NO317735B1 - Isolert DNA som koder for CD40L-mutein, fremgangsmate for fremstilling av dette, rekombinant ekspresjonsvektor, vertscelle, samt CD40L-polypeptid. - Google Patents
Isolert DNA som koder for CD40L-mutein, fremgangsmate for fremstilling av dette, rekombinant ekspresjonsvektor, vertscelle, samt CD40L-polypeptid. Download PDFInfo
- Publication number
- NO317735B1 NO317735B1 NO19975437A NO975437A NO317735B1 NO 317735 B1 NO317735 B1 NO 317735B1 NO 19975437 A NO19975437 A NO 19975437A NO 975437 A NO975437 A NO 975437A NO 317735 B1 NO317735 B1 NO 317735B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- cd40l
- polypeptide
- dna
- amino acid
- cells
- Prior art date
Links
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 11
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 title claims description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 21
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 54
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 52
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 41
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 17
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 17
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 10
- 230000003606 oligomerizing effect Effects 0.000 claims description 8
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 61
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 22
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 19
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 19
- 101100059511 Homo sapiens CD40LG gene Proteins 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 12
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 5
- 101100099884 Homo sapiens CD40 gene Proteins 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010007127 Pulmonary Surfactant-Associated Protein D Proteins 0.000 description 4
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 4
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 4
- -1 sulfopropyl Chemical group 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 4
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- 108010082808 4-1BB Ligand Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 102100031132 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100021592 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100027845 Pulmonary surfactant-associated protein D Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010039445 Stem Cell Factor Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100032101 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 9 Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UOHMMEJUHBCKEE-UHFFFAOYSA-N prehnitene Chemical compound CC1=CC=C(C)C(C)=C1C UOHMMEJUHBCKEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 101100107610 Arabidopsis thaliana ABCF4 gene Proteins 0.000 description 1
- OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O OAMLVOVXNKILLQ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101001007681 Candida albicans (strain WO-1) Kexin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700001097 Insect Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101710141452 Major surface glycoprotein G Proteins 0.000 description 1
- 108010037274 Member 9 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Proteins 0.000 description 1
- 102000011769 Member 9 Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 102000007339 Nerve Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100068078 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GCN4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 108010052621 fas Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000018823 fas Receptor Human genes 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000005829 trimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Amplifiers (AREA)
- Surface Acoustic Wave Elements And Circuit Networks Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Reverberation, Karaoke And Other Acoustics (AREA)
Description
Bakgrunn for oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse omfatter isolert DNA som koder for CD40L-mutein, fremgangsmåte for fremstilling av dette, rekombinant ekspresjonsvektor, vertscelle samt CD40L-polypeptid.
Humant CD40-protein (CD40) er et peptid på 277 aminosyrer med en molekylvekt på 30600 og et sekretorisk signalpeptid på 19 aminosyrer omfattende i det vesentlige hydrofobe aminosyrer Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403, 1989). CD40 tilhører en reseptorfamilie der medlemmene omfatter to former av TNF-reseptor (Smith et al., Science 248:1019, 1990; og Schall et al., Cell 61:361, 1990), nervevekstfaktorreseptor {Johnson et al., Cell 47:545, 1986), T-celleantigen OX40 (Mallett et al., EMBO J. 9:1063, 1990), humant Fas-antigen (Itoh et al., Cell 66:233, 1991) og murin 4-1BB-reseptor (Kwon et al., Cell. Immunol. 121:414, 1989 [Kwon et al. I] og Kwon et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:1963, 1989 [Kwon et al.II]). Molekylvekten (uten glykosylering) til det modne humane CD40-protein er 28300.
Aktiverte CD4+T-celler uttrykker høye nivåer av en ligand for CD40 (CD40L). Humant CD40L, et membranbundet glyko-protein, ble klonet fra perifere blod-T-celler som beskrevet i Spriggs et al., J. Exp. Med. 176:1543 (1992), og WO 93/08207. Kloningen av murint CD40L er beskrevet i Armitage et al., .Nature 357:80, 1992. CD40L induserer B-celleproliferasjon i fravær av enhver kostimulans og kan også indusere produksjon av immunglobuliner i nærvær av cytokiner. CD40L er en type II membranpolypeptid med et ekstracellulært område i dets C-terminale ende, et transmembranområde og et intracellulært område i dets N-terminale ende. Oppløselige former av CD40L omfatter det ekstracellulære område av CD40L eller et fragment derav. Den biologiske aktivitet til CD40L formidles ved binding av det ekstracellulære område av CD40L til CD40 og omfatter B-celleproliferasjon og induksjon av antistoffsekresjon (deriblant IgE-sekresjon).
Forut for foreliggende oppfinnelse var en ligand for CD4 0L som viser høyere bindingsaffinitet for humant CD40 enn den til nativt CD40L ukjent. Det er derfor et behov ifølge teknikkens stand for å identifisere og karakterisere et slikt
CD4 O-ligandmutein.
Oppsummering av oppfinnelsen
Et nytt cytokin, heretter kalt "CD40L" ble isolert og karakterisert som beskrevet i WO 93/08207. Foreliggende oppfinnelse omfatter isolerte DNA-molekyler som koder for nye humane CD40L-muteiner og deres komplementer. De isolerte DNA-molekyler er utvalgt fra gruppen bestående av et DNA som koder for et polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID NR.:2, hvori cysteinet og aminosyre 194 er byttet ut med tryptofan og DNA som koder for et polypeptid som er et fragment av muteinet omfattende tryptofan i aminosyre 194.
DNA som koder for fragmenter av et CD40L-mutein er utvalgt fra gruppen bestående av peptider omfattende aminosyrene 1 til 261, 35 til 261, 34 til 225, 113 til 261, 113 til 225, 120 til 261 eller 120 til 225 av SEKV. ID NR.:2 hvorved cysteinet i aminosyren tilsvarende aminosyre 194 SEKV. ID NR.:2 er byttet ut med tryptofan. DNA1 er som hybridiserer til enhver av de foregående DNA1 er under stringente betingelser (hybridisering i 6 X SSC ved 63 °C over natten; vasking i 3 X SSC ved 55 °C) og som koder for et peptid som binder til CD40 og hvorved cysteinet i aminosyren som tilsvarer aminosyre 194 i SEKV. ID NR.:2 er byttet ut med tryptofan, kan også fremstilles .
Oppfinnelsen tilveiebringer dessuten nye CD40L-muteiner som kodes av DNA-molekylene ifølge oppfinnelsen. De nye muteiner skiller seg fra nativt, humant CD40L ved å ha en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID NR.:2 hvori cysteinet i aminosyre 194 er byttet ut med tryptofan. De nye muteiner omfatter fragmenter av det ekstracellulære domene til CD4 0L som binder CD40 og som omfatter tryptofan i aminosyre 194. Fortrinnsvis er fragmentene fra gruppen bestående av peptider omfattende aminosyrene 1 til 261, 35 til 261, 34 til 225, 113 til 261, 113 til 225, 120 til 261 eller 120 til 225 av SEKV. ID NR.:2, mest foretrukket aminosyre 113 til 261, hvorved cysteinet i aminosyren tilsvarende aminosyre 194 i SEKV. ID NR.:2 er byttet ut med tryptofan.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser binding av trimert, humant og murint CD40L og dimert, humant og murint CD40L til C40/Fc, som bestemt i en biosensoranalyse. Figur 2 illustrerer bindingen av trimert, humant CD40L (Figur 2A) og to preparater av monomert, humant CD40L (Figur 2B) til CD40/Fc i en biosensoranalyse.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Nye polypeptider som kan virke som ligander for murint og humant CD40 ble isolert og sekvestrert som beskrevet i WO93/08207. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer isolert DNA, kjennetegnet ved at det koder for et CD40L-mutein utvalgt fra gruppen bestående av:
(a) et DNA som koder for et polypeptid som har
en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID
NR.:2, hvori et cystein i aminosyre 194 er
byttet ut med tryptofan, og
(b) et DNA som koder for et polypeptid som er
et fragment av muteinet (a) omfattende tryptofan i aminosyre 194 og der polypep-
tidet binder CD40.
Oppfinnelsen omfatter også en rekombinant ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter et DNA ifølge oppfinnelsen.
Videre omfattet av oppfinnelsen er også en vertscelle, kjennetegnet ved at den er transformert eller transfektert med en rekombinant ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen.
Også omfattet av oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av et CD40L-polypeptid som er kjennetegnet ved at den omfatter dyrkning av en vertscelle under betingelser som fremmer ekspresjon og gjenvinning av CD4OL-polypeptid fra kulturen.
Oppfinnelsen omfatter også et CD40L-polypeptid, kjennetegnet ved at det er kodet av et DNA ifølge oppfinnelsen.
CD40L er en ligand for CD40, en reseptor som er med-lem av TNF-reseptorsuperfamilien. Fullengde CD40L er et membranbundet polypeptid med et ekstracellulært område i dets C-terminale ende, et transmembrant område og et intracellulært område i dets N-terminale ende. En oppløselig utgave av CD40L kan fremstilles fra det ekstracellulære område eller et fragment derav. Det ekstracellulære område av humant CD40L strekker seg fra aminosyre 47 til aminosyre 261 i SEKV. ID NR.:1. Den biologiske aktivitet til CD40L er formidlet av binding til CD40 og omfatter proliferasjon av B-celler og induksjon av immunglobulinsekresjon fra aktiverte B-celler.
Det nye CD40L-mutein som er beskrevet heri ble erholdt ved mutasjon av nukleotidsekvenser som koder for et CD4OL-polypeptid. ET CD40L-mutein eller -analog, som angitt heri, er et polypeptid som i det vesentlige er homologt til et nativt CD40L, men som har en aminosyresekvens som er forskjel-lig fra nativ CD40L-polypeptidsekvens på grunn av én eller flere delesjoner, insersjoner eller substitusjoner. Analoger til CD40L kan syntetiseres fra DNA-konstruksjoner fremstilt ved oligonukleotidsyntese og ligering eller ved hjelp av sete-spesifikk mutageneseteknikker.
Fagfolk på området vil vite at ytterligere mutasjoner kan utføres på et DNA som koder for CD40L med en tryptofan i aminosyre 194. Generelt bør substitusjoner gjøres konservative; dvs. de mest foretrukne substituerte aminosyrer er de som ikke innvirker på evnen til proteinene ifølge oppfinnelsen, til å binde deres reseptorer på en måte som i det vesentlige er lik den til nativt CD40L. Eksempler på konservative substitusjoner omfatter substitusjon av aminosyrer utenfor det bindende domene(ne) og substitusjon av aminosyrer som ikke forandrer den sekundære og/eller tertiære struktur til CD40L. Ytterligere eksempler omfatter substitusjon av en alifatisk rest med en annen, slik som Ile, Val, Leu eller Ala med en annen, eller substitusjoner av én polar rest med en annen, slik som mellom Lys og Arg; Glu og Asp,- eller Gin og Asn. Andre slike konservative substitusjoner, for eksempel slik som substitusjoner av hele områder med lignende hydrofobisitets-karakteristika er vel kjent.
Likeledes, når en delesjons- eller insersjonsstrategi er tilpasset bør den potensielle virkning av delesjonen eller insersjonen på biologisk aktivitet vurderes. Subenheter av proteinene ifølge oppfinnelsen kan konstrueres ved hjelp av delesjon av terminale eller interne rester eller sekvenser fra fragmenter. Ytterligere veiledning i forhold til mutasjonstyper som kan utføres er tilveiebragt ved en sammenligning av sekvensen til CD40L med sekvensene og strukturene til andre TNF-familiemedlemmer.
Den primære aminosyrestruktur til CD40L-muteinet ifølge oppfinnelsen kan modifiseres for å danne CD40L-derivater ved dannelse av kovalente eller aggregatkonjugater med andre kjemiske rester, slik som glykosylgrupper, lipider, fos-fat, acetylgrupper og lignende, eller ved dannelse av amino-syremutanter. Kovalente derivater av CD40L fremstilles ved binding av særlige funksjonelle grupper til CD40L-aminosyre-sidekjeder eller i den N-terminale eller C-terminale ende av et CD40L-mutein eller det ekstracellulære domene derav.
Andre derivater av CD40L som er innen rammen av oppfinnelsen omfatter kovalente eller aggregatkonjugater av CD40L eller dets fragmenter med andre proteiner eller polypeptider, slik som ved syntese i rekombinant kultur i form av N-terminale eller C-terminale fusjoner. Konjugatet kan for eksempel omfatte en signal- eller lederpolypeptidsekvens i det N-terminale område eller C-terminale område til et CD40L-polypeptid som kotranslasjonelt eller posttranslasjonelt dirigerer overføring av konjugatene fra deres syntesesete til et sete inni eller utenfor cellemembranen eller celleveggen (for eksempel a-faktorlederen til Saccharomycea).
CD40L-polypeptidfusjoner kan omfatte polypeptider tilsatt for å lette rensing og identifisering av CD4 0L (for eksempel poly-His), eller fusjoner med andre cytokiner for å tilveiebringe nye polyfunksjonelle entiteter. Andre cytokiner omfatter, for eksempel enhver av interleukiner-1 til 13, TNF (tumornekrosisfaktor), GM-CSF (granulocyttmakrofagkoloni-stimulerende faktor), G-SCF (granulocyttkolonistimulerende faktor), MGF (mastcellevekstfaktor), EGF (epidermal vekstfaktor) , PDGF (blodplateavledet vekstfaktor), NGF (nervevekst-faktor) , EPO (erytropoietin) , ylFN (gammainterferon) , 4-1BB-L (4-1BB-ligand) og andre cytokiner som virker inn på immun cel-levekst, differensiering eller funksjon.
Biologisk aktivitet til CD40L kan for eksempel bestemmes ved bindingskonkurranse til det 1igandbindende domene
til CD40 (dvs. kompetitive bindingsanalyser). Flere anvendbare bindingsanalyser er beskrevet heri. Fagfolk på området kan med letthet utføre rutinemessige forsøk for å utvikle bindingsanalyser, ved anvendelse av enten isolert CD40-protein (dvs.
CD40/Fc) eller celler som uttrykker CD40.
CD40L kan også analyseres ved måling av biologisk aktivitet i en B-celleproliferasjonsanalyse. Humane B-celler kan erholdes fra humane mandler ved rensing ved hjelp av nega-tiv seleksjon og Percoll-densitetssedimentering, som beskrevet av Defrance et al., J. Immunol. 139:1135, 1987. Burkitt-lymfomcellelinjer kan anvendes for å måle celleproliferasjon ved respons på CD40L. Eksempler på Burkitt-lymfomcellelinjer omfatter for eksempel Raji (ATCC CLL 86), Daudi (ATCC CCL 213) og Namalwa (ATCC CRL 1432).
En annen analyse for bestemmelse av CD40L-biologisk aktivitet er å måle immunglobulin produsert av B-celler ved respons på aktivering med CD40L eller et derivat eller analog derav. Polyklonal immunglobulinsekresjon kan måles, for eksempel ved inkubering med 5 X IO<5> B celler/ml i kultur i minst syv dager. Immunglobulin (lg)-produksjon kan måles ved hjelp av en ELISA-analyse, slik som beskrevet i Maliszewski et al., J. Jmmuno-Z. 144:3028, 1990 [Maliszewski et al. I] eller Maliszewski et al., Bur J". Immunol. 20:1735, 1990 [Maliszewski et al. II] .
CD40L-polypeptider kan eksistere i form av oligomerer, slik som dimerer eller trimerer. Oligomerer er bundet ved hjelp av disulfidbindinger dannet mellom cysteinrester og ulike CD4 0L-polypeptider. Alternativt kan man binde to opp-løselige CD40L-domener med en linker-sekvens, slik som de beskrevet i US patent 5073627. CD40L-polypeptider kan dannes ved ekspresjon av et fusjonsprotein omfattende oppløselig CD40L (ekstracellulært domene) og et Fc-område til et immunglobulin (for eksempel SEKV. ID NR.:4) for å danne divalent CD40L. Fusjonsproteiner laget med både tunge og lette kjeder til et antistoff vil danne en CD40L-oligomer med så mange som fire CD40L-ekstracellulære områder. Trimert CD40L fremstilles ved ekspresjon av et DNA som koder for et fusjonsprotein omfattende et peptid som danner en trimer i oppløsning (for eksempel et mutein fra gjær-GCN4 "leucine zipper" (SEKV. ID NR.:5) eller lungesurfaktantprotein-D (SPD)-trimeriseringsdomenet
(SEKV. ID NR.:6; Hoppe, et al., FEBS Letters 344:191, 1994)
etterfulgt av det ekstracellulære område til CD40L.
Fusjonsproteiner kan fremstilles ved anvendelsé av vanlige teknikker for enzymkutting og ligering av fragmenter fra ønskede sekvenser. PCR-teknikker med anvendelse av syntet-iske oligonukleotider kan anvendes for å fremstille og/eller amplifisere de ønskede fragmenter. Overlappingssynteseoligo-nukleotider som representerer den ønskede sekvens kan også anvendes for å fremstille DNA-konstruksjoner som koder for fusjonsproteiner. Fusjonsproteiner kan også omfatte CD40L og to eller flere ytterligere sekvenser, deriblant en leder (eller signalpeptid)-sekvens, oligomeriserende område (dvs. Fc-område, leucin zipperrest eller egnet zipperrest), linker-sekvens og sekvenser som koder for høyantigene rester som tilveiebringer en fremgangsmåte for lettelse av rensing og rask påvisning av et fusjonsprotein.
Signalpeptider letter sekresjon av proteiner fra celler. Et eksempel på signalpeptid er aminosyrene -26 til -li SEKV. ID NR.:8, Flag-oktapeptidet Hopp et al., Bio/ Technolgy 6:1204, 1988) forandrer ikke den biologiske aktivitet til fusjonsproteiner, er meget antigent og tilveiebringer en epitop som er reversibelt bundet ved hjelp av et spesifikt monoklonalt antistoff, noe som muliggjør rask påvisning og letter rensing av det uttrykte fusjonsprotein. Flag-sekvensen kløyves også spesifikt ved hjelp av bovinmucosal enterokinase i resten umiddelbart etter Asp-Lys-paret, fusjonsproteiner med "cap"-ende med dette peptid kan også være motstandsdyktig mot intra-cellulær degradering i E. coli. Et murint, monoklonalt antistoff som binder Flag-sekvensen er deponert med ATCC med akses-jonsnummer HB 9259; fremgangsmåter for anvendelse av antistof-fet ved rensing av fusjonsproteiner omfattende Flag-sekvensen er beskrevet i US patent 5011912.
Egnede Fc-områder er definert i form av Fc-området som kan binde til protein-A eller protein-G eller alternativt som gjenkjennes av et antistoff som kan anvendes ved rensing eller påvisning av et fusjonsprotein omfattende Fc-området. Foretrukne Fc-områder omfatter Fc-området til humant IgGi eller murint IgG^ Ett eksempel på det humane IgGi Fc-område er vist i SEKV. ID NR.:4. Fragmenter av et egnet Fc-område kan også anvendes, for eksempel et Fc-område av humant IgGi der en sekvens av aminosyrene som er ansvarlig for binding til protein-A, slik som fragmentet som binder protein-G, men ikke protein-A, er fjernet.
En linkersekvens som separerer det ekstracellulære område til CD40L fra den oligomeriserende rest ved hjelp av en avstand som er tilstrekkelig til å sikre at CD40L holdes or-dentlig til dets sekundære og tertiære strukturer kan også anvendes. Egnede linkersekvenser (1) vil tilpasse en fleksibel forlenget konformasjon, (2) vil ikke fremvise et potensiale for utvikling av en ordnet sekundær struktur som kan inter-agere med de funksjonelle domener til fusjonsproteinene og (3) som vil ha en minimal hydrofob eller ladet karakter som kan fremme interaksjon med de funksjonelle proteindomenene. Vanlige overflateaminosyrer i fleksible proteinområder omfatter Gly, Asn og Ser. Praktisk talt enhver permutasjon av aminosyresekvenser inneholdende Gly, Asn og Ser vil være forventet å tilfredsstille de ovennevnte kriterier for en linkersekvens. Andre nære nøytrale aminosyrer, slik som Thr og Ala kan også anvendes i linkersekvensen. Lengden på linkersekvensen kan variere uten signifikant å innvirke på den biologiske aktivitet til fusjonsproteinet. Linkersekvenser er unødvendige der proteinet som fusjoneres har ikke-essensielle N- eller C-terminale aminosyreområder som kan anvendes til å separere de funksjonelle domener og forebygge sterisk interferens.
DNA-konstruksjoner som koder for ulike addisjoner eller substitusjoner av aminosyrerester eller sekvenser, eller delesjoner av terminale eller interne rester eller sekvenser som det ikke er behov for for biologisk aktivitet eller binding kan fremstilles. Det ekstracellulære CD40L N-glykosyler-ingssete kan for eksempel modifiseres til å utelukke glykosylering mens ekspresjon av en homogen, redusert karbohydrat-analog utelukkes ved hjelp av gjærekspresjonssystemer. N-gly-kosyleringsseter i eukaryote polypeptider er kjennetegnet ved en aminosyretriplett Asn-X-Y, hvori X er enhver aminosyre bortsett fra Pro og Y er Ser eller Thr. Egnede modifikasjoner av nukleotidsekvensen som koder for denne triplett vil resul-tere i substitusjoner, addisjoner eller delesjoner som fore-bygger binding av karbohydratrester i Asn-sidekjeden.
Andre tilnærmingsmåter for mutageneser omfatter modi-fisering av sekvenser som koder for dibasiske aminosyrerester for å øke ekspresjon i gjærsystemer hvorved KEX2-proteaseak-tivitet er til stede. Subenheter til CD40L-polypeptid kan konstrueres ved hjelp av delesjon av sekvenser som koder for terminale eller interne rester eller sekvenser. Dessuten kan andre analyser utføres for å understøtte fagmannen ved utvelgelse av seter for mutagenese. WO 93/08207 diskuterer for eksempel fremgangsmåter for utvelgelse av ligandagonister og antagonister.
Sekvensen til murint CD40L-CDNA ble erholdt ved hjelp av direkte ekspresjonsteknikker; sekvensen til humant CD40L ble erholdt ved hjelp av hybridiseringsteknikker på tvers av artene ved anvendelse av det murine CD40L-cDNA som en probe. Begge er beskrevet i WO 93/08207. I korte trekk ble det ekstracellulære område av humant CD40 (reseptoren; SEKV. ID NR.:3) klonet ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR)-teknikker ved anvendelse av primere basert på en sekvens publi-sert av Stamenkovic et al. Et CD40/FC-fusjonsprotein ble erholdt ved hjelp av PCR-teknikker ved hjelp av fusjonering av DNA som koder for det ekstracellulære domene til CD40 med DNA som koder for Fc-domene av humant IgGi (SEKV. ID NR.:4). Rensede oppløselige CD40-proteiner hadde evnen til å motarbeide CD40L-formidlede biologiske aktiviteter.
Et cDNA-bibliotek ble fremstilt fra en EL4-cellelinje sortert ved hjelp av FACS (fluorescensaktivert cellesortering) på bakgrunn av binding til et biotinylert CD40/Fc-fusjonsprotein. Celler ble lagret fem ganger inntil det var et signifikant skifte i fluorescensintensitet basert på ekspresjon av en ligand for CD4 0 av de lagrede EL4-celler. I korte trekk ble cDNA syntetisert, innsatt i tom pDC4 06-vektor og transformert inn i E. coli. Transformanter ble samlet og DNA<1>et fra oppsamlingene ble isolert og transfektert inn i CVl-EBNA-celler for å danne et ekspresjonskloningsbibliotek. Transfekterte CV1-EBNA-celler ble dyrket på objektglass for å tillate tran-sient ekspresjon av CD40L. Objektglassene ble screenet med radiojodert CD40/Fc og undersøkt for å identifisere celler som uttrykte CD40L ved hjelp av undersøkelse av nærværet av autor-adiografiske sølvkorn mot en lys bakgrunn.
En enkelt klon ble isolert og sekvensert ved hjelp av vanlige teknikker for å tilveiebringe cDNA-sekvensen og antatt aminosyresekvens til murint CD40L. Det humant homologe CD40L-cDNA ble funnet ved hjelp av hybridiseringsteknikker på tvers av arter. I korte trekk ble en human perifer blodlymfocytt (PBL)-cDNA-bibliotek laget fra aktiverte perifere blodlymfo-cytter. En murin probe ble konstruert som tilsvarte det kod-ende område til murint CD40L fra nukleotid 13 til nukleotid 793 av murint CD40L. Anvendelse av vanlige teknikker for hybridisering på tvers av arten, ble proben anvendt for å identifisere en klon som uttrykker humant CD40L. Nukleotid- og aminosyresekvenser til humant CD40L er vist i SEKV. ID NR.:1 og 2.
Rekombinante ekspresjonsvektorer for ekspresjon av CD40L ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker omfatter en CD4OL-DNA-sekvens omfattende et syntetisk eller cDNA-avledet DNA-fragment som koder for et CD40L-polypeptid, operativt bundet til en egnet transkripsjonen eller translasjonen regula-torisk nukleotidsekvens, slik som en sekvens avledet fra et pattedyr, mikrobe, virus eller insektgen. Eksempler på regulatoriske sekvenser omfatter sekvenser som spiller en regulator-isk rolle ved genekspresjon (for eksempel en transkripsjonen motor eller enhancer), eventuelt en operatorsekvens for kon-troll av transkripsjon, en sekvens som koder for et mRNA-ribo-somalt bindingssete og egnede sekvenser som kontrollerer transkripsjons- og translasjonsinitiering og -terminering.
Nukleotidsekvenser er operativt bundet når den regulatoriske sekvens forholder seg funksjonelt til CD40L-DNA-sekvensen. Dette innebærer en promoternukleotidsekvens som er operativt bundet til en CD4OL-DNA-sekvens dersom promoternuk-leotidsekvensen kontrollerer transkripsjonen til CD40L-DNA-sekvensen. Dessuten kan et ribosombindende sete være operativt bundet til en sekvens for et CD40L-polypeptid dersom det ribosombindende sete er posisjonert innen vektoren for å fremme translasjon. Dessuten kan sekvenser som koder for signalpeptider inkorporeres inn i ekspresjonsvektorer. En DNA- sekvens for et signalpeptid (sekretorisk leder) kan for eksempel bin-
des operativt til en CD4OL-DNA-sekvens.
Egnede vertsceller for ekspresjon av CD40L-polypeptider omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler. Prokaryoter omfatter gramnegative eller grampositive or-ganismer, for eksempel E. coli eller Bacilli. Egnede prokaryote vertsceller for transformasjon omfatter for eksempel E. coli, Bacillua subtil is, Salmonella typhimurium og ulike andre arter innen slekten Pseudojnonas, Streptomyces, og Staphylococ-cus. Høyere eukaryote celler omfatter etablerte cellelinjer med pattedyropprinnelse. Cellefrie translasjonssystemer kan også anvendes for å produsere CD40L-polypeptider ved anvendelse av RNA'er avledet fra DNA-konstruksjoner beskrevet heri. Egnede klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterielle, sopp-, gjær- og pattedyrcelleverter er beskrevet, for eksempel i Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratoiry Manual, Elsevier, New York, (1985).
Ekspresjonsvektorene som bærer den rekombinante CD4OL-DNA-sekvens transfekteres eller transformeres inn i en egnet homogen kultur av en egnet vertsmikroorganisme eller pattedyrcellelinje. Transformerte vertsceller er celler som har blitt transformert eller transfektert med nukleotidsekvenser som koder for CD40L-polypeptider og som uttrykker CD40L-polypeptider. Uttrykte CD40L-polypeptider vil være lokalisert innen vertscellen og/eller sekreres inn i kultursuper-natantvæsken, avhengig av egenskapene til vertscellen og gen-konstruksjonen som er satt inn i vertscellen.
Ekspresjonsvektorer som er transfektert inn i prokaryote vertsceller omfatter generelt én eller flere fenotypisk selekterbare markører. En fenotypisk selekterbar markør er for eksempel et gen som koder for et protein som gir anti-biotikaresistens eller som understøtter et autotroft behov og et replikasjonsorigo som gjenkjennes av verten for å sikre amplifisering innen verten. Andre anvendbare ekspresjonsvektorer for prokaryote vertsceller omfatter en selekterbar mar-kør med bakteriell opprinnelse avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider. Denne selekterbare markør kan omfatte genelementer fra kloningsvektoren pBR322 (ATCC 37017), pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetrasyklinresistens og tilveiebringer således enkle fremgangsmåter for identifisering av transformerte celler. pBR322 "ryggrad"-seksjoner kombineres med en egnet promoter og en CD4OL-DNA-sekvens. Andre kommersielt tilgjengelige vektorer omfatter for eksempel pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA).
Promotersekvenser anvendes vanligvis for rekombinante prokaryote vertscelleekspresjonsvektorer. Vanlige promotersekvenser omfatter p-laktamase (penicillinase), laktosepromoter-system (Chang et al.. Nature 275:615, 1978; og Goeddel et al., Nature 281:544, 1979), tryptofan (trp)- promotersystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980, og EP-A-36776) og tak-promoter (Maniatis, Afolecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, 1982). Et særlig anvendbart prokaryotvertscelleekspresjonssystem anvender en fag A Pi,- promoter og en cI857ts-termolabil repressorsek-vens. Plasmidvektorer tilgjengelige fra American Type Culture Collection med inkorporerte derivater av A PL-promoteren omfatter plasmid pHUB2 (til stede i E. coli-stamme JMB9 (ATCC 37092)) og pPLc28 (til stede i E. coli-RRl (ATCC 53082)).
CD40L kan uttrykkes i gjærvertsceller, fortrinnsvis fra Saccharomyces-slekten (f.eks. S. cerevisiae). Andre gjær-slekter, slik som Pichia eller Kluyveromyces, kan også anvendes. Gjærvektorer vil ofte inneholde en replikasjonsorigosekvens fra et 2 u gjærplasmid, en autonom replikerende sekvens (ARS), et promoterområde, sekvenser for polyadenylering og sekvenser for transkripsjonsterminering. Gjærvektorer omfatter fortrinnsvis en replikasjonsorigosekvens og en selekterbar markør. Egnede promotersekvenser for gjærvektorer omfatter promoterer for metallotionein, 3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al., J". Biol. Chem. 255:2073, 1980) eller andre glykolyt-iske enzymer (Hess et al., J". Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; og Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978), slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatde-karboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Andre egnede vektorer og promoterer for anvendelse ved gjærekspresjon er ytterligere beskrevet i Hitzeman, EPA-73657.
Pattedyr- eller insektsvertscellekultursystemer kan også anvendes for uttrykk av rekombinante CD40L-polypeptider. Eksempler på egnede pattedyrvertscellelinjer omfatter COS-7-linjen fra apenyreceller {ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981),-L celler, C127-celler, 3T3-celler (ATCC CCL 163), kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler, HeLa-celler og BHK {ATCC CRL 10)-cellelinjer. Egnede pattedyreekspresjonsvektorer omfatter ikke-transkriberte elementer, slik som et replikasjonsorigo, en promotersekvens, en enhancer bundet til det strukturelle gen, andre 5' eller 3<1->flankerende ikke-transkriberte sekvenser, slik som ribosombindende seter, et poly-adenyleringssete, spleisedonor og -akseptorseter og transkripsjonene termineringssekvenser.
Transkripsjonene og translasjonene kontrollsek-venser for pattedyrvertscelleekspresjonsvektorer kan hentes fra virale genomer. Vanlig anvendte pattedyrcellepromotersek-venser og enhancersekvenser er for eksempel avledet fra Poly-omavirus, Adenovirus 2, Apevirus 40 (SV40) og humant cytomegalovirus. DNA-sekvenser avledet fra SV40 viralt genom, for eksempel SV40-origo, tidlig og sen promoter, enhancer, spleis-og polyadenyleringsseter kan anvendes for å tilveiebringe andre genetiske elementer som er krevet for å uttrykke en strukturell gensekvens i en pattedyrvertscelle. Virale tidligere og sene promoterer er særlig anvendbare ettersom begge er lette å erholde fra et virusgenom i form av et fragment som også kan inneholde et viralt replikasjonsorigo (Fiers et al., Nature 273:113, 1987). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forutsatt at omtrent 250 bp av sekvensen som strekker seg fra Hind III-sete til Bgl I-sete lokalisert i SV40 viralreplikasjonsorigoet er inkludert.
For eksempel kan pattedyrekspresjonsvektorer konstrueres som beskrevet av Okayama og Berg ( Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). En anvendbar høyekspresjonsvektor, PMLSV N1/N4, beskrevet av Cosman et al., Nature 312:768, 1984 er deponert i form av ATCC 39890. Ytterligere anvendbare pattedyrekspresjonsvektorer er beskrevet i EP-A-0367566 og i US patentsøknad nr. 07/701415 innlevert 16. mai 1991. For ekspresjon av en type II-protein ekstracellulært område, slik som CD40L, bør en heterolog signalsekvens tilføres, slik som signalsekvensen for interleukin-7 (IL-7) beskrevet i US patent 4965195 eller signalsekvensen for interleukin-2-reseptor beskrevet i US patent-søknad nr. 06/626667 innlevert 2. juli 1984.
Rensing av rekombinante CD40L- polypeptider
CD40L-polypeptider kan fremstilles ved dyrking av transformerte vertsceller under dyrkingsbetingelser som er nødvendige for å uttrykke CD40L-polypeptider. De resulterende uttrykte polypeptider kan så renses fra kulturmediet eller celleekstrakter. CD40L-polypeptid kan, dersom det er ønsket, konsentreres ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentrasjonsfilter, for eksempel en Amicon eller Millipore Pellicon ultrafiltreringsenhet. Etter konsentra-sjonstrinnet kan konsentratet anvendes på en rensingsmatriks, slik som et gelfiltreringsmedium. Alternativt kan et anionbyt-terresin anvendes. Dette kan for eksempel være en matriks eller substrat med påhengte dietylaminoetyl (DEAE)-grupper. Matriksene kan være akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre vanlige typer ved proteinrensing. Alternativt kan et kationbyttertrinn anvendes. Egnede kationbyttere omfatter ulike uløselige matrikser omfattende sulfopropyl- eller kar-boksymetylgrupper. Sulfopropylgrupper er foretrukket.
Til slutt kan én eller flere revers-fase høyprestas-jonsvæskekromatografi (RP-HPLC)-trinn ved anvendelse av hydro-fobt RP-HPLC-medium (f.eks. silikagel med påhengte metyl-eller andre alifatiske grupper) anvendes for ytterligere å rense CD40L. Enkelte eller alle de tidligere rensingstrinn, i ulike kombinasjoner, kan også anvendes for å tilveiebringe et i det vesentlige homogent rekombinant protein.
Det er også mulig å anvende en affinitetskolonne omfattende CD40-ligandbindende domene for affinitetsrensing av uttrykte CD40L-polypeptider. CD4OL-polypeptider kan fjernes fra en affinitetskolonne i en elueringsbuffer med mye salt og så dialyseres i en buffer med mindre salt for anvendelse.
Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur iso-leres vanligvis ved en innledningsvis ødeleggelse av vertscel-lene, sentrifugering, ekstraksjon fra cellepelleter dersom det er et uoppløselig polypeptid eller fra supernatantvæsken dersom det er et oppløselig polypeptid, etterfulgt av én eller flere konsentrasjoner, utsalting, ionebytter, affinitétsren-sing eller størrelseseksklusjonskromatografitrinn. Til slutt kan RP-HPLC anvendes for et endelig rensingstrinn. Mikrobe-celler kan ødelegges ved hjelp av enhver vanlig fremgangsmåte, deriblant frysetinesyklus, sonikering, mekanisk ødeleggelse eller anvendelse av cellelyseringsmidler.
Transformerte gjærvertsceller anvendes fortrinnsvis for uttrykk av CD40L i form av et sekrert polypeptid. Dette forenkler rensing. Sekrert rekombinant polypeptid fra en gjær-vertscellefermentering kan renses ved hjelp av fremgangsmåter som er lik dem beskrevet av Urdal et al., (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. beskriver to sekvensielle, rever-sert fase-HPLC-trinn for rensing av et rekombinant humant IL-2 på en preparativ HPLC-kolonne.
Administrering av CD40L- preparater
For terapeutisk anvendelse administreres det rensede CD40L-mutein til en pasient, fortrinnsvis et menneske, for behandling på en egnet måte av tilstanden. Dette innebærer for eksempel at farmasøytiske preparater av CD40L-mutein (for eksempel i form av et oppløselig CD40L-mutein omfattende tryptofan i aminosyre 194) som administreres for å oppnå en ønsket terapeutisk virkning kan gis i form av bolusinjeksjon, kontinuerlig infusjon, vedvarende frigjøring fra implantater eller andre egnede teknikker.
Vanligvis vil et terapeutisk middel i form av CD40L-mutein administreres i form av et farmasøytisk preparat omfattende renset CD40L-mutein sammen med fysiologisk akseptable bærere, eksipienser eller fortynnere. Slike bærere vil være ikke-toksiske i de anvendte doser og konsentrasjoner. Vanligvis medfører fremstillingen av slike preparater kombinasjon av et CD40L-mutein med buffere, antioksidanter, slik som askor-binsyre, polypeptider med lav molekylvekt (mindre enn ca. 10 rester), proteiner, aminosyrer, karbohydrater inkludert glu-kose, sukrose eller dekstraner, chelaterende midler, slik som EDTA, glutation og andre stabilisatorer og eksipienser. Nøy-tralt bufret saltløsning eller saltløsning blandet med kon-spesifikk serumalbumin er for eksempel egnede fortynnere.
Eksempel 1
Foreliggende eksempel beskriver to fast-fasebindings-analyser, den første (a) kan anvendes for å vurdere evnen som trimert CD40L har til å binde CD40, og den andre, (b), anvendes for å påvise nærvær av CD40L.
( a) Kvantitativ CD40L ELISA
CD40/FC ble fremstilt og renset som beskrevet i WO 9308207 og anvendt for å dekke plater med 96 brønner (Corning Easy Wash ELISA-plater, Corning, NY, USA). Platene ble dekket med 2,5 ug/brønn CD40/FC i PBS over natten ved 4 °C og blok-kert med 1 % melk uten fett i PBS i 1 time ved romtemperatur. Testede prøver ble fortynnet i 10 % normalt geiteserum i PBS og 50 ul ble tilsatt pr. brønn. En titrering av ukjente prøver ble gjort med to paralleller og en titrering av standardre-feranse av CD40L ble gjort for å lage en standardkurve. Platene ble inkubert med prøver og kontroller i 45 minutter ved romtemperatur, for så å vaskes fire ganger med PBS. Andre-trinns reagens, kaninantioligomeriserende zipper, ble tilført (50 ul/brønn konsentrasjon på ca. 2,5 ug/ml) og platene ble inkubert ved romtemperatur i 45 minutter. Platene ble vasket på ny som beskrevet tidligere og geite-F(ab<1>)2 anti-kanin IgG konjugert med pepperrotperoksidase (Tago, Burlingame, CA, USA) ble tilsatt. Plater ble inkubert i 45 minutter ved romtemperatur, vasket som beskrevet og tilstedeværelse av CD40L ble påvist ved tilsetning av kromogen, tetrametylbenzen (TMB; 100 ul/brønn) i 15 minutter ved romtemperatur. Den kromogene reak-sjon ble stoppet ved tilsetning av 100 ul/brønn 2N H2S04 og bestemmelse av OD450-OD562 i brønnene. Mengden av trimert CD40L kan bestemmes ved sammenligning av de erholdte OD-verdier fra de ukjente prøver med verdiene frembragt i standardkurven. Verdier ble uttrykt i form av antallet bundne enheter pr. ml. En bundet enhet er omtrent én ng protein estimert ved anvendelse av et renset Fc-fusjonsprotein til liganden som en stan-dard. På denne måte ble konsentrasjonen og den spesifikke aktivitet til flere ulike satser av trimert CD40L bestemt.
(b) Kvantitativt dot blot
CD40L-trimer (1 ul uren supernatant eller kolonnefraksjoner) ble adsorbert på tørre BA85/21 nitrocellulose-membraner (Schleicher og Schuell, Keene, NH) og tørket. Membranene ble inkubert i vevskulturskåler i én time i tris (0,05 M) bufret saltløsning (0,15 M) pH 7,5 inneholdende 1 % vekt/volum BSA for å blokkere uspesifikke bindingsseter. Etter dette ble membranene vasket tre ganger i PBS og antioligomeri-serende zipperantistoff fra kanin ble tilsatt i en omtrentlig konsentrasjon på 10 ug/ml i PBS inneholdende 1 % BSA, etterfulgt av at membranene ble inkubert i én time ved romtemperatur. Membranene ble vasket på ny som beskrevet og pepperrotperoksidase (HRP)-merket antistoff (slik som geite-anti-Ig; Southern Biotech, Birmingham, AL) i en omtrentlig fortynning på 1:1000 i PBS inneholdende 1 % BSA ble tilført. Etter inkubering i én time ved romtemperatur ble membranene vasket og kromogen (dvs. 4-klornaftol-reagens, Kirkegård og Perry, Gaithersburg, MD) ble tilført. Utvikling av farge ble tillatt i 10 minutter ved romtemperatur og reaksjonen ble stoppet ved at membranene ble renset med vann. Membranene ble vasket og tilstedeværelsen av CD40L ble bestemt ved analysering med hensyn til tilstedeværelsen av en blå-svart farge. Denne analyse ble anvendt for å bestemme tilstedeværelsen eller fravær av trimert CD40L i cellekultursupernatantvæsker og ved rensing av kolonnefraksjoner. Analysen tilveiebringer dessuten en semik-vantitativ fremgangsmåte for påvisning av relative mengder trimert CD40L ved sammenligning av fargeintensiteten i ukjente prøver med intensiteten i kjente kontroilmengder.
Eksempel 2
Foreliggende eksempel beskriver konstruksjon av en human CD40L-konstruksjon for uttrykk av et trimert CD40L i kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler. Trimert CD40L inneholder en ledersekvens og en aminosyresekvens på 33 aminosyrer kalt en oligomeriserende zipper (SEKV. ID NR.:5, etterfulgt av det ekstracellulære område til humant CD40L fra aminosyre 51 til aminosyre 261 (SEKV. ID NR.:1). Konstruksjonen ble fremstilt ved kutting av passende DNA fra et plasmid inneholdende humant CD40L og legering av DNA'et inn i ekspresjonsvektoren pCAVDHFR. Den resulterende konstruksjon ble kalt CAV/DHFR-CD40LT. pCAVDHFR omfatter regulatoriske sekvenser avledet fra cytomegalovirus, SV40 og Adenovirus 2 sammen med genet for dihydrofolatreduktase (DHFR) og tillater tilfeldig integrasjon av et ønsket gen inn i vertscellekromosomer. Ekspresjon av
DHFR fører til at DHFR"-vertsceller kan gro på medium som
mangler glysin, hypoksantin og tymidin (GHT). En lignende konstruksjon ble også laget for ekspresjon av murint CD40L-trimer i CHO-celler. I tillegg til leder- og oligomeriserende zipper-sekvenser inneholdt den murine konstruksjon også en sekvens
som koder for oktapeptidet kalt Flag {beskrevet tidligere) mellom det trimeriserende domene ("leucin zipper" eller oligomeriserende zipper) og det ekstracellulære område til murint CD40L. Nukleotid- og aminosyresekvensen til de humane CD40L-kodende DNA'er er vist i henholdsvis SEKV. ID NR.:7 og 8. Ytterligere konstruksjoner kan fremstilles ved anvendelse av vanlige fremgangsmåter. Vektorer som inkorporerer doble promoterer, slik som de beskrevet i US patent 4656134 eller vektorer som gjør anvendelse av enhancersekvenser, slik som de beskrevet i US patent 4937190 eller i Kaufman et al., Nucl. Acids Rea. 19:4485, 1991, er også anvendbare for fremstilling av konstruksjoner for ekspresjon av CD40L i CHO-celler.
Det resulterende 1igeringsprodukt ble transfektert inn i CHO-celler ved anvendelse av enten Lipfofectinreagens eller Lipofectaminreagens (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Begge disse reagenser er kommersielt tilgjengelige reagenser anvendt for å danne lipidnukelinsyrekomplekser (eller liposomer) som, når de anvendes på dyrkede celler, fremmer opptak av nuklein-syre inn i cellene. Celler som transfektert med pCAVDHFR-CD40LT-konstruksjonen ble utvalgt i DMEM:Fl2-medium i fravær eller i nærvær av GHT. Celler som hadde evnen til å vokse i fravær av GHT ble testet med hensyn til produksjon av CD40L ved anvendelse av en fast fasebindingsanalyse som beskrevet i Eksempel 16. Resultater viser at i dette transfeksjonssystem ga Lipofectaminreagens større andel av vellykket transfeksjon.
Ca. 160 kloner ble screenet og to positive kloner ble identifisert og undersøkt for ytterligere studium. Celler ble ført inn i GHT-fritt DMEM:F12-medium og overvåket med hensyn til stabilitet ved hjelp av analyse av produksjon av trimert CD40L i den faste fasebindingsanalyse beskrevet ovenfor. På bakgrunn av disse resultater ble én klon vaigt som så ut til å være stabilt transfektert med CD4OL-DNA'et og som produserte og sekrerte omtrent 1 ug/10<6> celler/dag av CD40L-trimer. Ytterligere konstruksjoner omfattende andre vektorer og alle eller en del av DNA-sekvensene beskrevet i dette eksempel kan anvendes for å fremstille ytterligere stabile, transfekterte cellelinjer, i det vesentlige som beskrevet heri.
Med en gang slike stabile transfekterte celler ble identifisert ble kulturer av transfekterte celler dyrket i stor skala for å akkumulere supernatant inneholdende trimert CD40L. Egnede betingelser for kulturer i stor skala omfatter anvendelse av bioreaktorer. Lignende prosedyrer ble fulgt for å produsere CHO-cellelinjer som sekrerte et trimert, murint CD40L i omtrent 0,05 ug/10<6> celler/dag. CHO-celler som var stabilt transfektert med enten den humane eller murine CD40L-konstruksjon, som hadde fått et DHFR-gen fra pCAVDHFR-plas-midet, var motstandsdyktig mot metotrexat. Metotrexat kan til-føres kulturmediet for å amplifisere kopiantallet av CD40L-trimert DNA for å øke produksjonen av CD40L-trimer.
Eksempel 3
Foreliggende eksempel beskriver bindingsaffinitetene til flere ulike CD4 0L-konstruksjoner. Affinitetseksperimenter ble utført ved biospesifikke interaksjonsanalyser (BIA) ved anvendelse av en biosensor, et instrument som kombinerer en biologisk gjenkjennelsesmekanisme med en deteksjonsanordning eller -overfører. Et eksempel på biosensor er BIAcore, fra Pharmacia Biosensor AB (Uppsala, Sverige; se Fagerstam L.G., Teciinigues in Protein Chemistry II, ed. J.J. Villafranca, Acad. Press, NY, 1991). BIAcore anvender det optiske fenomen overflate "plasmon" resonans (Kretschmann og Raether, Z. Naturforschung, Teil. A 23:2135, 1968) for å måle interak-sjonen mellom to biologiske molekyler. Molekylpar med affini-tetskonstanter i området fra IO<5> til 10<10>M"<1>, og assosiasjons-gradskonstanter i området fra IO<3> til IO<6>M<1>S"<1> er egnet for karakterisering med BIAcore.
Biosensorbrikkene ble belagt med geite anti-humant IgGiFc som ble anvendt for å binde CD40/FC til brikken. Ulike CD4OL-konstruksjoner ble så tilført i økende konsentrasjoner; brikken ble degenerert mellom de ulike konstruksjoner ved til-føring av natriumhydroksid. To separate forsøk ble utført. I det første ble binding av et dimert, humant CD40L (CD40L/Fc), trimert, humant CD40L (CD40L/"leucin zipper") og dimert og trimert, murint CD40L (fremstilt i det vesentlige som beskrevet for humant CD40L) sammenlignet. I det andre forsøk ble binding av trimert, humant CD40L sammenlignet med bindingen til to ulike preparater i form av monomert, humant CD40L (omfattende bare delen med det ekstracellulære domene som var mest homologt til TNF). De resulterende data ble analysert for å bestemme affiniteten og assosiasjonsgradskonstantene til de ulike CD40L-konstruksjoner. Resultatene er vist i Tabell 1 og i Figurene 1 og 2.
Analyser av dataene indikerte at en CD40L-monomer omfattende kun delen med det ekstracellulære domene som var mest homologt til TNF hadde evnen til å binde CD40, med noe lavere affinitet enn oligomert CD40L. En analyse av bindings-graden i det andre eksperiment viste at det var to ganger så mye CD40L-monomerenheter bundet pr. CD40/Fc-molekyl som trimert CD40L, noe som viser at to monomerer av CD4 0L binder én CD40/Fc-dimer og ett trimert CD40L binder én CD40/Fc-dimer.
Eksempel 4
Dette eksempel viser fremstilling av flere muteiner av et CD40-ligand/zipperdomenefusjonsprotein. Mutante konstruksjoner som uttrykkes i gjær (mutanter 14, 18, 32, 41, 43, 10PP og 18PP) ble generert ved hjelp av PCR-"misincoporation"
(Mulrad et al Yeast 8:79, 1992) og utvalgt på grunnlag av en tilsynelatende økning i sekresjon noe som forbedret sekre-sjonsmutanter. Mutanter 14, 18, 32, 41 og 43 ble isolert i S. cerevisiae. Mutantene 10PP og 18PP ble isolert i P. pastoris.
Mutasjoner i konstruksjoner som ble uttrykt i pattedyrceller (FL194.W, 194.W, LZ12V, 215.T, 255.F, og 194.S) ble også fremstilt ved anvendelse av PCR og var enten resultatet av sete-dirigert mutagenese eller et tilfeldig produkt av PCR. De erholdte mutasjonstyper og deres virkning på aktivitet (evne til å binde CD40 i en fast fasebindingsanalyse, i det vesentlige som beskrevet i Eksempel 1) er vist i Tabell 2 nedenfor.
a: Mutasjoner er gitt i form av resten til stede i det native peptid, restnummer og rest til stede i muteinet. Restnummeret for zipperdomenemutasjoner er relativt til
SEKV. ID NR.:5.
b. Restnummeret for mutasjoner i CD40L-domene er relativt til
SEKV. ID NR.:1.
c. Mutant 10PP inneholdt også mutasjoner i områder andre enn CD4OL-domenet eller zipperdomenet {T-4S, D-2P, relativt til
SEKV. ID NR.:7)
d. Kunne ikke anvendes
e. Ikke gjort
Mutanten 18PP hadde kun en enkelt mutasjon i mole-kylet, noe som var tilstrekkelig for å virke inn på sekresjon i gjær. Mutant 41 hadde to mutasjoner, begge var i isoleucin-restene i zipperdomenet. Mutasjonene i zipperen forbedrer sekresjon fra gjær uten tilsynelatende effekt på aktiviteten. Mutant 94.W ble uttrykt i gjær-celler og renset ved enten en kombinasjon av ionebytterkromatografitrinn (194.W (c)) eller ved hjelp av affinitetskromatografi (194.W(a)) ved anvendelse av et monoklonalt antistoff som binder den oligomeriserende zipperrest. Mutanten som ble uttrykt i gjær (194.W) viste større affinitet til CD40 i en biosensoranalyse utført i det vesentlige som beskrevet i Eksempel 3 og viste større biologisk aktivitet enn villtype-CD40-ligand/zipperdomenefusjons-protein (WT) uttrykt i gjær, i en B-celleproliferasjonsanalyse. Disse resultater er vist i Tabell 3.
FL194W uttrykt i pattedyrceller viste dessuten også høyere binding enn WT CD40L i en semi-kvantitativ western-blot-analyse.
Ytterligere konstruksjoner ble fremstilt ved substitusjon av lungesurfaktantprotein D (SPD)-trimeriserende domene (SEKV. ID NR.:6; Hoppe, et al., FEBS Letters 344:191, 1994) på stedet til den trimerdannende zipper i SEKV. ID NR.:5. Denne konstruksjon uttrykkes i S. cerevisiae og i pattedyrceller i små mengder. Aktivitet ble bestemt som beskrevet tidligere, ulike mutanter basert på slike konstruksjoner kan også fremstilles for å optimalisere sekresjon eller andre produktkarak-teristika som beskrevet ovenfor.
Eksempel 5
Foreliggende eksempel viser bindingsaffiniteter til flere ulike CD40L-konstruksjoner. Affinitetsforsøk ble utført ved hjelp av biospesifikke interaksjonsanalyser (BIA), i det vesentlige som beskrevet i Eksempel 3, ved anvendelse av to av konstruksjonene beskrevet i Eksempel 4. Resultater vist i Tabell 4 representerer de gjennomsnittlige verdier erholdt fra to forskjellige preparater av mutein (194.W). Resultater er vist nedenfor.
Disse resultater bekrefter at CD40L 194.W har høyere affinitet for CD40/Fc enn villtype CD40LT.
Claims (8)
1. Isolert DNA,
karakterisert ved at det koder for et CD40L-mutein utvalgt fra gruppen bestående av: (a) et DNA som koder for et polypeptid som har en aminosyresekvens som vist i SEKV. ID NR.:2, hvori et cystein i aminosyre 194 er byttet ut med tryptofan, og (b) et DNA som koder for et polypeptid som er et fragment av muteinet (a) omfattende tryptofan i aminosyre 194 og der polypep-tidet binder CD40.
2. Isolert DNA ifølge krav 1, karakterisert ved at det koder for et polypeptid utvalgt fra gruppen bestående av polypeptider omfattende aminosyrene 1 til 261, 35 til 261, 34 til 225, 113 til 261, 113 til 225, 120 til 261 eller 120 til 225 i SEKV. ID NR.:2.
3. Isolert DNA ifølge krav 2, karakterisert ved at det dessuten omfatter et DNA som koder for et oligomeriserende peptid med en aminosyresekvens representert ved SEKV. ID NR.:5.
4. Isolert DNA ifølge krav 3, karakterisert ved at DNA'et koder for et fusjonsprotein omfattende det oligomeriserende peptidet fus-jonert til den amino-proksimale ende til et fragment av det ekstracellulære domene til CD40L, bestående av aminosyrene 113 til 261 i SEKV. ID NR.:2.
5. Rekombinant ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA ifølge krav 4.
6. Vertscelle,
karakterisert ved at den er transformert eller transfektert med en rekombinant ekspresjonsvektor ifølge krav 5.
7. Fremgangsmåte for fremstilling av et CD4 0L-polypeptid,
karakterisert ved at den omfatter dyrkning av en vertscelle ifølge krav 6 under betingelser som fremmer ekspresjon, og gjenvinning av CD40L-polypeptid fra kulturen.
8. CD40L-polypeptid,
karakterisert ved at det er kodet av et DNA ifølge ethvert av kravene 1 til 4.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/477,733 US5981724A (en) | 1991-10-25 | 1995-06-07 | DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40 |
| US08/484,624 US5962406A (en) | 1991-10-25 | 1995-06-07 | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| PCT/US1996/009632 WO1996040918A2 (en) | 1995-06-07 | 1996-06-06 | Novel cd40l mutein |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO975437D0 NO975437D0 (no) | 1997-11-26 |
| NO975437L NO975437L (no) | 1998-02-06 |
| NO317735B1 true NO317735B1 (no) | 2004-12-13 |
Family
ID=27045653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19975437A NO317735B1 (no) | 1995-06-07 | 1997-11-26 | Isolert DNA som koder for CD40L-mutein, fremgangsmate for fremstilling av dette, rekombinant ekspresjonsvektor, vertscelle, samt CD40L-polypeptid. |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0832229B1 (no) |
| JP (1) | JP3279573B2 (no) |
| KR (1) | KR100453314B1 (no) |
| AT (1) | ATE257858T1 (no) |
| AU (1) | AU693713B2 (no) |
| CA (1) | CA2222914C (no) |
| DE (1) | DE69631331T2 (no) |
| DK (1) | DK0832229T3 (no) |
| ES (1) | ES2214541T3 (no) |
| IL (1) | IL122174A (no) |
| MX (1) | MX9709447A (no) |
| NO (1) | NO317735B1 (no) |
| NZ (1) | NZ311335A (no) |
| PT (1) | PT832229E (no) |
| WO (1) | WO1996040918A2 (no) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7405270B2 (en) | 1991-10-25 | 2008-07-29 | Immunex Corporation | CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation |
| IL127912A0 (en) * | 1996-07-10 | 1999-11-30 | Immunex Corp | Method of activating dendritic cells |
| EP0951551B9 (en) | 1996-12-23 | 2012-12-26 | Immunex Corporation | Ligand for receptor activator of nf-kappa b, ligand is member of tnf superfamily |
| CA2328140C (en) * | 1998-05-14 | 2012-03-13 | Immunex Corporation | Method of inhibiting osteoclast activity |
| AU2001251612A1 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
| EP1365027A4 (en) * | 2000-05-26 | 2005-06-22 | Mochida Pharm Co Ltd | FUSION PROTEINS AS FAS-LIGAND |
| JP4266825B2 (ja) | 2001-09-20 | 2009-05-20 | イミユネツクス・コーポレイシヨン | ヘテロマーポリペプチドを発現する細胞の選択 |
| US7494805B2 (en) | 2003-02-14 | 2009-02-24 | Biogen Idec Ma Inc. | Expression cassette and vector for transient or stable expression of exogenous molecules |
| JP3936673B2 (ja) * | 2003-06-02 | 2007-06-27 | 国立大学法人群馬大学 | Ｃｄ４７部分ペプチドと抗ｓｈｐｓ−１モノクロナール抗体 |
| WO2005035570A2 (en) * | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Xencor, Inc. | Variants of cd40l protein |
| KR101370253B1 (ko) | 2004-10-22 | 2014-03-05 | 암젠 인크 | 재조합 항체의 재접힘 방법 |
| EP2500415A1 (en) | 2006-09-13 | 2012-09-19 | Abbott Laboratories | Cell culture improvements |
| SG10201510384UA (en) | 2006-09-13 | 2016-01-28 | Abbvie Inc | Cell culture improvements |
| US8604178B2 (en) | 2006-09-18 | 2013-12-10 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses |
| US8222016B2 (en) | 2007-06-29 | 2012-07-17 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Recombinant C-terminal α-amidating enzyme derivative |
| EP2197911A2 (en) | 2007-09-14 | 2010-06-23 | Amgen Inc. | Homogeneous antibody populations |
| CA2704457A1 (en) | 2007-10-30 | 2009-05-07 | Walter Bottje | Compositions and methods of enhancing immune responses to flagellated bacterium |
| PT2214701T (pt) | 2007-11-01 | 2016-11-02 | Univ Guelph | Composições e métodos de potenciar respostas imunes a eimeria |
| EP2240581B1 (en) | 2008-01-15 | 2016-05-11 | AbbVie Inc. | Improved mammalian expression vectors and uses thereof |
| LT2501822T (lt) | 2009-11-17 | 2017-10-25 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Padidintos baltymų produkcijos būdai |
| US8956618B2 (en) | 2010-01-21 | 2015-02-17 | The Texas A&M University System | Vaccine vectors and methods of enhancing immune responses |
| CA2800830C (en) | 2010-06-09 | 2020-09-08 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Vaccine and methods to reduce campylobacter infection |
| NZ711019A (en) | 2013-02-14 | 2019-07-26 | Univ Arkansas | Compositions and methods of enhancing immune responses to eimeria or limiting eimeria infection |
| US10023608B1 (en) | 2013-03-13 | 2018-07-17 | Amgen Inc. | Protein purification methods to remove impurities |
| JP6530742B2 (ja) | 2013-03-15 | 2019-06-12 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー | 腸内病原体の免疫応答を強化する組成物及び方法 |
| AU2016301361B2 (en) | 2015-08-05 | 2022-06-16 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-CD154 antibodies and methods of using them |
| WO2017083604A1 (en) | 2015-11-12 | 2017-05-18 | Amgen Inc. | Triazine mediated pharmacokinetic enhancement of therapeutics |
| AU2017260323B2 (en) | 2016-05-03 | 2023-11-16 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Yeast vaccine vector including immunostimulatory and antigenic polypeptides and methods of using the same |
| TWI821905B (zh) | 2016-05-11 | 2023-11-11 | 美商安美基公司 | 使用麩醯胺合成酶基因內互補載體直接選擇表現高水準異質蛋白的細胞 |
| CN109153729A (zh) * | 2016-05-13 | 2019-01-04 | 免疫医疗有限责任公司 | Cd40l-fc融合多肽及其使用方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK0897983T3 (da) * | 1991-10-25 | 2003-08-11 | Immunex Corp | Antistoffer mod CD40-L |
| US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
| CA2146559A1 (en) * | 1992-10-23 | 1994-05-11 | Melanie K. Spriggs | Methods of preparing soluble, oligomeric proteins |
-
1996
- 1996-06-06 WO PCT/US1996/009632 patent/WO1996040918A2/en active IP Right Grant
- 1996-06-06 DE DE1996631331 patent/DE69631331T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-06 IL IL12217496A patent/IL122174A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-06-06 ES ES96921405T patent/ES2214541T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 CA CA002222914A patent/CA2222914C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-06 AT AT96921405T patent/ATE257858T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-06-06 JP JP50191197A patent/JP3279573B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-06 KR KR1019970708620A patent/KR100453314B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-06-06 PT PT96921405T patent/PT832229E/pt unknown
- 1996-06-06 DK DK96921405T patent/DK0832229T3/da active
- 1996-06-06 NZ NZ311335A patent/NZ311335A/en unknown
- 1996-06-06 EP EP96921405A patent/EP0832229B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-06 MX MX9709447A patent/MX9709447A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-06-06 AU AU62638/96A patent/AU693713B2/en not_active Ceased
-
1997
- 1997-11-26 NO NO19975437A patent/NO317735B1/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0832229B1 (en) | 2004-01-14 |
| AU6263896A (en) | 1996-12-30 |
| NO975437L (no) | 1998-02-06 |
| CA2222914A1 (en) | 1996-12-19 |
| IL122174A (en) | 2004-07-25 |
| EP0832229A2 (en) | 1998-04-01 |
| WO1996040918A3 (en) | 1997-01-23 |
| AU693713B2 (en) | 1998-07-02 |
| DE69631331D1 (de) | 2004-02-19 |
| WO1996040918A2 (en) | 1996-12-19 |
| JPH11504819A (ja) | 1999-05-11 |
| DE69631331T2 (de) | 2004-11-18 |
| DK0832229T3 (da) | 2004-05-03 |
| JP3279573B2 (ja) | 2002-04-30 |
| ATE257858T1 (de) | 2004-01-15 |
| PT832229E (pt) | 2004-06-30 |
| ES2214541T3 (es) | 2004-09-16 |
| MX9709447A (es) | 1998-02-28 |
| NO975437D0 (no) | 1997-11-26 |
| CA2222914C (en) | 2002-04-02 |
| KR19990022141A (ko) | 1999-03-25 |
| KR100453314B1 (ko) | 2004-12-17 |
| NZ311335A (en) | 1998-05-27 |
| IL122174A0 (en) | 1998-04-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO317735B1 (no) | Isolert DNA som koder for CD40L-mutein, fremgangsmate for fremstilling av dette, rekombinant ekspresjonsvektor, vertscelle, samt CD40L-polypeptid. | |
| US6410711B1 (en) | DNA encoding CD40 ligand, a cytokine that binds CD40 | |
| US5716805A (en) | Methods of preparing soluble, oligomeric proteins | |
| JP3559281B2 (ja) | Ｃｄ２７リガンド | |
| JP3308534B2 (ja) | 新規なサイトカイン | |
| EP0672141B1 (en) | Methods of preparing soluble, oligomeric proteins | |
| EP0959897B1 (en) | Method of regulating nitric oxide production | |
| NO323197B1 (no) | Fusjonsproteiner omfattende tumornekrosefaktorreseptor, DNA som koder for dette, fremgangsmate for fremstilling av dette samt farmasoytisk preparat. | |
| WO1994010308A9 (en) | Methods of preparing soluble, oligomeric proteins | |
| JP2002509430A (ja) | Ｔｎｆスーパーファミリーのメンバーであるｎｆ−ｋａｐｐａ ｂの受容体アクティベーターに対するリガンド | |
| JPH09202800A (ja) | Ｃｔｌａ４変異体分子およびそれの使用 | |
| CA2295149A1 (en) | Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker | |
| ZA200208795B (en) | Mammalian cytokine receptor subunit proteins, related reagents and methods. | |
| CA2288351A1 (en) | Chimeric opg polypeptides | |
| JPH09508009A (ja) | Ｆａｓ抗原を結合するリガンド | |
| US7405270B2 (en) | CD40-Ligand lacking native-pattern glycosylation | |
| JP4493854B2 (ja) | リガンドの生物学的活性を増強する方法 | |
| WO1995026985A1 (en) | Modified receptors that continuously signal | |
| US7005412B1 (en) | Method of treating ulcerative colitis and Crohn's disease using IL-17 receptor proteins | |
| NO309000B1 (no) | Isolert DNA-sekvens som koder for en pattedyr-IL-4-reseptor |