CZ291212B6 - Hybridní protein, molekula DNA, expresní vektor, hostitelská buňka, způsob produkce hybridního proteinu, jeho pouľití a farmaceutický prostředek - Google Patents
Hybridní protein, molekula DNA, expresní vektor, hostitelská buňka, způsob produkce hybridního proteinu, jeho pouľití a farmaceutický prostředek Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291212B6 CZ291212B6 CZ19982644A CZ264498A CZ291212B6 CZ 291212 B6 CZ291212 B6 CZ 291212B6 CZ 19982644 A CZ19982644 A CZ 19982644A CZ 264498 A CZ264498 A CZ 264498A CZ 291212 B6 CZ291212 B6 CZ 291212B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- hybrid protein
- sequence
- protein
- fragments
- hcg
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 4
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 102100040296 TATA-box-binding protein Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 17
- 101000891654 Homo sapiens TATA-box-binding protein Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims abstract description 12
- 101001125540 Homo sapiens 26S proteasome regulatory subunit 6A Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 5
- 101000653510 Homo sapiens TATA box-binding protein-like 2 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 102100030631 TATA box-binding protein-like 2 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 32
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 26
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- 102000008175 FSH Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001895 Gonadotropin Receptors Human genes 0.000 claims description 5
- 108010040490 Gonadotropin Receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 5
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 5
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000012740 beta Adrenergic Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108010079452 beta Adrenergic Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000003325 follicular Effects 0.000 claims description 2
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 2
- 102100026720 Interferon beta Human genes 0.000 claims 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims 1
- 101710113649 Thyroid peroxidase Proteins 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 claims 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000539 dimer Substances 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 31
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 31
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 31
- 101710145783 TATA-box-binding protein Proteins 0.000 description 20
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 19
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 19
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 13
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 101710199392 TATA-box-binding protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 7
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 5
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108010003189 recombinant human tumor necrosis factor-binding protein-1 Proteins 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108050001718 Death domains Proteins 0.000 description 2
- 102000010170 Death domains Human genes 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 1
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 1
- 102000001617 Interferon Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010054267 Interferon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100037792 Interleukin-6 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710156592 Putative TATA-binding protein pB263R Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 201000008754 Tenosynovial giant cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 208000035647 diffuse type tenosynovial giant cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000045334 human TBP Human genes 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006525 intracellular process Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000002918 testicular germ cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- -1 ΙΙ · Νβ Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C209/00—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
- C07C209/04—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups
- C07C209/22—Preparation of compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton by substitution of functional groups by amino groups by substitution of other functional groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
- A61P5/16—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4 for decreasing, blocking or antagonising the activity of the thyroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Hybridn proteiny zahrnuj c dv koexprimovan aminokyselinov sekvence tvo° c dimer. Ka d sekvence obsahuje vazebnou st receptoru, jako je TBP1 nebo TBP2, nebo ligandy, jako je IL-6, IFN-b a TPO, napojenou na podjednotku heterodimern ho proteinov ho hormonu, jako je hCG. Ka d koexprimovan sekvence obsahuje odpov daj c podjednotku hormonu tak, aby po expresi vytvo°ila heterodimer. Zahrnuty jsou tak odpov daj c molekuly DNA, expresn vektory, hostitelsk bu ky stejn jako farmaceutick sm si a zp sob p° pravy t chto protein .\
Description
Oblast techniky
Navrhovaný vynález se týká hybridních proteinů, obsahujících dvě koexprimované aminokyselinové sekvence tvořící dimer, který obsahuje
a) alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci z následujících, homomemí receptor, řetězec, heteromemího receptorů, ligandu a nebo jejich fragmenty, a
b) podjednotku heterodimemího proteinového hormonu, nebo jeho fragmentu, kde (a) a (b) jsou navázány přímo nebo pomocí peptidového linkeru a v každém páru jsou dvě (b) podjednotky odlišné a schopné agregovat do formy dimemího komplexu.
Dosavadní stav techniky
Interakce protein - protein je nezbytná pro normální fyziologické funkce buněk i mnohobuněčných organismů. Celá řada proteinů začne vykazovat nové, nebo optimální funkce teprve po vytvoření komplexu s jedním nebo více řetězci proteinů. Je to ilustrováno množstvím kombinací ligand - receptor, které přispívají k regulaci buněčné aktivity. Některé ligandy, jako je Tumor necrosis factor a (TNFa), TNFp, nebo lidský choriový gonadotropin (hCG), působí jak komplexy několika podjednotek. Některé z těchto komplexů obsahují několik kopií stejné podjednotky. TNFa a TNFP (dále společně označené jako TNF) jsou homotrimery tvořené třemi stejnými podjednotkami (1-4). Ostatní ligandy jsou složeny z nestejných jednotek. Například hCG je heterodimer (5-7). Jako několika řetězcové komplexy mohou také působit, nebo fungovat receptory. Například receptor pro TNF přenáší signál poté co je agregován do heterodimeru (8-9). Agregaci dvou nebo tří řetězců receptorů způsobují ligandy těchto receptorů, čímž spouštějí mechanismus aktivace receptorů. Například TNF mediovaná agregace aktivuje TNF receptor (10-12).
Modulace interakcí protein - protein se zdá být použitelným mechanismem terapeutického zásahu v případě řady chorob a patologických stavů. Rozpustné vazebné proteiny, které jsou schopné interagovat s ligandy, mohou potenciálně izolovat ligand od receptorů, čímž sníží míru aktivace této konkrétní receptorové dráhy. Alternativně je také možné izolací ligandu prodloužit jeho eliminaci nebo degradaci, a tím prodloužit jeho přetrvávání či zesílit efekt a tím snad i specifickou aktivitu in vivo. V případě TNF, rozpustné TNF receptory, jsou primárně asociované s inhibicí aktivity TNF (13-17).
Rozpustné vazebné proteiny mohou být použitelné pro léčbu lidských chorob. Například rozpustné TNF receptory se ukázaly jako účinné pro léčbu na zvířecím modelu artritidy (18,19).
Jelikož TNF má tři vazebná místa pro svůj receptor (10-12) a dimerizace povrchového buněčného receptorů je zodpovědná za jeho bioaktivitu (8,9), je možné, že vazba jedné molekuly rozpustného receptorů na TNF nechává možnost, že tento 1:3 komplex rozpustný receptor: TNF (trimer) se je schopen stále vázat a aktivovat dvojici buněčných povrchových TNF receptorů. K dosažení inhibičního efektu, se zdá být nutné obsadit či blokovat dvě ze tří vazebných míst pro receptor na trimeru TNF pomocí rozpustného vazebného proteinu. Je také možné pomocí vazebného proteinu blokovat správnou orientaci TNF na povrchu buňky. Shrnuto, je třeba syntetizovat proteiny, obsahující dva řetězce receptorů (nebo ligandu), jako dimemí hybridní protein. Viz Wallach et al., patent US 5 487 925.
-1 CZ 291212 B6
Prvotní strategie vyvinutá pro generování dimerních nebo multimemích hybridních proteinů, obsahujících vazebné domény z extracelulámích receptorů, byla založena na fúzi těchto proteinů s konstantními oblastmi těžkého řetězce protilátek.
Tato strategie vedla například ke konstrukci CD4 iminoadhesinů (20). Tyto hybridní molekuly se skládají z prvních dvou (nebo všech čtyřech) imunoglobulinlike domén CD4 navázaných na konstantní oblast lehkého i těžkého řetězce protilátky. Tato strategie výroby hybridních molekul byla adaptována na receptory pro TNF (10, 16, 21) a vedla ke vzniku konstruktu s vyšší in vitro aktivitou než monomemí rozpustné vazebné proteiny.
Bývá pravidlem, že vyšší in vitro účinnost dimemího fúzního proteinu znamená i vyšší in vivo aktivitu. Jedna studie potvrzující tento předpoklad, ukazuje alespoň 50krát vyšší účinnost p75(TBP2)-Ig fúzního proteinu v ochraně myší před následnou intravenózní injekcí LPS(16).
Avšak, navzdory širokému použití imunoglobulinových fúzních proteinů, má tato metoda několik nevýhod. Jednou z nich je přítomnost Fc domén na molekule imunoglobulinu, neboť ty se účastní řady efektorových mechanismů imunitní reakce. Tyto jejich funkce pak mohou být v příslušném terapeutickém procesu nežádoucí (22).
Další limitace patří do skupiny speciálních případů, kdy je třeba produkovat heteromemí fůzní proteiny, například rozpustné analogy heteromemího IL-6 nebo interferonového receptoru typu 1. Ačkoliv existuje řada metod produkce bifunkčních protilátek (např. pomocí kontransfekce nebo fúzí hybridomů) efektivita syntézy je značně snížena produkcí směsi homodimerů a heterodimerů která takto vzniká (23). Bylo také zveřejněno několik prací popisujících použití motivu leucinového zipu, který umožňuje sestavení heterodimerů (24-26). To se zdá být slibnou možností pro účely výzkumu, avšak vytvořené nepřirozené nebo interacelulámí sekvence nejsou vhodné pro chronické aplikace v klinické praxi díky své antigenicitě. Limitující je I účinnost sestavování a stabilita molekuly pro sestavení.
Na druhé straně, v případě TNF receptorů, některé modifikace v p55 TNF receptoru jak se zdá umožňují homodimerizaci a signalizaci v nepřítomnosti ligandu (27, 28). Bylo zjištěno, že cytoplasmatická část receptoru, zvaná „doména smrti“, může sloužit jako homodimerizační motiv (28, 30). Jako alternativa k imunoglobulinovému hybridnímu proteinu, fúze extracelulámí domény TNF receptoru s jeho cytoplasmatickou doménou smrti, by pravděpodobně mohla vést k sekrečnímu proteinu který může dimerizovat v nepřítomnosti TNF. Tyto fúzní proteiny jsou zahrnuty a nárokovány I Intemational Patent Application WO 95/31544.
Třetím způsobem výroby rozpustných TNF receptorů je chemické navázání monomemích proteinů pomocí polyethylen glykolu (31).
Podstata vynálezu
Antemativou k takto získaným dimemím proteinům, mající některé důležité výhody, je navrhovaný vynález a představuje použití přirozených heterodimemích struktur odpovídajících cirkulujícím proteinům neimunoglobulinového charakteru, s dlouhým poločasem životnosti. Preferovaným příkladem je hCG, dobře sekretovaný protein s dostatečnou stabilitou a s dlouhým poločasem životnosti (32-32). Díky hlavní úloze hCG jako znaku těhotenství, byla vyvinuta řada reagencií pro jeho kvantitativní i kvalitativní testování jako in vitro, tak in vivo. Navíc hCG bylo intenzivně studováno pomocí mutageneze a ví se, že malé delece v proteinu, jako je odstranění pěti residuí na karboxy konci a subjednotky, může efektivně eliminovat jeho biologickou aktivitu a přitom nenaruší jeho schopnost tvořit heterodimery (34-35). malé inzerce, až do 30 aminokyselin, jsou na amino- i karboxy konci a subjednotky tolerovány (36), zatímco fúze a subjednotky s karboxy koncem Psubjednotky má malý efekt na formování heterodimerů (37). Byl také popsán analog hCG, kde byla imunoglobulinová Fc doména fúzována s C-koncem
-2CZ 291212 B6 β subjednotky, hCG, avšak tento konstrukt není sekretován a nebylo vynaloženo žádné úsilí kombinovat ho s a subjednotkou (38).
Tedy hlavním předmětem navrhovaného vynálezu, je hybridní protein obsahující dvě koexprimované aminokyselinové sekvence tvořící dimer, z nichž každá obsahuje:
a) alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci z následujících, homomemí receptor, řetězec heteromemího receptoru, ligandu a nebo jejich fragmenty, a
b) podjednotku heterodimemího proteinového hormonu, nebo jeho fragmentu, kde (a) a (b) jsou navázány přímo nebo pomocí peptidového linkeru a v každém páru jsou dvě (b) podjednotky odlišné a schopné agregovat do formy dimemího komplexu.
Dle navrhovaného vynálezu může být linker enzymaticky štěpitelný.
Sekvence (a) je vybrána z těchto variant: extracelulámí doména TNF receptoru 2 (75 kDa, také nazývaný TBP2), jejich fragmenty však stále obsahující vazebné doménu pro ligandu, extracelulámí doména IL-6 receptorů (také nazývaná gp80 a gp 130), extracelulámí doména IFN α/β receptoru nebo receptoru pro IFN γ, receptor pro gonadotropin nebo jeho extracelulámí fragmenty, proteiny s charakterem ligandu, jako jsou cytokiny, růstové faktoiy nebo hormony jiné než gonadotropiny, konkrétními příklady mohou být IL-6, ΙΙ·Νβ, TPO, nebo jejich fragmenty.
Sekvence (b) je v preferované variantě vybrána z hCG, FSH, LH, TSH, inhibiční subjednotka, nebo jejich fragmenty.
Pro inaktivaci komponent hybridních proteinů, je možné použít modifikace, jako je chemické nebo proteolytické štěpení proteinové kostry nebo chemická či enzymatická modifikace některých aminokyselinových postranních řetězců. Toto omezení aktivity, může být také uskutečněno prostřednictvím technik rekombinantní DNA změnou kódující sekvence hybridního proteinu takovým způsobem aby byla zrušena aktivita komponent, nebo tak aby vznikl protein který bude později snadněji přístupný chemické nebo enzymatické modifikaci.
Výše zmíněné hybridní proteiny budou monofunkční, bifunkční nebo multifunkční molekuly, v závislosti na aminokyselinové sekvenci (a) která je kombinovaná s (b). V každé dvojici (a) může být připojeno buď na amino nebo na karboxy konec (b), nebo obojí.
Monoklonální hydribní proteiny dle navrhovaného vynálezu mohou, například obsahovat extracelulámí doménu receptoru pro gonadotropin připojenou na jednu zodpovídajících subjednotek gonadotropinu vázající receptor. Dle jedné z konkrétních variant, hybridní protein navrhovaný vynálezem může být molekula ve které je například, extracelulámí doména FSH receptoru připojena na FSH tak by zvýšila poločas životnosti v plasmě a zesílila biologickou aktivitu.
Tato varianta může být použita k indukci folikulámí maturace v rámci řízených reprodukčních metod, jako je indukce ovulace nebo oplození in vitro a nebo jako způsob dramatického zesílení biologické aktivity hormonů nezbytných pro úspěch tohoto procesu, tím že redukuje požadavky na jak hormony samotné, tak na počet injekcí vyvolávajících ovulaci.
Receptor pro FSH a produkce extracelulámí domény lidského FSH receptoru je popsáno v WO 92/16 620 a WO 96/38 575.
Dle konkrétní varianty vynálezu, extracelulámí doména FSH receptoru (ECD) může být fúzována v rámci s peptidovým linkerem který obsahuje rozeznávací/štěpicí místo pro trombin (29) a představuje „zakotvenou“ paži. Peptidový linker připojuje extracelulámí doménu FSH
-3CZ 291212 B6 aFSH podjednotku. To umožní odstranění extracelulámí domény FSH receptoru štěpením v místě pro trombin ve chvíli kdy molekula přijde do styku s trombinem během cirkulace v systému.
V jiné variantě, namísto štěpícího místa pro trombin, je použito štěpící místo pro enzym vyskytující se v největším množství ve vaječníku. Tímto způsobem, je možné dosáhnout toho aby cirkulující molekula EDC-FSH byla vystavena působení enzymu ve chvíli kdy vputuje do vaječníku, kdy se enzym nachází v nejvyšší koncentraci, tím pádem je ECD odštěpeno a FSH může interagovat okamžitě s membránovým receptorem.
V jiné konkrétní variantě vynálezu, namísto místa rozeznávaného enzymem, je mezi ECD a FSH vklonována flexibilní patentová oblast tak aby ECD nemohl být enzymaticky odštěpen od hormonu. Takto po vstupu molekuly ECD-FSH do vaječníku, nastane kompetice ECD navázaného patentovou oblastí a ECD receptoru pro FSH nacházejícího se na membráně buňky.
V další, preferované, variantě vynálezu, je hybridní protein složený z agregátu páru aminokyselinových sekvencí, nichž jedna obsahuje TBP1 (nebo fragmenty od aminokyseliny 20 do aminokyseliny 161 nebo do aminokyseliny 190) jako (a) a a podjednotku hCG nebo (b), a nebo další, které obsahují vždy TBP1 (nebo ty samé fragmenty které jsou uvedené výše) jako (a) a β podjednotku hCG nebo její fragmenty jako (b). Dle této varianty je (b) zvoleno v závislosti na přesné sekvenci (celá β podjednotka hCG nebo její fragmenty či modifikace) a výsledný hybridní protein bude mít pouze jednu aktivitu (pouze jako TBP1) nebo kombinaci aktivit (té TBP1 zároveň s tou hCG). Hybridní protein popsaný v posledním případě, může být použit, například, v kombinované terapii Kaposiho sarkomu a metabolické ztráty při AIDS.
V další variantě vynálezu, je mezi dvě podjednotky (a) a (b) vložena jedna nebo více kovalentních vazeb aby se zvýšila stabilita výsledného hybridního proteinu. To může být provedeno, např. přidáním jedné nebo více nepřirozených meziřetězcových disulfidických vazeb. Vhodná místa pro toto spojení mohou být vyvozena ze známé struktury heterodimemího hormonu. Například, vhodné místo v hCG pro umístění cysteinového residua do a jednotky v místě Lys45 a do β podjednotky v míst Glu21, čímž je vodíkový můstek (nekovalentní vazba) nahrazen disulfídickou vazbou (kovalentní vazba). Dalším předmětem navrhovaného vynálezu jsou PEGylované nebo jinak chemicky modifikované formy hybridních proteinů.
Navrhovaný vynález také zahrnuje DNA molekulu obsahující DNA sekvence kódující výše zmíněné hybridní proteiny, tak jako nukleotidové sekvence v zásadě stejné. „Nukleotidové sekvence v zásadě stejné“ zahrnují všechny ostatní nukleotidové sekvence, které díky degeneraci genetického kódu kódují stejné aminokyselinové sekvence.
Pro produkci hybridních proteinů dle navrhovaného vynálezu, je DNA sekvence (a) získána z existujících klonů, stejně jako (b). DNA sekvence kódující požadovanou sekvenci (a) je ligovaná s DNA sekvencí kódující požadovanou sekvenci (b). Dva z těchto fúzních produktů jsou inzertované a ligované do vhodného plazmidu, nebo každá samostatně do odlišného plazmidu. Jakmile je vytvořen, je expresní vektor, nebo dva expresní vektory zavedeny do vhodné hostitelské buňky, která pak exprimuje vektory a dává tak vzniknout hybridním proteinům, dle vynálezu, jak byly popsány výše. Preferovanou metodou pro přípravu hybridů dle vynálezu, je PCR technologie za použití oligonukleotidů specifických pro požadované sekvence tak aby byly zkopírovány z klonů kódujících sekvence (a) a (b).
Exprese libovolných rekombinantních proteinů dle vynálezu, jak je zde zamýšleno, může probíhat v eukaryontních buňkách (např. kvasinky, hmyzí či savčí buňky), nebo v prokaryotních buňkách za použití odpovídajících expresních vektorů. Pro tento účel může být použita libovolná metoda dnes v praxi běžně používaná.
-4CZ 291212 B6
Například, DNA molekuly kódující proteiny získané libovolnou výše zmíněnou metodou jsou inzertované do vhodně konstruovaných expresních vektorů pomocí techniky běžně v praxi používané (viz. Sambrook et al., 1989). Dvojřetězcové cDNA jsou napojené do plazmidového vektoru homopolymemím napojením nebo restrikčním zavedením zahrnujícím použití syntetických DNA linkerů nebo ligační technikou tupých konců, pro ligaci DNA je použita DNA ligáza a nežadovaná napojení jsou blokována pomocí ošetření alkalickou fosfatázou.
Aby byl expresní vektor schopen exprimovat požadovaný protein, musí obsahovat také specifické nukleotidové sekvence obsahující transkripční a translační regulační informace vztahující se k DNA kódující požadované protein, které umožní expresi genu a produkci proteinu. Jako první z nich musí předcházet gen sekvence promotoru umožňující transkripci genu, která je rozeznávaná RNA polymerázou, na kterou se polymeráza váže a tím iniciuje transkripční proces. Existuje celá řada takových běžně používaných promotorů, které pracují s různou účinností (silní a slabé promotory).
Pro eukaryotní hostitelské buňky musí byl použity jiné transkripční a translační regulační sekvence, v závislosti na povaze hostitelské buňky. Mohou být odvozené od virových sekvencí, jako je adenovirus, hovězí papiloma virus, Simian virus a podobně, kde je regulační signál asociován s konkrétním genem s vysokou mírou exprese. Příkladem může být TK promotor Herpes viru, SV40 časný promotor, kvasinkový gal4 genový' promotor atd.
Transkripční iniciační regulační signály mohou být vybrány z těch které umožňují represi a aktivaci tak aby exprese genu mohla být modulována. DNA molekula obsahující nukleotidové sekvence kódující hybridní protein dle navrhovaného vynálezu, jsou inzertovány do vektoru(ů) s vhodně umístěnými transkripčními a translačními regulačními signály, které jsou schopné integrovat požadovanou genovou sekvenci do hostitelské buňky. Buňky stabilně transformované zavedenou DNA mohou být selektovány pomocí zavedení jednoho nebo několika markérů umožňujících selekci hostitelských buněk obsahujících expresní vektor. Markéry mohou představovat fototrofní na auxotropní hostitele, biocidní rezistenci, např. antibiotika nebo těžké kovy, jako je třeba měď, a podobně. Selekční markér gen může být buď přímo napojen na exprimovanou DNA sekvenci, nebo může být zaveden do buňky kotransfekcí. Při optimální syntézu proteinů dle navrhovaného vynálezu, mohou být třeba další složky.
Důležité faktory pro výběr plazmidu, nebo virového vektoru jsou: snadnost rozeznání a selekce buněk obsahujících vektor od těch buněk, které vektoru neobsahují, počet kopií vektoru, které jsou nutné pro konkrétního hostitele, a zda-li je možné, pokud je třeba, přenášet vektor mezi hostitelskými buňkami odlišných druhů.
Jakmile je vektor/vektory nebo DNA sekvence obsahující konstrukty/konstrukt připravena pro expresi, DNA konstrukt(y) mohou být vneseny do vhodné hostitelské buňky pomocí celé řady vhodných metod: transformací, transfekcí, konjugací, fůzí protoplastů, elektroporací, vápníkofosfátovou precipitací, přímou mikroinjekcí apod.
Hostitelské buňky mohou být jak prokaryotické tak eukaryotické. Preferované jsou eukaryotické buňky, např. savčí buňky jako jsou buňky lidské, opičí, myší, nebo buňky zvaječníků čínského křečka (CHO), neboť jsou schopny provést největší množství posttranslačních úprav na molekule proteinu, včetně správného zformování, nebo glykosylace na správných místech. Také buňky kvasinek jsou schopné obstarat posttranslační modifikace peptidů, včetně glykosylace. Existuje celá řada rekombinantních DNA strategií používajících sekvence silných promotorů a vysoký počet kopií plazmidů, které mohou být použité pro produkci požadovaného proteinu v kvasinkách. Kvasinky rozeznávají vedoucí sekvence produktů klonovaných savčích genů a vedoucí sekvence sekretovaných peptidů (tzn. pre-peptidy).
-5CZ 291212 B6
Po zavedení vektoru/vektorů, rostou hostitelské buňky na selekčním médiu, které selektuje rostoucí buňky obsahující vektor. Exprese klonované genové sekvence vede k produkci požadovaných proteinů.
Purifíkace rekombinantních proteinů probíhá podle některé z metod vyvinuté za tímto účelem, např. konvenční procedury jako jsou extrakce, precipitace, chromatografíe, elektroforéza a podobně. Další purifikační metody které mohou být použité pro přečištění proteinu dle navrhovaného vynálezu, jsou afinitní chromatografíe za použití monoklonálních protilátek vážících cílový protein a které jsou produkované a imobilizované na gelovém matric uvnitř kolony. Nečistý preparát obsahující požadovaný protein je protlačen skrz kolonu. Protein se naváže uvnitř kolony na specifickou protilátku, zatímco nečistoty projdou skrz. Po promytí je protein vymyt z gelu pomocí změny pH nebo iontové síly.
Termín „hybridní protein“ tak, jak je zde používán, popisuje protein složený ze dvou nebo více proteinů nebo jejich fragmentů.
Termín „fúzní protein“ tak, jak je zde používán, popisuje hybridní protein složený ze dvou nebo více proteinů nebo jejich fragmentů, které jsou dohromady spojeny kovalentně.
Termín „agregace“, tak, jak je zde používán, popisuje vytvoření silných specifických nekovalentních interakcí mezi dvěma polypeptidickými řetězci, tvořícími komplex, stejný jako ten mezi a a β podjednotkami heterodimemích hormonů (jako je FSH, LH, hCG nebo TSH).
Termín „ligand“ nebo „ligandový protein“, tak, jak je zde používán, popisuje molekulu, jinou než protilátku nebo imunoglobulin, schopnou navázat se na tu doménu receptoru, která váže ligand, mohou to být molekuly se vyskytující se přirozeně, nebo molekuly chemicky modifikované nebo chemicky syntetizované. Termín „doména vázající ligand“, tak, jak je zde používán, popisuje tu část receptoru, která se účastní vazby ligandu a je buď částí, nebo představuje celou extracelulámí doménu.
Termín „receptor“, tak, jak je zde používán, popisuje membránový protein, který po navázání patřičného ligandu spustí sekundární buněčnou reakci vedoucí k aktivaci nebo inhibici intracelulárních procesů.
Dalším aspektem popisovaným navrhovaným vynálezem je použití hybridních proteinů jako léčiv. Léčivo je pokud možno ve formě farmaceutické směsi obsahující protein navrhovaný vynálezem zároveň s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a/nebo vehikuly. Toto složení farmaceutické směsi je také dalším aspektem vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Pro objasnění některých aspektů vynálezu, jsou zde uvedeny popisy k připojeným obrázkům:
Obr. l(a) a 1 (b) zobrazují konstrukty TBP(20-161)-hCGa a TBP(20-161)-hCG3 a odpovídající sekvence (SEQ ID NOS: 1-4).
Obr. 2(a) a 2(b) zobrazují konstrukty TBP(20-190)-hCGa a TBP(20-190)-hCG3 a odpovídající sekvence (SEQ IDNOS:5-8).
Obr. 3 je graf znázorňující dávkově závislý protektivní efekt CHO buněk exprimujících TBPhCG(20-190) proti TNF-α indukované cytotoxicitě na BT-20 buňkách a řadě kontrol.
Obr. 4 je graf znázorňující dávkově závislý protektivní efekt COS buněk exprimujících TBPhCG(20-190) proti TNF-α indukované cytotoxicitě na BT-20 buňkách a řadě kontrol.
-6CZ 291212 B6
Obr. 5 je graf znázorňující dávkově závislý protektivní efekt afinitně přečištěných CHO buněk exprimujících TBP-hCG(20-161) proti TNF-α indukované cytotoxicitě na BT-20 buňkách a řadě kontrol.
Příklady provedení vynálezu
Vynález bude dále popsán pomocí následujících příkladů, které však nemohou být v žádném ío případě brány za limitace navrhovaného vynálezu.
Příklad 1
Materiál a metody
Buněčné linie použití pro tuto studii byly získány z Američan Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maiyland, pokud není uvedeno jinak. Buněčná linie CHO-DUKX byla získána od L. Chasina z Columbia University prostřednictvím D. Housemana zMIT (39). Buňky 20 CHO-DUKX, které postrádají funkční gen pro dihydrofolát reduktázu, byly kultivovány v kompletním α-plus Modified Eagles Medium (a(+)MEM) s 10% fetálním bovinním sérem (FBS).
Buňky COS-7 byly rutině pasážovány v Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) 25 doplněným 10% FBS. Pokud není uvedeno jinak, buňky byly ředěny tak aby byly udržovány v log fází růstu, kultivační média byla nakoupena od GIBCO (Grand Island, New York).
Sestavení genových konstruktů kódujících hybridní protein
Číselné označení pro p55 TNF receptoru je založeno na klonovacích údajích Wallacha (40), zatímco číselné označení pro hCG podjednotky je založeno na číslování podle Fiddesových údajů (41,42). Označení TBP, nebo TNF vázající protein se vztahuje k části extracelulámí domény TNF receptoru schopné vázat TNF. V tomto případě jsou DNA konstrukty označeny jako TBP-hybridní proteiny, s partnerem a oblastí TBP označenou v nomenklatuře konstruktu.
Všechny TBP-hCG konstrukty obsahující signální peptid lidského růstového hormonu (hCG) na místě přirozené p55 signální sekvence. Navíc, signální peptid hCG byl umístěn tak, aby těsně předcházel TBP residuum Asp20, o kterém se předpokládá, že je prvním residuem v hotovém sekretovaném proteinu. Tato modifikace není nezbytná pro hlavní koncept použití hCG jako partnera v hybridním proteinu.
DNA kódující hybridní protein byly konstruovány za použití PCR metody (43).
a. TBP 1(20-16 lý-hCG
Původní TBP-hCG konstrukt byl připraven tak, aby obsahoval doménu vážící ligand z extracelulámí oblasti p55 TNF receptoru (od Asp20 do residua Cyslól včetně) fúzovaný pomocí krátkého linkeru na hCG a a β podjednotky (počínaje residui aCys7 pro βΡΓθ7). Tento konstrukt, zde označovaný jako TBP 1(20-16l)-hCG, je heterodimer dvou modifikovaných hCG podjednotek, TBP 1(20-16 l)-hCGa a TBPl(20-161>-hCGp.
Pro konstrukt TBP 1(20-16 l)-hCGa byly použity tyto oligodeoxynukleotidové primery:
| Primer 1 (αβ) | TTT TCT CGA GAT GGC TAC AGG TAA GAG CCC (SEQ ID NO: 11) |
| Primer 2(a) | ACC TGG GGC AGC ACC GGC ACA GGA GA ACA CTC GTT TTC (SEQ ID NO: 12) |
| Primer 3 (a) | TGT GCC GGT GCT GCC CCA GGT TGC CCA GAA TGC ACG CTA CAG (SEQ ID NO: 13) |
| Primer 4 (a) | TTT TGG ATC CTT AAG ATT TGT GAT AAT AAC AAG TAC (SEQ ID NO: 14) |
Tyto a všechny ostatní použité primery popsané v těchto příkladech byl syntetizovány pomocí přístroje pro syntézu dna Applied Biosystems Model 392 (ABI, Foster City, Califomia), za použití chemie fosforamiditů.
Jelikož obě TBP-hCG podjednotky konstruktu mají stejný 5'konec (tzn. 5'konec hCG/TBP konstruktu), primer 1 (αβ) může být použit pro obě TBP-hCG podjednotky konstruktu. Další primery použité pro ΤΒΡ1(20-161)-1^Οβ^η5ίπι^ byly:
Primer 2 (β) CCG TGG ACC AGC ACC AGC ACA GA GAC ACA CTC GTT TTC (SEQ ID NO: 15)
Primer 3 (β) TGT GCT GGT TCT GGT CCA CGG TGC CGC CCC ATC AAT (SEQ ID NO: 16)
Primer 4 (β) TTT TGG ATC CTT ATT GTG GGA GGA TGC GGG TG (SEQ ID NO: 17)
Primery 2(a) a 3(a)jsou reverzně komplementární a pokrývají oba 3'konce kódujících oblastí pro p55 extracelulámí doménu a 5'konec α jednotky hCG. Podobně primeiy 2(β) a 3 (β) jsou rovněž reverzně komplementární a pokiývají oba 3'konce kódujících oblastí pro p55 extracelulámí doménu a 5'konec β podjednotky hCG.
Pro každý ze dvou konstruktů pro TBP-hCG podjednotku proběhly dvě PCR reakce. V první byly použity primery I (αβ) a 2 (α nebo β) a jako templát byl použit plazmid kódující rozpustná p55 residua 20-180 předcházené hCG signálním peptidem (plazmid pCMVhCGspcDNA.pA4). Ve druhé pak byly použity primery 3 (a nebo β) a 4 (a nebo β) a jako templát byl použit plazmid buď pSVL-hCGa, nebo ρβνΕ-ΙιΟΰβ (44). PCR proběhla za použití Vent™ polymerázy zNew England Biolabs (Beverly, Massachusetts) podle nároku doporučeného výrobcem, kdy pro každou reakci o 25 cyklech bylo použito:
100 mg templátové DNA mg každého primeru
U Vent™ polymerázy (New England Biolabs) denaturace v 99 °C po dobu 30 sekund renaturace pak: 59 °C po dobu 30 sekund pro primery 1 (αβ) a 2(a) °C po dobu 30 sekund pro primery 3 (a) a 4(a) °C po dobu 30 sekund pro primery 1 (αβ) a 2(β) °C pod dobu 30 sekund pro primery 3 (β) a 4 (β)
-8CZ 291212 B6 prodloužení v 75 °C po dobu 75 sekund.
Velikost PCR produktů byla zkontrolována elektroforézou v 2% agarózovém gelu a značena ethidium bromidem. Fragmenty byly pak purifikovány pomocí Wizard kolony (Promega) způsobem doporučeným výrobcem.
Konečná kódující sekvence pro TBP1 (20-161)-hCGa byla sestavena fúzní PCR za použití primeru 1 (αβ a primeru 4(a) a jako templát byl použit vyčištěný produkt zp55 a hCG ka fragmentů, získaný první PCR reakcí. První dva templáty, které díky překryvu mezi příměry 2(a) 3(a) mohou být denaturovány a renaturovány společně, prošly 10 cykly PCR v nepřítomnosti jakýchkoliv přidávaných primerů. Podmínky za kterých tato reakce proběhla byly v podstatě stejné jako u předchozích reakcí, pouze renaturace proběhla v 67 °C a fáze prodlužování probíhala 2 minuty. Po proběhnutí těchto 10 cyklů, byly přidány primery 1 (αβ) a 4 (a) a proběhlo dalších 10 cyklů. Podmínky pro tyto konečné reakce byly stejné jako pro reakce popisované dříve, pouze teplota při renaturaci byl 59 °C a fáze prodlužování probíhala 75 sekund.
Analýza produktů této reakce probíhala pomocí elektroforézy v 1% agarózovém gelu a potvrdila, že byly získány fragmenty okolo 110 bp. Fragmenty byly přečištěny přes Wizard kolonu a následně rozstřiženy pomocí Xbal a BamHI a znovu přečištěny v 0,7% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání. Vyčištěné fragmenty byly subklonovány do plasidu pSVL (Pharmacia), který byl nejprve rozstřižen pomocí Xbal a BamHI a přečištěny v 0,8% agarózovém gelu s nízkou teplotou tání. Následovala ligance pomocí T4 ligázy a směs byla použita k transformaci AG1 E. coli, které pak byly vysazeny na destičky obsahující LB/ampicilin a kultivovány přes noc při 37 °C. Plazmidová cDNA z ampicilinrezistentních kmenů byla analyzována po rozstřižení s pomocí Xbal a BamHI k ověření přítomnosti inzertu (který je enzymy vyštěpen). Bylo objeveno 6 klonů obsahujících inzert, a jeden (klon 7) byl vybrán pro další testování a označen pSVLTBPhCGa (obsahoval TBPl(20-161)-hCGa). Pomocí sekvenování inzertu pomocí dideoxy DNA metody (použito Seqenase™, U.S. Biochemicals, Cleveland Ohio) byla ověřena správná sekvence konstruktu a bylo zjištěno, že nedošlo k žádným nežádoucím změnám.
Výsledná kódující sekvence pro TBP 1(20-161)-ΝΧΙβ byla sestavena zcela stejným způsobem jako bylo popsáno pro TBP 1(20-16l)-hCGa za použití fúzní PCR a primerů 1 (αβ) a primeru 4 (β) a jako templát byl použit vyčištěný produkt z p55 a hCG β fragmentů, získaný první PCR reakcí. Výsledný pSVL plazmid obsahující inkriminovaný insert byl označen ρ5νΕΤΒΡ1ιΟΟβ.
TBP 1 (20-190)-hCG
Druhá sada TBP-hCG proteinů, byla připravena modifikací TBP 1(20-161)-HCG konstruktů aby vznikl analog obsahující TBP v rozsahu od Asp20 do Thrl90, namísto 20-161, oblasti v původním analogu. Toto bylo dosaženo pomocí nahrazení fragmentu mezi restrikčními místy BglII a Xbal v plazmidu pSVLTBPhCGa fragmentem obsahujícím změnu. Tyto fragmenty byly vytvořeny pomocí fúzní PCR. Primery byly:
Primer 1 TTT TAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC (SEQ ID NO: 18)
Primer 2 TGT GGT GCC TGA GTC CTC AGT (SEQ ID NO: 19)
Primer 3 ACT GAG GAC TCA GGC ACC ACA GCC GGT GCT GCC CCA GGT TG (SEQIDNO:20)
Primer 4 TTT TTC TAG AGA AGC AGC AGC CCA TG (SEQ ID NO:21)
Primery 1 a 2 byly použity pro vytvoření sekvence kódující oblast p55 residua od 161 do 190. PCR reakce proběhla v podstatě stejně jak byla popsána výše, za použití lpg každého primeru
-9CZ 291212 B6 a pUC-p55 jako templátu. Podobně primy 3 a 4 byly použity pro vytvoření linkeru mezi 3'-koncem oblasti kódující TBP a 5'-koncem a podjednotky hCG, kdy byl jako templát použit plazmid pSVLTBPhCGa. Velikost produktů těchto PCR reakcí (měla být okolo 296 bp a 121 bp) byla ověřena pomocí elektroforézy v 8 % polyakrylamidovém gelu (PAGE) a následně byla vyčištěna pomocí Wizard kolony. Primery 2 a 3 byly připraveny tak že se částečně navzájem překrývají, takže dva PCR produkty (z primerů 1 a 2, a z primerů 3 a 4) mohou být renaturovány během fúzního PCR s primery 1 a 4. Po fúzní reakci byl požadovaný produkt okolo 400bp zkontrolován a přečištěn na 1,5% agarózovém gelu a pomocí Wizard kolony. Tato DNA byla pak rozštěpena pomocí GblII a Xbal a ligována s BglII/Xbal rozštěpeným pSVLTBPhCGa. Přítomnost inzertu v plazmidu izolovaném z transformované AG1 E. coli byla ověřena rozštěpením pomocí GblI a Xbal. Nový konstrukt byl označen pSVLTBP(20-190)-hCGa.
Podobně plazmid pSVLTBPhCGp byl modifikován substitucí BglII-Xcml fragmentu. Toho bylo dosaženo subklonováním jednoho PCR produktu, spíše než fúzního PCR produktu. Primery 1 a 2b (viz níže) byly použity s pUC-p jako templáty.
Primer 2b TTT TCC ACA GCC AGG GTG GCA TTG ATG GGG CGG CAC AGT GGA CCA GCA CCA GCT GTG GTG CCT GAG TCC TCA GTG (SEW ID NO: 22)
Výsledný PCR produkt (okolo 337 bp) byl zkontrolován a přečištěn stejně jak už bylo popsáno výše, rozštěpen pomocí BglII a XcmI a pak ligován s GblII/Xbal rozštěpeným pSVLTBPhCGp. Přítomnost inzertu v plazmidu izolovaném v transformovaných AG E. coli byla ověřena rozštěpením pomocí BglII a XcmI. Nový konstrukt byl pak označen pSVLTBP(20-190)-hCGp.
Nakonec byl nový konstrukt zkontrolován sekvenováním. Navíc, kromě produkce těchto nových plazmidů založených na pSVL, byly tyto konstrukty také subklonovány do jiných expresních vektorů tak, aby byl více vhodné pro stabilní expresi v CHO, konkrétně to byly vektor Da, dříve popsaný jako plazmid CLH3AXSV2DHFR (45). To bylo uskutečněno pomocí konverze míst BamHI ohraničujícího inzerty ve vektorech odvozených od pSVL na Xhol místo a vyštěpením inzertu pomocí Xhol a klonováním do Xhol naštěpeného Da.
Přechodná a stabilní exprese hybridních proteinů
Transfekce COS-7 buněk (ATCC CRL 1651, ref. 46) pro dočasnou expresi TBP-hCG hybridních proteinů byla provedena pomocí elektroporace (47). Exponenciálně rostoucí COS-7 buňky byly sebrány pomocí trypsinu a lehce centrifugovány (800 rpm, 4 min) promyty studeným fosfát-fyziologickým roztokem (BPS), pH 7,3-7,4 a znovu zcentrifugovány. Buňky byly resuspendovány v koncentraci 5x106 buněk na 400 μΐ v studeném PBS a smíchány s lOpg plazmidové DNA v předchlazené 2 mm elektroporační kyvetě. Pro kontransfekci bylo použito 5 pg každého plazmidu. Kyveta s buňkami byla chlazena na ledu dalších 10 minut a poté podrobena elektroporaci za použití přístroje BTX Model 600, při 125 V, 950 pF a R=8. Poté byly buňky zchlazeny na ledu 10 minut, přeneseny do kónických zkumavek obsahujících 9,5 ml kompletního média (Dulbecco's modifíed Eagle's medium (DMEM) doplněné 10% fetálním bovinním sérem (FBS) a 1% L-glutaminem) o pokojové teplotě, a ponechány při teplotě 5 minut. Po jemném zamíchání v 15ml zkumavce byl celý objem vysazen na dvě PÍ00 misky a kultivován v inkubátoru při 37 °C v 5% CO2. Po 18 hodinách bylo médium vyměněno a v některých případech média obsahovala pouze 1% nebo 0% FBS. Po dalších 72 hodinách byla upravena média sebrána, centrifugací vyčištěna od buněk a zamražena na -70 °C.
Transfekce CHO-DUKX (CHO) buněk pro dočasnou nebo trvalou expresi byla provedena pomocí kalcium fosfátové precipitace DNA. 24 hodin před transfekcí, byly exponenciálně rostoucí CHO buňky přeneseny na 100 mm kultivační misky, v denzitě 7,5xl05 buněk na misku. V den transfekce, bylo 10 pg plazmidové DNA přeneseno do 0,5 ml transfekčního pufru (viz níže), bylo přidáno 31 pl 2M CaCl2, roztok DNA- CaCl2 byl na vortexu rozmíchán
- 10CZ 291212 B6 a ponechán při pokojové teplotě 20 minut. Po uplynutí této doby bylo na misky přidáno 5 ml kompletního média a(+)MEM obsahujícího 10% FBS a misky byly inkubovány 4 až 6 hodin v 37 °C. Poté bylo médium opatrně sebráno a buňky byly vystaveny glycerolovému šoku, inkubací v roztoku 15% glycerolu v transfekčním pufru při 37 °C po dobu 3,5 minutu. Po odstranění roztoku glycerolu byly buňky 2x promxTy v PBS, resuspendovány v lOml kompletního a(+)MEM s 1% FTS, a vloženy do inkubátoru do 37 °C. Po stabilní transfekci byly buňky po 48 hodinách rozředěny 1:10 a inkubovány na selekčním médiu (kompletní a-minus MEM (bez nukleotidů), 10% dialyzované FBS a 0,02 mm methotrexát). Netransfekované (nerezistentní) buňky jsou většinou během 3 až 4 týdnů eliminovány a v miskách zůstane pouze populace transfekovaných k methotrexátu rezistentních buněk.
Kvantifikace exprese
Míra sekrece hydridních proteinů transfekovanými buňkami byla stanovena pomocí komerčního kitu pro rozpustný p55 (R&D systems, Minneapolis Minnesota) podle návodu uváděného výrobcem. Pomocí této metody byl také hybridní protein stanoven v upravených médiích, což sloužilo jako základ pro výběr dávek použitých v technologii.
Určení formace heterodimeru
Pro ověření schopnosti fúzních podjednotek TBP-hCG kombinovat se a tvořit heterodimery byla použita sendvičová metoda použití protilátek proti hCG. Při této metodice je mikrotitrační destička potažena monoklonálními protilátkami proti hCG β podjednotce, které slouží k zachycení vzorku. Primární detekční protilátka je polyklonální kozí protilátka proti lidské a podjednotce TSH (#082422G - Biodesign Intemational, Kennebunkport Maine), která je následně detekována pomocí králičí anti kozí polyklonální protilátky konjugované s křenovou peroxidázou (Cappel, Dumham, North Carolina).
V tomto pokusu byly použito několik rozdílných protilátek proti β podjednotce hCG,. z nichž žádný nevykazovala křížovou reakci s volnou a podjednotkou. jedna z těchto protilátek (3/6) je používána v komerčním kitu MAIAclone hCG assay (Biodata, Roma, Italy).
Mikrotitrační destičky silně vázající protein (Costar #3590) byly potaženy zachytávající protilátkou inkubací (2 h, 37 °C) ΙΟΟμΙ/jamku roztoku 5 pg/ml protilátky ve značícím pufru (PBS, pH 7,4 + 0,1 % Tween 20) destička byla blokována kompletním zaplněním jamky (~ 400 μΐ/jamku) blokujícím roztokem (3 % hovězí sérový albumin (BSA, frakce V- A- 4503 Sigma) v PBS, pH 7,4) a inkubací po dobu jedné hodiny v 37 °C nebo přes noc ve 4 °C. Destička je pak 2x promyta promývacím roztokem a kontrolní i experimentální vzorky jsou rozpuštěny v rozpouštědle (5 mg/ml BSA v PBS, pH 7,4) tak aby výsledný objem byl 100 μΐ. Po inkubaci vzorků a destiček po dobu dvou hodin ve 37 °C, byly destičky opět 2x promyty promývacím roztokem. Pak bylo přidáno ΙΟΟμΙ/jamku primární detekční protilátky rozředěné 1:5000 v rozpouštědle. Sekundární detekční protilátka (HRP konjugovaná králičí anti kozí Ig) je přidána rozředěná 1:5000 v rozpouštědle (100 μΐ/jamku) a po inkubaci po dobu jedné hodiny v 37 °C byla destička třikrát promyta promývacím roztokem. Poté bylo přidáno 100 μΐ roztoku substrátu TMB (Kirkergaardf and Perry Laboratories) a destička byla inkubována 20 minut ve tmě při pokojové teplotě, enzymatická reakce byla zastavena přidáním 50 μΐ/jamku 0,3 M H2SO4. Destička byla nakonec analyzována pomocí zařízení ELISA reader při 450 nm.
Částečné přečištění
Pro lepší kvantifikaci aktivity těchto hybridních proteinů, byly TBP-hCG hybridní proteiny částečně přečištěny imunoafínitní chromatografií. Použitá protilátka byla monoklonální protilátka komerčně dostupná od R&D Systems (MAB #225). V koloně byl jako nosič použita CNBr aktivovaná separóza s navázanou protilátkou dle návodu uváděného výrobcem (Pharmacia).
- 11 CZ 291212 B6
Upravená média byla sebrána zT-175 kultivačních lahví od všech linií každý den po 50 ml, celkem pětkrát po sobě. Sebraná média byla centrifugována (1000 RPM) aby byly odstraněny zbytky buněk. Zbytek byl analyzován na obsah TBP pomocí komerční imunotechniky a zahuštěn (Centricon unit od Amicon, Beverly Massechusetts) tak aby výsledná koncentrace byla přibližně 50 ng/ml.
ml koncentrovaného TBP-hCG (vzorek #18873) bylo převedeno do přibližně 1 M NaCl přidáním NaCl a nastavením vodivosti roztoku na 85 mS/cm. Tento roztok byl puštěn přes kolonu ještě jednou. Poté byla kolona promyta 1 M NaCl vPBS. Navázané TBP(20-161)-hCG byl vymývány kolony 50 mm kyselinou citrónovou (pH 2,5). Vymytý roztok (asi 7 ml) byl koncentrován pomocí Amicon Centricon-10, dle instrukcí výrobce (Amicon), na objem přibližně 200 μΐ. Vzorek byl doplněn přibližně 800 μΐ tak aby výsledný objem byl 1 ml a až do testování byl skladován při 4 °C
Stanovení anti-TNF aktivity
Celá řada TNF indukovaných cytotoxických technik bylo popsáno pro testování analogů rozpustných TNF receptorů. My jsme použili techniku využívající lidskou buněčnou linii karcinomu prsu BT-20 (ATCC HTB 19): Použití těchto buněk jako základu detekční techniky pro TNF bylo již popsáno dříve (48). Tyto buňky byly kultivovány v 37 °C v RPMI 1640 médiu doplněném 10% tepelně inaktivovaného FBS. Buňky rostly do maximálně 80 až 90% hustoty, což zahrnovalo ředění každé 3 až 4 dny s výchozí denzitou okolo 3 x 106 buněk na TI75 cm2 láhev.
Technika využívající BT-20 zahrnuje vitální značení buněk pomocí krystalové violeti, jako detekční metody pro určení životnosti buněk po inkubaci s TNF. Mrtvé buňky nejsou schopné barvivo vyloučit a zůstávají tedy obarvené.
Zkráceně, protokol použitý pro tuto techniky určování anti-TNF aktivity je následující. Rekombinantní lidský TNFa (R&D systems) a experimentální vzorky byly rozředěny do média (RPMI 1640 s 5 % tepelně inaktivovaného FBS) na 96-jamkové kultivační destičce. Buňky byly přidány do jamek v koncentraci 1x105 buněk/jamku. Množství přidaného TNF bylo již stanoveno dříve pomocí titračních studií a představovalo množství, které běžně přežívá přibližně 50 % buněk. Po přidání vzorků byly buňky kultivovány 48 hodin v 37 °C a po ukončení této kultivace byl počet přežívajících buněk stanoven pomocí značení krystalovou violetí a měřením na ELIS A readeru (570 nm).
Závěr
Studované konstrukty
Struktura studovaných hybridních proteinů je shrnuta dále, pro srovnání byly použity dva kontrolní proteiny, monomerní rozpustný p55 (r-hTBP-1) a dimerní fúzní TBP-imunoglobulin protein (TBP-IgG3) (připravený tak jak je uvedeno v (10)).
-12CZ 291212 B6
| Konstrukt | TBP N-konec | TBP C-konec | fúzní |
| partner r-hTBP-1 | směs 9 a 20 | 180 | žádný |
| TBP-IgG3 | směs 9 a 20 | 190 | konstantní oblast IgG3 |
| TBP (20-160)-hCG20 | 161 | těžkého řetězce hCGa a hCGp (heterodimer) | |
| TBP(20-190)-hCG20 | 190 | hCGa a hCGP (heterodimer) |
Sekvence DNA kódující TBP(20-I61)-hCG a TBP(20-190)-hCG jsou uvedeny na obrázku 1 a 2.
Sekrece TBP-hCG proteinů
Všechny testované konstrukty byly produkovány a sekretovány do média transfekovanými savčími buňkami do média. Výsledky které to ukazují jsou uvedeny v tabulce 1 a 2.
TBP-hCG(a/p) fůzní proteiny tvoří heterodimery
Kombinace TBP-hCGa a TBP-hCGp byly potvrzeny použitou sendvičovou technikou pro hCG heterodimer. Pouze kombinovaná transfekce a a β podjednotky vede k detekci heterodimeru 15 (tab. 3).
TBP-hCG heterodimer vykazuje vyšší aktivitu než TBP monomer
Hybridní proteiny produkované buď COS-7, nebo CHO jsou silnými inhibitory TNFa v BH-20 20 technice. Výsledky testů některých vzorků jsou shrnuty v tabulce 4.
Negativní kontroly (upravená média ze simulovaných transfekcí) byly použity jako 1 vzorek média.
Jak ukazují obrázky 3 až 5 (body na ose y), přidány TNF (2,5ng/ml) vede kjasnému snížení přežívajících buněk v kultuře (jak bylo měřeno při OD 570). Ve všech případech, aktivní vzorky měly maximální ochranný efekt na přežívání buněk až na úroveň která byla u vzorků bez TNF (tzn. kontroly označené „samotné buňky“).
Pozitivní kontroly, r-hTBP-1 a TBp-IgG3, měly obě protektivní efekt s jasnou závislostí na dávce a ED500 okolo 100 ng/ml pro r-hTBP-1 (obr. 3 a 5) a asi 1,5 ng/ml ro TBP-IgG3 (obr. 3).
TBP-hCG konstrukty z lx média (CHO nebo COS) nebo po imunopurifikaci vykazují na dávce závislý ochranný efekt s ED50 okolo 2 až 11 ng/ml (obr. 3 až 5). Závěry in vitro technik jsou 35 uvedeny v tabulce 5. Výsledky ukazují, že hybridní proteiny inhibují cytotoxicitu TNF a že jsou podstatně účinnější než TBP monomer. V negativní kontrole se neprojevila žádná protektivní aktivita.
Navíc, nejen že dimerizace TBP může zvyšovat jeho účinnost, je také možné že aktivita 40 hybridních proteinů se nevztahuje k dimerickým interakcím s TBP, ale spíše ke sterické inhibici partnerem hybrida interferujícím s rozpustným TBP/TNF vázajícím se na TNF receptory na buněčném povrchu.
Všechny reference zde citované, včetně článků z časopisů nebo abstraktů, publikované nebo 45 vztahující se k US nebo cizím patentovým aplikacím, uznané US nebo zahraniční patenty, nebo jakkoliv jiné reference jsou zde vcelku zahrnuty jako reference včetně všech výsledků, tabulek,
-13CZ 291212 B6 obrázků a textu uvedeného v citované referenci. Navíc, celý seznam referencí citovaný v referenci zde citované je také celý zahrnut referencí.
Reference vztahující se ke známým metodickým postupům, konvenčním metodickým postupům, 5 nebo konvenčním metodikám v žádném případě neznamenají, že libovolný aspekt, popis, konkrétní varianta zahrnutá v navrhovaném vynálezu je známá v současném stavu techniky.
Předcházející popis konkrétní varianty nebude plně popisovat celkovou myšlenku vynálezu, neboť je možné, pomocí znalostí dobře známých v dosavadním stavu techniky (včetně seznamu 10 citace zde uvedeném) modifikovat a/nebo adaptovat postup pro řadu aplikací a konkrétních variant, bez složitého zkoumání a bez překročení hranic daných celkovým konceptem navrhovaného vynálezu. Tedy tyto adaptace a modifikace zapadají do smyslu vymezeného možnostmi a variantami založenými či odvozenými od zde uvedených. Je samozřejmé, že frazeologie a terminologie zde používaná je pouze pro účely popisu a není limitací, tato 15 terminologie a frazeologie předkládané specifikace nemůže být interpretována odborníky ve světle odvozenin a návodů zde prezentovaných v kombinaci se znalostmi současného stavu techniky.
-14CZ 291212 B6
Seznam citací
| 1. | Smith, R.A. et al., J. Biol. Chem. 262:6951- | |
| 6954, | 1987. 2 . | Eck, M.J. et al., J. Biol. Chem. 264:17595- |
| 17605, | 1989. | |
| 3 . | Jones, E.Y. et al , Nátuře 338:225-228, 1989. | |
| 4 . | Eck, M.J. et al., J. Biol. Chem. 267:2119-2122, | |
| 1992. | ||
| 5. | Pierce, J.G. et al., Annu. Rev. Biochem. | |
| 50:465 | -495, | 1981. |
| 6 . | Lapthorn, A.J. et al., Nátuře 369:455-461, | |
| 1994 . | ||
| 7 . | Wu, H., et al., Structure 2:545-550, 1994. | |
| 8 . | Engelmann, H., et al., J. Biol. Chem. |
265:14497-14504, 1990.
9. Adam, D. et al., J. Biol. Chem. 270:17482 17487,
1995.
| 10 . | Loetscher, H.R., et al., J. Biol. Chem. | |
| 266:18324-18329 | , 1991. | |
| 11 . | Banner, D.W., et al. , Cell 73:431-445, 1993. | |
| 12 . | Pennica, D. , et al. , Biochemistry 32:3131- 3138, | |
| 1993 . | ||
| 13 . | Engelmann, H. et a]., J. Biol. Chem. 265:1531- | |
| 1536, | 1990 . | |
| 14 . | Van Zee, K.J. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. | |
| USA 89 | :4845-4849, 1992. | |
| 15. | Aderka, D. et al., J. Exp. Med. 175:323-329, | |
| 1992 . | ||
| 16 . | Mohler, K.M., et al., J. Immunol. 151:1548-1561 | |
| 1993 . | ||
| 17. | Bertini, R. , et al. , Eur. Cytokine Netw. , 1993. | |
| 18 . | Piguet, P.F., et al. , Immunology 77:510- 514, | |
| 1992 . | ||
| 19 . | Williams, R.O., et al., Immunology 84:433-439, | |
| 1995 . | ||
| 20 . | Capon, D.J., et al., Nátuře 337: 525-531, 1989. |
-15CZ 291212 B6
| 21. | Ashkenazi, A., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. |
| 88:10535-10539, | , 1991. |
| 22. | Suitters, A.J., et. al. J. Exp. Med. 179:849-856, |
1994 .
| 23. | Nolan, O.et al., Biochim. Biophys. Acta 1040:1- |
11, 1990.
| 24 . | Rodrigues, M.L., et al., J. Immunol. 151:6954- |
6961, 1993.
| 25. | Chang, H.-C., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. |
USA 91:11408-11412, 1994.
| 26. | Wu, Z., et al., J. Biol. Chem. 270:16039-16044, |
1995.
| 27 . | Bazzoni, F. et al, Proč. Nati- Acad. Sci. USA |
92:5376-5380, 1995.
| 28. | Boldin, M.P., et al., J. Biol. Chem. 270:387- |
391,1995.
| 29. | Vu, T.-K.H., et al.. Cell, 64:1057-1068, 1991. |
| 30 . | Song, H.Y., et al., J. Biol. Chem. 269:22492- |
22495, 1994.
| 31. | Russell, D.A., et al., J. Infectious Diseases |
| 171:1528-1538, | 1995. |
| 32 . | Rao C.V. et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 146, |
65-68, 1983.
| 33 . | Damewood M.D. et al., Fertil. Steril. 52, 398- |
400, 1989.
| 34 . | Chen, F., et al., Mol. Endocrinol. 6:914-919, |
1992.
| 35. | Bielinska, M.f et al., J. Cell Biol. 111:330a, |
1990.
| 36 . | Furuhashi, M., et al., Mol Endocrinol. 9:54-63, |
1995.
| 37 . | Sugahara, T., et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. |
USA 92:2041-2045, 1995.
| 38. | Johnson, G.A., et al., Biol. Reprod. 52:68-73, |
1995.
| 39 . | Urlaub, G. and Chasin, L. Proč. Nati. Acad. |
Sci. USA 77:4216-4220, 1980.
| 40 . | Nophar, Y., et al., EMBO J. 9:3269-3278, 1990. |
- 16CZ 291212 B6
| 41. | Fiddes, J.C. et al., Nátuře 281:351-356, 1979. | |
| 42 . | Fiddes, J.C. et al., Nátuře 286:684-687, 1980. | |
| 43 . | Elion, E.A., in Current Protocols in Molecular | |
| Biology, | eds. | Ausuble, FM. et al., John Wiley & Sons, 1993. |
| 44 . | Campbell, R. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:760- | |
| 764, 1991 | • | |
| 45. | Cole E.S. et al., Biotechnology, 11, 1014-1024, | |
| 1993 . | ||
| 46 . | Gluzman, Y., Cell 23:175-182, 1981. | |
| 47. | Chu, G. et al., Nucl. Acid Res. 15:1313-1326, | |
| 1987. | ||
| 48 . | Yen, J. et al., J. Immunotherapy 10:174-181, | |
| 1991. |
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (19)
10 1. Hybridní protein složený ze dvou koexprimovaných aminokyselinových sekvencí tvořících heterodimer, z nichž každá obsahuje:
a) alespoň jednu aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující řetězec homomemího receptorů, řetězec heteromerního receptorů, ligand a jejich fragmenty, které si
15 zachovaly schopnost vazby ligand-receptor,
b) subjednotku heterodimemího proteinového hormonu, nebo jejich fragmenty, které si zachovávají schopnost formovat heterodimer sjeho další jednotkou,
20 kde sekvence (a) a (b) jsou navázány přímo, nebo přes peptidový linker, a v kterých sekvence (b) v každé z uvedených koexprimovaných sekvencí jsou schopny vzájemné agregace za vzniku heterodimemího komplexu.
2. Hybridní protein podle nároku 1, kde uvedená sekvence (a) je vybraná ze skupiny zahrnující 25 TBP1, TBP2 nebo jejich fragmenty ještě obsahující doménu vázající ligand, extracelulámí doménu IFNa/β receptorů, nebo IFNy receptorů, receptor pro gonadotropin, nebo jeho extracelulámí fragmenty, a IL-6, IFN-β, TPO nebo jejich fragmenty.
3. Hybridní protein podle nároku 1, kde uvedená sekvence (b) je vybraná ze skupiny zahrnující 30 hCG, FSH, LH, TSH nebo inhibin a jejich fragmenty.
4. Hybridní protein podle nároku 1, kde uvedená sekvence (a) je napojena na aminový konec sekvence (b).
35
5. Hybridní protein podle nároku 1, kde uvedená sekvence (a) je napojena na karboxylový konec sekvence (b).
-17CZ 291212 B6
6. Hybridní protein podle nároku 1, kde obě koexprimované aminokyselinové sekvence obsahují sekvence pro TBP1 nebo jeho fragment odpovídající aminokyselinovým residuím 20-161 nebo 20-190 TBP1, jako sekvence (a) a odpovídající a a β podjednotky hCG nebo jeho fragmenty jako sekvence (b).
7. Hybridní protein podle nároku 1, kde obě koexprimované aminokyselinové sekvence obsahují extracelulámí doménu receptorů pro gonadotropin jako sekvence (a) a odpovídající a a β podjednotky gonadotropinu jako sekvence (b).
8. Hybridní protein podle nároku 1, kde uvedená sekvence (a) je extracelulámí doména FSH receptorů a sekvence (b) je podjednotka FSH.
9. Hybridní protein podle nároku 7, kde sekvence (a) a (b) jsou napojeny peptidovým linkerem.
10. Hybridní protein podle nároku 9, kde peptidový linker obsahuje štěpící místo pro enzym.
11. Hybridní protein podle nároku 10, kde štěpící místo pro enzym je štěpící místo pro trombin.
12. Hybridní protein podle nároku 10, kde štěpící místo pro enzym je rozeznáváno a štěpeno enzymem, který se nachází ve vaječnících.
13. Hybridní protein podle nároku 9, kde peptidový linker slouží jako flexibilní pant.
14. Molekula DNA, která kóduje hybridní protein podle nároku 1.
15. Expresní vektor, který obsahuje molekulu DNA podle nároku 14.
16. Hostitelská buňka, která obsahuje expresní vektor podle nároku 15 a je schopna exprimovat hybridní protein podle nároku 1.
17. Způsob produkce hybridního proteinu podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelských buněk podle nároku 16, a extrakci jimi exprimovaného hybridního proteinu.
18. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje hybridní protein podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič a/nebo vehikulum.
19. Použití hybridního proteinu podle nároku 1 až 13 pro přípravu farmaceutického prostředku pro indukci folikulárního zrání.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1193696P | 1996-02-20 | 1996-02-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ264498A3 CZ264498A3 (cs) | 1998-12-16 |
| CZ291212B6 true CZ291212B6 (cs) | 2003-01-15 |
Family
ID=21752599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982644A CZ291212B6 (cs) | 1996-02-20 | 1997-02-20 | Hybridní protein, molekula DNA, expresní vektor, hostitelská buňka, způsob produkce hybridního proteinu, jeho pouľití a farmaceutický prostředek |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6193972B1 (cs) |
| EP (1) | EP0894141B1 (cs) |
| JP (2) | JP4140927B2 (cs) |
| KR (1) | KR100369985B1 (cs) |
| CN (1) | CN1261579C (cs) |
| AT (1) | ATE295887T1 (cs) |
| AU (1) | AU706504B2 (cs) |
| BG (1) | BG64510B1 (cs) |
| BR (1) | BR9707589A (cs) |
| CA (1) | CA2245877C (cs) |
| CZ (1) | CZ291212B6 (cs) |
| DE (1) | DE69733309T2 (cs) |
| DK (1) | DK0894141T3 (cs) |
| EA (1) | EA002474B1 (cs) |
| EE (1) | EE04025B1 (cs) |
| ES (1) | ES2241040T3 (cs) |
| HU (1) | HUP9900619A3 (cs) |
| IL (1) | IL125864A (cs) |
| NO (1) | NO321777B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ331539A (cs) |
| PL (1) | PL187400B1 (cs) |
| PT (1) | PT894141E (cs) |
| SK (1) | SK282326B6 (cs) |
| UA (1) | UA52646C2 (cs) |
| WO (1) | WO1997030161A1 (cs) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ331539A (en) * | 1996-02-20 | 2000-01-28 | Applied Research Systems | Hybrid proteins from two coexpressed receptors to form a heterodimer |
| US6635740B1 (en) * | 1997-03-27 | 2003-10-21 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Ligand/lytic peptide compositions and methods of use |
| CA2301846A1 (en) | 1997-09-04 | 1999-03-11 | Gryphon Sciences | Modular protein libraries and methods of preparation |
| EA006605B1 (ru) * | 2000-02-22 | 2006-02-24 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО чХГ |
| US20030228600A1 (en) * | 2000-07-14 | 2003-12-11 | Eppendorf 5 Prime, Inc. | DNA isolation method and kit |
| IL147414A0 (en) * | 2001-12-31 | 2002-08-14 | Yeda Res & Dev | Ifnar2 mutants, their production and use |
| US20030157091A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-08-21 | Dyax Corporation | Multi-functional proteins |
| DE10247755B4 (de) * | 2002-10-14 | 2006-01-19 | Pfizenmaier, Klaus, Prof. Dr. | Selektive, lokale Aktivierung von Mitgliedern der TNF-Rezeptorfamilie durch systemisch inaktive nicht-Antikörper-TNF-Liganden-Fusionsproteine |
| AU2005207960A1 (en) * | 2004-01-28 | 2005-08-11 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Heterodimeric follicle stimulating hormone-Fc (FSH-Fc) fusion proteins for the treatment of infertility |
| JP2008525002A (ja) | 2004-12-23 | 2008-07-17 | ラボラトワール セローノ ソシエテ アノニム | Ｂｃｍａポリペプチド及びその使用 |
| PT1885753E (pt) | 2005-06-03 | 2011-10-06 | Ares Trading Sa | Produção de proteína recombinante de ligação a il-18 |
| CN108129573B (zh) * | 2007-09-21 | 2021-10-08 | 加利福尼亚大学董事会 | 被导靶的干扰素显示强的细胞凋亡和抗肿瘤活性 |
| EP3009513A1 (en) * | 2008-02-01 | 2016-04-20 | Chromocell Corporation | Novel cell lines and methods |
| CN102002495B (zh) * | 2009-08-31 | 2012-07-18 | 成都蓉生药业有限责任公司 | 用于表达异二聚体糖蛋白激素的表达框、表达载体及制备方法 |
| SG10201602371VA (en) * | 2011-03-25 | 2016-04-28 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Hetero-dimeric immunoglobulins |
| ES2771478T3 (es) | 2013-02-18 | 2020-07-06 | Vegenics Pty Ltd | Moléculas de unión a ligando y usos de las mismas |
| JP7439372B2 (ja) * | 2018-06-21 | 2024-02-28 | シャタック ラボ，インコーポレイテッド | ヘテロ二量体タンパク質及びその使用 |
| US20220227837A1 (en) * | 2019-05-24 | 2022-07-21 | Proviva Therapeutics (Hong Kong) Limited | Il-2 compositions and methods of use thereof |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0721983A1 (en) * | 1988-01-22 | 1996-07-17 | ZymoGenetics, Inc. | Methods of producing biologically active peptide dimers |
| US5705478A (en) * | 1989-02-21 | 1998-01-06 | Washington University | Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists |
| US6225449B1 (en) * | 1991-10-04 | 2001-05-01 | Washington University | Hormone analogs with multiple CTP extensions |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5650150A (en) * | 1990-11-09 | 1997-07-22 | Gillies; Stephen D. | Recombinant antibody cytokine fusion proteins |
| IL99120A0 (en) * | 1991-08-07 | 1992-07-15 | Yeda Res & Dev | Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| US5932448A (en) * | 1991-11-29 | 1999-08-03 | Protein Design Labs., Inc. | Bispecific antibody heterodimers |
| ATE242322T1 (de) | 1992-03-30 | 2003-06-15 | Immunex Corp | Fusionsprotein , das zwei rezeptoren des tumornekrose-faktors enthält |
| US5447851B1 (en) * | 1992-04-02 | 1999-07-06 | Univ Texas System Board Of | Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells |
| IL111125A0 (en) | 1994-05-11 | 1994-12-29 | Yeda Res & Dev | Soluble oligomeric tnf/ngf super family ligand receptors and their use |
| NZ331539A (en) * | 1996-02-20 | 2000-01-28 | Applied Research Systems | Hybrid proteins from two coexpressed receptors to form a heterodimer |
| US6194177B1 (en) * | 1996-02-20 | 2001-02-27 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | DNA encoding a hybrid heterodimeric protein |
-
1997
- 1997-02-20 NZ NZ331539A patent/NZ331539A/xx unknown
- 1997-02-20 US US08/804,166 patent/US6193972B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 CN CNB971924112A patent/CN1261579C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 EP EP97906604A patent/EP0894141B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 IL IL125864A patent/IL125864A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 CZ CZ19982644A patent/CZ291212B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 WO PCT/US1997/002315 patent/WO1997030161A1/en active IP Right Grant
- 1997-02-20 EE EE9800256A patent/EE04025B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 EA EA199800744A patent/EA002474B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 KR KR10-1998-0706215A patent/KR100369985B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 PL PL97328454A patent/PL187400B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 DE DE69733309T patent/DE69733309T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 ES ES97906604T patent/ES2241040T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-02-20 HU HU9900619A patent/HUP9900619A3/hu unknown
- 1997-02-20 JP JP52949897A patent/JP4140927B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 CA CA2245877A patent/CA2245877C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-02-20 AT AT97906604T patent/ATE295887T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-02-20 DK DK97906604T patent/DK0894141T3/da active
- 1997-02-20 UA UA98094928A patent/UA52646C2/uk unknown
- 1997-02-20 BR BR9707589-2A patent/BR9707589A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-02-20 PT PT97906604T patent/PT894141E/pt unknown
- 1997-02-20 AU AU21252/97A patent/AU706504B2/en not_active Ceased
- 1997-02-20 SK SK1148-98A patent/SK282326B6/sk unknown
-
1998
- 1998-08-19 NO NO19983799A patent/NO321777B1/no unknown
- 1998-08-20 BG BG102705A patent/BG64510B1/bg unknown
-
2001
- 2001-01-09 US US09/756,186 patent/US6663867B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-12-01 US US10/724,226 patent/US7291339B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-07-10 JP JP2007181534A patent/JP2008019258A/ja active Pending
- 2007-09-26 US US11/861,835 patent/US20100075402A1/en not_active Abandoned
- 2007-10-30 US US11/929,292 patent/US20090240039A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100075402A1 (en) | DNA coding for polypeptide fusion | |
| US6194177B1 (en) | DNA encoding a hybrid heterodimeric protein | |
| CN111315768A (zh) | 具有缀合位点的t细胞调节性多聚体多肽及其使用方法 | |
| US20220056102A1 (en) | Multi-functional fusion proteins and uses thereof | |
| JPH11504819A (ja) | 新規の変異型ｃｄ４０ｌ | |
| KR101250364B1 (ko) | 오스테오프로테게린 변이체 단백질 | |
| JP4493854B2 (ja) | リガンドの生物学的活性を増強する方法 | |
| US20050250185A1 (en) | OGH fusion polypeptides and therapeutic uses thereof | |
| WO2005058953A2 (en) | Ogh fusion polypeptides and therapeutic uses thereof | |
| EP1541689B1 (en) | Hybrid proteins which form heterodimers | |
| MOOSMAYER et al. | Characterization of different soluble TNF receptor (TNFR80) derivatives: positive influence of the intracellular domain on receptor/ligand interaction and TNF neutralization capacity | |
| MOOSMAYER | Receptor/Ligand Interaction and TNF Neutralization Capacity |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090220 |