CN102002495B - 用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及其制备方法。本发明要解决的技术问题是为高效表达异二聚体重组蛋白提供新的选择。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种用于表达双亚基重组蛋白的表达框，其结构为在启动子后可操作的连接有双亚基重组蛋白的各个亚基的编码序列，各个亚基的编码序列之间用内部核糖体进入位点序列IRES进行连接。本发明表达框能实现在同一宿主细胞内各亚基的同步和高效表达，使其更经济和更有效。

Description

用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于表达双亚基异二聚体重组糖蛋白激素的表达框、表达载体及其制备方法。

背景技术

利用生物技术表达生产有价值的重组蛋白一直是生物技术领域的热点问题。而异二聚体糖蛋白激素的高效表达一直是本领域的难题。

糖蛋白激素(Glycoprotein hormones)是指由垂体产生的促甲状腺素(TSH)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和由胎盘产生的绒毛膜促性腺激素(CG)，这些激素在性腺和甲状腺功能上具有重要作用。

这些糖蛋白激素都是由α亚基和β亚基构成的异二聚体。大多数高等脊椎动物只有一种编码α亚基的基因，同一种属的所有糖蛋白激素的α亚基是相同的，而且不同种属之间α亚基的氨基酸序列也有很高的同源性。β亚基具有激素特异性，每一种激素的β亚基是由不同基因编码。在糖蛋白分子中，亚基的结合对激素的功能是相当重要的，单个亚基不具有生物活性，实际上在哺乳动物细胞内α亚基和β亚基表达后再形成具有高激素活性的异二聚体。

糖蛋白激素在临床上得到了广泛的应用。TSH由垂体前叶促甲状腺细胞合成并分泌，其主要功能就是促进甲状腺滤泡上皮细胞增生、甲状腺激素合成和释放的作用，临床上主要用于在分化良好型甲状腺癌的甲状腺切除治疗。FSH、LH均在垂体前叶合成，二者合称为促性腺激素(gonadotropin)，临床上主要用于治疗不排卵妇女的不孕症和男性促性腺激素分泌不足或精小管缺陷。绒毛膜促性腺激素在胎盘内合成，其主要功能就是刺激黄体，有利于雌激素和黄体酮持续分泌，促进胎盘生长成熟。

早期的激素药物是从动物或人的尸体、体液、尿、内脏中提取的天然激素。由于激素在体内的含量很低，生化提取耗费很大而且纯度不高，所用原料也是易受病毒污染。DNA重组技术使激素类药物的规模生产成为现实。目前，国际上上市的重组糖蛋白激素类药物有重组人促卵泡激素(rhFSH)，重组人绒毛膜促性素(rhCG)，重组人促黄体激素(rhLH)，重组人促卵泡激素(rhFSH)，重组人促甲状腺素(rhTSH)。

目前重组异二聚体激素的生产主要采用如下策略：分别将α亚基和β亚基构建在不同的表达载体上，共转染哺乳动物细胞，再经大量的筛选获得工程细胞株，细胞株经培养和纯化得到高纯度的重组产品。该方法的缺点是两个亚基必须构建于不同的载体上，而且各自带有不同标志基因，共同转染后由于整合位点不同、表达合的丢失或失活，使其两个亚基的表达不同步或失衡，造成表达水平低，生产成本高和产品价格高，给患者带来经济负担。

发明内容：

本发明要解决的技术问题是提供一种用于表达异二聚体糖蛋白激素(由α亚基和β亚基组成)的表达框。该表达框的结构为在启动子后可操作的连接有双亚基重组蛋白的各个亚基的编码序列，各个亚基的编码序列之间用内部核糖体进入位点序列IRES进行连接。所述可操作的连接，是指将基因编码序列连接于启动子后并由启动子控制其表达。

其中：上述用于表达双亚基重组蛋白的表达框所表达的目标蛋白为人糖蛋白激素。

其中，上述表达框的结构为启动子-β亚基-IRES-α亚基模式或启动子-α亚基-IRES-β亚基模式。

其中，上述表达框中α亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为其简并序列。

其中，上述表达框中的β亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.2(hFSH-β亚基)、SEQ IDNo.3(hCG-β亚基)、SEQ ID No.4(hLH-β亚基)或SEQ ID No.5(hTSH-β亚基)中的任一项所示或为其简并序列。

其中，上述表达框中的启动子为CMV启动子或其它真核表达启动子。

其中，上述表达框中的内部核糖体进入位点序列为SEQ ID No.6所示或为其变体。

本发明的另一个目的是提供一种用于表达双亚基重组蛋白的的表达载体。该载体上连接有上述的表达框。

其中，上述表达载体为真核表达载体。

其中，上述表达载体为质粒表达载体或病毒表达载体。

其中，上述表达载体中有DHFR基因、或谷氨酰胺合成酶基因GS或抗生素抗性基因作为筛选标志基因。

进一步的，上述载体的核苷酸序列为SEQ ID No.7所示。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述表达载体的宿主细胞。

其中，上述宿主细胞为CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞系、骨髓瘤细胞系、HEK293(humanembryonic kidney293)细胞系或和PER.C6(人胚胎成视网膜细胞)细胞系中的至少一种。

本发明的第四个目的是提供制备上述的表达框的方法。该方法包括以下步骤：从基因库中获得人β亚基和α亚基的序列以及IRES基因序列，在基因水平上按β亚基-IRES-α亚基或α亚基-IRES-β亚基模式进行拼接，并在5端和3端设计与目标载体链接的内切酶位点，进行全基因合成或用重叠PCR(Overlap PCR)进行并接得到。

制备本发明上述表达框还可以采用另外的方法，即从基因库中获得β亚基和α亚基的序列以及IRES基因序列，进行优化和基因合成，用重叠PCR(Overlap PCR)进行并接即得。

以上基因也可从相应的组织、器官和培养物中经RT-PCR扩增获得。

本发明为表达异二聚体糖蛋白激素提供了一种新的有效思路和工具。

本发明所述的异二聚体糖蛋白激素主要包括人促卵泡激素hFSH、绒毛膜促性素hCG、人促黄体激素hLH、人促甲状腺素hTSH，。本发明是利用IRES序列将糖蛋白激素的β亚基和α亚基连接形成表达框，实现亚基的同步和高效表达，其表达框结构模式为：启动子-B亚基-IRES-A亚基模式或启动子-A亚基-IRES-B亚基模式和启动子-β亚基-IRES-α亚基模式或启动子-α亚基-IRES-β亚基模式。本发明还提供了含有这些表达框的真核表达载体，以及该真核表达载体转染哺乳动物细胞、筛选和建立的稳定的基因工程细胞株的方法。本发明还提供了一种工程细胞株的无血清培养技术，从而避免在最终产品中动物源性蛋白和病毒的污染。

本发明的有益效果在于：利用内部核糖体进入位点序列(IRES)将糖蛋白激素不同的亚基在基因水平连接使其紧密连锁，构建于同一表达载体并受同一启动子控制。转染哺乳动物细胞后，表达框的完整性得到较高的保持，从而提高阳性克隆的比例和筛选效率。另由于两个亚基整合于染色体的同一位点，从而实现在同一宿主细胞内β亚基和α亚基的同步和高效表达，使其更经济和更有效。本发明的另一优点是在同一表达载体中构建有DHFR表达框，能在筛选压力下实现高表达。同时，采用无血清培养，避免动物源性蛋白质和外源病毒对产品的污染，使产品更具安全性。总的说来，本发明表达载体尤为适合糖蛋白激素的表达，为本领域提供了一种新的有效选择，解决困扰本领域的难以有效提高糖蛋白激素生产量的难题

附图说明

图1为人FSH表达框示意图。

图2为人FSH全基因拼接示意图，S分别为人FSHβ亚基和α亚基的信号肽.

图3是FSH全基因PCR拼接的电泳结果，第一道为DNA分子标准。

图4是表达载体经酶切鉴定结果，第一道为DNA分子标准，第二道为质粒，第三道是经BamH1和Xho1进行双酶切释放的片段。

图5是构建的表达载体的结构图，命名为pFSHβ/α。

图6重组人FSH工程细胞在摇瓶中的生长曲线(每ml培养基)，时间为天。

图7重组人FSH在摇瓶中的表达曲线，时间为天。

图8重组人FSH纯化产品电泳图，非还原。

具体实施方案

以下结合附图对本发明进行详细说明，本发明并不限于下述实例。

本发明下面以脑心肌炎病毒的IRES(EMCV-IRES)连接FSH β亚基和α亚基生产重组人FSH的生产方法为例对本发明进行详细的说明。

实例一  人FSH全基因表达载体的制备

从基因库中获得人FSH β亚基和α亚基的序列以及IRES基因序列，在基因水平上按β亚基——IRES——α亚基或α亚基——IRES——β亚基模式进行拼接，并在5端和3端分别设计BamH1和Xho1内切酶位点，进行优化和全基因合成。

或者进行PCR拼接：从基因库中获得人FSH β亚基和α亚基的序列以及IRES基因序列，分别进行基因合成，并用下列引物用重叠PCR进行并接(见图2)。具体的，先以IRES为模板，用引物P1和P2进行PCR反应，反应体积为50ul，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共30个循环，最后72℃延伸5min。凝胶电泳并回收DNA片段。再将回收片段按一定量与β亚基和α亚基片段混合进行PCR反应，反应体积为50 ul，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共10个循环。再补加引物P3和P4后继续进行PCR反应，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共30个循环，最后72℃延伸5min。凝胶电泳回收DNA片段，并克隆于TA克隆载体，进行酶解分析(见图3)和测序分析。

PCR拼接所使用的引物为：

P1(SEQ ID No.8)：5’TGAAATGAAA GAATAAGCGG CCGCCC 3’；

P2(SEQ ID No.9)：5’TTCTGTAGTA ATCCATGGTT GTGGCA 3’；

P3(SEQ ID No.10)：5’TGGATCCAGGATGAAGACACTCCAGT 3’；

P4(SEQ ID No.11)：5’GGCTCGAGTT AAGATTTGTG AT 3’；

带下划线的碱基分别为BamH1和Xho1酶切位点。

实例二  真核表达载体的构建

将实例1得到的FSH全基因用BamH1和Xho1进行双酶切，凝胶电泳分离，试剂盒回收。将回收的基因片段与真核表达载体PcDNA5/dhfr(PcDNA5/dhfr是用INVITROGEN的pcDAN5/frt/to质粒构建的，用二氢叶酸还原酶基因取代原质粒中的潮霉素抗性基因)连接。转化大肠杆菌DH-5a感受态细胞，挑选阳性菌落。过夜培养，提取质粒后进行双酶切分析和DNA测序鉴定。结果表明，插入片段序列与FSH-α和FSH-β的基因序列一致(SEQ ID No.1，SEQID No.2)，电泳图见图4，将构建得到的表达载体命名为pFHSβ/α(序列为SEQ ID No.7)，其结构示意图见图5。

实例三  真核细胞的转染

使用两种方法进行真核细胞的转染。

1、电转染法：DHFR(二氢叶酸还原酶)阴性CHO细胞经无血清悬浮培养至对数生长期，无血清培养基为HYQ-SFM4CHO培养基(HyClone公产品)，离心收集细胞，配制成200ul含2×10⁶细胞的细胞悬液，加入电转杯中，再加入上述实例2构建的表达质粒2ug，轻摇混匀，电压220V，电击一次(BTX公司产品，型号ECM630)，静止10分钟。将细胞转入T75方瓶，补足新鲜无血清培养基(含HT，Sigma)，于37℃静置培养48h。

2、脂质体转染法：DHFR阴性CHO细胞提前一天以无抗生素培养基HYQSFM4CHO-5％FBS-HT培养于6孔细胞板，2ml/well，待细胞生长至90％。取上述实例2构建的表达质粒0.5ug和真核细胞脂质体转染试剂2ul(Lipofectamine2000，Invitrogen)于100ul上述无抗生素培养基中轻轻混匀，静置5分钟，再将上述表达质粒和脂质体转染试剂混合物加于细胞孔中，前后左右轻轻摇匀，于37℃静置培养6h。6h后更换新鲜培养基，培养基为HyClone  无血清培养基(SFM4CHO)加2％FBS和HT，37℃继续培养24h。

实例四  工程细胞株的筛选和建立

收集上述实例三的转染细胞，离心后重悬于新鲜的无血清培养基中(不含HT)，将细胞分散种于10块96孔细胞培养板中，每孔200ul。于C0₂培养箱内培养，根据细胞生长情况大约每3-4天定时更换新鲜培养液，直至克隆出现。然后用ELISA法检测上清中FSH的含量。

本发明培养上清中重组FSH含量测定使用Microwell公司的FSH EIA试剂盒，用其标准方法进行。该试剂盒采用双抗体夹心法测定FSH活性。FSH由α亚基和β亚基组成。试剂盒中将抗-α亚基的单抗包被于微孔板上，制备成固相抗体，用辣根过氧化物酶标记抗-β亚基的单抗检测。  在分别标明标号的反应微孔中依次加入50μl标准品，质控血清，待测样品。每空加入100μl酶结合物，轻轻振荡微孔支架，充分混匀，在37℃水浴箱或温箱中温育30分钟。将各孔液体弃尽，用洗液冲洗5次，每次冲洗后将水分弃尽，最后一次冲洗后在干净的吸水纸上扣尽参与水分，切勿擦拭反应微孔内壁。每孔加50μl显色液A，再加50μl显色液B，充分混匀，在室温(20-28℃)下避光反应15分钟。显色反应15分钟后，每空加50μl终止液，并混匀。30分钟内，用酶标仪在450nm波长读记吸光度。根据标准品所测值计算样品的活性单位。

经电转染后，960孔中共出现279个细胞克隆，经ELISA法检测共有225孔出现阳性信号，克隆阳转率为80.65％。在这225孔阳性信号孔克隆细胞中，根据检测值高低及克隆细胞情况，挑出46孔克隆于细胞瓶继续筛选。经培养、MTX加压和克隆筛选最后确定一株细胞生长好表达高的细胞株(标号16E12D5)为候选工程细胞株，并进行了产物的表达分析，见表1。

表1：工程细胞株筛选和建立情况

	96孔板	阳性克隆	24孔板	细胞瓶	摇瓶	工程细胞株
							克隆数	279	225	46	16	5	1

结果表明，利用本发明构建的含有异二聚体糖蛋白激素表达框的真核表达载体转染细胞后阳性克隆得率高，其产量和活性高于现有的方法。

实例五  重组人FSH的制备

上述实例得到的工程细胞株按每ml30万接种于每50ml无血清培养基中，于37度摇瓶培养，定时取样计数活细胞数和测定FSH表达量，绘制生长曲线和表达曲线，见图6和图7，表达量达到1mg/L。含量测定是用纯化的FSH作标准，采用ELISA的方法测定。而该株工程细胞经工艺优化后表达量还应有极大的提高潜力，可达到5-8mg/L的高表达水平。当摇瓶中细胞达到每ml 300万时，按1∶5接种在生物反应罐中进行扩大培养，收集上清进行纯化和分析，纯化产品电泳结果见图8，表明能大规模生产FSH。

结果表明，利用本发明构建的含有异二聚体糖蛋白激素表达框的真核表达载体转染细胞后得到的工程菌的FSH表达量较高，说明该载体具有很好的使用前景，为异二聚体糖蛋白激素的高效表达提供了新的有效选择。

Claims (2)

1.用于表达异二聚体糖蛋白激素重组蛋白的表达框，其特征在于其结构为在启动子后可操作的连接有双亚基糖蛋白激素的α亚基和β亚基的编码序列，各个亚基的编码序列之间用内部核糖体进入位点序列IRES 进行连接；

所述可操作的连接，是指将基因编码序列连接于启动子后并由启动子控制其表达；

所述的α亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；

所述的β亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；

所述的内部核糖体进入位点序列为SEQ ID No.6 所示；

其制备方法为：从基因库中获得人FSHβ亚基的序列和α亚基的序列以及IRES基因序列，在基因水平上按β亚基——IRES——α亚基或α亚基——IRES——β亚基模型进行拼接，并在5端和3端分别设计BamH1和Xho1内切酶位点，进行优化和全基因合成；

或者进行PCR拼接：从基因库中获得人FSHβ亚基和α亚基的序列以及IRES基因序列，分别进行基因合成，并用下列引物用重叠PCR进行并接，先以IRES为模板，用引物P1和P2进行PCR反应，反应体积为50μl，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共30个循环，最后72℃延伸5min；凝胶电泳并回收DNA片段，再将回收片段按一定量与β亚基和α亚基片段混合进行PCR反应，反应体积为50μl，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共10个循环；再补加引物P3和P4后继续进行PCR反应，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共30个循环，最后72℃延伸5min；凝胶电泳回收DNA片段，并克隆于TA克隆载体，进行酶分析和测序分析；PCR拼接所使用的引物为：

   P1(SEQ ID No.8):5’TGAAATGAAA GAATAAGCGG CCGCCC 3’；

P2(SEQ ID No.9): 5’TTCTGTAGTA ATCCATGGTT GTGGCA 3’；

P3(SEQ ID No.10):5’TGGATCCAGGATGAAGACACTCCAGT 3’；

P4(SEQ ID No.11):5’GGCTCGAGTT AAGATTTGTG AT 3’。

2.根据权利要求1所述的用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框，其特征在于：所述的启动子为巨细胞病毒启动子。

3. 一种用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达载体，其特征在于：所述载体上具有权利要求1或者2所述的表达框。

4. 根据权利要求3所述表达载体，其特征在于：所述的载体为pcDNA5。

5．根据权利要求4所述表达载体，其特征在于：该载体的核苷酸序列为SEQ ID No.7 所示。

6．含有权利要求3~5任意一项所述的表达载体的宿主细胞。

 7. 制备权利要求1或者2所述的表达异二聚体糖蛋白激素的表达框的方法，其特征在于：该表达框的结构为在启动子后可操作的连接有双亚基糖蛋白激素的α亚基和β亚基的编码序列，各个亚基的编码序列之间用内部核糖体进入位点序列IRES 进行连接；

所述可操作的连接，是指将基因编码序列连接于启动子后并由启动子控制其表达；

所述的α亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；

所述的β亚基的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示；

所述的内部核糖体进入位点序列为SEQ ID No.6 所示；

其制备方法为：从基因库中获得人FSHβ亚基的序列和α亚基的序列以及IRES基因序列，在基因水平上按β亚基——IRES——α亚基或α亚基——IRES——β亚基模型进行拼接，并在5端和3端分别设计BamH1和Xho1内切酶位点，进行优化和全基因合成；

或者进行PCR拼接：从基因库中获得人FSHβ亚基和α亚基的序列以及IRES基因序列，分别进行基因合成，并用下列引物用重叠PCR进行并接，先以IRES为模板，用引物P1和P2进行PCR反应，反应体积为50μl，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共30个循环，最后72℃延伸5min；凝胶电泳并回收DNA片段，再将回收片段按一定量与β亚基和α亚基片段混合进行PCR反应，反应体积为50μl，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共10个循环；再补加引物P3和P4后继续进行PCR反应，反应条件为94℃变性3min，再94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸45sec，共30个循环，最后72℃延伸5min；凝胶电泳回收DNA片段，并克隆于TA克隆载体，进行酶分析和测序分析；PCR拼接所使用的引物为：

   P1(SEQ ID No.8):5’TGAAATGAAA GAATAAGCGG CCGCCC 3’；

P2(SEQ ID No.9): 5’TTCTGTAGTA ATCCATGGTT GTGGCA 3’；

P3(SEQ ID No.10):5’TGGATCCAGGATGAAGACACTCCAGT 3’；

P4(SEQ ID No.11):5’GGCTCGAGTT AAGATTTGTG AT 3’。

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