeren Proteine, die einige wichtige Vorteile bieten, ist diejenige der vorliegenden Erfindung und besteht in der Verwendung eines natürlichen heterodimeren Gerüsts, das einem zirkulierenden nicht-Immunglobulin-Protein mit einer langen Halbwertszeit entspricht. Ein bevorzugtes Beispiel ist hCG, ein Protein, das gut sezerniert wird, eine gute Stabilität hat und eine lange Halbwertszeit hat (32-33). Wegen der herausragenden Rolle von hCG als Schwangerschaftsmarker wurden viele Reagentien entwickelt, die das Protein in vitro und in vivo quantifizieren und untersuchen. Außerdem wurde hCG unter Verwendung von Mutagenese ausführlich untersucht und es ist bekannt, daß kleine Deletionen an dem Protein wie die Entfernung von fünf Resten am äußersten Carboxyl-Terminus der α-Untereinheit seine biologische Aktivität effektiv ausschalten können, während seine Fähigkeit zur Bildung von Heterodimeren erhalten bleibt (34, 35). Bei kleinen Insertionen von bis zu 30 Aminosäuren wurde gezeigt, daß sie an den Anino- Carboxyl-Termini der α-Untereinheit toleriert werden, während die Fusion der α-Untereinheit mit dem Carboxyl-Terminus der β-Untereinheit auch wenig Wirkung auf die Bildung von Heterodimer hatte (37).
Von einem Analogon von hCG, bei dem die Fc-Domäne eines Immunglobulins mit dem C-Terminus der β-Untereinheit von hCG fusioniert wurde, wurde auch berichtet; dieses Konstrukt wurde jedoch nicht sezerniert und es wurde nicht versucht, es mit einer α-Untereinheit zu kombinieren (38).
Deswegen ist die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ein Hybridprotein, das zwei co-exprimierte Aminosäuresequenzen umfaßt, die ein Dimer bilden, die jeweils umfassen:

a) mindestens eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem homomeren Rezeptor, einer Kette eines heteromeren Rezeptors, eines Liganden, und Fragmenten davon; und
b) eine Untereinheit eines heterodimeren Proteinhormons oder Fragmente davon; wobei (a) und (b) direkt oder durch einen Peptidlinker gebunden sind und bei jedem Paar die beiden Untereinheiten (b) unterschiedlich und unter Bildung eines dimeren Komplexes zu Aggregation in der Lage sind.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Linker enzymatisch spaltbar sein.
Die Sequenz (a) ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus: der extrazellulären Domäne des TNF-Rezeptors 1 (55 kDa, auch als TBP1 bezeichnet), der extrazellulären Domäne des TNF-Rezeptors 2 (75 kDa, auch als TBP2 bezeichnet) oder Fragmenten davon, die noch die Ligandenbindungsdomäne enthalten; den extrazellulären Domänen des IL-6-Rezeptors (auch als gp80 und gp130 bezeichnet); der extrazellulären Domäne des IFN α/β-Rezeptors oder des IFN γ-Rezeptors; einem Gonadotropin-Rezeptor oder seinen extrazellulären Fragmenten; den leichten Ketten von Antikörpern oder Fragmenten davon, gegebenenfalls assoziiert mit den entsprechenden schweren Ketten; den schweren Ketten von Antikörpern oder Fragmenten davon, gegebenenfalls assoziiert mit den entsprechenden leichten Ketten; Fab-Domänen von Antikörpern; oder Ligandenproteinen wie Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder anderen Hormonen als Gonadotropine; spezifische Beispiele dafür umfassen IL-6, IFNβ, TPO oder Fragmente davon.
Sequenz (b) ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus hCG, FSH, LH, TSH, Inhibin-Untereinheit oder Fragmenten davon.
Die Modifikationen der Proteine wie die chemische oder enzymatische Spaltung des Proteinrückgrats oder die chemische oder enzymatische Modifikation gewisser Aminosäureseitenketten kann verwendet werden, um die Komponenten des hybriden Proteins der Erfindung in einen inaktiven Zustand zu versetzen. Diese Restriktion der Aktivität kann auch durch die Verwendung der rekombinanten DNA-Techniken zur Veränderung der codierenden Sequenz für das Hybridprotein auf eine Art erreicht werden, die in der direkten Restriktion der Aktivität auf eine Komponente resultiert oder die das Protein der anschließenden chemischen oder enzymatischen Modifikation zugänglicher macht.
Die vorstehenden hybriden Proteine werden in monofunktionalen, bifunktionalen oder vielfach funktionalen Molekülen resultieren, in Abhängigkeit von den Aminosäresequenzen (a), die mit (b) kombiniert werden. Bei jedem Paar kann (a) mit den Amino-Termini oder den Carboxy-Termini von (b) verknüpft sein, oder mit beiden.
Ein monoclonales hybrides Protein der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel die extrazelluläre Domäne des Gonadotropinrezeptors umfassen, verknüpft mit einer der entsprechenden, Rezeptor bindenden Gonadotropin-Untereinheiten. Gemäß einer solchen Ausführungsform kann das hybride Protein der Erfindung ein Molekül sein, bei dem zum Beispiel die extrazelluläre Domäne des FSH-Rezeptors mit FSH verknüpft ist, um die Halbwertszeit im Plasma zu erhöhen und um die biologische Aktivität zu verbessern.
Diese Herstellung kann zur Induktion der Follikelreifung bei assistierten Reproduktionsverfahren wie der Induktion der Ovulation oder der in vitro-Fertilisation verwendet werden und als Mittel zur beträchtlichen Amplifikation der biologischen Aktivität des Hormons dienen, das für den Erfolg des Verfahrens essentiell ist, wodurch die Anforderungen an das Hormon selbst und an die Zahl der Injektionen reduziert werden, um die Ovulation zu erreichen.
Der FSH-Rezeptor und die Produktion der extrazellulären Domäne des menschlichen FSH-Rezeptors wurden in der WO 92/16620 bzw. WO 96/38575 beschrieben.
Gemäß einer speziellen Ausführungsform kann die extrazelluläre Domäne des FSH-Rezeptors (ECD) im Rahmen mit einem Peptidlinker fusioniert werden, der die Thrombin-Erkennungs-/Spaltstelle (29) enthält und einen "Verbindungs"arm darstellt. Der Peptidlinker verknüpft die extrazelluläre Domäne von FSH mit einer FSH-Untereinheit. Dies wird die Entfernung der extrazellulären Domäne des FSH-Rezeptors durch Spaltung an der Thrombinspaltstelle erlauben, wenn das Molekül in dem systemischen Kreislauf mit Thrombin in Kontakt kommt.
In einer anderen Ausführungsform wird anstelle der Thrombinspaltstelle eine Enzymerkennungsstelle für ein Enzym verwendet, das im Eierstock im größten Überschuß vorkommt. Auf diese Weise wird das ECD-FSH-Molekül, wenn es in den Eierstock wandert, den Enzymen ausgesetzt, die in diesem Gewebe mit den höchsten Konzentrationen gefunden werden, und das ECD wird entfernt, so daß das FSH mit dem Membran-gebundenen Rezeptor Wechselwirken kann.
In noch einer anderen Ausführungsform wird anstelle einer Enzymerkennungsstelle eine flexible Gelenk-Region zwischen ECD und FSH cloniert, so daß die ECD nicht enzymatisch von dem Hormon entfernt wird. Auf diese Weise wird, wenn das ECD-FSH-Molekül am Eierstock ankommt, eine Kompetition zwischen der Gelenk-verknüpften ECD und der ECD des FSH-Rezeptors stattfinden, der auf der Zellmembran des Eierstocks gefunden wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht das hybride Protein aus der Aggregation zwischen einem Paar an AS-Sequenzen (Aminosäuresequenzen), von denen eine TBP1 enthält (oder die Fragmente von AS 20 bis zu AS 161 oder bis zu AS 190) als (a) und die a-Untereinheit von hCG als (b), und die andere enthält immer TBP1 (oder dieselben Fragment wie vorstehend) als (a) und die p-Untereinheit von hCG oder Fragmente davon als (b). Gemäß dieser Ausführungsform wird das resultierende hybride Protein in Abhängigkeit von der speziellen Sequenz, die als (b) ausgewählt wurde (die gesamte p- Untereinheit von hCG oder Fragmente oder Modifikationen davon) eine Aktivität (nur die von TBP1) oder eine Kombination von Aktivitäten (die von TBP1 mit der von hCG) haben. In diesem letzteren Fall kann das Hybridprotein für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden, zum Beispiel für die kombinierte Behandlung von Kaposi Sarcom und metabolischem Schwund bei AIDS.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden eine oder mehrere kovalente Bindungen zwischen den Untereinheiten (b) hinzugefügt, um die Stabilität des resultierenden Hybridproteins zu erhöhen. Dies kann zum Beispiel durch Hinzufügen von einer oder mehreren nicht nativen Disulfidbindungen zwischen den Ketten erreicht werden. Die Stellen für diese Verknüpfungen können von den bekannten Strukturen der heterodimeren Hormone abgeleitet werden. Zum Beispiel könnte eine geeignete Stelle in hCG die Platzierung von Cysteinresten bei dem Rest Lys45 in der a-Untereinheit und bei dem Rest G1u21 in der p-Untereinheit sein, wodurch eine Salzbrücke (nicht kovalente Bindung) durch eine Disulfidbindung (kovalente Bindung) ersetzt wird. Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind PEGylierte oder andere chemisch modifizierte Formen der Hybridproteine.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein DNA-Molekül, das die DNA-Sequenz umfaßt, die für das vorstehende Hybridprotein codiert, ebenso wie eine im Wesentlichen gleiche Nucleotidsequenz. "Eine im Wesentlichen gleiche Nucleotidsequenz" umfaßt alle anderen Nucleinsäuresequenzen, die wegen der Degenerierung des genetischen Codes auch die vorgegebene Aminosäuresequenz codieren.
Für die Produktion des Hybridproteins der Erfindung wird die DNA-Sequenz (a) von existierenden Clonen erhalten, wie auch (b). Die DNA-Sequenz, die die gewünschte Sequenz (a) codiert, wird mit der DNA-Sequenz ligiert, die die gewünschte Sequenz (b) codiert. Zwei dieser fusionierten Produkte werden in ein geeignetes Plasmid oder jedes in ein anderes Plasmid inseriert und ligiert. Nach der Bildung wird der Expressionsvektor oder werden die beiden Expressionsvektoren in eine geeignete Wirtszelle eingebracht, die dann den/die Vektor/en exprimiert, um das vorstehend definierte Hybridprotein der Erfindung zu ergeben.
Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung des Hybrids der Erfindung ist mittels der PCR-Technologie unter Verwendung von Oligonucleotiden, die für die gewünschten Sequenzen spezifisch sind, die von den die Sequenzen (a) und (b) codierenden Clonen kopiert werden sollen.
Die Expression aller rekombinanter Proteine der Erfindung, wie sie hier erwähnt werden, kann unter Verwendung der geeigneten Expressionsvektoren in eukaryontischen (z.B. Hefen, Insekten- oder Säugerzellen) oder prokaryontischen Zellen durchgeführt werden. Es können alle im Stand der Technik bekannten Verfahren verwendet werden.
Zum Beispiel werden die DNA-Moleküle, die die Proteine codieren, die nach einem der vorstehenden Verfahren erhalten wurden, mittels Verfahren, die im Stand der Technik (vgl. Sambrook et al, 1989) gut bekannt sind, in in geeigneter Weise konstruierte Expressionsvektoren inseriert. Doppelsträngige cDNA wird mittels Ankoppeln von Homopolymerschwänzen oder durch Restriktionsverknüpfung unter Verwendung von synthetischen DNA-Linkern oder Ligierungsverfahren mit stumpfen Enden mit Plasmidvektoren verknüpft: DNA-Ligasen werden verwendet, um die DNA-Moleküle zu ligieren und eine unerwünschte Verknüpfung wird durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase verhindert.
Um zur Expression des gewünschten Proteins in der Lage zu sein, sollte ein Expressionsvektor auch spezifische Nucleotidsequenzen enthalten, die transkriptionale und translationale regulatorische Information enthalten und die auf eine Weise mit der das gewünschte Protein codierenden DNA verknüpft sind, daß sie die Genexpression und die Produktion des Proteins erlauben. Zunächst muß zur Transkription des Gens diesem ein Promotor vorausgehen, der von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann und an den die Polymerase bindet und somit den Transkriptionsprozeß einleitet. Es gibt eine Reihe von solchen Promotoren in Verwendung, die mit verschiedener Effizienz arbeiten (starke und schwache Promotoren).
Bei eukaryontischen Wirten können in Abhängigkeit von der Natur des Wirts verschiedene transkriptionale und translationale regulatorische Sequenzen verwendet werden. Sie können aus viralen Quellen bei denen die regulatorischen Signale mit einem speziellen Gen assoziiert sind, das ein hohes Expressionsniveau hat. Beispiele sind der TK-Promotor des Herpesvirus, der frühe Promotor von SV40, der Promotor des ga14-Gens von Hefe, usw. Regulatorische Signale der Transkriptionsinitiation können so ausgewählt werden, daß sie die Repression und Aktivierung zulassen, so daß die Expression der Gene moduliert werden kann.
Das DNA-Molekül, das die Nucleotidsequenz umfaßt, die das Hybridprotein der Erfindung codiert, wird in einen Vektor/Vektoren inseriert, der/die die transkriptionalen und translationalen regulatorischen Signale funktionell verknüpft hat/haben und der/die in der Lage ist sind, die gewünschten Gensequenzen in der Wirtszelle zu integrieren. Die Zellen, die durch die eingebrachte DNA stabil transformiert wurden, können durch gleichzeitige Einbringung von einem oder mehreren Markern selektiert werden, die die Selektion von Wirtszellen erlauben, die den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann auch einem auxotrophen Wirt Prototrophie bereitstellen, Biozidresistenz, z.B. Antibiotika oder Schwermetalle wie Kupfer, oder dergleichen. Der selektierbare Marker kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gensequenzen verknüpft sein oder durch co-Transfektion in dieselbe Zelle eingebracht werden. Es können auch zusätzliche Elemente für die optimale Synthese der Proteine der Erfindung erforderlich sein.
Faktoren von Bedeutung bei der Selektion eines speziellen Plasmids oder viralen Vektors umfassen: die Leichtigkeit, mit der Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und von den Empfängerzellen selektiert werden können, die den Vektor nicht enthalten; die Anzahl an Kopien des Vektors, die in einem speziellen Wirt erwünscht sind; und ob es erwünscht ist, in der Lage zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Arten "pendeln" zu lassen.
Nachdem der/die Vektor(en) oder die DNA-Sequenz, die das/die Konstrukt(e) enthält/enthalten, für die Expression hergestellt wurde(n), kann können das/die DNA-Konstrukt(e) mittels einer Vielzahl von geeigneten Verfahren in eine geeignete Wirtszelle eingebracht werden: Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion, usw.
Die Wirtszellen können entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bevorzugt sind eukaryontische Wirte, z.B. Säugerzellen wie Zellen des Menschen, Affen, der Maus und Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), weil sie post-translationale Modifikationen der Proteinmoleküle bereitstellen, einschließlich der korrekten Faltung oder der Glycosylierung an den korrekten Stellen. Auch Hefezellen können post-translationale Peoptidmodifikationen einschließlich der Glycosylierung durchführen. Es existiert eine Reihe von rekombinanten DNA-Strategien, die starke Promotorsequenzen und hohe Kopienzahlen an Plasmiden verwenden, die für die Produktion der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt die Leader-Sequenzen bei clonierten Säugergenprodukten und sezerniert Peptide, die Leader-Sequenzen enthalten (z.B. prä-Peptide).
Nach der Einbringung des Vektors/der Vektoren werden die Wirtszellen in einem selektiven Medium gezüchtet, das auf das Wachstum der den Vektor enthaltenden Zellen selektiert. Die Expression der clonierten Gensequenz(en) resultiert in der Produktion der gewünschten Proteine.
Die Reinigung der rekombinanten Proteine wird mittels jedes Verfahren durchgeführt, die für diesen Zweck bekannt sind, z.B. herkömmliche Verfahren einschließlich Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese oder dergleichen. Ein weiteres Reinigungsverfahren, das bevorzugt für die Reinigung des Proteins der Erfindung verwendet werden kann, ist die Affinitätschromatographie unter Verwendung von monoclonalen Antikörpern, die das Zielprotein binden und die produziert und auf einer Gehnatrix immobilisiert werden, die in einer Säule enthalten ist. Unreine Herstellungen, die das rekombinante Protein enthalten, werden durch die Säule gegeben. Das Protein wird durch den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden, während die Verunreinigungen durchlaufen werden. Nach dem Waschen wird das Protein durch eine Veränderung des pH-Werts oder der Ionenstärke von dem Gel eluiert.
Der Ausdruck "Hybridprotein" oder hybrides Protein, wie er hier verwendet wird, betrifft im Allgemeinen ein Protein, das ein oder zwei verschiedene Proteine oder Fragmente davon enthält.
"Fusionsprotein", wie hier verwendet, betrifft ein Hybridprotein, das aus zwei oder mehreren Proteinen oder Fragmenten davon besteht, die kovalent miteinander verbunden sind.
Der Ausdruck "Aggregation", wie er hier verwendet wird, bedeutet die Bildung einer starken, spezifischen, nicht kovalenten Wechselwirkung zwischen zwei Polypeptidketten, die einen Komplex bilden, so wie diejenige, die zwischen der α- und der β-Untereinheit eines heterodimeren Hormons besteht (wie FSH, LH, hCG oder TSH).
Der Ausdruck "Ligand" oder "Ligandenprotein", wie er hier verwendet wird, betrifft ein anderes Molekül als einen Antikörper oder ein Immunglobulin, das in der Lage ist, durch die Liganden bindende Domäne eines Rezeptors gebunden zu werden; ein solches Molekül kann in der Natur vorkommen oder es kann chemisch modifiziert oder chemisch synthetisiert werden.
Der Ausdruck "Liganden bindende Domäne", wie er hier verwendet wird, betrifft einen Teil des Rezeptors, der in die Bindung eines Liganden involviert ist und der im Allgemeinen ein Teil der oder im Wesentlichen die gesamte extrazelluläre Domäne ist.
Der Ausdruck "Rezeptor", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Membranprotein, dessen Bindung mit dem entsprechenden Liganden eine sekundäre zelluläre Antwort anstößt, die in der Aktivierung oder Inhibierung eines intrazellulären Prozesses resultiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung des hybriden Proteins als Arzneimittel bereit. Das Arzneimittel wird bevorzugt in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung angeboten, die das Protein der Erfindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder Excipienten umfaßt. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen stellen noch einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die Erfindung wird unter Bezug auf die beigefügten Abbildungen besser verstanden werden, wobei:
1(a) und 1(b) zeigen die TBP(20-161)-hCGα- bzw. TBP(20-161)-hCGβ-Konstrukte und die entsprechenden Sequenzen (SEQ ID NOS:1-4).
2(a) und 2(b) zeigen die TBP(20-190)-hCGα- bzw. TBP(20-190)-hCGβ-Konstrukte und die entsprechenden Sequenzen (SEQ ID NOS:S-8).
3 ist eine Graphik, die die dosisabhängige Schutzwirkung von CHO-Zellen exprimiertem TBP-hCG(20-190) vor der von TNFα induzierten Cytotoxizität bei BT-20-Zellen und verschiedene Kontrollen zeigt.
4 ist eine Graphik, die die dosisabhängige Schutzwirkung von COS-Zellen exprimiertem TBP-hCG(20-190) vor der von TNFα induzierten Cytotoxizität bei BT-20-Zellen und verschiedene Kontrollen zeigt.
5 ist eine Graphik, die die dosisabhängige Schutzwirkung von Affinitätsgereinigtem, von CHO-Zellen exprimiertem TBP-hCG(20-161) vor der von TNFα induzierten Cytotoxizität bei BT-20-Zellen und verschiedene Kontrollen zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Erfindung wird nun mittels der folgenden Beispiele beschrieben, die nicht in irgendeiner Weise als einschränkend betrachtet werden sollten.
BEISPIELE
Materialien und Methoden
Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, erhalten, außer es ist anders angegeben. Die CHO-DUKX-Zelllinie wurde von L. Chasin an der Columbia University durch D. Houseman am MIT (39) erhalten. Die CHO-DUKX-Zellen, denen ein funktionelles Gen für die Dihydrofolatreduktase fehlt, wurden routinemäßig in komplettem α-plus Modifizerten Eagle-Medium (α(+)MEM) gehalten, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war. Die COS-7-Zellen wurden routinemäßig in Dulbecco Modifizierten Eagle-Medium (DMEM) gehalten, das mit 10% FBS ergänzt war. Außer anders angeben, wurden die Zellen aufgeteilt, um sie in der log-Wachstumsphase zu halten und die Kulturreagentien wurden von GIBCO erhalten (Grand Island, New York).
1. Zusammenbau von genetischen Konstrukten, die die hybriden Proteine codieren
Die Nummerierungszuordnungen für den p55-TNF-Rezeptor beruhen auf der Clonierungsveröffentlichung von Wallach (40), während die Nummerierungszuordnungen für die hCG-Untereinheiten auf den Nummerierungszuordnungen der Clonierungsveröffentlichungen von Fiddes (41,42) beruhen. Die Bezeichnung TBP oder TNF bindendes Protein betrifft die Teile der extrazellulären Domäne des TNF-Rezeptors, die in der Lage sind, TNF zu binden. Bei diesen Beispielen werden die DNA-Konstrukte als TBP-hybride Proteine bezeichnet, mit dem Partner und dem Bereich von TBP, die in der Nomenklatur des Konstrukts angegeben sind. Alle TBP-hCG-Konstrukte enthalten das Signalpeptid von menschlichem Wachstumshormon (hGH) anstelle der nativen p55-Signalsequenz. Zusätzlich wurde das hGH-Signalpeptid so platziert, daß es dem Rest Asp20 von TBP unmittelbar vorausgeht, von dem man annimmt, daß dies damit der erste Rest in dem reifen, sezernierten Protein wird. Diese Modifikationen sind nicht essentiell für das grundlegende Konzept der Verwendung von hCG als Partner des hybriden Proteins.
Die DNAs, die die hybriden Proteine codieren, wurden unter Verwendung des PCR-Verfahrens (43) konstruiert.
a. TBP 1 (20-161)-hCG
Das anfängliche TBP-hCG-Konstrukt wurde so konstruiert, daß es die Ligandenbindungsdomäne aus der extrazellulären Region des p55-TNF-Rezeptors (von Asp20 bis einschließlich Rest Cys161) enthielt, durch einen kurzen Linker fusioniert mit den hCG α- und hCG β-Untereinheiten (beginnend mit Rest αCys7 bzw. βPro7). Dieses Konstrukt, im weiteren als TBP1(20-161)-hCG bezeichnet, ist ein Heterodimer aus zwei modifizierten hCG-Untereinheiten, TBP1(20-161)-hCGα und TBP1(20-161)-hCGβ.
Die Oligodesoxynucleotidprimer, die für das TBP1(20-161)-hCGα verwendet wurden, waren:
Primer 1(αβ) TTT TTT CGA GAT GGC TAC AGG TAA GCG CCG (SEQ ID NO:11)
Primer 2 (α) ACC TGG GGC AGC ACC GGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC (SEQ ID NO:12)
Primer 3 (α) TGT GCC GGT GCT GCC CCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG (SEQ ID NO:13)
Primer4 (α) TTT TGG ATC CTT AAG ATT TGT GAT AAT AAC AAG TAC (SEQ ID NO:14)
Diese und alle anderen Primer, die in den Beispielen beschrieben sind, wurden mit einem DNA-Synthesegerät Applied Biosystems Modell 392 (ABI, Foster City, California) unter Verwendung der Phosphoamidit-Chemie synthetisiert.
Da beide der TBP-hCG-Untereinheitskonstrukte dasselbe 5'-Ende haben (d.h. das 5q'-Ende des hGH/TBP-Konstrukts) wurde der Primer 1 (αβ) für beide TBP-hCG-Untereinheitskonstrukte verwendet. Die anderen Primer, die für das TBP 1(20-161)-hCGβ-Konstrukt verwendet wurden, waren:
Primer 2(β) CCG TGG ACC AGC ACC AGC ACA GGA GAC ACA CTC GTT TTC (SEQ ID NO:15) TGT GCT GGT GCT GGT CCA CGG TGC CGC
Primer 3(β) CCC ATC AAT (SEQ ID NO:16)
Primer 4(β) TTT TGG ATC CTT ATT GTG GGA GGA TCG GGG TG (SEQ ID NO:17)
Die Primer 2 (α) und 3 (α) sind umgekehrt komplementär und decken beide das 3'-Ende der codierenden Region für die extrazelluläre Domäne von p55 und das 5'-Ende der hCG-α-Untereinheit ab. In ähnlicher Weise sind auch die Primer 2 (β) und 3 (β) umgekehrt komplementär und decken beide das 3'-Ende der codierenden Region für die extrazelluläre Domäne von p55 und das 5'-Ende der hCG-β-Untereinheit ab.
Es wurden für jedes der beiden TBP-hCG-Untereinheitskonstrukte zwei PCR-Reaktionen durchgeführt. Die zuerst verwendeten Primer waren 1 (αβ) und 2 (α oder β) und verwendeten als Matrize ein Plasmid, das die löslichen p55-Reste 20-180 codierte, denen das hGH-Signalpeptid vorausging (Plasmid pCMVhGHspcDNA.pA4). Die als zweites verwendeten Primer waren 3 (α oder β) und 4(α oder β) und verwendeten als Matrize entweder das Plasmid pSVL-hCGα oder pSVL-hCGβ (44). Die PCR wurde unter Verwendung von Vent (TM)-Polymerase von New England Biolabs (Beverly, Massachusetts) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, wobei für jede Reaktion 25 Cyclen und die folgenden Bedingungen verwendet wurden:
100 μg Matrizen-DNA
1 μg von jedem Primer
2U Vent (TM)-Polymerase (New England Biolabs)
30 Sekunden Denaturierung bei 99°C
Anlagerung: 30 Sekunden bei 59°C für die Primer 1 (αβ) und 2 (α)
30 Sekunden bei 59°C für die Primer 3 (α) und 4 (α)
30 Sekunden bei 57°C für die Primer 1 (αβ) und 2 (β)
30 Sekunden bei 63°C für die Primer 3 (β) und 4 (β)
75 Sekunden Verlängerung bei 75°C.
Bei den PCR-Produkten wurde mittels Elektrophorese in einem 2%-igen Agarosegel und Färbung mit Ethidiumbromid bestätigt, daß sie von der erwarteten Größe waren. Die Fragmente wurden dann mittels Durchlauf durch eine Wizard-Säule (Promega) gemäß den Empfehlungen des Herstellers der Säule gereinigt.
Die endgültige codierende Sequenz für TBP1(20-161)-hCGα wurde durch Fusions-PCR unter Verwendung von Primer 1 (αβ) und Primer 4 (α) und unter Verwendung des gereinigten Produkts von den p55- und hCG-α-Fragmenten, die durch die ersten PCR-Reaktionen erhalten worden waren, als Matrize zusammengebaut. Zuerst wurden die beiden Matrizen, die wegen der Überlappung zwischen den Primern 2 (α) und 3 (α) denaturiert und aneinandergelagert werden konnten, ohne Zugabe von irgendeinem Primer 10 Zyklen PCR unterworfen. Die Bedingungen für diese Zyklen waren im Wesentlichen dieselben wie die früher verwendeten, außer daß die Aneinanderlagerung bei 67°C und die Verlängerung 2 Minuten durchgeführt wurde. Am Ende dieser 10 Zyklen wurden die Primer 1 (αβ) und 4 (α) zugegeben und es wurden erneut 10 Zyklen durchgeführt. Die Bedingungen für diese letzte Runde an Reaktionen waren im Wesentlichen dieselben wie die früher verwendeten, außer daß eine Aneinanderlagerungtemperatur von 59°C verwendet wurde und die Verlängerung 75 Sekunden durchgeführt wurde.
Die Analyse der Produkte dieser Reaktion mittels Elektrophorese in einem 1%-igen Agarosegel bastätigte, daß das erwartete Fragment von etwa 1100 bp erhalten wurde. Die Reaktion wurde durch eine Wizard-Säule laufen gelassen, um das Fragment zu reinigen, das dann mit XbaI und BaMHI verdaut und dann erneut in einem 0,7%-igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Das gereinigte Fragment wurde in das Plasmid pSVL (Pharmacia) subcloniert, das zuerst mit XbaI und BamHI verdaut und dann in einem 0,8%-igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt worden war. Nach der Ligierung mit T4-Ligase wurde das Gemisch verwendet, um AG1-E. coli zu transformieren, und dann auf LB/Ampicillin-Platten für die Züchtung über Nacht bei 37°C ausplattiert. Die Plasmid-DNA von Ampicillin-resistenten Kolonien wurde durch Verdau mit XhoI und BamHI analysiert, um die Anwesenheit der Insertion zu bestätigen (die bei dem Verdau ausgeschnitten wird). Es wurden sechs Clone gefunden, die Insertionen enthielten, und ein Clon (Clon 7) wurde für die weiteren Arbeiten ausgesucht und als pSVLTBPhCGα (der TBP1(20-161)-hCGα enthielt) bezeichnet. Die Didesoxy-DNA-Sequenzierung (unter Verwendung von Sequenase^TM, U.S.
Biochemicals, Cleveland, Ohio) der Insertion in diesem Vektor bestätigte, daß das Konstrukt korrekt war und daß keine unerwünschten Veränderungen eingetreten waren.
Die endgültige codierende Sequenz für TBP1(20-161)-hCGβ wurde auf eine Weise zusammengebaut, die ähnlich war zu der für TBP1(20-161)-hCGα beschriebenen, unter Verwendung der Fusions-PCR und der Primer 1 (αβ) und Primer 4 (β) und unter Verwendung des gereinigten Produkts von den p55- und hCG-β-Fragmenten, die durch die ersten PCR-Reaktionen erhalten worden waren, als Matrize. Das resultierende pSVL-Plasmid, das die Insertion von Interesse enthielt, wurde als pSVLTBPhCGβ bezeichnet.
b. TBP(20-190)-hCG
Ein zweiter Satz von TBP-hCG-Proteinen wurde durch Modifikation der TBP 1(20-161)-hCG-Konstrukte hergestellt, um ein Analogon zu produzieren, das TBP enthielt, das sich von Asp20 bis Thr190 anstelle der Region 20-161 in dem ursprünglichen Analogon erstreckte. Dies wurde durch Ersatz des Fragments zwischen den BgIII- und XbaI-Stellen in dem Plamid pSVLTBPhCGα durch ein PCR-Fragment erreicht, das die Veränderung enthielt. Das PCR-Fragment wurde unter Verwendung der Fusions-PCR erzeugt. Die Primer waren:
Primer 1 TTT TAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAG (SEQ ID NO:18)
Primer 2 TGT GGT GCC TGA GTC CTC AGT (SEQ ID NO:19)
Primer 3 ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GGC CCA GGT TG (SEQ ID NO: 20)
Primer 4 TTT TTC TAG AGC AGC AGC AGC AGC CCA TG (SEQ ID NO:21)
Die Primer 1 und 2 wurden verwendet, um die Sequenz zu erzeugen, die die zusätzlichen p55-Reste von 161–190 codiert. Die PCR-Reaktion wurde, im Wesentlichen wie früher beschrieben unter Verwendung von 1 μg von jedem Primer und pUC-p55 als Matrize durchgeführt. In ähnlicher Weise wurden die Primer 3 und 4 verwendet, um mittels PCR den Linker zwischen dem 3'-Ende der TBP codierenden Region und dem 5'-Ende der die hCG α-Untereinheit codierenden Region unter Verwendung des Plasmids pSVLTBPhCGα als Matrize herzustellen. Bei den Produkten von diesen PCR-Reaktionen wurde mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese auf einem 8%-igen Gel bestimmt, daß sie die korrekte Größe hatten (etwa 296 bp bzw. 121 bp) und sie werden dann unter Verwendung einer Wizard-Säule gereinigt. Die Konstruktion der Primer 2 und 3 war so, daß sie eine Überlappungsregion enthielten, so daß die zwei PCR-Produkte (von den Primern 1 und 2 und von den Primern 3 und 4) für die Fusions-PCR an die Primer 1 und 4 angelagert werden konnten. Nach der Fusionsreaktion wurde das erwünschte Produkt von etwa 400 by unter Verwendung eines 1,5%-igen Agarosegels und einer Wizard-Säule bestätigt und gereinigt. Diese DNA wurde dann mit Bg1II und XbaI verdaut und mit mit Bg1II/XbaI verdautem pSVLTBPhCGα ligiert. Die Anwesenheit einer Insertion in den Plasmiden, die von transformiertem AG1-E. coli isoliert wurden, wurde durch Verdau mit Bg1II und XbaI bestätigt. Das neue Konstrukt wurde als pSVLTBP(20-190)-hCGα bezeichnet.
In ähnlicher Weise wurde das Plasmid pSVLTBPhCGβ durch Substitution des Bg1II-XcmI-Fragments modifiziert. Dies wurde jedoch durch Subclonierung eines einzelnen PCR-Produktes anstatt mit einem Fusions-PCR-Produkt durchgeführt. Die Primer 1 und 2b (siehe nachstehend) wurde mit pUC-55 als Matrize verwendet.
Primer 2b TTT TCT ACA GCC AGG GTG GCA TTG ATG GGG CGG CAC CGT GGA CCA GCA CCA GCT GTG GTG CCT GAG TCC TCA GTG (SEQ ID NO:22)
Das resultierende PCR-Produkt (etwa 337 bp) wurde, wie vorstehend beschrieben, bestätigt und gereinigt, mit Bg1II und XcmI verdaut und dann mit mit Bg1II/XbaI verdautem pSVLTBPhCGβ ligiert. Die Anwesenheit einer Insertion in den Plasmiden, die von transformiertem AG1-E. coli isoliert wurden, wurde durch Verdau mit Bg1II und XcmI bestätigt. Das neue Konstrukt wurde als pSVLTBP(20-190)-hCGβ bezeichnet.
Die neuen Konstrukte wurden anschließend durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Zusätzlich zur Produktion dieser neuen Plasmide auf Basis von pSVL wurden diese Konstrukte auch in andere Expressionsvektoren subcloniert, die wahrscheinlich für eine stabile Expression in CHO geeigneter sind, insbesondere der Vektor Da, der zuvor als Plasmid CLH3AXSV2DHFR (45) beschrieben wurde. Dies wurde durch Umwandlung einer BamHI-Stelle, die die Insertionen in den Vektoren auf Basis von pSVL flankierte, in eine XhoI-Stelle erreicht, gefolgt von dem Ausschneiden der Insertion mit XhoI und Clonierung in Da, das mit XhoI verdaut worden war.
2. Transiente und stabile Expression der hybriden Proteine
Die Transfektion von COS-7-Zellen (ATCC CRL 1651, Ref. 46) für die transiente Expression der hybriden TBP-hCG-Proteine wurde unter Verwendung der Elektroporation durchgeführt (47). Exponentiell wachsende COS-7-Zellen wurden mittels Trypsinisierung entfernt, durch sanftes Zentrifugieren (4 Minuten mit 800 U/Min.) gesammelt, mit kalter, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH-Wert 7,3–7,4, gewaschen und dann erneut zu einem Pellet zentrifugiert. Die Zellen wurden mit einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen pro 400 μl kaltem PBS resuspendiert und mit 10 μg Plasmid-DNA in einer vorgekühlten Elektroporationsküvette mit 2 mm Weite gemischt. Für die Cotransfektion wurden 5 μg von jedem Plasmid verwendet. Die Küvetten und Zellen wurden weitere 10 Minuten auf Eis gekühlt und dann unter Verwendung des Instruments BTX Modell 600 und den Bedingungen von 125 V, 950 μF und R = 8 der Elektroporation unterworfen. Danach wurden die Zellen zum Kühlen 10 Minuten auf Eis gestellt, bei Raumtemperatur in konische Röhrchen von 15 ml übertragen, die 9,5 ml vollständiges Medium (Dulbecco modifizierts Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % L-Glutamin) enthielten, und 5 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Nach vorsichtigem Mischen in den Röhrchen von 15 ml wurde der gesamte Inhalt auf zwei P100-Platten ausgesät und bei 37°C, 5 % CO₂ in einen Inkubator platziert. Nach 18 Stunden wurde das Medium gewechselt und in einigen Fällen enthielt das neue Medium nur 1 % oder 0 % FBS. Nach weiteren 72 Stunden wurde das konditionierte Medium geerntet, zum Entfernen der Zellen zentrifugiert und dann bei – 70°C gefroren aufbewahrt.
Die Transfektion von CHO-DLTKX (CHO)-Zellen für die transiente oder stabile Expression wurde unter Verwendung der Calciumphosphatfällung von DNA durchgeführt. 24 Stunden vor der Transfektion wurden exponentiell wachsende CHO-Zellen auf Kulturplatten von 100 mm mit einer Dichte von 7,5 × 10⁵ Zellen pro Platte ausplattiert. Am Tag der Transfektion wurden 10 μg Plasmid-DNA in 0,5 ml Transfektionspuffer (vgl. nachstehend) gebracht, 31 μl 2 M CaCl₂ wurden zugegeben, die DNA-CaCl₂-Lösung wurde mit einem Vortex-Mischer gemischt und 45 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde das Medium von den Platten abgesaugt, die DNA wurde unter Verwendung einer sterilen Plastikpipette zu den Zellen zugegeben und die Zellen wurden 20 Minuten bei Raumtemperatur gelassen. Am Ende dieses Zeitraums wurden 5 ml komplettes α(+)MEM, das 10 % FBS enthielt, zu den Platten zugegeben, die 4–6 Stunden bei 37°C inkubiert wurden. Das Medium wurde dann von den Platten abgesaugt und die Zellen wurden einem Glycerinschock ausgesetzt, indem sie 3,5 Minuten bei 37°C mit einer Lösung von 15 % Glycerin in Transfektionspuffer inkubiert wurden. Nach dem Entfernen der Glycerinlösung wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, noch einmal mit 10 ml komplettem α(+)MEM, 10 % FBS gefüttert und bei 37°C in den Inkubator zurückgebracht. Für die stabilen Transfektionen wurden die Zellen nach 48 Stunden 1:10 aufgeteilt und mit Selektionsmedium gefüttert (komplettes α-minus MEM (ohne Nucleoside), 10 % dialysiertes FBS und 0,02 μM Methotrexat). Nicht transfizierte (nicht resistente) Zellen wurden typischerweise in 3–4 Wochen eliminiert, übrig blieben Populationen von transfizierten, Methotrexat-resistenten Zellen.
3. Quantifizierung der Expression
Die Sekretion der hybriden Proteine durch die transfizierten Zellen wurde unter Verwendung eines kommerziellen Testkits für lösliches p55 (R&D Systems; Minneapolis, Minnesota) gemäß den Anweisungen des Herstellers festgestellt. Dieser Test stellt auch eine Abschätzung der Niveaus an hybridem Protein in konditionierten und bearbeiteten Medien bereit, was als Basis für die Selektion der Dosen diente, die bei dem Biotets verwendet werden sollten.
4. Feststellung der Bildung von Heterodimer
Um die Fähigkeit der TBP-hCG-Untereinheitfusionen zur Kombination und Heterodimerbildung festzustellen, wurde ein Sandwich-Immuntest unter Verwendung von Antikörper gegen die hCG-Untereinheiten durchgeführt. Bei diesem Test wird eine Mikrotiterplatte mit einem monoclonalen Antikörper gegen die hCG β-Untereinheit beschichtet und zum Festhalten des Analyten verwendet. Der primäre Nachweisantikörper ist ein polyclonaler der Ziege, der gegen die menschliche TSH α-Untereinheit (#082422G – Biodesign International; Kennenbunkport, Maine) erzeugt wurde, der wiederum unter Verwendung eines mit Meerrettichperoxidase konjugiertem polyclonalem Kaninchen-anti-Ziege-Antikörpers (Cappel; Durham, North Carolina) nachgewiesen wurde.
Es wurden mehrere verschiedene anti-hCG β-Untereinheit-Antikörper bei dieser Arbeit verwendet, von denen alle keine nachweisbare Kreuzreaktivität mit der freien α-Untereinheit zeigten. Einer dieser Antikörper (3/6) wird bei dem kommerziell verfügbaren MAIAclon hCG-Testkit (Biodata; Rom, Italien) verwendet.
Mikrotiterplatten mit hoher Proteinbindung (Costar #3590) wurden durch Inkubation (2 Stunden bei 37°C) mit 100 μl/Mulde einer Lösung von 5 μg/ml Antikörper in Beschichtungspuffer (PBS, pH-Wert 7,4, 0,1 mM Ca⁺⁺, 0,1 mM Mg⁺⁺) mit dem Einfangantikörper beschichtet. Nach einmal Waschen mit Waschlösung (PBS, pH-Wert 7,4 + 0,1 % Tween 20) wird die Platte durch vollständiges Füllen der Mulden (≈400 μl/Mulde) mit Blockierungslösung (3 % Rinderserumalbumin (BSA; Fraktion V – A4503 Sigma) in PBS, pH-Wert 7,4) und eine Stunde Inkubation bei 37°C oder über Nacht bei 4°C blockiert. Die Platte wird dann zweimal mit Waschlösung gewaschen und die Referenz- und Experimentproben, mit Verdünnungsmittel (5 mg/ml BSA in PBS, pH-Wert 7,4) so verdünnt, daß sie ein Volumen von 100 μl ergeben, werden zugegeben. Nach zwei Stunden Inkubation der Proben und der Platte bei 37°C wird die Platte erneut zweimal mit Waschlösung gewaschen. Der primäre Nachweisantikörper, 1:5000 mit Verdünnungsmittel verdünnt, wird zugegeben (100 μl/Mulde) und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Der sekundäre Nachweisantikörper (mit HRP konjugiertes Kaninchen-anti-Ziege-Ig), 1:5000 mit Verdünnungsmittel verdünnt, wird zugegeben (100 μl/Mulde) und nach einer Stunde Inkubation bei 37°C wird die Platte dreimal mit Waschlösung gewaschen. 100 μl an TMB-Substratlösung (Kirkegaard and Perry Laboratories) werden zugegeben, die Platte wird 20 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und dann wird die enzymatische Reaktion durch Zugabe von 50 μl/Mulde 0,3 M H₂SO₄ gestoppt. Die Platte wird dann unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesegeräts analysiert, das auf eine Wellenlänge von 450 nm eingestellt ist.
5. Partielle Reinigung
Um die Aktivitäten dieser hybriden Proteine besser zu quantifizieren, wurden die hybriden TBP-hCG-Proteine mit der Immunaffinitäts-Chromatographie partiell gereinigt. Der verwendete Antikörper war ein monoclonaler, der kommerziell bei R&D Systems (MAB #225) verfügbar war. Die Säule war eine mit CNBr aktivierte Sepharose, die gemäß den Vorschriften des Herstellers (Pharmacia) mit dem Antikörper beladen war.
Konditioniertes Medium wurde von konfluenten T-175-Flaschen von jeder Linie gesammelt, wobei täglich 50 ml SFMII-Medien (GIBCO) geerntet wurden, mit 5 Ernten für jede Linie. Die Sammlungen wurden der Zentrifugation (1000 U/Min.) unterworfen, um Zellbruchstücke zu entfernen. Das Material wurde dann unter Verwendung des kommerziellen Immuntests auf seinen TBP-Gehalt getestet und konzentriert (Centricon-Einheiten von Amicon; Beverly, Massachusetts), so daß die scheinbare TBP-Konzentration etwa 50 ng/ml war.
Zehn ml an konzentriertem TBP-hCG (Probe #18873) wurden durch Zugabe von NaCl und Einstellen der Lösung auf eine Leitfähigkeit von ungefähr 85 mS/cm auf etwa 1 M NaCl gebracht. Diese wurde durch eine anti-TBP-Immunaffinitätssäule von 0,5 ml gegeben. Der Durchfluß wurde gesammelt und ein zweites Mal durch die Säule laufen gelassen. Danach wurde die Säule mit 1 M NaCl in PBS gewaschen. Das gebundene TBP(20-161)-hCG wurde nach der Elution mit 50 mM Zitronensäure (pH-Wert 2,5) gesammelt. Das Eluat (etwa 7 ml) wurde durch Filtration unter Verwendung von Amicon Centricon 10's gemäß den Vorschriften des Herstellers (Amicon) auf ein Volumen von etwa 200 μl konzentriert. Es wurden etwa 800 μl PBS zugegeben, um das Probenvolumen auf 1 ml zu bringen, was bis zum Biotest bei 4°C aufbewahrt wurde.
6. Bewertung der anti-TNF-Aktivität
Es wurden zahlreiche, durch TNF-induzierte in vitro-Cytotoxizitätstests für die Bewertung von Analoga von löslichen TNF-Rezeptoren beschrieben. Wir verwendeten einen Test, der eine menschliche Brustkrebszelllinie verwendete, B7-20-Zellen (ATCC HTB 19). Die Verwendung dieser Zellen als Basis für einen TNF-Biotest wurde zuvor beschrieben (48). Diese Zellen wurden bei 37°C in RPMI 1640-Medium gezüchtet, das mit 10 %h hitzeinaktiviertem FBS ergänzt war. Die Zellen wurden bis maximal 80–90 % Konfluenz gezüchtet, was alle 3–4 Tage eine Aufteilung mit einer Saatdichte von etwa 3 × 10⁶ Zellen pro T175cm²-Kolben zur Folge hatte.
Der BT-20-Test verwendet den Einschluß eines Zellfarbstoffs, Kristallviolett, als Nachweisverfahren zur Bewertung des Überlebens von Zellen nach der Behandlung mit TNF. Tote Zellen sind nicht in der Lage, den Farbstoff aufzunehmen und zu behalten.
Kurz gesagt ist das Protokoll, das für den Test der anti-TNF-Aktivität verwendet wurde, wie folgt. Rekombinanter menschlicher TNFα (R&D-Systems) und die experimentellen Proben werden zu Bestandteilen von Medium (RPMI 1640 mit 5% hitzeinaktiviertem FBS) gemacht und zu den Mulden einer Kulturplatte mit 96 Mulden zugegeben. Die Zellen werden dann mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/Mulde in diese Mulden ausplattiert. Die Menge an zugegebenem TNFα wurde zuvor mit Titrationsuntersuchungen bestimmt und stellt eine Menge dar, bei der etwa 50 % der Zellen abgetötet werden.
Nach der Zugabe der Proben wurden die Zellen 48 Stunden bei 39°C gezüchtet, wonach der Anteil der lebenden Zellen unter Verwendung der Kristallviolettfärbung und eines Mikrotiterplatterilesegeräts (570 nm) bestimmt wurde
ERGEBNISSE
1. Konstrukte in der Untersuchung
Der Aufbau der untersuchten hybriden Proteine ist nachstehend kurz zusammengefaßt; zwei Kontrollproteine, ein monomeres lösliches p55 (r-hTBP-1) und ein dimeres TBP-Immunglobulinfusionsprotein (TBP-IgG3) (hergestellt wie im Wesentlichen in (10) beschrieben) wurden zu Vergleichszwecken untersucht.
Die Sequenzen der DNAs, die TBP(20-190)-hCG und TBP(20-161)-hCG codieren, werden in den 1 bzw. 2 bereitgestellt.
2. Sekretion der TBP-hCG-Proteine
Bei allen getesteten Konstrukten wurde gefunden, daß sie von transfizierten Säugerzellen produziert und in das Kulturmedium sezerniert wurden. Die Daten, die das zeigen, sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
3. TBP-hCG(α/β)-Fusionsproteine setzen sich zu Heterodimeren zusammen
Die Kombination von TBP-hCGα und TBP-hCGβ wurde unter Verwendung des Sandwich-Tests für das hCG-Heterodimer bestätigt. Nur die kombinierte Transfektion der α- und β-Untereinheitsfusionen resultierte im Nachweis von Heterodimer (Tabelle 3).
4. Hybride Proteine TBP-hCG zeigen eine erhöhte Aktivität gegenüber dem TBP-Monomer
Es wurde gefiunden, daß hybride Proteine, die entweder in COS-7- oder CHO-Zellen produziert wurden, potente Inhibitoren von TNFα in dem BT-20-Biotest sind. Einige der getesteten Proben sind in Tabelle 4 zusammengestellt.
Für die 1 × Medium-Proben wurden die negativen Kontrollen (konditionierte Medien von Scheintransfektionen) eingeschlossen.
Wie in den 3–5 (Punkte auf der y-Achse) gezeigt, resultiert die Zugabe von TNF (2,5 ng/ml) in einer eindeutigen Reduktion der Zahl lebenden Zellen (bestimmt durch die OD 570). In jedem Fall haben die aktiven Proben als maximale Schutzwirkung die Wiederherstellung der Lebensfähigkeit der Zellen zu dem Niveau, das bei Abwesenheit von zugegebenem TNF zu sehen war (d.h. die Kontrolle mit der Bezeichnung „Zellen allein").
Die positiven Kontrollen r-hTBP-1 und TBP-IgG3 sind beide schützend und zeigen eine klare Dosisabhängigkeit und ED50-Werte von etwa 100 ng/ml für r-hTBP-1 (3–5) bzw. etwa 1,5 ng/ml für TBP-IgG3 (3).
Die TBP-hCG-Konstrukte von dem 1 × Medium (CHO oder COS) oder von der Immunreinigung zeigen einen dosisabhängigen Schutz mit einer ungefähren ED50, die von 2–11 ng/ml reicht (3-5).
Die Ergebnisse von den in vitro-Biotests sind in der Tabelle 5 dargestellt. Die Daten zeigen, daß die hybriden Proteine die Cytotoxizität von TNF inhibieren und daß sie wesentlich potenter sind als das TBP-Monomer. Die negativen Kontrollen zeigen keine Schutzwirkung.
Zusätzlich zu der Möglichkeit, daß die Dimerisierung von TBP die Wirksamkeit erhöht, ist es auch möglich, daß die Aktivität der hybriden Proteine nicht in Bezug zur Dimer-Wechselwirkung mit TBP steht, sondern eher zur sterischen Inhibierung wegen des Partners in dem Hybrid, der mit der Bindung von löslichem TBP/TNF an TNF-Rezeptoren an der Zelloberfläche interferiert.
Die Bezugnahme auf bekannte Verfahrensschritte, herkömmliche Verfahrensschritte, bekannte Verfahren oder herkömmliche Verfahren ist in keinster Weise ein Eingeständnis, daß irgendein Aspekt, irgendeine Beschreibung oder Ausführungsform der vorliegenden Erfindung im Stand der Technik offenbart, gelehrt oder nahegelegt wird.
Die vorstehende Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen wird so vollständig die allgemeine Natur der Erfindung offenbaren, daß andere durch Anwendung des Wissens des Stands der Technik (einschließlich des Inhalts der hier zitierten Referenzen) solche spezifischen Ausführungsformen einfach modifizieren und/oder an verschiedene Anwendungen anpassen können, ohne unangemessene Versuche, ohne das allgemeine Konzept der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Daher wird beabsichtigt, daß solche Adaptionen und Modifikationen innerhalb der Bedeutung oder des Bereichs von Äquivalenten der offenbarten Ausführungsformen liegen und auf den hier offenbarten Lehren und Anweisungen beruhen. Es ist so zu verstehen, daß die Ausdrucksweise oder Terminologie hier zum Zwecke der Beschreibung und nicht der Einschränkung ist, so daß die Terminologie oder Ausdrucksweise der vorliegenden Beschreibung durch einen Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet angesichts der hier präsentierten Lehren und Anweisungen in Kombination mit dem Wissen des Durchschnittsfachmanns auf dem Fachgebiet interpretiert werden sollte.
Tabellen
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48 Yen, J. et al., J. Immunotherapy 10:174–181, 1991.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Hybridprotein, das zwei co-exprimierte, ein Dimer bildende Aminosäuresequenzen umfasst, die jeweils umfassen: (a) mindestens eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem homomeren Rezeptor, einer Kette eines heteromeren Rezeptors und Fragmenten davon, die ihre Liganden-Rezeptor-Bindungsfähigkeit beibehalten, und (b) eine Untereinheit eines heterodimeren Proteinhormons, oder Fragmenten davon, die die Fähigkeit der Untereinheit behalten ein Heterodimer mit anderen Untereinheiten davon zu bilden; wobei die Sequenzen (a) und (b) direkt oder über einen Peptidlinker verbunden sind, und in denen Sequenz (b) in jeder der zwei co-exprimierten Sequenzen unter Bildung eines dimeren Komplexes aggregieren kann.
Hybridprotein nach Anspruch 1, wobei die Sequenz (a) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus TBP1, TBP2 oder Fragmenten davon, die noch die Liganden-Bindungsdomäne enthalten; der extrazellulären Domäne des IFNα/β-Rezeptors oder des IFNγ Rezeptors; oder einem Gonadotropinrezeptor oder extrazelluläre Fragmente davon.
Hybridprotein nach Anspruch 1, wobei die Sequenz (b) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Untereinheiten von hCG, FSH, LH, TSH oder Inhibin und Fragmenten davon.
Hybridprotein nach Anspruch 3, wobei die Sequenz (b) hCG ist und hCG mutagenisiert wurde um dessen biologische Aktivität auszuschalten.
Hybridprotein nach Anspruch 1, wobei die Sequenz (a) mit dem Amino-Terminus, dem Carboxy-Terminus oder beiden Termini der Sequenz (b) verbunden ist.
Hybridprotein nach Anspruch 1, wobei das Hybridprotein ein monofunktionales, bifunktionales oder multifunktionales Molekül ist.
Hybridprotein nach Anspruch 1, wobei die zwei co-exprimierten Aminosäuresequenzen jeweils die Sequenz für TBP1 oder einem Fragment davon, das den Aminosäureresten 20-161 oder 20-190 von TBP1 entspricht, als Sequenz (a) und die entsprechenden α- und β-Untereinheiten von hCG oder Fragmenten davon als Sequenz (b) einschließen.
Hybridprotein nach Anspruch 7, wobei das Protein SEQ ID Nr. 2 und 4, oder SEQ ID Nr. 6 und 8 umfasst.
Hybridprotein nach Anspruch 1, wobei die beiden co-exprimierten Aminosäuresequenzen jeweils die extrazelluläre Domäne eines Gonadotropinrezeptors als Sequenz (a) und die entsprechenden α- und β-Untereinheiten eines Gonadotropins als Sequenz (b) einschließen.
Hybridprotein nach Anspruch 9, wobei die Sequenz (a) die extrazelluläre Domäne des FSH-Rezeptors und die Sequenz (b) eine Untereinheit von FSH ist.
Hybridprotein nach Anspruch 9, wobei die Sequenzen (a) und (b) mit einem Peptidlinker verbunden sind.
Hybridprotein nach Anspruch 11, wobei der Peptidlinker eine Enzymspaltungsstelle aufweist.
Hybridprotein nach Anspruch 12, wobei die Enzymspaltungsstelle eine Thrombinspaltungsstelle ist.
Hybridprotein nach Anspruch 12, wobei die Enzymspaltungsstelle von einem Enzym erkannt und gespalten wird, das im Eierstock gefunden wird.
Hybridprotein nach Anspruch 11, wobei der Peptidlinker als flexibles Gelenk dient.
Hybridprotein nach Anspruch 1, wobei eine oder mehrere kovalente Bindungen zwischen den beiden Untereinheiten (b) hinzugefügt sind.
DNA-Molekül, das eine von den beiden Aminosäuresequenzen codiert, die das Hybridprotein nach Anspruch 1 bilden.
Expressionsvektor, der ein oder zwei DNA-Molekül(e) enthält, die die Aminosäuresequenzen codiert, die ein Hybridprotein nach Anspruch 17 bilden.
Expressionsvektor nach Anspruch 18, wobei das DNA-Molekül SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 5 oder SEQ ID Nr. 7 ist.
Wirtszelle, die einen oder zwei verschiede Expressionsvektor(en) nach Anspruch 18 enthält und das Hybridprotein exprimieren kann.
Verfahren zur Herstellung eines Hybridproteins umfassend: Züchten einer Wirtszelle nach Anspruch 19 und Gewinnen des dadurch exprimierten Hybridproteins.
Arzneimittel, das ein Hybridprotein nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Excipienten umfasst.
Verwendung des Hybridproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung eines Medikaments.
Verwendung des Hybridproteins nach Anspruch 7 zur Herstellung eines Medikaments für Erkrankungen des Menschen, welche die Inhibierung von TNF benötigen.
Verwendung des Hybridproteins nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Medikaments zur Induzierung der Follikelreifung.