JPH11504819A - 新規の変異型ｃｄ４０ｌ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＣＤ４０Ｌの変異型であるポリペプチド、およびＤＮＡ配列、ベクターおよびそのようなＣＤ４０Ｌ変異型を提供するのに有用な形質転換された宿主細胞、を開示している。

Description

【発明の詳細な説明】 新規の変異型ＣＤ４０Ｌ 発明の背景 ヒトＣＤ４０タンパク質（ＣＤ４０）は、３０，６００の分子量を持つ２７７ アミノ酸からなるペプチド、および疎水性アミノ酸を多く含む１９アミノ酸から なる分泌シグナルペプチドである（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、ＥＭＢＯ Ｊ． ，８：１４０３，１９８９）。ＣＤ４０は、膜が二つの形のＴＮＦレセプター（ Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｊｅｎｃｅ，２４８：１０１９．１９９０；およびＳｃｈａ ｌｌら、Ｃｅｌｌ，６１：３６１、１９９０）、神経成長因子レセプター（Ｊｈ ｏｎｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，４７：５４５．１９８６）、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０（Ｍ ａｌｌｅｔｔら、ＥＭＢＯ Ｊ．，９：１０６３，１９９０）、ヒトＦａｓ抗原 （Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ，６６：２３３，１９９１）およびマウス４−１ＢＢレ セセター（Ｋｗｏｎら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：４１４，１９８９ ［Ｋｗｏｎら、Ｉ］およびＫｗｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．．ＵＳＡ，８６：１９６３、１９８９［Ｋｗｏｎら、II］）を含むレセプター の族に属する。ヒトの成熟型ＣＤ４０タンパク質の分子量（グリコシル化を除く ）は、２８，３００である。 活性化されたＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４０（ＣＤ４０Ｌ）のためのリガンド を高レベルで発現している。ヒトＣＤ４０Ｌ、膜結合糖タンパク質は、Ｓｐｒｉ ｇｇｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１５４３（１９９２）およびＷＯ９ ３／０８２０８７に記載されているように、末梢血液Ｔ細胞よりクローン化した 。マウスＣＤ４０Ｌのクローニングは、Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ，３ ５７：８０，１９９２に記載されている。ＣＤ４０Ｌは、共刺激因子が何も存在 しなくてもＢ細胞の増殖を誘導し、また、サイトカイン存在下でイムノグロブリ ンの生成を誘導することができる。ＣＤ４０Ｌは、Ｃ末端に細胞外領域、膜貫通 領域およびＮ末端に細胞内領域を持つ膜ポリペプチドII型であろ。可溶型のＣＤ ４０Ｌは、ＣＤ４０Ｌの細胞外領域またはそのフラグメントを含む。ＣＤ４０Ｌ の 生物活性は、ＣＤ４０Ｌの細胞外領域とＣＤ４０との結合によって仲介され、Ｂ 細胞の増殖および抗体分泌（ＩｇＥ分泌を含む）の誘導を含む。 本発明以前には、天然型ＣＤ４０Ｌの結合アフィニティーより高いヒトＣＤ４ ０との結合アフィニティーを示したＣＤ４０用リガンドは、知られていなかった 。従って、この技術分野では、そのようなＣＤ４０リガンドの変異型（ｍｕｔｅ ｉｎ）の同定および特徴付けが必要である。 発明の概要 新規のサイトカイン（以後”ＣＤ４０Ｌ”と呼ぶ）は、ＷＯ９３／０８２０７ に記載されたように単離され特徴付けられた。本発明は、新規のヒトＣＤ４０Ｌ 変異型をコードする単離されたＤＮＡ分子およびその補体を含む。単離されたＤ ＮＡ分子は、配列番号２（配列中、アミノ酸１９４のシステインを他のアミノ酸 で置換する）に示すアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、およ び変異型のフラグメントであるポリペプチドをコードするＤＮＡからなるグルー プから選択される。好ましくは、残基１９４のシステインの代わりとして置換さ れるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンよりな る基より選択され、最も好ましくは、アミノ酸はトリプトファンである。 さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌ変異型のフラグメントをコードするＤＮＡを提 供する。フラグメントは、配列番号２のアミノ酸１から２６１、３５から２６１ 、３４から２２５、１１３から２６１、１１３から２２５、１２０から２６１ま たは１２０から２２５のアミノ酸を含むペプチドからなるグループより選択され 、配列番号２のアミノ酸１９４に該当するアミノ酸であるシステインは、その他 のアミノ酸で置換されている。厳密条件下で（６ｘＳＳＣ中、６３°Ｃで一晩ハ イブリダイゼーション；３ｘＳＳＣ中、５５°Ｃで洗浄）任意の前記のＤＮＡと ハイブリダイズし、かつＣＤ４０と結合するペプチドであって、配列番号２のア ミノ酸１９４に該当するアミノ酸であるシステインがその他のアミノ酸で置き換 えられているペプチドをコードするＤＮＡもまた提供される。 さらに、本発明は、本発明のＤＮＡ分子によってコードされる新規のＣＤ４０ Ｌ変異型を提供する。新規の変異型は、前述した配列番号２のアミノ酸配列にお いてアミノ酸１９４のシステインがその他のアミノ酸で置き換えられている配列 を有する点で、ヒトの天然型ＣＤ４０Ｌとは異なる。好ましくは、残基１９４の Ｃｙｓの代わりに用いられるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギ ン酸、およびリジンからなる基より選択され：最も好ましくは、アミノ酸はトリ プトファンである。新規の変異型は、ＣＤ４０を結合するＣＤ４０Ｌの細胞外ド メインのフラグメントを含んでいる。好ましくは、フラグメントは、配列番号２ のアミノ酸１９４に該当するアミノ酸であるシステインがその他のアミノ酸で置 き換えられている、配列番号２のアミノ酸１から２６１、３５から２６１、３４ から２２５、１１３から２６１、１１３から２２５、１２０から２６１、または １２０から２２５を含む、最も好ましくはアミノ酸１１３から２６１を含むペプ チドからなるグループから選択される。 図面の簡単な説明 図１は、バイオセンサーアッセイで測定した、三量体のヒトおよびネズミのＣ Ｄ４０Ｌならびに二量体のヒトおよびネズミのＣＤ４０ＬとＣ４０／Ｆｃとの結 合について示している。 図２は、バイオセンサーアッセイでの三量体のヒトＣＤ４０Ｌ（図２Ａ）およ び単量体のヒトのＣＤ４０Ｌ（図２Ｂ）の２つの調製物とＣ４０／Ｆｃとの結合 について示している。 発明の詳細な説明 ＷＯ９３／０８２０７に記載のように、ネズミおよびヒトＣＤ４０のリガンド として作用することのできる新規のポリペプチドを、単離し、配列決定した。本 発明は、新規のヒトＣＤ４０Ｌ変異型およびそれらの補体をコードするＤＮＡ分 子を提供する。単離したＤＮＡ分子は、配列番号１２のアミノ酸１９４のシステ インがシステイン以外のアミノ酸で置換されている、配列番号１に示したような アミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、およびそのフラグメント をコードするＤＮＡからなるグループより選択される。好ましくは、残基１９４ のシステインの代わりに用いられるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アス パラギン酸およびリジンからなる基より選択され；最も好ましくは、アミノ酸は 、トリプトファンである。 ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４０のリガンドであり、ＴＮＦレセプタースーパーファミ リーの一員のレセプターである。全長のＣＤ４０Ｌは、そのＣ末端に細胞外領域 、膜貫通領域、およびＮ末端に細胞内領域を持つ、膜結合ポリペプチドである。 ＣＤ４０Ｌの可溶形は、細胞外領域またはそのフラグメントから作ることができ る。ヒトＣＤ４０Ｌの細胞外領域は、配列番号１のアミノ酸４７からアミノ酸２ ６１にわたる。ＣＤ４０Ｌの生物活性は、ＣＤ４０との結合によって仲介され、 Ｂ細胞の増殖および活性化されたＢ細胞からの免疫グロブリン分泌の誘導を含む 。 本明細書中に記載されている新規のＣＤ４０Ｌ変異型は、ＣＤ４０Ｌポリペプ チドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得られた。本明細書中の ＣＤ４０Ｌ変異型（ｍｕｔｅｉｎ）または類似体（ａｎａｌｏｇ）は、天然のＣ Ｄ４０Ｌと実質的に相同であるが、一つまたは複数の欠失、挿入または置換のた めに、天然型配列のＣＤ４０Ｌポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を持ってい るポリペプチドである。ＣＤ４０Ｌの類似体は、オリゴヌクレオチドの合成およ び結合によって、または部位特異的突然変異誘発技術によって調製された、ＤＮ Ａ構築物から合成することができる。 一般的には、置換は、保存的に行われねばならない、即ち、最も好ましい置換 アミノ酸は、天然のＣＤ４０Ｌの様式と実質的に等価な様式でそれらのレセプタ ーを結合する本発明のタンパク質の能力に影響を与えないアミノ酸である。保存 的置換の例としては、結合ドメインの外側のアミノ酸の置換、およびＣＤ４０Ｌ の二次構造および／または三次構造を変化させないアミノ酸の置換が含まれる。 さらなる例として、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａを互いに置換すると言 ったような一つの脂肪族残基をもう一つの脂肪族残基に置換すること、またはＬ ｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；あるいはＧｌｎとＡｓｎの間の置換のような一 つの極性残基をもう一つの極性残基に置換することが含まれる。その他のそのよ うな保守的置換では、例えば、同様の疎水性性質を持つ領域全体の置換が良く知 られている、 その他の例として、Ｃｙs残基が欠失するまたは他のアミノ酸で置き換えられ る原因となる様に、Ｃｙｓ残基をコードする配列を変化させ、再生時の不適当な 分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。ヒトＣＤ４０Ｌは、その細 胞外ドメイン内に５つのＣｙｓ残基を含んでいる。それ故、タンパク質の三次構 造あるいはジスルフィド結合の形成に影響しないように、５つのＣｙｓ残基の内 の少なくとも一つを、その他のアミノ酸で置き換えるかまたは欠失させることが できる。好ましくは、置換されるＣｙｓは配列番号２のアミノ酸１９４であり、 それ故、置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およ びリジンからなる基より選択され、最も好ましくは、アミノ酸はトリプトファン である 同様に、欠失または挿入戦略を採用する場合、生物活性への欠失または挿入に よる潜在的効果を考慮しなければならない。本発明のタンパク質のサブユニット は、末端あるいは内部の残基または配列を欠失させて、フラグメントを形成する ことによって構築できる。ＣＤ４０Ｌの配列を他のＴＮＦファミリー構成員の配 列および構造と比較することによって、作り出すことのできる突然変異の型につ いての指針もさらに提供される。 本発明のＣＤ４０Ｌ変異型のアミノ酸の一次構造は、ＣＤ４０Ｌ誘導体を作り 出すために、グルコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびその類似物等のよ うな他の化学的部分と共有結合または凝集結合を形成することによって、または 、アミノ酸配列変異体を作り出すことによって、修飾することができる。ＣＤ４ ０Ｌの共有結合誘導体は、ＣＤ４０Ｌアミノ酸側鎖、またはＣＤ４０Ｌ変異型若 しくはその細胞外ドメインのＮ末端あるいはＣ末端に、特別な官能基を連結させ ることによって調製される。 本発明の範囲内にあるＣＤ４０Ｌのその他の誘導体には、Ｎ末端またはＣ末端 の融合といったような組換え培地内での合成によるような、ＣＤ４０Ｌあるいは そのフラグメントをその他のタンパク質あるいはポリペプチドと共有結合または 凝集させた複合体が含まれる。例えば、複合体は、翻訳と同時にまたは翻訳後に その合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側の部位へ複合体を運搬す ることに関する、ＣＤ４０ＬポリペプチドのＮ末端領域またはＣ末端領域のシグ ナルまたはリーダーポリペプチドを含むことができる（例えば、サッカロミセス のα因子リーダー）。 ＣＤ４０Ｌポリペプチド融合体は、ＣＤ４０Ｌの精製および同定を容易にする ために加えたポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）、または新規の多機能性本 体を提供するためのその他のサイトカインとの融合を含む。その他のサイトカイ ンには、例として、任意のインターロイキン−１から１３、ＴＮＦ（腫瘍壊死因 子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ （顆粒球−コロニー刺激因子）、ＭＧＦ（肥満細胞成長因子）、ＥＧＦ（表皮成 長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＥＰＯ （エリスロホエチン）、γ−ＩＦＮ（ガンマ−インターフェロン）、４−１ＢＢ −Ｌ（４−１ＢＢリガンド）、並びに免疫細胞の成長、分化または機能に影響す るその他のサイトカインが含まれる。 ＣＤ４０Ｌの生物活性は、例えば、ＣＤ４０のリガンド結合ドメインとの結合 を競合させること（例えば、競合結合アッセイ）によって定量することができる 。いくつかの有効な結合アッセイをここに開示する。当業者らは、単離したＣＤ ４０タンパク質（即ちＣＤ４０／Ｆｃ）または細胞が発現するＣＤ４０のいずれ かを用いて、容易に日常的実験を適用して結合アッセイを開発することができる 。 また、Ｂ細胞増殖アッセイで生物活性を測定することによっても、ＣＤ４０Ｌ をアッセイすることができる。ヒトＢ細胞は、Ｄｅｆｒａｎｃｅら、Ｊ．Ｉｍｍ ｕｎｏｌ．，１３９：１１３５、１９８７に記載の方法に従って、負の選択およ びパーコール密度沈降による精製によって、ヒトの扁桃腺から得ることができる 。ＣＤ４０Ｌに応答する細胞増殖を測定するためには、バーキットリンパ腫細胞 系を用いることができる。バーキットリンパ腫細胞系の例としては、例えば、Ｒ ａｊｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３） およびＮａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３２）が含まれる。 ＣＤ４０Ｌの生物活性を定量するその他のアッセイは、ＣＤ４０Ｌまたはその 誘導体もしくは類似体による活性化に応答するＢ細胞によって生成される免疫グ ロブリンを測定することによる。ポリクローナル免疫グロブリンの分泌は、例え ば、５ｘ１０⁵Ｂ細胞／ｍｌ培地と共に、少なくとの７日間インキュベートする ことによって、測定することができる。免疫グロブリン（Ｉｇ）の生成は、Ｍａ ｌ ｉｓｚｅｗｓｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：３０２８、１９９０［Ｍ ａｌｉｓｚｅｗｓｋｉら、Ｉ］またはＭａｌｉｓｚｅｗｓｋｉら、Ｅｕｒ．Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０：１７３５、１９９０［Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉら、Ｉ Ｉ］に記載された方法に従って、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定することがで きる。 ＣＤ４０Ｌポリペプチドは、二量体または三量体の様なオリゴマーとして存在 することもある。オリゴマーは、異なるＣＤ４０Ｌポリペプチド上のシステイン 残基間に形成されたジスルフィド結合によって連結されている。あるいは、米国 特許第５，０７３，６２７号（ここに参照として採用される）に記載されたよう に、２つの可溶性ＣＤ４０Ｌドメインをリンカー配列で結合することもできる。 また、可溶性ＣＤ４０Ｌ（細胞外ドメメイン）および免疫グロブリンのＦｃ領域 （例えば、配列番号４）を含む融合タンパク質を発現させることによって、ＣＤ ４０Ｌポリペプチドを作りだし、二価のＣＤ４０Ｌを形成することもできる、抗 体の重鎖および軽鎖で作られた融合タンパク質は、ＣＤ４０Ｌ細胞外領域を４つ ほど持つＣＤ４０Ｌオリゴマーを形成するであろう。三量体のＣＤ４０Ｌは、溶 液中で三量体を形成するペプチド［例えば、酵母ＧＣＮ４「ロイシンジッパー」 （配列番号５）の変異型、または肺の界面活性剤であるプロテインＤ（ｓｕｒｆ ａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ）（ＳＰＤ）三量体化ドメイン（配列番号６ ；Ｈｏｐｐｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３４４：１９１，１９９４）］に 続いてＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードするＤＮＡを 発現させることによって、調製される。 融合タンパク質は、所望の配列からフラグメントを酵素で切断および結合する 慣用的技術を用いて、調製することができる。合成オリゴヌクレオチドを用いる ＰＣＲ技術は、所望のフラグメントを調製および／または増幅させるために用い ることができる。所望の配列を示すオーバーラップした合成のオリゴヌクレオチ ドもまた、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を調製するために用いるこ とができる。また、融合タンパク質は、ＣＤ４０Ｌ、ならびに、リーダー（また はシグナルペプチド）配列、オリゴマー化領域（例えば、Ｆｃ領域、ロイシンジ ッパー部分または適当なジッパー部分）リンカー配列、および融合タンパク質を 容易に精製または迅速に検出するための手段を提供する免疫原性の高い部分をコ ードする配列を含む、２つまたはそれより多くの付加配列を含むことができる。 シグナルペプチドは、細胞からのタンパク質の分泌を促進する。典型的なシグ ナルペプチドは、アミノ酸配列８のアミノ酸−２６からー１である。Ｆｌａｇ（ 登録商標）オクタペプチド（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６： １２０４，１９８８）は、融合タンパク質の生物活性を変化させず、高い免疫原 性を持ち、そして発現した融合タンパク質の迅速な検出および容易な精製を可能 にする、特異的モノクローナル抗体によって可逆的に結合されるエピトープを提 供する。また、Ｆｌａｇ（登録商標）配列は、ウシの粘膜のエンテロキナーゼに よって、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対に続くすぐの残基で特異的に切断され、このペプチド でキャップされた融合タンパク質はまた、大腸菌内での細胞内分解にも耐性であ る。Ｆｌａｇ（登録商標）と結合するネズミのモノクローナル抗体は、ＡＴＣＣ に寄託され（寄託番号 ＨＢ ９２５９）；Ｆｌａｇ（登録商標）配列を含む融 合タンパク質を抗体を用いて精製する方法は、米国特許第５，０１１，９１２号 に記載されており、ここに参照として採用される。 適当なＦｃ領域は、プロテインＡあるいはプロテインＧと結合することが出来 るＦｃ領域と定義されるか、あるいは、Ｆｃ領域を含む融合タンパク質の精製あ るいは検出に用いることのできる抗体によって認識される。望ましいＦｃ領域は 、ヒトのＩｇＧ₁またはネズミのＩｇＧ₁のＦｃ領域を含む。一つの例として、配 列番号４に示すヒトのＩｇＧ₁ Ｆｃ領域が挙げられる。適当なＦｃ領域のフラ グメント、例えば、プロテインＡとの結合に応答するアミノ酸の配列を欠失させ 、そうすることによってフラグメントがプロテインＧとは結合するがプロテイン Ａとは結合しないようにした、ヒトＩｇＧ₁のＦｃ領域もまた、用いることがで きる。 ＣＤ４０Ｌがその二次構造および三次構造内へ適切に畳込まれることを確保す るために、ＣＤ４０Ｌの細胞外領域をオリゴマー化部分から充分に離すことによ って分離するリンカー配列もまた用いることができる。適当なリンカー配列は、 （１）可動性を持つ伸びたコンフォメーションをとり、（２）融合タンパク質の 機能性ドメインと相互作用しうる規定の二次構造をとる傾向を示さず、そして（ ３）タンパク質の機能性ドメインとの相互作用を促進できる最小の疎水性また は荷電特性を持つであろう。タンパク質のフレキシブル領域の代表的な表面アミ ノ酸は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒを含む。実質的には、Ｇｌｙ、Ａｓｎおよ びＳｅｒを含むアミノ酸配列の任意の置換は、リンカー配列の上記基準を満足さ せると予想される。ＴｈｒおよびＡｌａのような、その他の中性に近いアミノ酸 もまた、リンカー配列内に用いることができる。リンカー配列の長さは、融合タ ンパク質の生物活性に有意な影響を与えることなく、変化させることができる。 機能ドメインを分離し、そして立体緩衝を防ぐために用いることができる重要で ないＮ末端またはＣ末端アミノ酸を融合タンパク質が持つような配列では、リン カー配列は必要でない。 アミノ酸残基または配列のさまざまな付加あるいは置換、または生物活性また は結合に必要でない末端あるいは内部残基あるいは配列の欠失、をコードするＤ ＮＡ構築物を調製することができる。例えば、酵母の発現系を用いると、均一の 還元された炭水化物類似体の発現を許すが、細胞外ＣＤ４０ＬのＮ−グリコシル 化部位を修飾して、グルコシル化を排除することができる。真核生物のポリペプ チド内のグリコシル化部位は、アミノ酸のトリプレット、Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（式中 ，ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）を 特徴とする。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適当な修飾は、 Ａｓｎ側鎖の炭水化物残基の結合を防ぐ置換、付加または欠失を結果として生ず るであろう。 突然変異誘発のその他の方法は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系 での発現を強化するために、二塩基性のアミノ酸残基をコードする配列を修飾す ることを含む。ＣＤ４０Ｌポリペプチドのサブユニットは、末端あるいは内部の 残基または配列をコードする配列を欠失させることによって、構築することがで きる。さらに、突然変異を誘発する部位の選択で、当業者を援助するために、そ の他の分析を行うことができる。例えば、ＷＯ９３／０８２０７（この開示は、 ここに参照として採用される）は、リガンドのアゴニストおよびアンタゴニスト を選択する方法について考察している。 ネズミのＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡの配列は、直接発現技術によって得られた；ヒ トＣＤ４０Ｌ配列は、ネズミのＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡをプローブとして用いる交 差種ハイブリダイゼーション技術によって、得られた。両方とも、ＷＯ９３／０ ８２０７に記載されている。簡単に言えば、ヒトＣＤ４０の細胞外領域（レセプ ター；配列番号３）は、Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃらが公表した配列を基にしたプ ライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術によってクローン化され た。ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＤ４０の細胞外ドメインをコードする ＤＮＡをヒトＩｇＧ１（配列番号４）のＦｃドメインをコードするＤＮＡと融合 させることによる、ＰＣＲ技術を用いて得られた。精製された可溶性ＣＤ４０タ ンパク質は、ＣＤ４０Ｌの仲介する生物活性と拮抗することができた。 ｃＤＮＡライブラリーは、ビオチニル化されたＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質 の結合を基にして、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）によって選別されたＥＬ４ 細胞系から調製された。選別されたＥＬ−４細胞によるＣＤ４０のリガンドの発 現に基づく蛍光強度が明らかにシフトするまで、細胞を５回選別した。簡単に言 えば、ｃＤＮＡを合成し、からのｐＤＣ４０６ベクター内に挿入し、大腸菌内に 形質転換した。形質転換株をプールし、プールからＤＮＡを単離し、そして、Ｃ Ｖ１−ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクトして、発現クローニングライブラリー を作成した。ＣＤ４０Ｌの一過性発現を可能にするために、トランスフェクトさ れたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞をスライド上で培養した。放射能標識したＣＤ４０／ Ｆｃでスライドをスクリーニングし、そして、光のバックグラウンドに対するオ ートーラジオグラフの銀粒子の存在を確認することによって、ＣＤ４０Ｌを発現 している細胞を同定するために試験した。 ネズミのＣＤ４０ＬのｃＤＮＡ配列およびそれより推論されるアミノ酸配列を 提供するために、標準的技術を用いて、単一のクローンを単離し、配列決定した 。ヒトの相同体のＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡは、交差種ハイブリダイゼーション技術 によって見いだされた。簡単に言えば、ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）ｃＤＮ Ａライブラリーを、活性化された末梢血液リンパ球より作成した。ネズミのＣＤ ４０Ｌのヌクレオチド１３からヌクレオチド７９３までのネズミのＣＤ４０Ｌの コード領域に対応して、ネズミのプローブを構築した。交差種ハイブリダイゼー ションの標準的技術を用い、プローブを用いてヒトＣＤ４０Ｌを発現するクロー ンを同定した。ヒトＣＤ４０Ｌのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、配列番号 １ および２に示す。 組換えＤＮＡ技術によってＣＤ４０Ｌを発現するための組換え発現ベクターに は、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子から誘導されたような適当 な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に機能するように（ｏｐｅｒａｂｌｙ） 連結させた、ＣＤ４０Ｌポリペプチドをコードする合成またはｃＤＮＡ誘導のＤ ＮＡフラグメントを含むＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡ配列が含まれる。調節配列の例と しては、遺伝子発現に調節的役割を持つ配列（例えば、調節プロモーターまたは エンハンサー）、所望であれば転写を制御するためのオペレーター配列、ｍＲＮ Ａリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の開始ならびに 終止を制御する適当な配列が含まれる。 調節配列がＣＤ４０Ｌ ＤＮＡ配列と機能上関係する場合に、ヌクレオチド配 列は機能しうるように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結している。例えば、プロモータ ーヌクレオチド配列がＣＤ４０Ｌ ＤＮＡ配列の転写を制御するならば、プロモ ーターヌクレオチド配列は機能しうるようにＣＤ４０Ｌ ＤＮＡ配列に連結して いる。さらになお、リボソーム結合部位が翻訳を促進するためにベクター内に位 置するならば、リボソーム結合部位は機能しうるようにＣＤ４０Ｌポリペプチド 配列に連結しているであろう。さらに、シグナルペプチドをコードする配列を発 現ベクター内に取り込むこともできる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダ ー）のＤＮＡ配列を、機能しうるようにＣＤ４０Ｌ ＤＮＡ配列に連結すること ができる。 ＣＤ４０Ｌポリペプチドの発現に適当な宿主細胞には、原核生物、酵母または より高度な真核生物細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性またはグラム陽 性の生物体、例えば、大腸菌またはＢａｃｉｌｌｉが含まれる。形質転換に適当 な原核生物宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔ ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ並びにシュードモナス、ストレプトマイヤスおよびサッカ ロマイセス属のさまざまなその他の種が含まれる。より高度な真核生物細胞には 、哺乳動物起源の確立された細胞系が含まれる。無細胞翻訳系もまた、本明細書 中に開示したＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いてＣＤ４０Ｌポリペプチ ドを生成するために用いることができた。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞 宿 主で用いるために適当なクローニング用および発現用ベクターは、例えば、Ｐｏ ｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５）に記載されてい る。 組換えＣＤ４０Ｌ ＤＮＡ配列を持つ発現ベクターを、適当な宿主微生物また は哺乳動物の細胞系の実質的に均一な培養物内に感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）ま たは形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）する。形質転換された宿主細胞は、ＣＤ４ ０Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換またはトランスフェ クトした細胞であり、ＣＤ４０Ｌポリペプチドを発現する。発現したＣＤ４０Ｌ ポリペプチドは、宿主細胞および宿主細胞内に挿入された遺伝子構築物の性質に 依存して、宿主細胞内に位置する、および／または培養液上澄み液体内に分泌さ れるであろう。 原核生物の宿主細胞内にトランスフェクトされた発現ベクターは、一般的には 、一つまたはそれより多くの選択可能な表現型マーカーを含んでいる。選択可能 な表現型マーカーは、例えば、抗体耐性を授与するまたは栄養素要求性を供給す るタンパク質をコードする遺伝子、および宿主内での増幅を確実にするように宿 主によって認識される複製開始点である。原核生物宿主細胞のその他の有効な発 現ベクターには、商品として入手可能なプラスミドから誘導された細菌起源の選 択可能マーカーが含まれる。この選択可能マーカーは、クローニングベクターｐ ＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝要素を含むことができる。ｐＢＲ３ ２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に関する遺伝子を含み、それ 故、形質転換された細胞を同定するための単純な手段を提供する。ｐＢＲ３２２ の「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」部分を、適当なプロモーターおよびＣＤ４０Ｌ ＤＮＡ配列と結合する。その他の商品として入手可能なベクターには、例えば 、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕ ｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅ ｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。 プロモーター配列は、組換え原核生物宿主細胞発現ベクターに共通して用いら れている。共通プロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、 ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５，１ ９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４、１９７９） 、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８：４０５７，Ｔ９８０；およびＥＰ−Ａ−３６７７６） 、およびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，４１２，１９８２）が含まれる。特に 有用な原核生物宿主細胞発現系には、ファージλ Ｐ_Lプロモーターおよびｃ１ ８５７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列が用いられている。Ａｍｅｒｌｃａｎ Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な、λ Ｐ_Lプロ モーターの誘導体を組み込むプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２［ 大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ ３７０９２）内に常在］およびｐＰＬｃ２８［大 腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に常在］が含まれる。 ＣＤ４０Ｌは、酵母宿主内で望ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例え ば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からの、酵母宿主細胞内で発現させることがで きる。ＰｉｃｈｉａまたはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのようなその他の酵母の 属もまた、用いることができる。酵母ベクターは、時として、２μ酵母プラスミ ドからの複製開始配列、自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデ ニル化配列、および転写終止配列を含んでいるであろう。望ましくは、酵母ベク ターは、複製開始配列および選択可能マーカーを含む。適当な酵母ベクターのプ ロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈ ｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈeｍ．，２５５：２０７３、１９８０） 、あるいはその他の解糖系の酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒ ｅｇ．，７：１４９、１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １７：４９００、１９７８）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホ スフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ 、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３− ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイ ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ等が含まれる 。 酵母発現に用いられるその他の適当なベクターおよびプロモーターは、さらに、 Ｈｉｔｚｅｍａｎ、ＥＰＡ−７３，６５７に記載されている。 また、哺乳動物または昆虫の宿主細胞培養系を、組換えＣＤ４０Ｌポリペプチ ドを発現させるために用いることもできる。適当な哺乳動物宿主細胞系の例とし ては、サルの腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚ ｍａｎら、Ｃｅｌｌ，２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細 胞、ＨｅＬａ細胞およびＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞系が含まれる。適 当な哺乳動物発現ベクターには、構造遺伝子に連結された、複製開始点、プロモ ーター配列、エンハンサーの等の非転写エレメント；リボソーム結合部位、ポリ アデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位ならびに転写終止配 列等の５’または３’近接非転写配列；が含まれる。 哺乳動物の宿主細胞発現ベクターの転写および翻訳制御配列は、ウイルスゲノ ムから切り出すことができる。例えば、一般に用いられる哺乳動物細胞プロモー ター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、 シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトのサイトメガロウイルスから誘導 される。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０開始 点、初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデ ニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞内で構造遺伝子配列の発現に必要とされ るその他の遺伝エレメントを提供することができる。ウイルスの初期および後期 プロモーターは、両方とも、ウイルスの複製開始点も含むであろうフラグメント としてウイルスゲノムから容易に得られるので、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら 、Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３、１９７８）。ＳＶ４０のウイルス複製開始部 位内に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇｌＩ部位にわたる約２５０ｂｐの配列 を含む限り、より小さいまたはより大きいＳＶ４０フラグメントもまた用いるこ とができる。 模範的な哺乳動物の発現ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：２８０、１９８３）によって開示された方法に従 って、構築することができる。Ｃｏｓｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７６８ ， １９８４に記載された、有用な高発現ベクターであるＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４は 、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベク ターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５５６、および米国特許出願番号０７／７０１，４ １５、１９９１年５月１６日出願、ここに参照として採用される、に記載されて いる。ＣＤ４０Ｌのような、II型タンパク質の細胞外領域を発現させるためには 、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ− ７）のシグナル配列、または米国特許出願０６／６２６，６６７、１９８４年７ 月２日出願、に記載のインターロイキン−２レセプターのシグナル配列のような 、異種のシグナル配列を加えねばならない。組換えＣＤ４０Ｌポリペプチドの精製 ＣＤ４０Ｌポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌポリペプチドを発現するために必要な 培養条件下で形質転換された宿主細胞を培養することによって、調製することが できる。次に、その結果得られた発現したポリペプチドを、培養液または細胞抽 出物より精製することが出来る。所望であれば、ＣＤ４０Ｌポリペプチドを、商 品として入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭ ｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを用いて、濃縮すること ができる。濃縮段階の後、濃縮物を、ゲルろ過媒質のような精製用マトリックス に負荷することができる。あるいは、陰イオン交換樹脂、例えば、遊離のジエチ ルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を持つマトリックスまたは基質、を用いることが できる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロ ースまたはタンパク質の精製に共通して用いられるその他の型であることができ る。あるいは、陽イオン交換段階を用いることもできる。適当な陽イオン交換体 には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性マトリ ックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。 最終的に、さらにＣＤ４０Ｌを精製するために、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（ 例えば、遊離のメチルあるいはその他の脂肪族の基を持つシリカゲル）を用いる 一段階またはそれより多段階の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ Ｃ）を用いることができる。前述の精製段階のいくつかまたはすべてをさまざ まに組み合わせて、実質的に均一な組換えタンパク質を提供するために用いるこ ともできる。 発現したＣＤ４０Ｌポリペプチドをアフィニティー精製するために、ＣＤ４０ リガンド結合ドメインを含むアフィニティーカラムを用いることもまた、可能で ある。ＣＤ４０Ｌポリペプチドを、高塩の溶出バッファーでアフィニティーカラ ムから取り出し、次に、用いられるより低塩のバッファーで透析することができ る。 細菌培養で生成した組換えタンパク質は、通常、最初に宿主細胞の崩壊、遠心 分離、不溶性ポリペプチドであれば細胞ペレットからの、または、可溶性ポリペ プチドであれば上澄み液からの抽出、さらに、一段階またはそれより多段階の濃 縮、塩析、イオン交換、アフィニティー精製または限外ろ過クロマトグラフィー によって、単離される。最終的には、ＲＰ−ＨＰＬＣを最終精製段階に用いるこ とができる。微生物細胞は、凍結融解循環、音波処理、機械的崩壊または細胞溶 解剤の使用を含む、任意の慣用的方法に従って崩壊させることができる。 形質転換した酵母の宿主細胞は、望ましくは、分泌ポリペプチドとしてＣＤ４ ０Ｌを発現させるために用いられる。このことは精製を簡易化にする。酵母宿主 細胞発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ ａｔｏｇ．，２９６：１７１，１９８４）によって開示された方法に類似した方 法に従って、精製することができる。Ｕｒｄａｌらは、調製用ＨＰＬＣカラム上 でヒトの組換えＩＬ−２を精製するために順々に行う２段階の逆相ＨＰＬＣにつ いて記載している。ＣＤ４０Ｌ組成物の投与 本発明は、適当な希釈剤またはキャリヤー中の有効量のＣＤ４０Ｌを含む治療 組成物、および組成物を用いて哺乳動物を治療する方法を提供する。治療的使用 では、精製したＣＤ４０Ｌまたは生物学的に活性なその類似体を、徴候に適当な 方式で治療するために、患者、望ましくはヒトに投与する。そのために、例えば 、所望の治療効果を達成するように投与される（例えば、可溶性細胞外ドメイン またはそのフラグメントの形の）ＣＤ４０Ｌ医薬組成物を、ボーラス注射、連続 注 入、移植物からの持続性遊離、またはその他の適当な技術によって、与えること ができる。 典型的には、ＣＤ４０Ｌ治療薬剤は、精製したＣＤ０Ｌポリペプチドを生理学 的に受容可能なキャリヤー、補助剤または希釈剤と共に含む医薬組成物の形で投 与されるであろう。そのようなキャリヤーは、用いられる投与量および濃度では 患者に毒性を示さないであろう。通常、そのような組成物の調製は、バッファー 、アスコルビン酸のような抗酸化剤、低分子量（約１０残基より小さい）ポリペ プチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストランを 含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルチオンならびにその他の安定 化剤および補助剤とＣＤ４０Ｌポリペプチドを合わせることを伴う。中性緩衝化 食塩水または同一種の血清アルブミンと混合した食塩水は、典型的な適切な希釈 剤である。 以下の実施例は、特定の実施態様を説明するものであって、本発明の範囲を制 限するものではない。、ここに引用したすべての文献の関連した開示は、特別に 参照として採用される。実施例１ この実施例は、２種類の固相結合アッセイ：第一のアッセイ（ａ）は、ＣＤ４ ０を結合する三量体のＣＤ４０Ｌの能力を評価するために用いることができ、そ して、第二のアッセイ（ｂ）は、ＣＤ４０Ｌの存在を検出するために用いること ができる：について説明している。 （ａ）定量的ＣＤ４０Ｌ ＥＬＩＳＡ ＣＤ４０／Ｆｃを、ＷＯ９３／０８２０７に記載の方法に従って、調製し精製 し、そして、これを用いて９６穴のプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｅａｓｙ Ｗａ ｓｈ ＥＬＩＳＡ プレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）をコートする。 プレートを、ＰＢＳ中の２．５μｇ／穴のＣＤ４０／Ｆｃで、一晩４°Ｃでコー トし、ＰＢＳ中の１％脱脂粉乳で、室温で１時間ブロックする。試験されるサン プルを、ＰＢＳ中の１０％のヤギ正常血清で希釈し、そして穴あたり、５０μｌ を加える。未知のサンプルの滴定を二重に走行させ、そして、ＣＤ４０Ｌの対照 標準の滴定を走行させて標準曲線を作成する。プレートをサンプルと共にインキ ュベートし、４５分間室温に制御し、そして、ＰＢＳで４回洗浄した。第二段階 試薬、ウサギ抗オリゴマー化ジッパーを加え（５０μｌ／穴、濃度約２．５μｇ ／ｍｌ）、プレートを室温で４５分間インキュベートする。再度、プレートを前 述の方法に従って洗浄し、そして、西洋わさびのペルオキシダーゼ（Ｔａｇｏ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）と結合させたヤギのＦ（ａｂ’）２ 抗 −ウサギＩｇＧを加える。プレートを４５分間、室温でインキュベートし、前述 のように洗浄し、そして、発色原であるテトラメチルベンジデンを加えて（ＴＭ Ｂ；１００μｌ／穴）、１５分間室温におくことによって、ＣＤ４０Ｌの存在を 検出する。１００μｌ／穴の２Ｎ−Ｈ₂ＳＯ₄を加えることによって、発色原の反 応を停止し、穴のＯＤ₄₅₀−ＯＤ₅₆₂を測定した。未知サンプルで得られたＯＤ値 を標準曲線より得られた値と比較することによって、三量体のＣＤ４０Ｌの量を 定量することが出来る。値は、ｍｌあたりの結合ユニット数として表される。結 合ユニットは、標準としてリガンドの精製Ｆｃ融合タンパク質を用いて、概算で ざっと１ｎｇのタンパク質である。この方法で、さまざまな異なるバッチのＣＤ ４０Ｌ三量体の濃度および特異的活性を測定した。 （ｂ）定性的ドットブロット ＣＤ４０Ｌ三量体（１μｌの粗上清液またはカラム画分）を、乾燥ＢＡ８５／ ２１ニトロセルロース膜（ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅ ｎｅ、ＮＨ）に吸収させ、そして乾燥させる。膜は、組織培養皿内、１％ ｗ／ ｖ ＢＳＡを含むトリス（０．０５Ｍ）緩衝化食塩水（０．１５Ｍ）ｐＨ７．５ 内で１時間インキュベートし、非特異的結合部位をブロックする。この時間の終 わりに、膜をＰＢＳ中で３回洗浄し、そしてウサギの抗−オリゴマー化ジッパー 抗体を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中のおおよそ１０μｇ／ｍｌの濃度で加え、次 いで、膜を室温で１時間インキュベートする。再度、膜を上記の方法に従って洗 浄し、西洋わさびのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗体（ヤギの抗ウサ ギＩｇ等；Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ ）を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中でおおよそ１：１０００に希釈して、加える。 室温で１時間インキュベートした後、膜を洗浄し、発色原（即ち、４−クロロナ フトール試薬，ＫｉｒｋｅｇａｒｄおよびＰｅｒｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ，ＭＤ）を加える。室温で１０分間発色させ、そして膜を水でリンスすること によって、反応を止める。膜を洗浄し、濃い藍色の存在を分析することによって 、ＣＤ４０Ｌの存在を決定する。細胞培地上澄み液体中および精製カラム画分中 のＣＤ４０Ｌ三量体の存在または非存在を決定するために、このアッセイが用い られた。さらに、アッセイは、未知のサンプルの色の強度を、既知濃度の対照の 強度と比較することによって、ＣＤ４０Ｌ三量体の相対量を定量する半定量的方 法を提供する。実施例２ この実施例は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞中にＣＤ４０Ｌ 三量体を発現させるためのヒトＣＤ４０ＬＤＮＡ構築物の構築について記載して いる。ＣＤ４０Ｌ三量体は、リーダー配列、およびオリゴマー化ジッパーと呼ば れる３３のアミノ酸配列（配列番号５）、次いでアミノ酸５１からアミノ酸２６ １（配列番号１）までのヒトＣＤ４０Ｌの細胞外領域を含む。構築物は、ヒトＣ Ｄ４０Ｌを含むプラスミドから適当なＤＮＡを切断し、発現ベクターｐＣＡＶＤ ＨＦＲ内にＤＮＡを連結させることによって調製した。得られた構築物を、ＣＡ Ｖ／ＤＨＦＲ−ＣＤ４０ＬＴと名付けた。ｐＣＡＶＤＨＦＲは、サイトメガロウ イルス、ＳＶ４０、およびアデノウイルス２から誘導された調節配列を、ジヒド ロ葉酸レダクターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）（Ｄ ＨＦＲ）と共に含み、宿主細胞染色体内への所望の遺伝子のランダムな取り込み を許す。ＤＨＦＲの発現は、ＤＨＦＲ^-宿主細胞が、グリシン、ヒポキサンチン およびチミジン（ＧＨＴ）を含まない培地中で増殖することを可能にする。また 、ＣＨＯ中でネズミＣＤ４０Ｌ三量体が発現するように、同様の構築物を作成し た。リーダーおよびオリゴマー化ジッパー配列に加えて、ネズミの構築物は、三 量体化ドメイン（「ロイシンジッパー」またはオリゴマー化ジッパー）とネズミ のＣＤ４０Ｌの細胞外領域との間に、Ｆｌａｇ（登録商標）と呼ばれるオクタペ プチドをコードする配列を含んでいた。ヒトＣＤ４０ＬをコードするＤＮＡのヌ クレ オチドおよびアミノ酸の配列を、それぞれ、配列番号７および８に示す。さらな る構築物も、標準法を用いて調製することができる。例えば、米国特許第４，６ ５６，１３４号に記載されているような二重のプロモーターを採用するベクター 、または、米国特許第４，９３７，１９０号あるいはＫａｕｆｍａｎら、Ｎｕｃ ｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９：４４８５，１９９１に記載されているようなエ ンハンサー配列を用いるベクターもまた、ＣＨＯ細胞内でＣＤ４０Ｌを発現する 構築物を調製するために有用である。 得られた連結生成物は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔま たはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ 、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のいずれかを用いて、ＣＨＯ細胞内にトラ ンスフェクトされた。これらの試薬は両方とも、培養細胞に適用する場合に細胞 内への核酸の取り込みを促進する、脂質−核酸複合体（またはリポソーム）を形 成するために用いられる、商品として入手可能な試薬である。ｐＣＡＶＤＨＦＲ −ＣＤ４０ＬＴ構築物でトランスフェクトされた細胞を、ＧＨＴ非存在下、ＤＭ ＥＭ：Ｆ１２培地内で選択した。ＧＨＴ非存在下で増殖できる細胞は、実施例１ ６に記載の方法に従って、固相結合アッセイを用いて、ＣＤ４０Ｌの生成につい て試験された。結果から、このトランスフェクション系では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ ａｍｉｎｅ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔの方が、より高速でのトランスフェクション に成功したことが示された。 おおよそ１６０のクローンを、スクリーニングし、２つの陽性のクローンを同 定し、さらなる研究に進めた。ＧＨＴを含まないＥＭＤＥ：Ｆ１２培地内に、細 胞を進め、上記の固相結合アッセイでＣＤ４０Ｌ三量体の生成を評価することに よって、安定性をモニターした。これらの結果に基づき、ＣＤ４０Ｌ ＤＮＡで 安定にトランスフェクトされ、ＣＤ４０Ｌ三量体をおおよそ１μｇ／１０⁶細胞 ／日で生成し分泌した、一つのクローンを選んだ。他のベクターおよび本実施例 に記載したＤＮＡ配列のすべてまたは一部を含むさらなる構築物を用いて、実質 上ここに記載したような、安定にトランスフェクトされた細胞系をさらに調製す ることができる。 ひとたび、そのような安定にトランスフェクトされた細胞を同定したならば、 トランスフェクトされた細胞の大規模培養を行い、ＣＤ４０Ｌ三量体を含む上澄 み液を蓄積させた。適当な大規模培養の条件は、バイオリアクターの使用を含む 。同様の方法を行い、おおよそ０．０５μg／１０⁶細胞／日でネズミのＣＤ４０ Ｌ三量体を分泌したＣＨＯ細胞系の作り出した。ヒトまたはネズミのいずれかの ＣＤ４０Ｌ構築物で安定にトランスフェクトされたＣＨ０細胞は、ｐＣＡＶＤＨ ＦＲプラスミドからのＤＨＦＲ遺伝子を獲得しており、メトトレキセートに耐性 である。ＣＤ４０Ｌ三量体の生成を増加させるために、メトトレキセートを培地 に加え、ＣＤ４０Ｌ三量体ＤＮＡのコピー数を増幅させることができる。実施例３ この実施例は、いくつかの異なるＣＤ４０Ｌ構築物の結合アフィニティーにつ いて説明している。アフィニティー実験は、生物特異的相互反応分析（ｂｉｏｓ ｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＢＩＡ）によ って、バイオセンサー（生物学的認識機構を感作装置または変換器と結びつけた 装置）を用いて行った。典型的なバイオセンサーは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉ ｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ｆａｇｅｒｓｔａｍ Ｌ．Ｇ．、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ II、Ｊ．Ｊ．Ｖｉｌｌａｆｒａｎｃａ編、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９ １を参照のこと）からのＢＩＡｃｏｒｅ（商標）である。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標 ）は、２種類の生物分子の相互作用をモニターするために、光学現象表面プラス モン共鳴（ＫｒｅｔｓｃｈｍａｎｎおよびＲａｅｔｈｅｒ、Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏ ｒｓｃｈｕｎｇ、Ｔｅｉｌ．Ａ．，２３：２１３５，１９６８）を用いる。１０⁵ から１０¹⁰Ｍ^-1の範囲のアフィニティー定数、および１０³から１０⁶Ｍ^-1ｓ^-1 の範囲の会合速度定数を持つ分子対は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）での特徴付けに 適している。 バイオセンサーチップを、ヤギの抗ヒトＩｇＧ₁ Ｆｃでコートし、これを用 いて、ＣＤ４０／Ｆｃをチップに結合させた。次いで、別のＣＤ４０Ｌ構築物を 濃度を増加させながら加えた；チップは、水酸化ナトリウムを加えることによっ て、構築物を違える度ごとに再生した。二種類の別々の実験を行った。第一の実 験で は、ヒトのＣＤ４０Ｌ二量体（ＣＤ４０Ｌ／Ｆｃ）、ヒトのＣＤ４０Ｌ三量体（ ＣＤ４０Ｌ／「ロイシンジッパー」）、ならびにネズミのＣＤ４０Ｌ二量体およ び三量体（実質上、ヒトＣＤ４０Ｌに記載した方法に従って調製した）を比較し た。第二の実験では、ヒトのＣＤ４０Ｌ三量体の結合を、二種類の異なるヒトの ＣＤ４０Ｌ単量体の調製物（ＴＮＦと最も相同な細胞外ドメインの部分のみを含 む）の結合と比較した。得られたデータを分析し、異なるＣＤ４０Ｌ構築物のア フィニティー定数および会合速度定数を測定した。得られたデータを下の表１お よび図１および２に示した。 データの分析により、ＴＮＦに最も相同な細胞外ドメインの部分のみを含むＣ Ｄ４０Ｌ単量体は、オリゴマー化ＣＤ４０Ｌより少々低いアフィニティーではあ るが、ＣＤ４０と結合する能力を持つことが示された。第二の実験における結合 率の分析では、ＣＤ４０／Ｆｃ分子あたりのＣＤ４０Ｌ単量体の単位結合がＣＤ ４０Ｌ三量体の２倍ほど多いことが示され、２つのＣＤ４０Ｌ単量体は一つのＣ Ｄ４０／Ｆｃ二量体と結合し、一つのＣＤ４０Ｌ三量体は、一つのＣＤ４０／Ｆ ｃ二量体を結合することが確認された。実施例４ この実施例は、数多くのＣＤ４０リガンド／ジッパードメイン融合タンパク質 の変異型の調製について説明している。酵母で発現した構築物の突然変異（変異 体１４、１８、３２、４１、４３、１０ＰＰおよび１８ＰＰ）は、ＰＣＲの取込 みの間違いによって生じ（Ｍｕｌｒａｄら、Ｙｅａｓｔ，８：７９、１９９２） 、分泌改良変異株のように分泌の明らかな増加を基に選択した。変異体１４、１ ８、３２、４１および４３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで単離された。変異株 １０ＰＰおよび１８ＰＰは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで単離された。哺乳動物細胞 で発現する構築物の変異体（ＦＬ１９４．Ｗ、１９４．Ｗ、ＬＺ１２Ｖ、２１５ ．Ｔ、２５５．Ｆおよび１９４．Ｓ）もまた、ＰＣＲを用いて調製され、部位特 異的突然変異誘発の結果であるか、またはＰＣＲのランダム生成物であるかのい ずれかであった。得られた変異の型およびそれらの活性への影響（実質的に実施 例１に記載したように固相結合アッセイにおいてＣＤ４０を結合する能力）を下 の表２に示す。 変異体１８ＰＰは、分子内に単一の変異のみを持ち、酵母での分泌に充分な影 響を与える。変異体４１は２つの変異を持ち、それらは両方ともジッパードメイ ンのイソロイシン残基にある。ジッパー内の変異は、活性に明らかな影響を与え ることなく、酵母からの分泌を改善する。変異体１９４．Ｗは酵母細胞で発現し 、イオン交換クロマトグラフィー段階［１９４．Ｗ（ｃ）］の組み合わせによる か、あるいはオリゴマー化ジッパー部分を結合するモノクローナル抗体を用いる アフィニティークロマトグラフィー［１９４．Ｗ（ａ）］によるかのいずれかで 、精製した。酵母で発現した変異体（１９４．Ｗ）は、実施例３に記載の方法に 従って実質的に行われたバイオセンサーアッセイでＣＤ４０により大きなアフィ ニティーを示し、且つ、Ｂ細胞増殖アッセイでは、酵母で発現した野生型のＣＤ ４０リガンド／ジッパードメイン融合タンパク質（ＷＴ）より大きな生物活性を 示した。これらの結果を表３に示す。 さらに、哺乳動物細胞で発現したＦＬ１９４Ｗもまた、半定量的ウエスタンブ ロット分析でＷＴＣＤ４０Ｌより高い結合を示した。 配列番号５の三量体形成ジッパーの位置に肺の表面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ ）の三量体化ドメイン（配列番号６；Ｈｏｐｐｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ，３４４：１９１、１９９４）を置換することによって、さらなる構築物を調製 した。この構築物は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよび哺乳動物細胞内で、低い レベルで発現する。前記の方法に従って、活性を測定する；そのような構築物に 基づいたさまざまな変異体もまた調製され、上記の方法に従って、分泌またはそ の他の生成特性を最適化することができる。実施例５ この実施例は、いくつかの異なるＣＤ４０Ｌ構築物の結合アフィニティーにつ いて説明している。アフィニティー実験は、実質的には実施例３に記載の方法に よる、生物特異的相互作用分析（ＢＩＡ）によって、実施例４記載の２つの構築 物を用いて、行った。表４に示した結果は、野生型（ＷＴ）ＣＤ４０ＬＴの２つ の異なる調製物、および変異型（１９４．Ｗ）の３つの異なる調製物で得られた 平均値を示す。結果を以下に示す。 これらの結果は、ＣＤ４０ＬＴ １９４．Ｗが、野生型ＣＤ４０ＬＴよりＣＤ ４０／Ｆｃにより高いアフィニティーを持つことを、確証する。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年８月３１日 【補正内容】 （１）特許請求の範囲を以下の通り補正する。 『 請求の範囲 １． ＣＤ４０Ｌ変異型をコードする単離されたＤＮＡであって、 （ａ）アミノ酸１９４のシステインをトリプトファンで置き換えた、配列番号 ２に示されたアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ；および、 （ｂ）アミノ酸１９４のトリプトファンを含む変異型（ａ）のフラグメントで あるポリペプチドをコードするＤＮＡであって、当該ポリペプチドがＣＤ４０を 結合する、前記ＤＮＡ ； からなる群より選択される前記ＤＮＡ。 ２． 配列番号２のアミノ酸１から２６１、３５から２６１、３４から２２５ 、１１３から２６１、１１３から２２５、１２０から２６１、または１２０から ２２５を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする 、請求項１記載の単離されたＤＮＡ。 ３． さらに、配列番号５に示したアミノ酸配列を持つオリゴマー化ジッパー をコードするＤＮＡを含む、請求項２記載の単離ＤＮＡ。 ４． ＤＮＡが、配列番号２のアミノ酸１１３から２６１からなるＣＤ４０Ｌ の細胞外ドメインのフラグメントのアミノ末端の先端に融合したオリゴマー化ジ ッパーを含む融合タンパク質をコードする、請求項３記載の単離ＤＮＡ。 ５． 請求項４記載のＤＮＡを含む組換え発現ベクター。 ６． 請求項５記載の組み換え発現ベクターで形質転換または感染された宿主 細胞。 ７． 発現を促進する条件下で請求項６記載の宿主細胞を培養し、そして培地 からＣＤ４０Ｌポリペプチドを回収することを含む、ＣＤ４０Ｌポリペプチドを 調製する方法。 ８． 請求項１から４のいずれか１項に記載のＤＮＡによってコードされる、 ＣＤ４０Ｌポリペプチド。』 （２）本願明細書第２頁第１０行−第１６行の『単離されたＤＮＡ分子は・・・ アミノ酸はトリプトファンである。』を、『単離されたＤＮＡ分子は、配列番号 ２（配列中、アミノ酸１９４のシステインがトリプトファンで置換されている） に示すアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ、およびアミノ酸１ ９４のトリプトファンを含む 変異型のフラグメントであるポリペプチドをコード するＤＮＡからなるグループから選択される。』と補正する。 （３）本願明細書第２頁第１７行−第２２行の『さらに、本発明は、・・・アミ ノ酸で置換されている。』を、『ＤＮＡによってコードされるＣＤ４０Ｌ変異型 のフラグメントは 、配列番号２のアミノ酸１から２６１、３５から２６１、３４ から２２５、１１３から２６１、１１３から２２５、１２０から２６１または１ ２０から２２５のアミノ酸を含むペプチドからなるグループより選択され、配列 番号２のアミノ酸１９４に該当するアミノ酸であるシステインは、トリプトファ ン で置換されている。』と補正する。 （４）本願明細書第２頁第２５行−第２６行の『システインがその他のアミノ酸 で置き換えられているペプチドをコードするＤＮＡも提供される。』を、『シス テインがトリプトファンで置き換えられているペプチドをコードするＤＮＡも調 製され得る。 』と補正する。 （５）本願明細書第３頁第１行の『その他のアミノ酸』を『トリプトファン』と 補正する。 （６）本願明細書第３頁第２行−第５行の『好ましくは・・・トリプトファンで ある。』を削除する。 （７）本願明細書第３頁第５行の『ＣＤ４０を結合する』を『ＣＤ４０を結合し 、 アミノ酸１９４にトリプトファンを含む 』と補正する。 （８）本願明細書第３頁第７行の『その他のアミノ酸』を『トリプトファン』と 補正する。 （９）本願明細書第３頁第２３行の『配列番号１２』を『配列番号２』と補正す る。 （１０）本願明細書第３頁第２４行の『配列番号１』を『配列番号２』と補正す る。 （１１）本願明細書第３頁下２行−第４頁第２行の『好ましくは、・・・トリプ トファンである。』を『好ましくは、残基１９４のシステインの代わりに用いら れるアミノ酸は、トリプトファンである。』と補正する。 （１２）本願明細書第４頁第１８行の『一般的には』の前に以下の文章を挿入す る。 『当業者は、アミノ酸１９４にトリプトファンを有するＣＤ４０Ｌをコードす るＤＮＡに、さらなる変異を施すことができることを、認識するであろう。』 （１３）本願明細書第４頁最終行−第５頁第９行の『その他の例として・・・ト リプトファンである。』を削除する。 （１４）本願明細書第１６頁第２３行の『ＣＤ４０Ｌ』を『ＣＤ４０Ｌ変異型』 と補正する。 （１５）本願明細書第１６頁第２５行の『精製したＣＤ４０Ｌまたは生物学的に 活性なその類似体』を、『精製したＣＤ４０Ｌ変異型』と補正する。 （１６）本願明細書第１６頁下２行−最終行の『（例えば、可溶性細胞外ドメイ ンまたはそのフラグメントの形の）ＣＤ４０Ｌ医薬組成物』を、『（例えば、ア ミノ酸１９４にトリプトファンを含む、可溶性ＣＤ４０Ｌ変異型の形の ）ＣＤ４ ０Ｌ変異型医薬組成物』と補正する。 （１７）本願明細書第１７頁第３行の『ＣＤ４０Ｌ治療薬剤』を『ＣＤ４０Ｌ変 異型 治療薬剤』と補正する。 （１８）本願明細書第１７頁第３行の『ＣＤ０Ｌポリペプチド』を『ＣＤ４０Ｌ 変異型 』と補正する。 （１９）本願明細書第１７頁第１０行の『ＣＤ４０Ｌポリペプチド』を『ＣＤ４ ０Ｌ変異型』と補正する。 （２０）本願明細書第２５頁の表４を以下の通り補正する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＩＬ，Ｊ Ｐ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ (72)発明者 ファンズロウ，ウィリアム・シー，ザ・サ ード アメリカ合衆国ワシントン州98023，フェ デラル・ウェイ，サウス・ウエスト・スリ ーハンドレッドアンドトゥエンティセブン ス・プレース 218 (72)発明者 スプリッグス，メラニー・ケイ アメリカ合衆国ワシントン州98119，シア トル，トゥエルブス・アベニュー・ウエス ト 2256 (72)発明者 スリニヴァッサン，サブハッシニ アメリカ合衆国ワシントン州98034，カー クランド，ノース・イースト・ワンハンド レッドアンドトゥエンティナインス・スト リート 11325 (72)発明者 ギブソン，マリールー・ジー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，ウィステリア・ウェイ 7209

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＣＤ４０Ｌ変異型をコードする単離されたＤＮＡであって、 （ａ）アミノ酸１９４のシステインをその他のアミノ酸で置き換えた、配列番 号２に示したようなアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするＤＮＡ；およ び、 （ｂ）変異型（ａ）のフラグメントであって、そしてポリペプチドがＣＤ４０ を結合する、ポリペプチドをコードするＤＮＡ； からなる群より選択され、その中で、アミノ酸１９４のシステインを置換するア ミノ酸が、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなる基よ り選択される、前記のＤＮＡ。 ２． 配列番号２のアミノ酸１から２６１、３５から２６１、３４から２２５ 、１１３から２６１、１１３から２２５、１２０から２６１、または１２０から ２２５を含むポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドをコードする 、請求項１記載の単離されたＤＮＡ。 ３． さらに、配列番号５に示したアミノ酸配列を持つオリゴマー化ジッパー をコードするＤＮＡを含む、請求項２記載の単離ＤＮＡ。 ４． ＤＮＡが、配列番号２のアミノ酸１１３から２６１からなるＣＤ４０Ｌ の細胞外ドメインのフラグメントのアミノ末端の先端に融合したオリゴマー化ジ ッパーを含む融合タンパク質をコードする、請求項３記載の単離ＤＮＡ。 ５． 請求項４記載のＤＮＡを含む組換え発現ベクター。 ６． 請求項５記載の組み換え発現ベクターで形質転換または感染された宿主 細胞。 ７． 発現を促進する条件下で請求項６記載の宿主細胞を培養し、そして培地 からＣＤ４０Ｌポリペプチドを回収することを含む、ＣＤ４０Ｌポリペプチドを 調製する方法。 ８． 請求項１から４のいずれか１項に記載のＤＮＡによってコードされる、 ＣＤ４０Ｌポリペプチド。