NO323197B1 - Fusjonsproteiner omfattende tumornekrosefaktorreseptor, DNA som koder for dette, fremgangsmate for fremstilling av dette samt farmasoytisk preparat. - Google Patents

Fusjonsproteiner omfattende tumornekrosefaktorreseptor, DNA som koder for dette, fremgangsmate for fremstilling av dette samt farmasoytisk preparat. Download PDF

Info

Publication number
NO323197B1
NO323197B1 NO19943617A NO943617A NO323197B1 NO 323197 B1 NO323197 B1 NO 323197B1 NO 19943617 A NO19943617 A NO 19943617A NO 943617 A NO943617 A NO 943617A NO 323197 B1 NO323197 B1 NO 323197B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
tnf
sequence
dna
fusion protein
linker
Prior art date
Application number
NO19943617A
Other languages
English (en)
Other versions
NO943617L (no
NO943617D0 (no
Inventor
Craig A Smith
Original Assignee
Immunex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunex Corp filed Critical Immunex Corp
Publication of NO943617D0 publication Critical patent/NO943617D0/no
Publication of NO943617L publication Critical patent/NO943617L/no
Publication of NO323197B1 publication Critical patent/NO323197B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

1
Foreliggende oppfinnelse omfatter fusjonsproteiner omfattende tumornekrosefaktorreseptor, DNA som koder for dette, fremgangsmåte for fremstilling av dette samt farmasøy-tisk preparat.
Oppfinnelsens bakgrunn
En rekke cytokiner er kjent for å bindes til spesifikke reseptorproteiner på overflaten av målceller. Blant de spesifikke reseptorproteinene som er blitt identifisert, er tumornekrosefaktorreseptorer og interleukin-l-reseptorer. En stor innsats er rettet mot isolering og karakterisering av en rekke reseptorer for å studere deres fysiologiske roller og utforske mulige terapeutiske anvendelser. Bindingen av et bestemt målmolekyl ved hjelp av en oppløselig reseptor adminis-trert til en pasient, kan lindre sykdommer formidlet ved hjelp av målmolekylet.
Tumornekrosefaktor-å (TNFå, også kjent som kachektin) og tumornekrosefaktor-å (TNFå, også kjent som lymfotoksin) er homologe, endogene, sekretoriske pattedyrproteiner med evne til å indusere mange forskjellige effekter på et stort antall celletyper. De store likhetene i de strukturelle og funksjonelle karakteristika til disse to cytokinene har resultert i deres felles beskrivelse som "TNF". Komplementære cDNA-kloner som koder for TNFå (Pennica et al., Nature 312:724, 1984) og TNFå (Gray et al., Nature 312:721, 1984), er blitt isolert, noe som muliggjør ytterligere strukturell og biologisk karakterisering av TNF.
TNF-proteiner initierer sin biologiske effekt på celler ved å binde seg til spesifikke TNF-reseptor- (TNF-R) proteiner uttrykt på plasmamembranen til en TNF-responsiv celle. TNFå og TNFå ble først påvist å bindes til en felles reseptor på den humane cervikalkarsinomcellelinje ME-180 (Aggarwal et al., Nature 318:665, 1985). Hohmann et al. (J. Biol. Chem. 264:14927, 1989) rapporterte at minst to forskjellige celleoverflatereseptorer for TNF foreligger på forskjellige celletyper, selv om slektskapet mellom disse TNF-R-er er uklart. Disse reseptorene har en tilsynelatende molekylvekt på henholdsvis ca. 75-80 kDa og ca. 55-60 kDa. I tillegg til celleoverflatereseptorer for TNF er det også blitt identifisert oppløselige proteiner fra humanurin som er i stand til å 2
binde TNF (Peetre et al., Eur. J. Haematol. 41:414, 1988; Seckinger et al., J. Exp. Med. 157:1511, 1988; Seckinger et al., J. Biol. Chem. 264:11966, 1989; GB patentsøknad med publ. nr. 2 218 101, Seckinger et al.; Engelmann et al., J. Biol. Chem. 264:11974, 1989).
Interleukin-lå (IL-lå) og interleukin-lå (IL-lå) er fjernt beslektede polypeptidhormoner som spiller en sentral rolle i reguleringen av immun- og inflammatoriske responser. Disse to proteinene virker på mange forskjellige celletyper og har flere biologiske virkninger. De biologiske virkningene tilskrevet IL'-lå og IL-lå, formidles via minst to klasser av plasmamembranbundne reseptorer som binder både IL-lå og IL-lå. IL-1-reseptorene uttrykt på B-celler (her henvist til som type II IL-l-reseptorer) er forskjellige fra IL-l-reseptorer påvist på T-celler og andre celletyper (her henvist til som type I
IL-l-reseptorer).
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot reseptorer som omfatter et første tumornekrosefaktorreseptorpolypeptid (TNF-R-polypeptid) kovalent bundet til et andre TNF-R-polypeptid. Alternativt omfatter reseptoren ett eller to TNF-R-polypeptider kovalent bundet til ett eller to interleukin-l-reseptor-polypeptider (IL-lR-polypeptider).
Reseptorene fremstilles fortrinnsvis som fusjonsproteiner via teknologi med rekombinant DNA. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fusjonsprotein, kjennetegnet ved at det omfatter en humantumornekrosefaktorreseptor (TNF-R), omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -22-x i sekvensidentitet nr. 1, hvor x er et helt tall fra 163 til 235, eller en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -40-x i sekvensidentitet nr. 3, hvor x er et helt tall fra 161 til 171, og en humaninterleukin-l-reseptor (IL-1R), omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -20-x i sekvensidentitet nr. 5, hvor x er et helt tall fra 312-316, eller en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -13-x i sekvensidentitet nr. 7, hvor x er et helt tall fra 330-333, med formel TNF-R-linker-TNF-R, hvor linkeren er en peptidlinker.
Ved en annen utførelsesform av oppfinnelsen omfatter fusjonsproteinet TNF-R og IL-1R. Fusjonsproteinet omfatter fortrinnsvis to TNF-R-polypeptider og enten ett eller to IL-lR-polypeptider.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også isolerte DNA-sekvenser som koder for fusjonsproteinene, rekombinante ekspresjonsvektorer som omfatter slike DNA-sekvenser/ og fremgangsmåter for fremstilling av de rekombinante fusjonsproteinene ved å dyrke vertscellene. Farmasøytiske preparater som omfatter et renset fusjonsprotein som beskrevet ovenfor og en egnet fortynner, bærer eller eksipiens, tilveiebringes også ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. Slike preparater kan anvendes i terapi, diagnose og analyser for tilstander formidlet ved hjelp av tumornekrosefaktor eller interleukin-1.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1 viser et restriksjonskart for en type I human IL-lR-cDNA-klon. Setene hvor visse restriksjonsenzymer spalter cDNA-en, er vist. Figurene 2A-2B viser den partielle cDNA-sekvens og avledede aminosyresekvens for en human TNF-R-klon. Nukleotider er nummerert fra begynnelsen av det 5'-utranslaterte område. Aminosyrer er nummerert fra begynnelsen av signalpeptidsekven-sen. Den tilsynelatende signalpeptidsekvens er representert ved aminosyrene -22 til -1. Det N-terminale leucin i det fullt ferdige TNF-R-protein er understreket i stilling 1. Det tilsynelatende transmembranområde fra aminosyrene 236 til 265 er også understreket. C-endene til forskjellige oppløselige TNF-R-er er markert med en pil (0)* Spaltingsseter for visse res-triks jonsendonukleaser anvendt for å konstruere ekspresjonsvektorer, er angitt. Figur 3 viser en plasmidvektor som omfatter et DNA-fragment som koder for et fusjonsprotein med formel TNF-R-linker-TNF-R, konstruert som beskrevet i eksempel 11. Figur 4 viser en plasmidvektor som omfatter et DNA-fragment som koder for et fusjonsprotein med formel IL-1R-linker-TNF-R-linker-TNF-R, konstruert som beskrevet i eksempel 12. Figur 5 viser tre plasmidvektorer som er mellomprod-
ukter ved konstruksjonen av visse vektorer ifølge foreliggende oppfinnelse, som beskrevet i eksempel 12.
Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse er rettet mot reseptorer som omfatter et første TNF-R-polypeptid kovalent bundet til et andre TNF-R-polypeptid. Alternativt omfatter reseptoren ett eller to TNF-R-polypeptider kovalent bundet til ett eller to IL-lR-polypeptider. TNF-R og (når de er til stede) IL-lR-polypeptidkomponentene kan festes til hverandre ved å bruke hvilken som helst egnet teknikk for festing av ett polypeptid til et annet. Kryssbindingsreagenser og peptidlinkere er blant sammenbindingsmetodene som kan anvendes. TNF-R- og IL-lR-polypeptidene er avledet fra pattedyrarter, fortrinnsvis mennes-ket .
Reseptorene fremstilles fortrinnsvis som fusjonsproteiner via teknologi med rekombinant DNA. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fusjonsproteiner som omfatter som én kom-ponent, en pattedyrtumornekrosefaktor (TNF-R). Ett fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter to TNF-R-polypeptider og kan vises ved hjelp av den følgende formel:
TNF-R-linker-TNF-R
\ hvor linkeren er en peptidlinker.
Ved en annen utførelsesform av oppfinnelsen omfatter fusjonsproteinet TNF-R og en pattedyr-interleukin-l-reseptor (IL-lR). Ved denne utførelsesformen av oppfinnelsen kan fusjonsproteinet omfatte ett TNF-R-polypeptid og ett IL-1R-) polypeptid. Fortrinnsvis er to TNF-R-polypeptider og ett IL-lR-polypeptid føyd sammen til fusjonsproteinet. De to TNF-R-polypeptidene er fortrinnsvis ved siden av hverandre (i motsetning til IL-lR som er plassert mellom de to TNF-R-ene) for å fremme binding av TNF. Eksempler på slike fusjonsproteiner
> er vist ved hjelp av de følgende formler:
TNF-R-linker-IL-lR
IL-lR-linker-TNF-R
TNF-R-linker-TNF-R-linker-IL-lR og
IL-lR-linker-TNF-R-linker-TNF-R
hvor hver linker er en peptidlinker. N-enden til hvert fusjonsprotein er på den venstre side av hver formel.
Hver TNF-R-polypeptidkomponent i fusjonsproteinene er uavhengig av hverandre i stand til å binde tumornekrosefaktor (TNF). Likeledes er hvert IL-lR-polypeptid anvendt i fusjonsproteinene, uavhengig av hverandre i stand til å binde interleukin-1 {IL-1}. Det er fordelaktig å inkludere to nabostilte TNF-R-polypeptider i fusjonsproteinet ved at TNF-bindingsaf-finiteten økes sammenlignet med bindingen av TNF ved hjelp av et eneste TNF-R-polypeptid.
Peptidlinkere som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, atskiller TNF-R-polypeptider (og IL-lR-polypeptider når slike er til stede) fra hverandre med en tilstrekkelig avstand til å sikre at hvert polypeptid foldes korrekt i sek-undær- og tertiærstrukturene som er nødvendige for den ønskede biologiske aktivitet. Linkeren bør også gjøre det mulig for de ekstracellulære områdene i TNF-R- og IL-lR-polypeptidene å innta den korrekte romlige orientering slik at det dannes et bindingssete for TNF eller IL-1. Peptidlinkerne virker som mellomledd, i motsetning til de farmasøytisk aktive TNF-R- og IL-lR-polypeptidkomponentene i fusjonsproteinene. Egnede poly-peptidlinkere vil fortrinnsvis (1) innta en fleksibel, forlen-get konformasjon, (2) ikke oppvise tilbøyelighet til å utvikle en ordnet sekundærstruktur som kunne virke inn på de funksjonelle proteinområdene, og (3) ha minimal hydrofob eller ladet karakter som kunne fremme interaksjon med de funksjonelle proteinområdene. Typiske overflateaminosyrer i fleksible protein-områder omfatter glysin (Gly), asparagin (Asn) og serin (Ser). Praktisk talt enhver permutasjon av aminosyresekvenser som inneholder Gly, Asn og Ser, ville forventes å tilfredsstille de ovenfor nevnte kriterier for en peptidlinkersekvens. Andre tilnærmet nøytrale aminosyrer, slik som treonin (Thr) og alanin (Ala), vil også kunne anvendes i linkersekvensen. Egnede peptidlinkere omfatter generelt en kjede av aminosyrer, fortrinnsvis fra 5 til 100 aminosyrer lang, og helst fra 10 til 20 aminosyrer lang. Eksempler på slike linkere omfatter, men er ikke begrenset til, (Gly4Ser)n, hvor n er 1-12,
Gly4SerGly5Ser og (Gly4SerGlysSer) 2.
TNF- R- og IL- lR- polypeptider
Slik de her er brukt, henviser uttrykkene "interleukin-l-reseptor" og "IL-lR" til proteiner som er i stand til å binde interleukin-1- (IL-1) molekyler, og i deres naturlig forekommende konfigurasjon som humanplasmamembranproteiner, spiller de en rolle ved å overføre signalet tilveiebrakt ved hjelp av IL-1 til en celle. Slik de her er brukt, henviser uttrykkene "TNF-reseptor" og "TNF-R" til proteiner som er biologisk aktive ved at de er i stand til å binde tumornekrosefaktor (TNF). Naturlig forekommende, membranbundne former av proteinene overfører også et biologisk signal initiert ved hjelp av en TNF-molekylbinding til en celle. For fusjonsproteiner som omfatter mer enn ett TNF-R-polypeptid, kan TNF-R-polypeptidene være identiske eller forskjellige. Det samme gjelder for IL-lR-polypeptider.
Intakte reseptorer omfatter generelt et ekstracellu-lært område som binder seg til en ligand, et hydrofobt transmembranområde som forblir innpakket i plasmamembranlipiddob-beltlaget, og et cytoplasmatisk eller intracellulært område som antas å avgi et biologisk signal til effektorceller via en kaskade av kjemiske reaksjoner i cellens cytoplasma. Det hydrofobe transmembranområde og et svært ladet område i det cytoplasmatiske område umiddelbart nedstrøms for transmembranområdet virker sammen til å stanse transport av IL-1- og TNF-reseptorer over plasmamembranen. Det ekstracellulære område i TNF-R- og IL-lR-proteinene som her er beskrevet, er den N-terminale del av proteinet, fra aminosyre 1 til aminosyren umiddelbart forut for transmembranområdet'. Det cytoplasmatiske område er den delen av proteinet som er lokalisert nedstrøms for transmembranområdet.
Blant TNF-R-polypeptidene som kan anvendes som kom-ponenter i fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen, er et polypeptid som omfatter aminosyrene 1-439 i sekvensen vist i figurene 2A-2B, som er en fullengde, naturlig forekommende TNF-R-sekvens. Denne TNF-R-DNA og aminosyresekvensen er også vist i sekvensidentitet nr. 1 og 2. Når signalsekvensen er ønsket, kan TNF-R-polypeptidet omfatte aminosyrene -22 til 439 i sekvensen ifølge figurene 2A-2B. Ønskeligheten av å inkludere signalsekvensen avhenger av slike faktorer som posisjonen til TNF-R-polypeptidet i fusjonsproteinet og hvorvidt de påtenkte vertsceller vil prosessere en pattedyrsignalsekvens, som omtalt nedenunder. Den fullt ferdige, fullengde, naturlig forekommende, glykosylerte form av denne humane TNF-R er et glykoprotein med en molekylvekt på ca. 80 kilodalton (kDa). Slik det er brukt gjennom beskrivelsen, betyr uttrykket "fullt ferdig" et protein som mangler en leder- eller signalsekvens som vil kunne være til stede i fullengdetranskripter av et naturlig forekommende gen. Et protein kan omfatte en signalsekvens når det uttrykkes initielt. Spalting av signalsekvensen etter utskillelse av proteinet fra cellen gir den fullt ferdige form av proteinet.
Andre egnede TNF-R-polypeptider er beskrevet i europeisk patentsøknad med publikasjonsnr. 422 339 {heretter EP 422 339) . To egnede TNF-R-polypeptider omfatter arginin (Arg) som rest 174, men er ellers identiske med de ovenfor beskrevne polypeptider som omfatter aminosyrene henholdsvis 1 til 439 eller -22 til 439, i figurene 2A-2B i foreliggende søknad. En TNF-R-aminosyresekvens som er identisk med den ifølge figurene 2A-2B (i foreliggende søknad) bortsett fra utbytting av arginin (Arg) for metionin (Met) i stilling 174 i den fullt ferdige sekvens, er beskrevet i EP 422 339 (se figur 39 der).
cDNA og de utkodede aminosyresekvenser for et annet anvendbart TNF-R-polypeptid er beskrevet i figur 21 i EP
422 339. Det kodende område i cDNA-sekvensen ifølge figur 21 i EP 422 339, og aminosyresekvensen som kodes ved det, er vist som sekvensidentitet nr. 3 og 4 i foreliggende søknad. Selv om det er henvist til et 30 kilodalton protein i EP 422 339, er det blitt rapportert andre molekylvekter for dette proteinet. En molekylvekt på ca. 55 kilodalton ble f.eks. rapportert av Loetscher et al. (Cell 61:351, 1990) og i EP 417 563. Anvendbare TNF-R-polypeptider inkluderer de som omfatter aminosyrene 1 til 415 i sekvensen med sekvensidentitet nr. 4 eller, når signalsekvensen er ønsket, aminosyrene -40 til 415 i sekvensen med sekvensidentitet nr. 4. Fremgangsmåter for fremstilling av dette TNF-R-protein, enten ved rensing fra urin eller fra mediet til en kultur av u937-celler, eller ved hjelp av tekno-
o
logi med rekombinant DNA, er beskrevet i EP 422 339. Denne TNF-R er kjennetegnet ved en N-terminal sekvens (for den fullt ferdige form av proteinet) Asp-Ser-Val-Cys-Pro-Gln-, mens den N-terminale sekvens i den fullt ferdige form av TNF-R-proteinet ifølge figurene 2A-2C er Leu-Pro-Ala-Gln-Val-Ala-.
I visse utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse er TNF-R-polypeptidet et oppløselig TNF-R-polypeptid. Oppløse-lige TNF-R-polypeptider mangler minst en del av (fortrinnsvis hele) transmembranområdet som fremmer retensjon av proteinet på celleoverflaten. De oppløselige polypeptidene mangler også generelt det ladede område i det cytoplasmatiske område (lokalisert umiddelbart nedstrøms for transmembranområdet) som bi-drar til retensjon på celleoverflaten. Fortrinnsvis er hele transmembranområdet og det cytoplasmatiske området deletert fra proteinet eller byttet ut med hydrofile aminosyrer slik at det dannes oppløselig TNF-R. Oppløselig TNF-R utskilles fra cellene og beholder den ønskede biologiske aktivitet.
Eksempler på oppløselige TNF-R-polypeptider er de som omfatter aminosyrene 1-x i sekvensen ifølge figur 2A, hvor x er den C-terminale aminosyre og er valgt fra gruppen bestående av hvilken som helst av aminosyrene 163-235 i figur 2A. Bestemte eksempler omfatter polypeptider som omfatter syrene 1-163, 1-185 eller 1-235 i figur 2A. Det oppløselige TNF-R-polypeptid kan i tillegg omfatte en signalsekvens, f.eks. aminosyrene -22 til -1 i figur 2A.
Ytterligere eksempler på oppløselige TNF-R-polypeptider er de som omfatter aminosyrene 1-184 eller 1-182, -22-184 eller -22-182 i sekvensen ifølge figurene 2A-2B. Slike proteiner kan inneholde enten metionin eller arginin i stilling 174. Fremgangsmåter for fremstilling av eksempler på slike TNF-R-polypeptider omfatter de som er beskrevet i eksemplene 17 og 22 i EP 422 339.
TNF-R-proteinet vist i sekvensidentitet nr. 4, omfatter et signalpeptid (betegnet aminosyrene -40 til -1) og et transmembranområde som begynner med valinresten i stilling 172. Foretrukne, oppløselige former av dette TNF-R-protein omfatter de som omfatter aminosyrene -40-w eller 1-w i sekvensidentitet nr. 4, hvor w er et helt tall fra 161-171 (dvs. hvilken som helst av aminosyrene 161 til 171 i sekvensidentitet nr. 4 er C-enden). Anvendelsen av oligonukleotidrettet rautagenese in vitro for å konstruere en ekspresjonsvektor som koder for et biologisk aktivt TNF-R-protein med aminosyre 161 (asparagin) som den C-terminale aminosyre, er illustrert i eksempel 7 i EP 422 339. Videre er det blitt beskrevet fremgangsmåte for rensing av naturlig forekommende, oppløselige former av begge de ovenfor beskrevne TNF-R-proteiner (dvs. oppløselige former av proteinene med sekvensidentitet nr. 2 og sekvensidentitet nr. 4) fra humanurin, av Engelmann et al. (J. Biol. Chem. 265:1531, 1990).
Interleukin-l-reseptorer som kan anvendes som kompon-enter i fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen, omfatter polypeptider her betegnet som type I IL-lR og type II IL-lR. Type I IL-l-reseptorer er blitt påvist på T-celler og visse andre celletyper, mens ekspresjon av type II IL-l-reseptorer på B-celler er blitt rapportert. I fravær av en spesifikk betegn-else henviser uttrykket "IL-l-reseptor" slik det her er brukt, kollektivt til IL-l-reseptorer av type I og type II.
Blant IL-lR-polypeptidene som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, er type I IL-lR-polypeptidene beskrevet i US patentsøknad nr. 07/821 716, innlevert 14. januar 1992, og nr. 455 488, innlevert 21. desember 1989; og i europeisk patentsøknad med publikasjonsnr. 318 296. DNA-sekvensen til en klonet cDNA som koder for et humant type I IL-lR-protein og aminosyresekvensen utkodet med denne, er her vist i sekvensidentitetene nr. 5 og 6. Proteinet inneholder 569 aminosyrer hvorav 20 er et N-terminalt signalpeptid. Asparaginsyreresten (Asp) i stilling 1 er den første aminosyre i det fullt ferdige protein. Transmembranområdet omfatter aminosyrene 317 (His) - 336 (Tyr). Sekvensen til human IL-lR er også beskrevet i Sims et al., Proe. Nat<*>l. Acad. Sei. USA 86:8946 (1989).
Som med TNF-R-polypeptidene, kan oppløselige IL-lR-polypeptider anvendes i fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse. Oppløselige IL-lR-polypeptider mangler generelt transmembranområdet og mangler fortrinnsvis også det cytoplasmatiske område. Oppløselige IL-lR-proteiner kan også omfatte en del av transmembranområdet eller det cytoplasmatiske området, forutsatt at det oppløselige IL-lR-protein er i stand til å bli utskilt fra cellen.
Eksempler på oppløselige IL-lR-polypeptider av type 1 omfatter, men er ikke begrenset til, de som omfatter aminosyresekvensen vist som aminosyrene y-x i sekvensidentitet nr. 6, hvor x er 312-316 og y er -3 til 3. Med andre ord er den N-terminale aminosyre valgt fra Leu-, Glu-, Ala-, Asp-, Lys- og Cys-restene i henholdsvis stillingene -3, -2, -1, 1, 2 og 3. Den C-terminale aminosyre i det oppløselige protein er valgt fra Thr-, Asn-, Phe-, Gin- og Lys-restene i henholdsvis stillingene 312, 313, 314, 315 og 316. Foretrukne, oppløselige IL-lR-polypeptider inkluderer de som omfatter aminosyrene 1-x i sekvensidentitet nr. 6, hvor x er 312-316.
Hvilke som helst av de ovenfor beskrevne, oppløselige IL-lR-polypeptider av type 1 kan i tillegg omfatte en signalsekvens, f.eks. signalsekvensen vist som aminosyrene -20 til -1 i sekvensidentitet nr. 6. Alternativt kan det anvendes en forskjellig signalsekvens som er funksjonell i en påtenkt vertscelle (f.eks. en gjærsignalsekvens), som omtalt nedenunder .
Blant IL-lR-polypeptidene av type II som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, er de som er beskrevet i US patentsøknad nr. 701 415, innlevert 16. juni 1991, og i europeisk patentsøknad med publikasjonsnr. 460 846. Naturlig forekommende, glykosylerte human-IL-lR-proteiner av type II utvunnet fra cellelysater, har generelt en tilsynelatende molekylvekt på ca. 60-68 kilodalton ved SDS-PAGE. DNA-sekvensen til en klonet cDNA som koder for et humant IL-lR-protein av type II og den derved utkodede aminosyresekvens, er her vist i sekvensidentitetene nr. 7 og 8. Proteinet omfatter et 13-aminosyrers signalpeptid. Transmembranområdet omfatter aminosyrene 331 (Ala) - 356 (Met).
Oppløselige IL-lR-proteiner av type II utvinnes ved å deletere en C-terminal del av proteinet som ikke er nødvendig for IL-l-binding, slik at proteinet utskilles fra cellen. Cys-teinresten i stilling 313 antas å være nødvendig for å opp-rettholde den tertiære struktur til type II IL-lR-molekylet og muliggjøre binding av IL-1. Eksempler på oppløselige IL-lR-polypeptider av type II omfatter således de hvor den C-terminale aminosyre er valgt fra hvilken som helst av aminosyrene 314-333. Med andre ord kan den oppløselige IL-lR inneholde
J.J.
aminosyresekvensen vist som aminosyrene 1-x i sekvensidentitet nr. 8 hvor x er et helt tall fra 314 til 333. Foretrukne eksempler på egnede, oppløselige IL-lR-polypeptider av type II omfatter, men er ikke begrenset til, de som omfatter aminosyrene 1-x i sekvensidentitet nr. 8, hvor x er 330-333. Med andre ord er den C-terminale aminosyre i det oppløselige protein valgt fra Glu-, Ala-, Ser- og Ser-restene i henholdsvis stillingene 330, 331, 332 og 333. De oppløselige IL-lR-polypeptidene av type II kan i tillegg omfatte en signalsekvens, f.eks. signalsekvensen vist som aminosyrene -13 til -1 i sekvensidentitet nr. 8. Alternativt kan det anvendes en forskjellig signalsekvens som er funksjonell i den påtenkte vertscelle (f.eks. en gjærsignalsekvens), som omtalt nedenunder.
Analysefremgangsmåter som her er beskrevet, kan anvendes for å bekrefte biologisk aktivitet for ytterligere, oppløselige TNF-R- og IL-lR-polypeptider utover de bestemte eksempler som er angitt ovenfor. Oppløselig TNF-R og oppløse-lig IL-lR kan identifiseres {og skjelnes fra deres ikke-opp-løselige, membranbundne motparter) ved å skille intakte celler som uttrykker det ønskede protein fra dyrkningsmediet, f.eks. ved sentrifugering, og analysere mediet (supernatanten) med hensyn på tilstedeværelsen av det ønskede protein. Dyrkningsmediet kan analyseres ved å bruke fremgangsmåter som er like eller identiske med de som er beskrevet i eksemplene neden-iunder. Tilstedeværelsen av TNF-R og IL-lR i mediet indikerer at proteinet ble utskilt fra cellene og således er en oppløse-lig form av det ønskede protein.
N- eller C-endene til TNF-R- eller IL-lR-polypeptidene kan variere etter slike faktorer som typen av verts-\ celler som anvendes når fusjonsproteinet fremstilles via teknologi med rekombinant DNA, og de bestemte cellene hvorfra proteinet renses når det anvendes ikke-rekombinant TNF-R eller IL-lR. Slike variasjoner kan f.eks. tilskrives forskjellig posttranslasjonell prosessering av proteinet i forskjellige i typer av celler. Variasjoner i den N- eller C-terminale sekvens kan også skrive seg fra oligonukleotidene valgt til å rekonstruere enten enden av DNA-sekvensen som koder for TNF-R eller IL-lR når ekspresjonsvektorer konstrueres.
Forskjellig prosessering kan resultere i fullt ferdige TNF-R- eller IL-lR-proteiner med en annen N-terminal aminosyre enn de som er vist i stilling 1 i sekvensidentitetene nr. 2, 4, 6 og 8. For eksempel vil, hos visse vertsceller, posttranslasjonell prosessering fjerne metioninresten som kodes for av et initieringskodon, mens metioninresten vil forbli i N-enden til proteiner fremstilt i andre vertsceller. Videre har N- og C-endene vært kjent for å variere for det samme protein avhengig av kilden for proteinet. I noen til-feller kan delesjonen av aminosyrer i begge ender av proteinet skyldes proteolyse som inntrer enten intracellulært eller under rensing. Varierende N-ender kan også skrive seg fra spalting av signalpeptidet hos visse vertsceller på et annet punkt enn mellom aminosyrene -1 og 1 i de beskrevne sekvenser.
Som beskrevet i eksemplene 10 og 11 og figur 31 i EP 422 339, manglet et ikke-rekombinant, fullt ferdig TNF-R-protein renset fra humanurin, to N-terminale aminosyrer som finnes i et ikke-rekombinant TNF-R-protein renset fra den monocyttlignende humancellelinje U937. Den N-terminale aminosyre i den urinavledede TNF-R var alaninresten i stilling 3 i sekvensidentitet nr. 1. Engelmann et al. (J. Biol. Chem. 265:1531, 1990) beskriver et protein som binder TNF og ble renset fra humanurin i former avkortet i N-enden i varierende grad {se sammendraget og side 1533) . Den N-terminale aminosyresekvens til én proteinart var Val-Ala-Phe-Thr-Pro- som tilsvarer aminosyrene 5-9 i sekvensidentitet nr. 1. Andre former av proteinet hadde enten fenylalanin (aminosyre 7 i sekvensidentitet nr. 1) eller treonin (aminosyre 8 i sekvensidentitet nr. 1) som den N-terminale aminosyre.
N- og C-endene til TNF-R- og IL-lR-proteinene kan variere av grunner som omfatter de som er omtalt ovenfor. Den N-terminale aminosyre kan f.eks. være hvilken som helst av aminosyrene i stillingene 1 til 5 i sekvensidentitetene nr. 2 eller 4 for TNF-R, eller i sekvensidentitetene nr. 6 eller 8 for IL-lR. C-enden kan bevisst avkortes under ekspresjonsvek-torkonstruksjon (f.eks. ved konstruksjon av vektorer som koder for oppløselige proteiner som beskrevet ovenfor) eller f.eks. som et resultat av forskjellig prosessering som kan fjerne opptil ca. 5 C-terminale aminosyrer.
Ytterligere TNF-R- og IL-lR-polypeptider som kan anvendes, bibeholder den ønskede, biologiske aktivitet, men varierer fra de naturlig forekommende sekvenser ved at aminosyren (e) er addert til, deletert fra eller byttet ut i den naturlig forekommende sekvens. Den biologiske aktivitet til slike proteiner kan bekreftes ved å bruke analysene som her er beskrevet.
Derivater av TNF-R og IL-lR som er innenfor omfanget av oppfinnelsen, omfatter også forskjellige strukturelle former av det primære protein som bibeholder biologisk aktivitet. På grunn av tilstedeværelsen av ioniserbare amino- og karboksylgrupper kan et TNF-R- eller IL-lR-protein f.eks. være i form av sure eller basiske salter, eller kan være i nøytral sform. Individuelle aminosyrerester kan også modifiseres ved oksidasjon eller reduksjon.
Den primære aminosyrestruktur kan modifiseres ved å danne kovalente eller aggregative konjugater med andre kjemiske rester, slik som glykosylgrupper, lipider, fosfat- og acetylgrupper, og lignende. Kovalente derivater fremstilles ved å binde bestemte, funksjonelle grupper til aminosyresidekjeder eller til N- eller C-endene. Naturlig forekommende varianter kan resultere fra alternative RNA-spleisehendelser.
Andre proteiner som kan anvendes i fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen, omfatter konjugater av TNF-R eller IL-lR med andre polypeptider, som kan fremstilles ved syntese i rekombinant kultur som N-terminale eller C-terminale fusjoner. For eksempel kan det konjugerte peptid være en signal- (eller leder-) peptidsekvens i det N-terminale område av proteinet som kotranslasjonelt eller posttranslasjonelt styrer overfør-ing av proteinet til dets syntesesete til dets funksjonssete innenfor eller utenfor cellemembranen eller -veggen (f.eks. gjær-å-faktorlederen). Fusjonsproteinene kan omfatte peptider som er tilsatt for å lette rensing eller identifikasjon av fusjonsproteinet. Slike peptider omfatter f.eks. poly-His eller de antigene identifikasjonspeptidene beskrevet i US patentskrift nr. 5 Oll 912 og i Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988. Ett slikt peptid er "FLAG"-peptidet, Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK), som er svært antigent og gir en epitop som er reversibelt bundet ved hjelp av et spesifikt, monoklonalt antistoff som muliggjør hurtig analyse og lettvint rensing av uttrykt, rekombinant protein. Denne sekvensen avspaltes også spesifikt ved hjelp av bovin mukosa-enterokinase i resten umiddelbart etter Asp-Lys-paret. Fusjonsproteiner påsatt dette peptidet, kan også være resis-tente overfor intracellulær nedbrytning i £. coli. Et murint hybridom betegnet 4E11, produserer et monoklonalt antistoff som binder peptidet DYKDDDDK i nærvær av visse toverdige metallkationer {som beskrevet i US patentskrift nr. 5 011-912), og er blitt deponert ved American Type Culture Collection under deponeringsnr. HB 9259.
Fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen omfatter TNF-R eller IL-lR med eller uten tilknyttet glykosylering med naturlig forekommende mønster. TNF-R og IL-lR uttrykt i gjær eller pattedyrekspresjonssystemer, f.eks. COS-7-celler, kan være like eller litt forskjellige i molekylvekt og glykosylerings-mønster sammenlignet med de native molekyler, avhengig av eks-presjonssystemet. Ekspresjon av rekombinante proteiner i bakterier, slik som E. coli, gir ikke-glykosylerte proteiner. Proteiner med inaktiverte N-glykosyleringsseter kan fremstilles ved hjelp av oligonukleotidsyntese og ligering, eller ved setespesifikke mutageneseteknikker. Disse mutantproteinene kan fremstilles i en homogen form med redusert karbohydrat i godt utbytte under anvendelse av gjærekspresjonssystemer. N-glykosyleringsseter i eukaryote proteiner er kjennetegnet ved amino-syretripletten Asn-Ai-Z, hvor Ai er hvilken som helst aminosyre bortsett fra Pro, og Z er Ser eller Thr. I denne sekvensen gir asparagin en sidekjedeaminogruppe for kovalent binding av karbohydrat. Et slikt sete kan fjernes ved å bytte ut Asn eller resten Z med en annen aminosyre, deletere Asn eller Z, eller innføye en ikke-Z-aminosyre mellom Ai og Z, eller en annen aminosyre enn Asn mellom Asn og h%. Kjente fremgangsmåter for inaktivering av N-glykosyleringsseter i proteiner omfatter de som er beskrevet i US patentskrift nr. 5 071 972 og EP
276 846. Eksempler på N-glykosyleringsseter i human IL-lR av type II er aminosyrene 53-55, 59-61, 99-101, 206-208 og 264-266 i sekvensidentitet nr. 8. Potensielle N-glykosyleringsseter finnes i IL-lR-proteinet av type I (sekvensidentitet nr.
6) i aminosyrene 80-82, 173-175, 213-215, 229-231, 243-245 og 277-279. N-glykosyleringsseter finnes ved aminosyren 171-173
og 358-360 i TNF-R i figurene 2A-2B.
Cysteinrester som ikke er essensielle for biologisk aktivitet, kan deleteres eller erstattes med andre aminosyrer for å forhindre dannelse av unødvendige eller ukorrekte, intramolekylære disulfidbroer etter renaturering. Cysteinres-ten i stilling 178 i TNF-R-sekvensen ifølge figurene 2A-2B kan f.eks. deleteres. I US patentskrift nr. 4 518 584 beskrives anvendelsen av seterettet mutagenese for å deletere eller erstatte cysteinrester med et protein. Andre fremgangsmåter for mutagenese omfatter modifikasjon av tilgrensende, tobas-iske aminosyrerester for å øke ekspresjon i gjærsystemer hvor KEX2-proteaseaktivitet er til stede. EP 212 914 beskriver bruken av setespesifikk mutagenese for å inaktivere KEX2-proteaseprosesseringsseter i et protein. For å bevare den biologiske aktivitet til TNF-R og IL-lR vil utbyttinger fortrinnsvis resultere i homologe eller konservativt substituerte sekvenser, hvilket betyr at en bestemt aminosyrerest erstattes av en rest med lignende fysikalsk-kjemiske karakteristika. Eksempler på konservative utbyttinger omfatter utbytting av én alifatisk rest med en annen, slik som Ile, Val, Leu eller Ala med en annen, eller utbyttinger av én polar rest med en annen, slik som mellom Lys og Arg; Glu og Asp eller Gin og Asn. Andre slike konservative utbyttinger, f.eks. utbyttinger av hele områder med lignende hydrofobisitetskarakteristika, er vel-kjent. Dessuten tyder bestemte aminosyreforskjeller mellom menneske-, murin- og andre pattedyr-TNF-R-er på ytterligere konservative utbyttinger som kan gjøres uten å endre de essensielle, biologiske karakteristika til TNF-R eller IL-lR.
Endringer i den naturlig forekommende aminosyresekvens kan utføres ved hjelp av hvilken som helst av en rekke kjente teknikker. Mutasjoner kan innføres på bestemte steder ved å syntetisere oligonukleotider som inneholder en mutant-sekvens, flankert med restriksjonsseter som muliggjør ligering til fragmenter i den naturlig forekommende sekvens. Etter ligering koder den resulterende, rekonstruerte sekvens for en analog med den ønskede aminosyreinnføyelse, -utbytting eller
-delesjon.
Alternativt kan det anvendes oligonukleotidrettede, setespesifikke mutagenesefremgangsmåter for å tilveiebringe et
IO
endret gen med bestemte kodoner endret i overensstemmelse med den utbytting, delesjon eller innføyelse som er påkrevet. Eksempelvise metoder for å lage endringene angitt ovenfor, er beskrevet av Walder et al. {Gene 42:133, 1986); Bauer et al.
(Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, januar 1985, 12-19); Smith et al. {Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981), og i US patentskrifter nr. 4 518 584 og 4 737 462 beskrives egnede teknikker.
Variantaminosyresekvensen er fortrinnsvis minst 80% identisk, helst fortrinnsvis minst 90% identisk med den naturlig forekommende sekvens. Prosentvis likhet kan bestemmes f.eks. ved å sammenligne sekvensinformasjon under anvendelse av GAP-datamaskinprogrammet, versjon 6.0, tilgjengelig fra University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Ved GAP-programmet utnyttes sammenstillingsmetoden til Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), som revidert av Smith and Waterman {Adv. Appl. Math. 2:482, 1981). I korte trekk definerer GAP-programmet likhet som det antall sammenstilte symboler {dvs. nukleotider eller aminosyrer) som er like, dividert med det totale antall symboler i den korteste av de to sekvensene. De foretrukne standardparametre for GAP-programmet omfatter: (1) en ensartet sammenligningsmatriks (inneholdende en verdi på 1 for identiteter og 0 for ikke-identiteter) for nukleotider, og den veide sammenligningsmatriks til Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, som beskrevet av Schwartz and Dayhoff, red., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Found-ation, s. 353-358, 1979; (2) et fradrag på 3,0 for hver åpning og ytterligere 0,10 i fradrag for hvert symbol i hver åpning; og (3) ikke noe fradrag for endeåpninger.
Andre proteiner som er i stand til å blokkere bindingen av IL-1 til cellulære reseptorer in vivo, kan erstatte IL-lR-polypeptidene beskrevet ovenfor i fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike proteiner, generelt henvist til som IL-l-reseptorantagonister, omfatter de som er beskrevet av Eisenberg et al. (Nature 343:341, 1990), Hannum et al. (Nature 343:336, 1990), og Carter et al. (Nature 344:633, 1990). Disse antagonistproteinene bindes til IL-l-reseptorer, men har ingen IL-l-lignende aktivitet (f.eks.
X I
overfører de ikke et signal eller gir på annen måte de biologiske effektene som fås fra binding av IL-1 til en cellulær IL-1-reseptor). Antagonistproteinene konkurrerer med IL-1 med hensyn på binding til endogene IL-l-reseptorer og inhiberer således biologiske effekter formidlet ved hjelp av IL-1 in vivo.
US 5073627 beskriver en oppfinnelse som fortrinnsvis vedrører fusjonsproteiner som består av GM-CSF og IL-3.
Craig A. Smith et al., Science, vol. 248, 1990, s 1019-1023 beskriver isolering av en cDNA-klon til TNF-reseptoren og diskuterer molekylære mekanismer som TNF er involvert i.
Stephen P. Einsenberg et al.. Nature, vol. 343, 1990, s. 341-346 bringer til veie primærstrukturen til en human interleukin-l-reseptorantagonist.
WO 9117184 beskriver modifiserte IL-l-inhibitorer.
Karsten Poppel et al., Journal of Exp. Med., vol. 174, 1991, s. 1483-1489 omhandler en konstruksjon av cDNA som koder for det ekstracellulære domenet til en human TNF-reseptor koplet til en sekvens som koder for Fc-delen og hengselsregionen til en muse IgGl tung kjede.
DNA- sekvenser som koder for rekombinante fusjonsproteiner
Isolerte DNA-sekvenser som koder for de ovenfor beskrevne fusjonsproteiner, tilveiebringes også ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. En DNA-sekvens som koder for et fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse, konstrueres ved å bruke teknikker med rekombinant DNA for å innføye DNA-fragmenter som koder for IL-lR- eller TNF-R-polypeptidene, i en passende ekspresjonsvektor. 3'-enden til et DNA-fragment som koder for TNF-R, ligeres (via en peptidlinker) til 5'-enden av DNA-fragmentet som koder for IL-lR, med leserammene i sekvensene i fase for å muliggjøre translasjon av mRNA til et enkelt biologisk aktivt fusjonsprotein. Alternativt kan 3'-enden av et DNA-fragment som koder for IL-lR, ligeres (via en peptidlinker) til 5'-enden av DNA-fragmentet som koder for TNF-R, med leserammene i sekvensene i fase for å muliggjøre translasjon av mRNA til et enkelt biologisk aktivt fusjonspro-
IO
tein. En ytterligere sekvens som koder for TNF-R, kan ligeres i den samme leseramme, hvorved det fås en sekvens som koder for et fusjonsprotein som omfatter to TNF-R-polypeptider og ett IL-lR-polypeptid. Den IL-IR-kodende sekvens plasseres fortrinnsvis oppstrøms for den eller de TNF-R-kodende sekvens (er). Selv om fusjonsproteinet kan omfatte to IL-lR-polypeptider sammen med TNF-R-polypeptidet eller -polypeptidene, er én IL-lR foretrukket. En enkelt IL-lR gir den ønskede, høye affinitet-IL-l-bindende aktivitet uten de mulige ulempene med økning av størrelsen på fusjonsproteinet ved å addere en andre IL-lR. Slike ulemper kan omfatte forøkt kompleksitet av vek-torkonstruksjonsfremgangsmåter og mulig reduksjon i ekspre-sjonsnivået til det ønskede protein. Ved en annen utførelses-form av foreliggende oppfinnelse ligeres en DNA-sekvens som koder for TNF-R til en linkersekvens som igjen ligeres til en andre TNF-R-kodende sekvens.
En DNA-sekvens som koder for en N-terminal signalsekvens, kan beholdes på DNA-sekvensen som koder for det N-terminale polypeptid, mens stoppkodoner som ville forhindre gjen-nomlesning til den eller de nedstrøms DNA-sekvens(er), fjernes. Omvendt beholdes et stoppkodon som er påkrevet for ende-translasjon generelt på DNA-sekvensen som koder for det C-terminale polypeptid. DNA-som koder for en signalsekvens, fjernes fortrinnsvis fra andre DNA-sekvenser enn de som koder for det N-terminale polypeptid.
En DNA-sekvens som koder for en ønsket peptidlinker, kan innføyes mellom, og i den samme leseramme som, DNA-sekvensene som koder for TNF-R eller IL-lR under anvendelse av hvilken som helst egnet, konvensjonell teknikk. For eksempel kan et kjemisk syntetisert oligonukleotid som koder for linkeren og som inneholder passende restriksjonsendonuklease-spaltingsseter, ligeres mellom sekvensene som koder for TNF-R eller IL-lR. Alternativt kan en kjemisk syntetisert DNA-sekvens inneholde en sekvens som er komplementær til 3'-enden (uten stoppkodonet) av enten TNF-R eller IL-lR etterfulgt av en linkerkodende sekvens som etterfølges av en sekvens som er komplementær til 5<*->enden av den andre av TNF-R og IL-lR. Oligonukleotidrettet mutagenese anvendes så for å innføye den linkerkodende sekvens i en vektor som inneholder en direkte 13
fusjon av TNF-R og IL-lR. Ved en annen teknikk anvendes polymerasekjedereaksjoner ved bruk av primere som delvis omfatter enkelttrådfragmenter som koder for en peptidlinker. PCR-genererte DNA-fragmenter som koder for to forskjellige proteiner, kan knyttes sammen gjennom annealering av de komplementære, enkelttrådede, linkerkodende segmenter som er til stede i en ende av hvert fragment. Foretrukne fremgangsmåter for innføy-else av et linkerkodende DNA-segment mellom TNF-R og IL-1R-DNA-sekvenser (eller mellom to TNF-R-DNA-sekvenser), er beskrevet i eksemplene 11 og 12 nedenunder.
DNA-sekvenser som koder for TNF-R og IL-lR, kan isoleres ved hjelp av hvilken som helst egnet, vanlig fremgangsmåte, for anvendelse ved konstruksjon av de fusjonsproteinkodende DNA-sekvenser ifølge foreliggende oppfinnelse. DNA-sekvenser som koder for fusjonsproteiner som skal uttrykkes i en mikroorganisme, vil fortrinnsvis ikke inneholde noen introner som altfor tidlig kunne avslutte transkripsjon av DNA til mRNA; for tidlig avslutning av transkripsjon kan imidlertid være ønskelig f.eks. når det ville resultere i mutanter med fordelaktige, C-terminale avkortninger, f.eks. delesjon av et transmembranområde, hvorved man får en oppløselig reseptor som ikke er bundet til cellemembranen. Blant de egnede fremgangsmåter for kloning av type I og type II IL-lR-cDNA er de som er vist i henholdsvis eksemplene 8 og 9. TNF-R-cDNA kan isoleres ved hjelp av fremgangsmåter som omfatter de som er beskrevet i eksempel 3.
Den kodende sekvens for TNF-R kan fås ved å isolere en sekvens som koder for TNF-R fra et rekombinant cDNA- eller genomisk DNA-bibliotek. Et cDNA-bibliotek konstrueres fortrinnsvis ved å oppnå polyadenylert mRNA fra en bestemt cellelinje som uttrykker en pattedyr-TNF-R, f.eks. den humane fibroblastcellelinje WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1), og anvende mRNA-en som et templat for å syntetisere dobbelttrådet cDNA. Den dobbelttrådede cDNA pakkes så inn i en rekombinant vektor som innføres i en vertscelle (f.eks. en passende E. coli-stamme) og propageres. TNF-R-sekvenser inneholdt i cDNA-biblioteket, kan identifiseres ved screening av biblioteket med en passende nukleinsyreprobe som er i stand til å hybridisere med human TNF-R-cDNA. En annen kloningsteknikk som kan anvendes, er den direkte ekspresjonsfremgangsmåte beskrevet i eksempel 3 nedenunder. Alternativt kan DNA-er som koder for TNF-R-proteinet, settes sammen ved ligering av syntetiske oligonukleotidunderenheter som tilsvarer hele eller en del av sekvensen ifølge figurene 2A-2B, hvorved man får en komplett kodende sekvens.
Ytterligere cDNA-kloner kan isoleres fra cDNA-biblio-teker fra andre pattedyrarter ved kryssartshybridisering. For bruk ved hybridisering kan DNA som koder for TNF-R eller IL-lR, merkes kovalent med et påvisbart stoff, slik som en fluor-escerende gruppe, et radioaktivt atom eller en kjemilumines-cerende gruppe, ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente for fagfolk innen den aktuelle teknikk.
Som for de fleste pattedyrgener, kodes pattedyr-TNF-reseptorer og IL-l-reseptorer antakeligvis av multieksongener. Alternative mRNA-konstruksjoner som kan tilskrives de forskjellige mRNA-spleisehendelser etter transkripsjon, og som har til felles store områder med identitet eller likhet med cDNA-ene som her er beskrevet, slik at biologisk aktiv TNF-R eller IL-lR derved utkodes, anses for å være nyttige ved fremstilling av fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse.
DNA som koder for oppløselige TNF-R- og IL-lR-polypeptider, kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst av en rekke vanlige teknikker. Et DNA-fragment som koder for et ønsket, oppløselig polypeptid, kan underklones i en ekspresjonsvektor. DNA-fragmenter kan fremstilles ved hjelp av restrik-sjonsendonukleasefordøyelse av en fullengde, klonet DNA-sekvens og isoleres ved elektroforese på agarosegeler. Alternativt kan en ønsket DNA-sekvens syntetiseres kjemisk ved å bruke kjente teknikker. Linkere som inneholder restriksjons-endonukleasespaltingssete(r), kan anvendes for å innføye det ønskede DNA-fragment i en ekspresjonsvektor, eller fragmentet kan fordøyes i spaltingsseter som er naturlig til stede i det.
De velkjente fremgangsmåtene med polymerasekjedereaksjon (PCR) kan også anvendes for å isolere en DNA-sekvens som koder for et ønsket, oppløselig proteinfragment. Denne teknikken er illustrert i eksemplene nedenunder.
Ved en annen fremgangsmåte kan en enzymatisk behandling (under anvendelse av Bal 31-eksonuklease) anvendes'for å deletere terminale nukleotider fra et DNA-fragment, hvorved man får et fragment med en bestemt ønsket ende. Blant de kommersielt tilgjengelige linkere er de som kan ligeres til de butte endene fremstilt ved hjelp av Bal 31-fordøyelse og som inneholder restriksjonsendonukleasespaltingssete(r). Alternativt kan oligonukleotider som rekonstruerer N- eller C-enden av et DNA-fragment til et ønsket punkt, syntetiseres. Oligonukleotidet kan inneholde et restriksjonsendonukleasespalt-ingssete oppstrøms for den ønskede, kodende sekvens og ha plassert et initieringskodon (ATG) i N-enden av den kodende sekvens.
TNF-R- og IL-lR-DNA-sekvensene kan variere fra de som er vist i sekvensidentitetene nr. 1, 3, 5 og 7. På grunn av den kjente degenerasjon av den genetiske kode kan det f.eks. være betydelig variasjon i nukleotidsekvenser som koder for den samme aminosyresekvens. DNA-sekvenser som er i stand til å hybridisere til DNA-sekvensene ifølge sekvensidentitetene nr. 1, 3, 5 og 7 under middels strenge betingelser (55°C, 5 x SCC), og som koder for et biologisk aktivt TNF-R- eller IL-1R-polypeptid, anses også for å være henholdsvis TNF-R-kodende eller IL-IR-kodende DNA-sekvenser i sammenhengen med den foreliggende oppfinnelse. Mutasjoner kan bevisst lages i de naturlig forekommende DNA-sekvenser, f.eks. for å frembringe de ovenfor beskrevne aminosyreutbyttinger, -delesjoner og -inn-føyelser. Visse av mutasjonene vil ikke bli uttrykt i det en-delige proteinprodukt. For eksempel kan nukleotidutbyttinger lages for å øke ekspresjon, primært for å unngå sekundærstruk-tursløyfer i den transkriberte mRNA (se EP 75 444). Andre endringer i nukleotidsekvensen kan lages for å tilveiebringe kodoner som lettere translateres ved hjelp av den utvalgte vert, f.eks. de velkjente E. coli-preferansekodonene for E. coli-ekspresjon. Stille mutasjoner (endringer i DNA-sekvensen som ikke endrer den utkodede aminosyresekvens) kan også inntre under polymerasekjedereaksjoner. Ved én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse endres nukleotid nr. 437 i sekvensidentitet nr. 5 (type I IL-lR) fra en T til en C. Denne -stille mutasjon inntrådte under en polymerasekjedereaksjon.
Mutasjoner i nukleotidsekvenser bør selvsagt bevare leserammefasen til de kodende sekvenser. Mutasjonene vil fortrinnsvis ikke skape kompleraentærområder som ville kunne hybridisere slik at det fremstilles sekundære mRNA-strukturer, slik som sløyfer eller hårnåler som på skadelig måte ville påvirke translasjon av fusjonsprotein-mRNA.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen som koder for de ovenfor beskrevne fusjonsproteiner, hvor hver TNF-R-DNA-sekvens i fusjonsprotein-DNA-sekvensen er valgt fra: (a) DNA-sekvenser avledet fra det kodende område i et naturlig forekommende pattedyr-TNF-R-gen (f.eks. cDNA avledet fra det kodende område i sekvensidentitetene nr. 1 eller 3); (b) DNA-sekvenser som er i stand til å hybridisere til en DNA-sekvens ifølge (a) under middels strenge betingelser (50°C, 2 x SSC) og som koder for biologisk aktiv TNF-R, og (c) DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode, til DNA-sekvensene definert under (a) eller (b), og som koder for biologisk aktiv TNF-R. Fusjonsprotein-DNA-sekvensen kan likeledes omfatte IL-lR-kodende DNA-sekvens(er) valgt fra: (a) DNA-sekvenser avledet fra det kodende område i et naturlig forekommende pattedyr-IL-lR-gen (f.eks. cDNA avledet fra det kodende område i sekvensidentitetene nr. 5 eller 7); (b)- DNA-sekvenser som er i stand til å hybridisere til en DNA-sekvens ifølge (a) under middels strenge betingelser (55°C, 5 x SSC) og som koder for biologisk aktiv IL-lR; og (c) DNA-sekvenser som er degenererte som et resultat av den genetiske kode, til DNA-sekvensene definert under (a) eller (b), og som koder for biologisk aktiv IL-lR.
Ekspresjon av rekombinante fusjonsproteiner
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer rekombinante ekspresjonsvektorer for uttrykking av DNA som koder for fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse. De rekombinante ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen er repliker-bare DNA-konstruksjoner som inneholder en syntetisk eller cDNA-avledet DNA-sekvens som koder for et av de ovenfor beskrevne fusjonsproteiner, operativt bundet til egnede transkripsjons- eller translasjonsregulatorelementer. Eksempler på genetiske elementer med en regulatorrolle i geneks-presjon omfatter transkripsjonspromoterer, -operatorer eller -fremmere, en sekvens som koder for egnede ribosomale mRNA-bindingsseter, og passende transkripsjons- og translasjonsini-tierings- og -termineringssekvenser. Evnen til å replikere i en vert, vanligvis bidratt til ved hjelp av et replikasjonsopprinnelsessted, og et seleksjonsgen for å lette gjenkjenn-else av transformanter, kan i tillegg være inkorporert. Regulatorelementene som anvendes i ekspresjonsvektorene, avledes generelt fra pattedyr-, mikrobe-, virus- eller insektgener. Ekspresjonsvektorer avledet fra retrovirus, kan også anvendes.
DNA-områder er operativt bundet når de er funksjonelt relatert til hverandre. En DNA-sekvens som koder for et fusjonsprotein, sies å være operativt bundet til ett eller flere av de ovenfor beskrevne regulatorelementer når fusjonsprotein-DNA-sekvensen transkriberes, eller den resulterende mRNA translateres, under kontroll av regulatorelementet eller regulatorelementene.
Transformerte vertsceller er celler som er blitt transformert eller transfektert med fremmed-DNA under anvendelse av teknikker med rekombinant DNA. I foreliggende oppfin-nelsessammenheng omfatter fremmed-DNA en sekvens som koder for fusjonsproteinet ifølge oppfinnelsen. Vertsceller kan transformeres for det formål å klone eller amplifisere fremmed-DNA, eller kan transformeres med en ekspresjonsvektor for fremstilling av fusjonsproteinet under kontroll av passende promoterer. Egnede vertsceller omfatter prokaryoter, gjær eller høyere eukaryote celler. Passende klonings- og ekspresjonsvektorer for anvendelse med bakterie-, sopp-, gjær- og pattedyr-celleverter er beskrevet av Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985). Cellefrie trans-lasjonssystemer vil også kunne anvendes for å fremstille fusjonsprotein under anvendelse av RNA-er avledet fra DNA-kon-struksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse.
Prokaryoter omfatter gramnegative og grampositive organismer. Prokaryote ekspresjonsvektorer omfatter generelt én eller flere fenotypeselekterbare markører, f.eks. et gen som koder for proteiner som gir antibiotisk resistens eller tilfører et autotroft behov, og et replikasjonsopprinnelsessted som gjenkjennes av verten, for å sikre amplifikasjon i verten. Eksempler på egnede, prokaryote verter for transformasjon omfatter E. coli, slike basiller som Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, og forskjellige arter innenfor slek-tene Pseudomonas, Streptomyces og Staphylococcus, selv om andre også kan anvendes etter valg.
Anvendbare ekspresjonsvektorer for bakteriell bruk kan omfatte en selekterbar markør og et bakterielt replikasjonsopprinnelsessted fra kommersielt tilgjengelige plasmider som omfatter genetiske elementer fra den velkjente klonings-vektor pBR322 (ATCC 37017). Slike kommersielle vektorer omfatter f.eks. pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) og pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI, USA) . Disse pBR322-"ryggrad"-avsnitt kombineres med en passende promoter og struktursekvensen som skal uttrykkes. E. coli transformeres vanligvis under anvendelse av derivater av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-art (Bolivar et al., Gene 2:95, 1977). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetrasyklinresis-tens som gir enkle midler for å identifisere transformerte celler.
Vanlig brukte promoterer i rekombinante, mikrobielle ekspresjonsvektorer omfatter å-laktamase- (penicillinase) og laktosepromotersystemet (Chang et al., Nature 275:615, 1978; og Goeddel et al., Nature 251:544, 1979), tryptofan- (trp-) promotersystemet (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980; og EPA 36 776) og tac-promoteren (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 412, 1982). Ved et særlig nyttig bakterielt ekspresjonssys-tem anvendes fag é-pL-promoteren og den varmeinduserbare cI857ts-repressor. Plasmidvektorer tilgjengelige fra American Type Culture Collection som omfatter derivater av é-Pi,-promoteren, inkluderer plasmid pHUB2 som finnes i E. coli-stamme JMB9 (ATCC 37092) og pPLc28, som finnes i E. coli RR1 (ATCC 53082).
Det rekombinante fusjonsprotein kan også uttrykkes i gjærverter, fortrinnsvis fra Saccharomyces-arter, slik som S. cerevisiae. Gjær fra andre slekter, slik som Pichia eller iCluyverojnyces, kan også anvendes. Gjærvektorer vil generelt inneholde et replikasjonsopprinnelsessted fra 2 im-gjærplas-midet eller en autonomt replikerende sekvens (ARS), en promoter, DNA som koder for fusjonsproteinet, sekvenser for poly-adenylering og transkripsjonsterminering, og et seleksjonsgen. Fortrinnsvis vil gjærvektorer omfatte et replikasjonsopprinnelsessted og selekterbare markører som muliggjør transformasjon av både gjær og E. coli, f.eks. ampicillinresistensgenet fra E. coli og trpl-genet fra S. cerevisiae som gir en selek-sjonsmarkør for en mutantstamme av gjær som mangler evnen til å vokse i tryptofan, og en promoter avledet fra et høyuttrykt gjærgen for å indusere transkripsjon av en struktursekvens nedstrøms. Tilstedeværelsen av trpl-skaden i gjærvertscelle-genomet tilveiebringer så et effektivt miljø for å påvise transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan.
Egnede promotersekvenser i gjærvektorer omfatter pro-moterne for metallotionein, 3-fosfoglyseratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; og Hol-land et al., Biochem. 17:4900, 1978), slik som enolase, glyseraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Egnede vektorer og promoterer for anvendelse i gjærekspresjon er videre beskrevet i R. Hitzeman et al., EPA 73 657.
Foretrukne gjærvektorer kan settes sammen under anvendelse av DNA-sekvenser fra pBR322 for seleksjon og replikasjon i E. coli (Amp<E->gen og replikasjonsopprinnelse), og gjær-DNA-sekvenser som omfatter en glukose-undertrykkbar ADH2-promoter og å-faktorsekresjonsleder. ADH2-promoteren er blitt beskrevet av Russell et al. (J. Biol. Chem. 255:2674, 1982) og Beier et al., (Nature 300:724, 1982). Fordelaktig bindes et DNA-segment som koder for en ledersekvens som er funksjonell i gjær, operativt til 5'-enden av DNA som koder for fusjonsproteinet. Det utkodede lederpeptid fremmer sekresjon av fusjonsproteinet fra vertscellen og spaltes generelt fra fusjonsproteinet etter sekresjon. Som ett eksempel kan gjær-å-faktorlederen som styrer sekresjon av heterologe proteiner, innføyes mellom promoteren og strukturgenet som skal uttrykkes. Se f.eks. Kurjan et al., Cell 30:922, 1982; og Bitter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5330, 1984. Ledersekvensen kan modifiseres slik at den nær sin 3'-ende inneholder ett eller flere anvendbare restriksjonsseter for å lette fusjon av ledersekvensen til fremmedgener.
Egnede gjærtransformasjonsfremgangsmåter er kjent for fagfolk innen teknikken. En eksempelvis teknikk er beskrevet av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75:1929, (1978), hvor det selekteres med hensyn på Trp<+->transformanter i et selektivt medium bestående av 0,67% gjærnitrogenbase, 0,5% kasaminosyrer, 2% glukose, 10 ig/ml adenin og 20 ig/ml uracil. Vertsstammer transformert ved hjelp av vektorer som omfatter den ovenfor beskrevne ADH2-promoter, kan dyrkes for ekspresjon i et rikt medium bestående av 1% gjærekstrakt, 2% pepton og 1% glukose supplert med 80 ig/ml adenin og 80 ig/ml uracil. De-represjon av ADH2-promoteren inntrer etter uttømming av mediumglukose. Urensede gjærsupernatanter innhøstes ved fil-trering og holdes ved 4% før videre rensing.
Forskjellige pattedyr- eller insektcellekultursys-temer kan anvendes for å uttrykke rekombinant protein. Baculo-virussystemer for fremstilling av heterologe proteiner i insektsceller er det gitt en oversikt over av Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Etablerte cellelinjer av pattedyropprinnelse kan anvendes. Eksempler på egnede patte-dyrvertscellelinjer omfatter C0S-7-linjene av apenyreceller, beskrevet av Gluzman (Cell 23:175, 1981), L-celler, C127-3T3-, kinesisk hamsterovarie- (CHO), HeLa- og BHK-cellelinjer. Pat-tedyrekspresjonsvektorer kan omfatte ikke-transkriberte elementer, slik som et replikasjonsopprinnelsessted, en egnet promoter og fremmer bundet til genet som skal uttrykkes, og andre 5'- eller 3'-flankerende, ikke-transkriberte sekvenser, og 5'- eller 3'-ikke-translaterte sekvenser, slik som nødvend-ige, ribosombindende seter, et polyadenyleringssete, spleise-donor og akseptorseter, og transkripsjonstermineringssek-venser.
Transkripsjons- og translasjonskontrollsekvensene i ekspresjonsvektorer som skal anvendes ved transformering av hvirveldyrceller, kan tilveiebringes ved hjelp av viruskilder. For eksempel avledes vanlig brukte promoterer og fremmere fra polyoma, - adenovirus 2, apevirus 40 (SV40) og humancytomegalo-virus. DNA-sekvenser avledet fra SV40-virusgenomet, f.eks. SV40-opprinnelsessted, "tidlig" og "sen" promoter, fremmer, spleiser og polyadenyleringsseter, kan anvendes for å tilveiebringe de øvrige genetiske elementene som er påkrevet for ekspresjon av en heterolog DNA-sekvens. De "tidlige" og "sene" promoterer er særlig nyttige ettersom begge oppnås lett fra viruset som et fragment som også inneholder SV40-virusreplika-sjonsopprinnelsesstedet (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Mindre eller større SV40-fragmenter kan også anvendes, forutsatt at den omtrent 250 bp store sekvensen som strekker seg fra Hind III-setet mot Bgll-setet lokalisert i virusreplika-sjonsopprinnelsesstedet, er inkludert. Eksempelvise vektorer kan konstrueres som beskrevet av Okayama and Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Et nyttig system for stabil høynivåeks-presjon av pattedyrreseptor-cDNA-er i C127 murine brystepitel-celler kan konstrueres hovedsakelig som beskrevet av Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986).
Fremstilling og rensing av fusjonsproteinet
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av det rekombinante fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse, som omfatter å dyrke en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor som omfatter en DNA-sekvens som koder for fusjonsproteinet, under betingelser som fremmer ekspresjon av fusjonsproteinet, som så renses fra dyrkningsmediene eller celleekstraktene. Hvilken som helst egnet renseprosess kan anvendes, idet den valgte fremgangsmåte varierer etter slike faktorer som typen av vertsceller og hvorvidt det ønskede protein utskilles fra vertscellene. Fusjonsproteinet vil bli utskilt i dyrkningsmediet når det først fusjoneres til en signalsekvens eller et lederpeptid som er operativt i vertscellene, eller når proteinet omfatter opp-løselige former av .TNF-R og IL-lR-polypeptidene.
For eksempel kan supernatanter fra ekspresjonssys-temer som utskiller rekombinant protein i dyrkningsmediet, først konsentreres under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig proteinkonsentreringsfilter, f.eks. en "Amicon" eller "Millipore Pellicon" ultrafiltreringsenhet. Etter konsentrer-ingstrinnet kan konsentratet tilføres en egnet rensematriks. For eksempel kan en egnet affinitetsmatriks omfatte TNF eller IL-1. En affinitetsmatriks kan fremstilles ved å koble rekombinant, human TNF eller IL-1 til cyanbromidaktivert "Sepharose" (Pharmacia) eller "Hydrazide Affigel" (Biorad), i henhold til produsentens anbefalinger. En foretrukket rensefremgangs-måte omfatter sekvensvis, immunologisk rensing under anvendelse av antistoffer bundet til en egnet bærer. Proteiner som bindes til et antistoff som er spesifikt for TNF-R, utvinnes og bringes i kontakt med et antistoff som er spesifikt for IL-lR på en uoppløselig bærer. Proteiner som reagerer immunologisk med begge antistoffer, kan således identifiseres og isoleres. Et monoklonalt antistoff som er spesifikt for humantype I IL-lR, ble deponert ved American Type Culture Collection under deponeringsnr. HB 10556, 13. september 1990. Alternativt kan en anionbytterharpiks anvendes, f.eks. en matriks eller et substrat med utstikkende dietylaminoetylgrupper (DEAE). Matriksene kan være akrylamid, agarose, dekstran, cellulose eller andre typer som vanligvis anvendes ved proteinrensing. Alternativt kan det anvendes et kationbyttertrinn. Egnede kat-ionbyttere omfatter forskjellige uoppløselige matrikser som omfatter sulfopropyl- eller karboksymetylgrupper. Sulfopropyl-grupper er foretrukket. Ett eller flere trinn med reversfase-væskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) hvor det anvendes hydrofobe RP-HPLC-medier, f.eks. silikagel med utstikkende metyl- eller andre alifatiske grupper, kan anvendes for ytterligere å rense en fusjonsproteinbestanddel.
Rekombinant protein fremstilt i bakteriekultur, isoleres vanligvis ved innledende ekstraksjon fra cellepelleter, etterfulgt av ett eller flere konsentrasjons-, utsaltings-, vandig ionebytter- eller størrelsesutelukkelseskromatografi-trinn. Til sist kan det anvendes væskekromatografi med høy yteevne (HPLC) for sluttrensingstrinn. Mikrobeceller anvendt ved ekspresjon av rekombinante fusjonsproteiner, kan brytes opp ved hjelp av hvilken som helst passende metode, inkludert fryse-tine-sirkulering, sonikering, mekanisk oppbrytning eller anvendelse av cellelyserende midler.
Fermentasjon av gjær som uttrykker fusjonsproteiner som et utskilt protein, forenkler rensing i stor grad. Utskilt, rekombinant protein som skriver seg fra en storskala-fermentering, kan renses ved hjelp av fremgangsmåter som er analoge med de som er beskrevet av Urdal et al. (J. Chromatog.
296:111, 1984), som omfatter to sekvensvise, reversfase-HPLC-trinn for rensing av et rekombinant protein på en preparativ HPLC-kolonne.
Noen av eller alle de forutgående rensetrinn kan i forskjellige kombinasjoner anvendes for å tilveiebringe et hovedsakelig homogent, rekombinant protein. Rekombinant cel-lekultur muliggjør fremstillingen av fusjonsproteinet fritt for de forurensende proteiner som normalt kan være forbundet med TNF-R eller IL-lR slik de finnes i naturen i sine respek-tive opprinnelsesarter, f.eks. i celler, celleeksudater eller kroppsvæsker. Rensefremgangsmåtene ovenfor er blant de som også kan anvendes til å rense ikke-rekombinante reseptorer ifølge foreliggende oppfinnelse.
Som et alternativ til fremstilling av reseptorene ifølge oppfinnelsen som fusjonsproteiner kan TNF-R- og IL-1R-proteinene fremstilles separat og renses og deretter bindes sammen. Et stort antall reagenser som kan anvendes til kryss-binding av ett proteinmolekyl til et annet, er kjent. Hetero-bifunksjonelle og homobifunksjonelle linkere er tilgjengelige for dette formål fra f.eks. Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois. Slike linkere inneholder to funksjonelle grupper (f.eks. estere og/eller maleimider) som vil reagere med visse funksjonelle grupper på aminosyresidekjeder (f.eks. aminer på lysinrester og sulfhydrylgrupper generert på cysteinrester ved reduksjon), hvorved ett polypeptid bindes til et annet. Eksempler på slike kryssbindingsreagenser er N-maleimidobenzoyl-succinimidylester og N-hydroksysuccinimid. Reagenset og reak-sjonsbetingelsene bør velges slik at kryssbindingen ikke virker inn på binding av TNR eller IL-1 til reseptoren. TNF-R-og IL-lR-polypeptidene bindes fortrinnsvis via en av de ovenfor beskrevne peptidlinkerne som virker som et mellomledd. En peptidlinker kan festes til TNF-R eller til IL-lR ved hjelp av hvilken som helst av de vanlige fremgangsmåter som brukes til å feste ett polypeptid til et annet. Kryssbindingsreagensene som er tilgjengelige fra Pierce Chemical Company som beskrevet ovenfor, er blant de som kan anvendes. Aminosyrer med side-kjeder som er reaktive med slike reagenser, kan være inkludert i peptidlinkeren, f.eks. i endene av den.
JU
Farmasøytiske preparater
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer farmasøytiske preparater som omfatter hvilket som helst av de ovenfor beskrevne fusjonsproteiner og en fysiologisk akseptabel bærer, fortynner eller eksipiens. Slike bærere, eksipienser og for-tynnere vil være ikke-toksiske for mottakere ved de doseringer og konsentrasjoner som anvendes. Slike preparater kan omfatte buffere, slike antioksidanter som askorbinsyre, polypeptider med lav molekylvekt {mindre enn ca. 10 rester), proteiner, aminosyrer, karbohydrater inkludert glukose, sukrose eller dekstriner, slike chelateringsmidler som EDTA, glutation og andre stabiliseringsmidler og eksipienser. Nøytralbufret salt-oppløsning eller saltoppløsning blandet med konspesifikt serumalbumin, er eksempler på passende fortynningsmidler. Fortrinnsvis formuleres preparatet som et lyofilisat under anvendelse av passende eksipiensoppløsninger (f.eks. sukrose) som fortynningsmidler. Passende doseringer kan bestemmes i kliniske forsøk. Mengden og hyppigheten av administrering vil selvsagt avhenge av slike faktorer som egenskapene til og al-vorligheten av indikasjonen som behandles, den ønskede respons, tilstanden til pasienten, og så videre.
Tilstander formidlet ved hjelp av enten TNF eller IL-1, kan behandles ved å administrere en terapeutisk effektiv mengde av et fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse i form av et farmasøytisk preparat til en pasient som lider av en slik sykdom. En sykdom sies å være formidlet av TNF eller IL-1 når TNF eller IL-1 forårsaker {direkte eller indirekte) eller forverrer sykdommen. Oppløselige reseptorproteiner kan brukes til å bindes kompetitivt til TNF eller IL-1 for derved å inhibere binding av TNF eller IL-1 til celleoverflatereseptorer .
For terapeutisk bruk administreres rensede fusjonsproteiner ifølge foreliggende oppfinnelse til en pasient, fortrinnsvis et menneske, for behandling på en måte som er passende for indikasjonen. Således kan f.eks. de farmasøytiske preparater administreres ved hjelp av bolusinjeksjon, kontinu-erlig innsprøyting, langvarig frigjørelse fra implantater eller ved annen egnet teknikk.
Fusjonsproteinet som anvendes i de farmasøytisk preparater, bør være renset ved at fusjonsproteinet er i det vesentlige fritt for andre proteiner av naturlig eller endogen opprinnelse og inneholder mindre enn ca. 1 vekt% protein-forurensninger som er tilbake fra produksjonsprosesser. Slike preparater kan imidlertid inneholde andre proteiner tilsatt som stabiliseringsmidler, bærere, eksipienser eller kotera-peutika. Fusjonsproteinet renses inntil hovedsakelig homogenitet dersom det er påvisbart som et enkelt proteinbånd i en polyakrylamidgel ved sølvfarging.
Fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres for å behandle tilstander som antas å være formidlet, i det minste delvis, av TNF, slik som cacheksi, reumatoid artritt, diabetes, multippel sklerose, pulmonar fibrose og silikose, cerebral malaria og allograft- og xenograftavvis-ning i "graft versus host"-sykdom. TNF har også vært implisert i sårbetennelse og septisk sjokk. Bakterieendotoksin kan for-årsake sårbetennelse hos pattedyr infisert med visse typer av bakterier, og menes å stimulere makrofager slik at de produserer faktorer som omfatter TNF. Folks et al. (PNAS USA 86:2365, 1989) foreslår at TNF-å spiller en viktig rolle i patogenesen til HIV-infeksjon. TNF-å induserte ekspresjon av HIV i en cellelinje anvendt som en modell for HIV-latens for å undersøke omdannelse fra en latent til en produktiv infeksjon.
Visse cytokiner (IL-1, IL-2 og andre kolonistimuler-ende faktorer) kan indusere signifikant vertsproduksjon av
TNF. Fusjonsproteiner med formel TNF-R-linker-TNF-R kan således anvendes til å behandle bivirkninger forbundet med cyto-kinterapi. På grunn av den primære rolle IL-1 spiller ved fremstillingen av TNF, kan det være foretrukket med fusjonsproteiner som omfatter både IL-l-reseptor(er) og TNF-reseptor(er) ved behandlingen av TNF-assosierte, kliniske indika-sjoner.
TNF er blitt rapportert å indusere utskillelse av IL-1 in vivo. Fusjonsproteiner som binder både TNF og IL-1, kan således anvendes ved behandling av tilstander formidlet av IL-1. Fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen kan administreres f.eks. for det formål å undertrykke immunresponser hos et menneske. Mange forskjellige sykdommer eller tilstander forår-sakes av en immunrespons mot alloantigen. Ved alloantigeninduserte immunresponser undertrykker IL-lR lymfoproliferasjon og betennelse som fås etter aktivering av T-celler. IL-lR kan således anvendes til å undertrykke alloantigeninduserte immunresponser ved den kliniske behandling av f.eks. avvisning av allografter (slik som hud-, nyre- og hjertetransplantater), og "graft-versus-host"-reaksjoner hos pasienter som har fått ben-margstransplantater. IL-1 menes å spille en forårsakende rolle i allergier og autoimmundysfunksjoner {slik som reumatoid artritt, diabetes og multippel sklerose) som er avhengige av aktiveringen av T-celler mot antigener som ikke gjenkjennes som medfødt hos verten.
TNF og IL-1 har vært implisert i en rekke av de samme sykdommene slik det kan ses ved å sammenligne listene over TNF-formidlede og IL-1-formidlede tilstander vist ovenfor. I tillegg er TNF og IL-1 to av de viktigste mediatorene for betennelse, ofte samvirkende. Fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter reseptorer for både TNF og IL-1, byr således på fordeler ved behandlingen av en rekke tilstander hvor både TNF og IL-1 antas å spille en forårsakende rolle.
Bruken av oppløselige former av IL-lR og TNF-R i fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen er fordelaktig for visse anvendelser. Rensing av proteinene fra rekombinante vertsceller lettes ettersom de oppløselige proteinene utskilles fra cellene. Videre er oppløselige proteiner generelt mer egnet for intravenøs administrering og kan utøve sin terapeutiske effekt (binding av IL-1 og/eller TNF) i blodstrømmen. Ved å binde IL-1 og/eller TNF vil de oppløselige fusjonsproteiner inhibere signalomforming via endogene celleoverflatereseptorer for IL-1 eller TNF.
Fusjonsproteinene ifølge oppfinnelsen kan også anvendes som reagenser i reseptorbaserte, immunologiske analyser, reagenser i analyser for TNF eller IL-1, eller som bindende midler for affinitetsrensing av TNF eller IL-1.
Eksempler
Eksempel 1
TNF- bindende analyser
A. Radioaktiv merking av TNFå og TNFå. Rekombinant, human TNFå i form av et fusjonsprotein som inneholder et hydrofilt oktapeptid i N-enden, ble uttrykt i gjær som et utskilt protein og renset ved affinitetskromatografi (Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988). Renset, rekombinant, human TNFå ble levert fra R & D Systems {Minneapolis, MN). Begge proteinene ble merket radioaktivt ved å bruke det kommersielt tilgjengelige fastfasemiddel, "IODO-GEN" .{Pierce) . Ved denne fremgangsmåten ble 5 ig "IODO-GEN" platet ut på bunnen av et 10 x 75 mm glassrør og inkubert i 20 minutter ved 4°C med 75 il 0,1 M natriumfosfat, pH 7,4, og 20 11 {2 mCi) Na <1>25I. Denne oppløsningen ble så overført til et andre glassrør inneholdende 5 ig TNFå (eller TNFå) i 45 il PBS i 20 minutter ved 4°C. Reaksjonsblandingen ble fraksjonert ved gelfiltrering på et 2 ml lagvolum av "Sephadex G-25" (Sigma) ekvilibrert i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium inneholdende 2,5% (vekt/volum) bovint serumalbumin (BSA), 0,2% (vekt/- volum) natriumazid og 20 mM Hepes, pH 7,4 {bindende medium). Sluttblandingen av 125I-TNF ble fortynnet til en arbeidsstan-dardoppløsning på 1 x IO"<7> M i bindende medium og lagret i opptil én måned ved 4°C uten påvisbart tap av reseptorbindende aktivitet. Den spesifikke aktivitet er rutinemessig 1 x IO<6 >cpm/mmol TNF.
B. Binding til intakte celler. Bindende analyser med intakte celler ble utført ved hjelp av to metoder. I den første metoden ble celler først dyrket enten i suspensjon (f.eks. U937) eller ved festing på vevskulturplater (f.eks. WI26-VA4- eller COS-celler som uttrykker den rekombinante TNF-reseptor). Adherente celler ble deretter fjernet ved behandling med 5 mM EDTA-behandling i 10 minutter ved 37°C. Bindingsanalyser ble så utført ved hjelp av en ftalatoljeseparasjonsmetode (Dower et al., J. Immunol. 132:751, 1984) hovedsakelig som beskrevet av Park et al. (J. Biol. Chem. 261:4177, 1986) . Ikke-spesifikk binding av <125>I-TNF ble målt i nærvær av et 200 ganger eller større molart overskudd av umerket TNF. Natriumazid (0,2%) ble tatt med i en bindingsanalyse for å inhibere internalisering av <125>I-TNF ved hjelp av celler. I den andre metoden ble COS-celler som var transfektert med det TNF-R-holdige plasmid, og som uttrykker TNF-reseptorer på over-
Ol
flaten, testet med hensyn på evnen til å binde <125>I-TNF ved hjelp av platebindingsanalysen beskrevet av Sims et al.
(Science 241:585, 1988).
C. Fastfasebindingsanalyser. Evnen til TNF-R når det gjelder å bli stabilt adsorbert til nitrocellulose fra deter-gentekstrakter av humanceller som ennå har i behold TNF-bindende aktivitet, ga et middel for å påvise TNF-R. Celleekstrakter ble fremstilt ved å blande en cellepellet med 2 x volumet av PBS inneholdende 1% "Triton X-100" og en blanding av proteaseinhibitorer (2 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 iM pepstatin, 10 iM leupeptin, 1 mM o-fenantrolin og 2 mM EGTA) ved kraftig vorteksbehandling. Blandingen ble inkubert på is i 30 minutter, hvoretter den ble sentrifugert ved 12.000 x g i 15 minutter ved 8°C for å fjerne kjerner og andre rester. 2 il aliquoter av celleekstrakter ble plassert på tørre BA85/21 nitrocellulosemembraner (Schleicher and Schuell, Keene, NH) og fikk tørke. Membranene ble inkubert på vevskulturskåler i 30 minutter i Tris (0,05 M) bufret saltoppløsning (0,15 M), pH 7,5, inneholdende 3% (vekt/volum) BSA for å blokkere ikke-spesifikke bindingsseter. Membranen ble så belagt med 5 x 10"<11> M <12>SI-TNF i PBS + 3% BSA og inkubert i 2 timer ved 4°C med risting. Ved slutten av dette tidsrommet ble membranene vasket 3 ganger i PBS, tørket og plassert på "Kodak X-Omat AR"-film i 18 timer ved -70°C.
D. Signalomformingsanalyser. Inhibering av TNF-signalomformingsaktivitet kan bestemmes ved å transfektere celler med rekombinante TNF-R-DNA-er som koder for membranbundet TNF-R, hvorved man får rekombinant reseptorekspresjon på celleoverflaten. Cellene bringes så i kontakt med TNF, og de resulterende, metabolske effekter undersøkes. Dersom det fås en effekt som kan tilskrives virkningen av liganden og ikke kan tilskrives endogene TNF-reseptorer på cellene, har den rekombinante reseptor signalomformingsaktivitet. Eksempelvise fremgangsmåter for å bestemme hvorvidt et polypeptid har signalomformingsaktivitet, er beskrevet av Idzerda et al., J. Exp. Med. 171:861 (1990); Curtis et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:3045 (1989); Prywes et al., EMBO J. 5:2179 (1986) og Chou et al., J. Biol. Chem. 262:1842 (1987). Evnen til et oppløse-lig TNF-R-polypeptid når det gjelder å inhibere signalomfor-
JO
ming kompetitivt, kan bestemmes ved å bruke lignende fremgangsmåter. Primærceller eller cellelinjer som uttrykker en endogen TNF-reseptor og har en påvisbar, biologisk respons på TNF, vil kunne benyttes som et alternativ til cellene som uttrykker rekombinant, membranbundet TNF-R. Redusert signalomforming når et oppløselig TNF-R-polypeptid tilsettes til ana-lyseblandingen, indikerer binding av TNF ved hjelp av den oppløselige TNF-R slik at mindre TNF bindes til celleover-flate-TNF-reseptorene for initiering av signalomforming.
Eksempel 2
IL- l- bindinqsanalyser
A. Radioaktiv merking av rIL- lå. Rekombinant, human IL-lå ble fremstilt ved ekspresjon i E. coli og rensing til homogenitet som beskrevet av Kronheim et al. {Bio/Technology 4:1078, 1986). IL-lå ble merket med di-jod {<125>I) Bolton-Hunter-reagens (New England Nuclear, Glenolden, PA). 10 ig (0,57 nmol) protein i 10 il fosfatbufret (0,015 mol/l) salt-oppløsning (PBS; 0,15 mol/l), pH 7,2, ble blandet med 10 il natriumboratbufret (0,1 mol/l) saltoppløsning (0,15 mol/l), pH 8,5, og omsatt med 1 mCi (0,23 nmol) Bolton-Hunter-reagens ifølge produsentens instruksjoner i 12 timer ved 8°C. Deretter ble 30 il 2% gelatin og 5 il 1 mol/l glysinetylester tilsatt, og proteinet ble skilt fra uomsatt Bolton-Hunter-reagens på en 1 ml lagvolum "Biogel" P6-kolonne (BioRad Laboratories, Rich-mond, CA). Rutinemessig ble det observert 50 til 60% inkorpor-ering av markør. Radiojodering ga spesifikke aktiviteter i området 1 x 10<15> til 5 x IO<15> cpm/mmol"<1>(0,4 til 2 atomer I pr. proteinmolekyl), og natriumdodecylsulfatpolyakrylamidgelelek-troforese (SDS/PAGE) avslørte et enkelt, merket polypeptid på 17,5 kD i overensstemmelse med tidligere rapporterte verdier for IL-1. Det merkede protein var mer enn 98% TCA-utfellbart, noe som indikerer at <l25>I ble kovalent bundet til protein.
B. Inhiberingsbindinqsanalyse for membranbundet IL- lR. "IL-1" henviser kollektivt til IL-lå og IL-lå. Bindingsinhiberingskonstanten for et IL-lR-protein kan bestemmes ved inhiberingsbindingsanalyser hvor varierende konsentrasjoner av en konkurrent (IL-lå eller IL-lå) inkuberes med en konstant mengde radioaktivt merket IL-lå eller IL-lå, og
JD
celler som uttrykker IL-lR. Den ikke-radioaktivt merkede konkurrent bindes til reseptoren og forhindrer at den radioaktivt merkede ligand bindes til reseptoren. Bindingsanalyser ble utført ved hjelp av en ftalatoljeseparasjonsmetode hovedsake-i lig som beskrevet av Dower et al., J. Immunol. 132:751, 1984 og Park et al., J. Biol. Chem. 261:4177, 1986. I korte trekk ble vertsceller som uttrykker en membranbundet, rekombinant IL-lR, inkubert i 6-brønners plater (Costar, Cambridge, MA) ved 4°C i 2 timer med <125>I-IL-lå i 1 ml bindingsmedium (Roswell i Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium med 2% BSA, 20 mM Hepes-buffer og 0,1% natriumazid, pH 7,2). Natriumazid ble tatt med for å inhibere internalisering og nedbrytning av <1>25i-IL-1 ved hjelp av celler ved 37°C. Platene ble inkubert på et roterende risteapparat i 1 time ved 37°C. Replikaaliquoter av
> inkubasjonsblandingen ble så overført til polyetylensentri-fugerør inneholdende en ftalatoljeblanding omfattende 1,5 del dibutylftalat til 1 del bis(s-etylheksyl)ftalat. Kontrollrør inneholdende et 100 x molart overskudd av umerket IL-lå, ble også inkludert for å bestemme ikke-spesifikk binding. Cellene ) med bundet <125>I-IL-1 ble skilt fra ubundet 12SI-IL-1 ved sentrifugering i 5 minutter ved 15.000 x g i en Eppendorf mikrosentrifuge. Radioaktiviteten forbundet med cellene, ble så bestemt på en gammateller.
C. Inhiberingsbindinqsanalyse med hensyn på oppløse-3 lig IL- lR. Bindingsinhiberingskonstanten for en oppløselig, human IL-lR kan bestemmes ved hjelp av en inhiberingsbindings-analyse hvor varierende konsentrasjoner av en IL-lå-konkurrent inkuberes med en konstant mengde radioaktivt merket I-IL-lå og CB23-celler (en Epstein Barr-virustransformert B-lymfocytt-
D cellelinje fra ryggmargsblod) som uttrykker type II IL-lR. En cellelinje som uttrykker endogene type I IL-l-reseptorer, kan erstatte CB23-cellene i analyser som omfatter oppløselig type I IL-lR. Bindingsanalyser ble utført ved hjelp av en ftalatoljeseparasjonsmetode hovedsakelig som beskrevet av Dower et 5al., J. Immunol. 132:751, 1984 og Park et al., J. Biol. Chem. 261:4177, 1986. I korte trekk ble CVI-EBNA-celler (pattedyr) transfektert med ekspresjonsvektoren pDC406 som inneholder en cDNA som koder for en oppløselig, human type II IL-lR som beskrevet i eksempel 10. Supernatanter fra cellene ble innhøstet 3 dager etter transfeksjon og seriefortynnet i bindingsmedium (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium inneholdende 2% BSA, 20 mM Hepes-buffer og 0,2% natriumazid, pH 7,2) i 6-brønners plater inntil et volum på 50 il/brønn. Supernatan-tene ble inkubert med 50 il 9 x 10"10 M <125>I-IL-lå pluss 2,5 x IO<6> CB23-celler ved 8°C i 2 timer med omrøring. 60 il aliquoter av inkubasjonsblandingen in duplo ble så overført til poly-etylensentrifugerør inneholdende en ftalatoljeblanding omfattende 1,5 del dibutylftalat til 1 del bis(s-etylheksyl)ftalat. Et negativt kontrollrør inneholdende 3 x IO"<6> M umerket IL-lå, ble også tatt med for å bestemme ikke-spesifikk binding (100% inhibering), og et positivt kontrollrør inneholdende 50 ml bindingsmedium med bare radioaktivt merket IL-lå, ble tatt med for å bestemme maksimal binding. Cellene med bundet 125I-IL-lå ble skilt fra ubundet 12SI-IL-lå ved. sentrifugering i 5 minutter ved 15.000 x g i en Eppendorf mikrosentrifuge. Supernatanter inneholdende ubundet <125>I-IL-lå, ble kassert, og cellene ble forsiktig skyllet med iskaldt bindingsmedium. Cellene ble inkubert i 1 ml trypsin-EDTA ved 37°C i 15 minutter og så innhøstet. Radioaktiviteten forbundet med cellene, ble så bestemt på en gammateller. Evnen til oppløselig IL-lR når det gjelder å inhibere binding av IL-lå til endogene celleresep-torer, kan bestemmes ved hjelp av den samme fremgangsmåten. Analoge teknikker kan anvendes i analyser som omfatter opp-løselig TNF-R.
Eksempel 3
Isolering av human TNF- R- cDNA ved direkte ekspresjon av aktivt protein i COS- 7- celler
Forskjellige huraancellelinjer ble screenet med hensyn på ekspresjon av TNF-R basert på deres evne til å binde øl-merket TNF. Humanfibroblastcellelinjen WI-26 VA4 (ATCC CCL 95.1) ble funnet å uttrykke et rimelig antall reseptorer pr. celle. Likevektsbindingsundersøkelser viste at cellelinjen oppviste tofasebinding av 12<5>I-TNF med omtrent 4.000 høyaffini-tetsseter (Ka = 1 x 10<10> M"<1>) og 15.000 lavaffinitetsseter (Ka = 1 x 10e M"1) pr. celle.
Et uregelmessig cDNA-bibliotek ble konstruert ved hjelp av reverstranskripsjon av polyadenylert mRNA isolert fra total-RNA ekstrahert fra humanfibroblast WI-26 VA4-celler dyr-
JO
ket i nærvær av kerraesbærmitogen under anvendelse av standard-teknikker (Gubler et al., Gene 25:263, 1983; Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, 1987). Cellene ble innhøstet ved å lysere cellene i en guanidinhydro-kloridoppløsning, og total-RNA ble isolert som tidligere beskrevet (Maren et al., Nature 315:641, 1985).
Poly A<+->RNA ble isolert ved hjelp av oligo dT-cellu-losekromatografi, og dobbelttrådet cDNA ble fremstilt ved hjelp av en lignende fremgangsmåte som den ifølge Gubler and Hoffman (Gene 25:263, 1983). I korte trekk ble poly A<+->RNA omdannet til en RNA-cDNA-hybrid ved hjelp av reverstranskrip-tase under anvendelse av oligo dT som en primer. RNA-cDNA-hybridet ble så omdannet til dobbelttrådet cDNA under anvendelse av RNAase H i kombinasjon med DNA-polymerase I. Den resulterende, dobbelttrådede cDNA ble gjort buttendet med T4 DNA-polymerase. Til den buttendede cDNA tilsettes EcoRI-linker-adaptere (med interne Afotl-seter) som ble fosforylert på bare én ende (Invitrogen). Den linkertilpassede cDNA ble behandlet méd T4-polynukleotidkinase for å fosforylere det 5'-overheng-ende område i linker-adapteren, og uligerte linkere ble fjernet ved å kjøre cDNA-en over en "Sepharose CL4B"-kolonne. Den linker-tilpassede cDNA ble ligert til en ekvimolar konsentra-sjon av EcoRl-kutt og defosforylerte armer fra bakteriofag égtlO (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, red., IRL Press, s. 49-78). Den ligerte DNA ble pakket inn i fagpartikler under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett for å frembringe et bibliotek av rekombinanter (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA). Rekombinanter ble amplifisert videre ved å plate ut fag på en flekk av E. coli stamme c600(hfl").
Fag-DNA ble renset fra det resulterende égtlO-cDNA-bibliotek og cDNA-innføyelsene fjernet ved fordøyelse med res-triksjonsenzymet Noti. Etter elektroforese av fordøyelsesprod-uktet gjennom en agarosegel ble det isolert cDNA-er som var større enn 2.000 bp.
De resulterende cDNA-er ble ligert inn i den eukaryote ekspresjonsvektor pCAV/NOT som var utformet for å uttrykke cDNA-sekvenser innføyd i dens multippelkloningssete når den ble transfektert inn i pattedyrceller. pCAV/NOT ble satt sam-
J7
men fra pDC201 (et derivat av pMLSV, tidligere beskrevet av Cosman et al., Nature 312:768, 1984), SV40 og cytomegalovirus-DNA, og omfatter i rekkefølge etter transkripsjonsretningen fra replikasjonsopprinnelsesstedet: (1) SV40-sekvenser fra koordinatene 5171 til 270 inkludert replikasjonsopprinnelsesstedet, fremmersekvensene og "tidlig"- og "sen"-promoterne; (2) cytomegalovirussekvenser inkludert promoter- og fremmerom-rådene (nukleotidene 671 til +63 fra sekvensen publisert av Boechart et al. (Cell 41:521, 1985); (3) adenovirus-2-sekvenser inneholdende det første ekson og en del av intronet mellom det første og det andre ekson i tripartittlederen, det andre ekson og en del av det tredje ekson i tripartittlederen og et multippelkloningssete (MCS) inneholdende setene for Xhol, Kpnl, Smal, Noti og Bgllt (4) SV40-sekvenser fra koordinatene 4127-4100 og 2770-2533 som omfatter polyadenylerings-og termineringssignalene for tidligtranskripsjon; (5) sekvenser avledet fra pBR322 og virusassosierte sekvenser VAI og VAII i pDC201, med adenovirussekvensene 10532-11156 inneholdende VAI- og VAII-genene, etterfulgt av pBR322-sekvenser fra 4363-2486 og 1094-375 inneholdende ampicillinresistensgenet og replikasjonsopprinnelsesstedet. pCAV/NOT er blitt deponert ved American Type Culture Collection under deponeringsnr. ATCC 68014.
Det resulterende WI-26 VA4-cDNA-bibliotek i pCAV/NOT ble brukt til å transformere E. coli stamme DH5å, og rekombin-antene ble platet ut, hvorved det ble tilveiebrakt omtrent 800 kolonier pr. plate og tilstrekkelig med plater til å tilveiebringe i alt omtrent 50.000 kolonier pr. screening. Kolonier ble skrapet fra hver plate, slått sammen og plasmid-DNA fremstilt fra hver blanding. Den sammenslåtte DNA ble så brukt til å transfektere et subsammenflytende lag av ape-COS-7-celler under anvendelse av DEAE-dekstran etterfulgt av kloro-kinbehandling, som beskrevet av Luthman et al. (Nucl. Acids Res. 11:1295, 1983) og McCutchan et al. (J. Nati. Cancer Inst. 41:351, 1986). Cellene ble så dyrket i kultur i tre dager for å muliggjøre forbigående ekspresjon av de innføyde sekvenser. Etter tre dager ble cellekultursupernatanter kassert og celle-monolagene i hver plate analysert med hensyn på TNF-binding på følgende måte. 3 ml bindingsmedium inneholdende 1,2 x 10"<11> M
1 v
<125>I-merket "FLAG"-TNF, ble tilsatt til hver plate og platene inkubert ved 4°C i 120 minutter. Dette medium ble så kassert, og hver plate ble vasket én gang med kaldt bindingsmedium (ikke inneholdende noe merket TNF) og to ganger med kald PBS. Kantene av hver plate ble så brutt av, hvorved det ble tilbake en flat skive som ble brakt i kontakt med røntgenfilm i 72 timer ved -70°C under anvendelse av en forsterkningsskjerm som beskrevet av Sims et al., Science 241:585 (1988). TNF-bindingsaktivitet ble synliggjort på de eksponerte filmer som en mørk flekk mot en forholdsvis jevn bakgrunn.
Etter at omtrent 240.000 rekombinanter fra biblioteket hadde gjennomgått screening på denne måte, ble én transfektantblanding observert å gi TNF-bindingssentre som var klart synlige mot bakgrunnseksponeringen. Et nedfryst forråd av bakterier fra den positive blanding ble så brukt til å oppnå plater ved omtrent 150 kolonier. Replikaer av disse platene ble laget på nitrocellulosefiltere, og platene ble så skrapet og plasmid-DNA fremstilt og transfektert som beskrevet ovenfor for å identifisere en positiv plate. Bakterier fra individuelle kolonier fra nitrocellulosereplikaene av denne platen ble dyrket i 0,2 ml kulturer som ble brukt til å oppnå plasmid-DNA, som ble transfektert inn i COS-7-celler som beskrevet ovenfor. På denne måte ble det isolert en enkeltklon som var i stand til å indusere ekspresjon av human-TNF-R i COS-celler. Ekspresjonsvektoren pCAV/NOT inneholdende denne TNF-R-cDNA, er blitt deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive; Rockville, MD 20852, USA (deponeringsnr. 68088) under navnet pCAV/NOT-TNF-R.
Eksempel 4
Konstruksjon av cDNA- er som koder for oppløselig huTNF- RÅ235
En cDNA som koder for en oppløselig huTNF-RA235, ble konstruert. Det utkodede protein omfatter sekvensen av aminosyrene -22 til 235 ifølge figur 2A. Prosessering av signalsekvensen gir et protein med sekvensen av aminosyrene 1 til 235 ifølge figur 2A. Et 840 bp stort fragment ble fjernet fra pCAV/NOT-TNF-R med restriksjonsenzymene Noti og Pvu2. Noti kutter i multippelkloningssetet til pCAV/NOT-TNF-R, og Pvu2 kutter innenfor det kodende område TNF-R 20 nukleotider 5<1> i
*1 x
forhold til transmembranområdet. For å rekonstruere 3'-enden til TNF-R-sekvensene, ble det syntetisert og annealert to oligonukleotider for å skape den følgende oligonukleotidlinker:
Denne oligonukleotidlinkeren har terminale Pvu2- og Bgl2-restriksjonsseter, regenererer 20 nukleotider av TNF-R etterfulgt av et termineringskodon {understreket) og et BamHl-restriksjonssete (for lettvinthets skyld ved isolering av hele den oppløselige TNF-R ved hjelp av Notl/BamHl-fordøyelse). Dette oligonukleotid ble så ligert med 840 bp Notl/Pvu2-TNF-R-inn-føyelse i Bgl2/Notl-kuttet pCAV/NOT, hvorved man fikk psol-huTNF-RA235/CAVNOT, som ble transfektert inn i COS-7-celler som beskrevet ovenfor. Denne ekspresjonsvektor induserte ekspresjon av oppløselig, human TNF-R som var i stand til å binde
TNF.
Eksempel 5
Konstruksjon av cDNA- er som koder for oppløselig huTNF- RA185
En cDNA som koder for en oppløselig huTNF-RÅ185 med sekvensen til aminosyrene -22 til 185 i figur 2A {eller aminosyrene 1-185 etter prosessering av signalsekvensen i en passende vertscelle), ble konstruert ved å fjerne et 640 bp stort fragment fra pCAV/NOT-TNF-R med restriksjonsenzymene Noti og Bgl2. Noti kutter i multippelkloningssetet til pCAV/NOT-TNF-R, og Bgl2 kutter innenfor det TNF-R-kodende område i nukleotid 638 som er 237 nukleotider 5" fra transmembranområdet. De føl-gende oligonukleotidlinkere ble syntetisert: Oligonukleotidlinkerne ovenfor rekonstruerer 3'-enden til res-ept ormole kyl et opptil nukleotid 708, etterfulgt av et termineringskodon (understreket). Disse oligonukleotidene ble så ligert med den 640 bp store Notl-TNF-R-innføyelse i Notl-kuttet pCAV/NOT, hvorved man fikk ekspresjonsvektoren psolTNFRA185/CAVNOT som ble transfektert inn i COS-7-celler som beskrevet ovenfor. Denne ekspresjonsvektoren induserte ekspresjon av oppløselig human-TNF-R som var i stand til å binde TNF.
Eksempel 6
Konstruksjon av cDNA- er som koder for oppløselig huTNF- RAl63
En cDNA som koder for en oppløselig huTNF-RAl63 med sekvensen av aminosyrene -22 til 163 i figur 2A (1-163 etter
prosessering av signalsekvensen), ble konstruert ved å fjerne et 640 bp stort fragment fra pCAV/NOT-TNF-R med restriksjonsenzymene Noti og Bgl2 som beskrevet i eksempel 4. De følgende oligonukleotidlinkere ble syntetisert:
Denne ovenfor nevnte oligonukleotidlinker rekonstruerer 3'-enden til reseptormolekylet opptil nukleotid 642 (aminosyre 163), etterfulgt av et termineringskodon (understreket). Dette oligonukleotidet ble så ligert med den 64 0 bp store Notl-TNF-R-innføyelse inn i Notl-kuttet pCAV/NOT, hvorved man fikk ekspresjonsvektoren, psolTNFRAl63/CAVNOT, som ble transfektert inn i COS-7-celler som beskrevet ovenfor. Denne ekspresjonsvektoren induserte ekspresjon av oppløselig human-TNF-R som var i stand til å binde TNF i bindingsanalysen beskrevet i eksempel 1.
Eksempel 7
Konstruksjon av cDNA- er som koder for oppløselig huTNF- RA142
En cDNA som koder for en oppløselig huTNF-RAl42 (med sekvensen av aminosyrer -22 til 142 i figur 2A {1-142 etter prosessering av signalsekvensen), ble konstruert ved å fjerne et 550 bp stort fragment fra pCAV/NOT-TNF-R med restriksjonsenzymene Noti og AlwNl. AlwNl kutter innenfor det TNF-R-kodende område i nukleotid 549. Den følgende oligonukleotidlinker ble syntetisert: Bgl2 Hoti
5'-CTGAARCATCAGACGTGGTGTGCAAGCCCTGTlAfiA-3'
sekvensidentitet nr. 13 cttgactttgtagtctgcaccacxcgttcgggacaatttctaga
Ende
Denne ovenfor nevnte oligonukleotidlinker rekonstruerer 3<*->enden til reseptormolekylet opptil nukleotid 579 (aminosyre 142) etterfulgt av et termineringskodon (understreket). Dette oligonukleotid ble så ligert med den 550 bp store Notl/AlwNl TNF-R-innføyelse i Notl/Bgl2-kuttet pCAV/NOT, hvorved man fikk ekspresjonsvektoren psolTNFRA142/CAVNOT, som ble transfektert inn i COS-7-celler som beskrevet ovenfor. Denne ekspresjonsvektoren induserte ikke ekspresjon av oppløselig human-TNF-R som var i stand til å binde TNF. Det antas at denne bestemte konstruksjon ikke uttrykte biologisk aktiv TNF-R ettersom én eller flere essensielle cysteinrester (f.eks. Cys<157> eller Cys<163>) påkrevd for intramolekylær binding (for dannelse av korrekt tertiærstruktur for TNF-R-molekylet), var fjernet.
Eksempel 8
Isolering av human type IL- lR- cDNA- kloner
cDNA som koder for et humant type I IL-lR-protein, ble isolert ved hybridisering til en probe avledet fra murin type I IL-lR-cDNA. Kloning av denne murine IL-lR-cDNA er beskrevet i eksempel 4 i EP 318 296. En vektor inneholdende den murine cDNA, ble deponert ved American Type Culture Collection under navnet GEMBL78 19. november 1987, og tildelt deponeringsnr. ATCC 67563.
Et 2356 basepar (bp) stort fragment av denne depon-erte, murine klon 78 ble isolert som beskrevet av Sims et al.
(Science 241:585, 1988) og merket radioaktiv ved "nick"-trans-
lasjon under anvendelse av DNA-polymerase I for anvendelse som en probe. Den anvendte metode var i det vesentlige lik den som er beskrevet av Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, s. 109).
Proben ble brukt til screening av human-cDNA-biblio-teker med hensyn på human-IL-lR, som beskrevet av Sims et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 86:8946, 1989. Et cDNA-bibliotek ble konstruert ved hjelp av reverstranskripsjon av polyadenylert mRNA isolert fra total-RNA ekstrahert fra de dyrkede celler av en human T-cellelinje betegnet klon 22, beskrevet av Acres et al. (J. Immunol. 15*8:2132, 1987). Disse cellene ble dyrket i RPMI 1640-medium pluss 10% bovint fosterserum som beskrevet av Acres et al. (supra), i nærvær av 10 ng/ml OKT3-antistoff og 10 ng/ml humant IL-2. cDNA ble gjort dobbelttrådet ved å bruke DNA-polymerase I, gjort buttendet med T4-DNA-polymerase, metylert med EcoRI-metylase for å beskytte EcoRI-spaltingsseter innenfor cDNA-en, og ligert til EcoRI-linkere. De resulterende konstruksjoner ble fordøyd med EcoRI for å fjerne alle, bortsett fra én kopi av linkerne i hver ende av cDNA-en-, og ligert til EcoRI-kuttede og defosforylerte armer av bakteriofag égtlO (Huynh et al., DNA Cloning: A Practical Approach, Glover, red., IRL Press, s. 49-78). Den ligerte DNA ble pakket inn i fagpartikler under anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett (Stratagene Cloning Systems, San Diego, CA, USA 92121), hvorved det ble frembrakt et bibliotek av rekombinanter. Rekombinanter ble platet ut på E. coli stamme C600(hfl") og utsatt for screening ved hjelp av standard plakkhybridiseringsteknikker under middels strenge betingelser (50°C, 6 x SSC).
Etter flere runder med screening ble det fra biblioteket isolert ni kloner som hybridiserte til cDNA-proben. Klonene ble plakkrenset og brukt til å fremstille bakteriofag-DNA som ble fordøyd med EcoRI. Fordøyelsesproduktene ble elektroforesebehandlet på en agarosegel, blottet over på nylonfiltere og testet på nytt med hensyn på hybridisering. Klonene ble fordøyd med EcoRI etterfulgt av preparativ agar-osegelelektroforese, så subklonet inn i et EcoRI-kuttet derivat (pGEMBL) av standardkloningsvektoren pBR322 inneholdende en polylinker med et unikt EcoRI-sete, et BamHl-sete og et stort antall andre, unike restriksjonsseter. En eksempelvis vektor av denne type er beskrevet av Dente et al. (Nucl. Acids Res. 11:1645, 1983).
Restriksjonskartlegging og sekvensering av en 4,8 kb stor human IL-lR-klon indikerte at klonen omfattet en sekvens som koder for 518 aminosyrer som oppviser 80% aminosyresek-vensidentitet med den tilsvarende murine sekvens i det ekstracellulære eller N-terminale område fjernt fra transmembranområdet, 63% identitet i transmembranområdet og 87% identitet i det cytoplasmatiske eller Crterminale område. Et 440 bp stort EcoRI-Nsil-fragment avledet fra 5<*->delen av den humane IL-1R-klon ble <32>P-merket ved "nick"-translasjon som beskrevet ovenfor, og brukt til screening av et cDNA-bibliotek fremstilt ved hjelp av vilkårlig priming av human T-cellelinjeklon 22-mRNA fremstilt som beskrevet ovenfor. 23 kloner som hybridiserte til proben, ble isolert og analysert ved restriksjonskartlegging. Sekvensering av én av disse klonene ga sekvensinforma-sjonen som tilsvarer de gjenværende, N-terminale 34 aminosyrene i humanproteinet. DNA-en og den utledede aminosyresekvens til det komplette, kodende område for type I human-IL-IR er vist i sekvensidentitetene nr. 5 og 6. Dette human-IL-lR-protein omfatter 569 aminosyrer {inkludert et 20 aminosyrers signalpeptid) og inkluderer 16 cysteinrester, hvorav 13 er bevart mellom det murine og det humane gen. I tillegg omfatter humansekvensen seks potensielle N-glykosyleringsseter hvorav fem er bevart mellom murin og human.
Eksempel 9
Isolering av cDNA- er som koder for type II IL- lR
En DNA-sekvens som koder for human type II IL-lR, ble isolert fra et cDNA-bibliotek som var blitt fremstilt ved å bruke standardmetoder, ved hjelp av reverstranskripsjon og polyadenylert RNA isolert fra den humane B-cellelymfoblastoid-linje CB23, beskrevet av Benjamin & Doser, Blood 75:2017, 1990. I korte trekk er CB23-cellelinjen en EBV-transformert lymfocyttcellelinje fra ryggmargsblod (CB) som ble utvunnet ved å bruke fremgangsmåtene beskrevet av Benjamin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 6*1:3547, 1984.
Det ble gjennomført screening av CB23-biblioteket ved
1 u
hjelp av modifisert/ direkte ekspresjon av sammenslåtte cDNA-fragmenter i apenyrecellelinjen CV-l/EBNA-1 under anvendelse av en pattedyrsekspresjonvektor (pDC406) som inneholder repli-kas jonsopprinnelsessteder avledet fra SV40, Epstein-Barr-virus og pBR322. pDC406 er et derivat av HAV-EO beskrevet av Dower et al., J. Immunol. 142:4314 (1989). pDC406 atskiller seg fra HAV-EO ved delesjonen av intronet som er til stede i adenovirus 2-tripartittledersekvensen i HAV-EO. CV-l/EBNA-l-cellelinjen ble avledet ved transfeksjon av CV-l-cellelinjen med genet som koder for Epstein-Barr-virus-kjerneantigen-1 (EBNA-1) og med en vektor som inneholder CMV-regulatorsekvenser, slik at EBNA-1 uttrykkes under kontroll av den humane CMV-"immediate-early" fremmer/promoter. EBNA-l-genet muliggjør den episomale replikasjon av ekspresjonsvektorer, slik som pDC406 som inneholder EBV-replikasjonsopprinnelsesstedet.
Transfektanter som uttrykker biologisk aktiv type II IL-lR, ble først identifisert ved å bruke en modifisert auto-radiografisk teknikk med preparatglass, hovedsakelig som beskrevet av Gearing et al., EMBO J. 8:3667, 1989. I korte trekk ble CV-l/EBNA-l-celler transfektert med miniprep-DNA i pDC406 fra blandinger av cDNA-kloner direkte på preparatglass og dyrket i 2-3 dager for å muliggjøre forbigående ekspresjon av type II IL-lR. Preparatglassene som inneholdt de transfekterte celler, ble så inkubert med medium inneholdende <12>SI-IL-lå, vasket for å fjerne ubundet, merket IL-lå, fiksert med glutar-aldehyd og dyppet i flytende, fotografisk emulsjon og ekspon-ert i mørket. Etter fremkalling av preparatglassene ble de hver for seg undersøkt med et mikroskop, og positive celler som uttrykker type II IL-lR, ble identifisert ved tilstedeværelsen av autoradiografiske sølvkorn mot en lys bakgrunn.
Ved å bruke denne fremgangsmåten ble det gjennomført screening av omtrent 250.000 cDNA-er i blandinger av omtrent 3.000 cDNA-er under anvendelse av den autoradiografiske metode med preparatglass inntil analyse av én transfektantblanding viste flere celler som var klart positive med hensyn på IL-lå-binding. Denne blanding ble så fordelt i blandinger å 500, og på nytt ble det gjennomført screening ved hjelp av autoradio-grafi med preparatglass. En positiv blanding ble identifisert. Denne blandingen ble videre fordelt i blandinger å 75, Og det
4 /
ble gjennomført screening ved platebindingsanalyser analysert ved hjelp av kvantifisering av bundet <l25>I-IL-lå. Cellene ble skrapet av og tellet for å bestemme hvilken blanding av 75 som var positiv. Individuelle kolonier fra denne blandingen av 75 ble underkastet screening inntil det var identifisert en enkelt klon som styrte syntese av et overflateprotein med påvisbar IL-lå-bindingsaktivitet. Denne klonen ble isolert, og dens innføyelse ble sekvensert for å bestemme sekvensen til den humane type II IL-lR-cDNA som er vist sammen med aminosyresekvensen utkodet ved den i sekvensidentitetene nr. 7 og 8. pDC406-kloningsvektoren inneholdende human type II IL-1R-cDNA-en, betegnet pHu IL-1R-II 75, ble deponert i E. coli-vertsceller med American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC), 5. juni 1990 under deponeringsnr. ATCC 68337. Deponeringen ble gjort under betingelsene ifølge Budapestkonvensjonen.
Som for de fleste pattedyrgener kodes pattedyrtype II IL-lR sannsynligvis av multieksongener. Alternative mRNA-konstruksjoner som kan tilskrives forskjellige mRNA-spleisehendelser etter transkripsjon, og som har til felles store områder med identitet eller likhet med cDNA-ene som her er krevet, anses for å være innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 10
Konstruksjon og ekspresjon av cDNA- er som koder for human, oppløselig type II IL- lR
En cDNA som koder for en oppløselig human type II IL-lR (med sekvensen til aminosyrene -13 til 333 i sekvensidentitet nr. 8), ble konstruert ved hjelp av amplifikasjon med polymerasekjedereaksjon (PCR) under anvendelse av fullengde type II IL-lR-cDNA-klon 75 (ATCC 68337) i vektor pDC406 (beskrevet i eksempel 9) som et templat. Den følgende 5'-oligo-nukleotidprimer (sekvensidentitet nr. 14) og 3'-oligonukleo-tidprimer (sekvensidentitet nr. 15} ble først konstruert:
5'-primeren tilsvarer nukleotidene 31-51 fra det utranslaterte område i human type II IL-lR-klon 75 (sekvensidentitet nr. 7) med en 5<1->tilføyelse av et Sall-restriksjonssete; denne nukleotidsekvensen er i stand til å gi annealering til (-)-tråden som er komplementær til nukleotidene 31-51 i humanklon 75. 3'-primeren er komplementær til nukleotidene 1191-1172 (som omfatter antisense-nukleotider som koder for 3 aminosyrer i human type II IL-lR-klon 75, og har en 5'-tilføyelse av et Notl-restriksjonssete og et stoppkodon.
De følgende PCR-reagenser ble tilsatt til et 1,5 ml Eppendorf-mikrosentrifugerør: 10 il 10X PCR-buffer (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3 ved 25°C, 15 mM MgCl2 og 1 mg/ml gelatin) (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CN), 10 il av en 2 mM oppløsning inneholdende hver dNTP (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP og 2 mM dTTP), 2,5 enheter (0,5 il standard 5000 enheter/ml oppløsning) Taq DNA-polymerase (Perkin-Elmer Cetus), 50 ng templat-DNA og 5 il av en 20 iM oppløsning av hver av de ovenfor nevnte oligonukleotidprimere og 74,5 il vann inntil et sluttvolum på 100 il. Sluttblandingen ble så' tildekket med 100 il paraffinolje. PCR ble utført under anvendelse av et DNA varmesyklusapparat (Ericomp, San Diego, CA) med innledende denaturering av templatet ved 94°C i 90 sekunder, annealering på nytt ved 55°C i 75 sekunder og forlengelse av cDNA-en ved 72°C i 150 sekunder. PCR ble utført i ytterligere 20 sykluser ved amplifikasjon under anvendelse av et trinnprogram (denaturering ved 94°C, 25 sekunder; annealering ved 55<*>C, 45 sekunder; forlengelse ved 72°C, 150 sekunder) etterfulgt av en 5 minutters forlengelse ved 72°C.
Prøven ble fjernet fra paraffinoljen og DNA ekstrahert ved hjelp av fenolkloroformekstraksjon og "spun"-kolon-nekromatografi over G-50 (Boehringer Mannheim). En 10 il aliquot at den ekstraherte DNA ble fraskilt fra hjelp av elektroforese på 1% "SeaKem" agarose (FMC BioProducts, Rockland, ME) og farget med etidiumbromid for å bekrefte at DNA-fragment-størrelsen var i overensstemmelse med det forutsagte produkt.
20 il av de PCR-amplifiserte cDNA-produkter ble så fordøyd med Sali- og Notl-restriksjonsenzymer under anvendelse
t 3
av standardfremgangsmåter. Sall/Notl-restriksjonsfragmentet ble så fraskilt på en 1,2% "Seaplaque" agarose med lav geldan-nelsestemperatur (LGT), og båndet som representerer fragmentet, ble isolert. Fragmentet ble ligert inn i pDC406-vektoren ved hjelp av en standard "in gel"-ligeringsmetode. Den resulterende vektor ble transfektert inn i CVl-EBNA-celler, og det oppløselige IL-lR-protein ble uttrykt.
Eksempel 11
Konstruksjon av vektor som koder for Di- TNF- R
En vektor som koder for et fusjonsprotein med formel TNF-R-peptid-linker-TNF-R og som er vist i figur 3, ble konstruert på følgende måte. Relevante restriksjonsenzymspalt-ingsseter i TNF-R-sekvensen er også vist i figurene 2A-2B.
Ekspresjonsvektoren konstruert i eksempel 4 og betegnet psol-huTNF-RA235/CAVNOT, ble fordøyd med restriksjons-enzymet Noti som kutter i multippelkloningssetet i pCAV/NOT-vektorer (dvs. oppstrøms for TNF-R-sekvensen som er innføyd i den). Overhenget generert ved hjelp av Notl-fordøyelse, ble gjenfylt ved å bruke Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I, hvorved det ble fremstilt en butt ende. Vektoren ble så for-døyd med BamHI som spalter nedstrøms for stoppkodonet som føl-ger etter kodonet for aminosyre 235, som vist i eksempel 4.
Det buttendede Notl/BamHI-fragment inneholdende TNF-R-sekvensen, ble isolert ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter og innføyd i en plasmidvektor betegnet pCAV/DHFR
som var blitt fordøyd med Smal og Bglll. pCAV/DHFR-vektoren er en ekspresjonsvektor som inneholder SV40-promotersekvenser oppstrøms for et multippelkloningssete og andre trekk som beskrevet for pCAV/NOT i eksempel 3, og inneholder også et gen for dihydrofolatreduktase (DHFR) som en selekterbar markør. DHFR-genet gir en selektiv fordel på ellers DHFR" pattedyrceller som har tatt opp vektoren, når de dyrkes i nærvær av metotrexat (MTX). Smal-fordøyelse gir butte ender hvortil de buttede Notl-endene i det TNF-R-holdige fragment ligeres. De Bglll-genererte overheng ligeres til de BamHI-fordøyde ender
av det TNF-R-holdige fragment. Ligeringen ødelegger BamHI- og Bglll-setene. E. coli-celler transformeres med ligeringsblandingen ved hjelp av vanlige fremgangsmåter. Plasmid-DNA utvin-
nes fra vertscellene, og den ønskede konstruksjon bekreftes ved hjelp av restriksjonsanalyse. Den resulterende vektor inneholdende TNF-R-innføvelsen, betegnes pCAV/DHFR/TNF-R.
De følgende DNA-fragmenter ble isolert for anvendelse ved fremstilling av en vektor som koder for to TNF-R-polypeptider atskilt av en peptidlinker: (A) Asp718 (et restriksjonsenzym) til Espl-fragment i pCAV/DHFR/TNF-R-vektoren. Asp718 spalter vektoren oppstrøms for den innføyde TNF-R-sekvens; Espl (tilgjengelig fra U.S. ' Biochemicals) spalter TNF-R-sekvensen i stillingene vist i figur 2A. Det ønskede fragment er ca. 6,7 kilobasepar (kbp) langt og omfatter vektorsekvenser og 3'-enden til en TNF-R-sekvens . (B) Asp718 til PvulI-fragment i ekspresjonsvektoren i konstruert i eksempel 4 og betegnet psol-huTNF-RÅ235/CAVNOT.
Asp718 spalter vektoren oppstrøms for den innføyde TNF-R-sekvens. Det ønskede 865 bp store fragment omfatter en TNF-R-sekvens som strekker seg fra 5'-signalsekvensen gjennom PvuII-setet vist i eksempel 4. (C) Et dobbelttrådet oligonukleotid med sekvensen (sekvensidentitetene nr. 16 og 17): (D) Bgll til Espl-fragment i ekspresjonsvektoren konstruert i eksempel 4 og betegnet psol-huTNF-RA235/CAVNOT. Det
ønskede fragment er ca. 304 bp langt. Bgll spalter innenfor i kodonet for aminosyre 5 (Val) i TNF-R; Espl spalter TNF-R-sekvensen i stillingen vist i figur 2A; det gjenværende (3'-ende) i denne oppløselige TNF-R-kodende sekvens er tilveiebrakt ved hjelp av fragment (A).
Oligonukleotidet (C) fremstilles ved hjelp av konven-i sjonelle fremgangsmåter for kjemisk syntese av oligonukleotider. Oligonukleotidet rekonstruerer 3'-enden i den første TNF-R-sekvens fra PvuII-setet gjennom den siste aminosyre i det ekstracellulære område (Asp i stilling 235). Oligonukleotidet inneholder også en sekvens i ramme som koder for peptidlinkeren Gly4SerGly5Ser. Sekvensen i denne delen av oligonukleotidet kan ora ønsket varieres slik at den koder for andre peptidlinkere. Oligonukleotid C rekonstruerer også 5'-enden til den andre TNF-R-sekvens fra et kodon for leucin, den første aminosyre i det fullt ferdige protein, gjennom et partielt kodon for valin (aminosyre 5) innenfor det fremstikkende 3'-overheng som vil regenerere Val-kodonet når det ligeres til det komplementære overheng på den Bgll-fordøyde ende av fragment D.
DNA-fragmentene betegnet A-D, ble ligert sammen i stillingene vist i figur 3 slik at det dannes en vektor betegnet pCAV DHFR Di-TNF-R som koder for et fusjonsprotein i foreliggende oppfinnelse. E. coli-celler transformeres med ligeringsblandingen ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter.
Plasmid-DNA utvinnes fra vertscellene, og den ønskede konstruksjon bekreftes ved hjelp av restriksjonsanalyse. Det oppstrøms TNF-R-polypeptid kodet for av denne ekspresjonsvektoren, inneholder aminosyrene -22 til 235 i sekvensidentitet nr. 2 (dvs. en oppløselig TNF-R som omfatter den N-terminale signalsekvens og hele det ekstracellulære område innenfor et stoppkodon). Det nedstrøms TNF-R-polypeptid mangler signalsekvensen og inneholder aminosyrene 1-235 i sekvensidentitet nr. 2, med et stoppkodon plassert umiddelbart etter aminosyre 235. Peptidlinkeren i denne bestemte konstruksjon er Gly4SerGly5Ser.
Pattedyrceller transfekteres med ekspresjonsvektoren ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter og dyrkes slik at
de fremstiller det ønskede fusjonsprotein. Én egnet pattedyrcellelinje er DHFR" ovariecellelinje fra kinesisk hamster betegnet CH0-K1 og tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, under deponeringsnr. CCL61. Cellene kan transfekteres med ekspresjonsvektoren ved hjelp av standard kalsiumfosfatutfelling, hovedsakelig som beskrevet av Graham and van der Eb, Virology 52:456 (1983). De transfekterte celler dyrkes under egnede, konvensjonelle forhold, og tilstedeværelsen av det ønskede fusjonsprotein i dyrkningsmediet bekreftes ved hjelp av slike analyser som de som er beskrevet i eksemplene 1 og 2.
En annen egnet pattedyrcellelinje er C0S-7-cellelinjen. I ett forsøk ble C0S-7-celler transfektert med den TNF-R-dimerkodende ekspresjonsvektor beskrevet ovenfor og dyrket for å muliggjøre ekspresjon av dimeren. Ikke-konsentrert supernatant (inneholdende den utskilte dimer) ble analysert med hensyn på evne til å inhibere binding av radiojodert, murin TNFå til U937-celle (en human, monocyttlignende cellelinje som bærer endogene reseptorer for TNF). Inhiberingsbindingsanalysen ble utført i henhold til vanlige fremgangsmåter som er like de som er beskrevet i eksempel 2, avsnitt C. Negative kontrollrør (for å måle ikke-spesifikk binding) inneholdt TNFå som ikke var radioaktivt merket, U937-celler og radiojodert TNFå. Positive kontrollrør (for å måle maksimal, ikke-inhibert binding av radiojodert TNFå til U937-celler) inneholdt bindingsmedium, U937-celler og radiojodert TNFå. Den dimerholdige supernatant inhiberte over 90% av TNF-bindingen til U937-celler som man fikk for den positive kontroll.
Eksempel 12
Fusjonsprotein omfattende ett IL- lR- polypeptid og to TNF- R-polypeptider
En plasmidvektor inneholdende DNA som koder for et fusjonsprotein med formel IL-lR-peptid-linker-TNF-R-peptid-linker-TNF-R, konstrueres på følgende måte.
cDNA som koder for et oppløselig type I IL-lR-polypeptid, ble isolert og amplifisert under anvendelse av den velkjente fremgangsmåte med polymerasekjedereaksjon (PCR). De følgende oligonukleotider ble syntetisert for anvendelse som primere i PCR-reaksjonen:
Disse oligonukleotidene samt de som er omtalt nedenunder, syntetiseres ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter, f.eks. ved å anvende en automatisert DNA-syntesemaskin, slik som de som er tilgjengelige fra Biosearch, Inc., San Rafael, Califor-nia eller Applied Biosystems. Templatet anvendt i PCR-reaksjonen, er en plasmidvektor fremstilt ved å innføye type I human IL-lR-cDNA i en vektor betegnet SF-CAV. SF-CAV-vektoren er en pattedyrekspresjonsvektor vist i figur 5 {som viser bruken av SF-CAV i en ytterligere vektorkonstruksjon beskrevet nedenunder). SF-CAV i E. coli-celler ble deponert ved American Type Culture Collection, 27. februar 1992, under betingelsene ifølge Budapestkonvensjonen, og tildelt deponeringsnr. 68922.
SV40-, CMV-, pA- og VA-sekvensene og ampicillinresistensgenet i SF-CAV er som beskrevet for pCAV/NOT i eksempel 3 ovenfor og også i eksempel 8 og figur 3 i PCT-søknad WO 90/05183. Et multippelkloningssete plassert mellom adenovirus-2-tripartittleder- (TPL-) og pA-sekvensene, inneholder gjen-kjennelsesseter for restriksjonsendonukleasene Xhol, Kpnl, Smal, Noti og Bgll. TPL-sekvensen atskiller seg fra pCAV/NOT ved at et område som antas å være ødeleggende for konstruksjon av IL-lR-kodende vektorer, er blitt deletert fra SV-CAV-TPL-sekvensen. Den uheldige påvirkning på IL-lR-vektorer kan muligens tilskrives en kryptisk promoter i den uønskelige sekvens hvorfra uønsket protein uttrykkes i E. coli. Lavnivåekspresjon av human IL-lR utenfor den kryptiske promoter kan være toksisk for bakteriene.
SF-CAV fordøyes med Smal som gjenkjenner et unikt restriksjonssete innenfor multippelkloningssetet og gir butte ender. Et DNA-fragment inneholdende type I IL-lR-cDNA, produs-eres av Styl/Bglll-fordøyelse etterfulgt av gjenfylling av overhengene under anvendelse av Klenow-fragmentet i DNA-polymerase I, hvorved det frembringes butte ender. Styl spalter i nukleotid 49, og Bglll spalter i nukleotid 1997 i sekvensidentitet nr. 5. IL-lR-cDNA-fragmentet ligeres i den Smal-fordøyde SF-CAV-vektor, og E. coli-celler transformeres med ligeringsblandingen ved hjelp av standardfremgangsmåter. Den resulterende vektor utvinnes fra E. coli- cellene og brukes som templatet i PCR-reaksjonen.
5r<->primeren {sekvensidentitet nr. 18) tilsvarer en 17-nukleotiders sekvens som finnes i vektoren oppstrøms for den innføyde IL-lR-cDNA. 3<*->primeren (sekvensidentitet nr. 19) omfatter et segment som er komplementært til nukleotidene 1060-1079 i sekvensidentitet nr. 5, som koder for aminosyrene fra og med 306 {partielt kodon) til og med 312, nær C-enden av
det IL-lR-ekstracellulære område. Denne 3'-primeren inneholder også en sekvens som koder for peptidlinkeren Gly4SerGlysSer.
En PCR-reaksjon utføres ved å bruke hvilken som helst egnet fremgangsmåte, slik som de som er beskrevet i Sarki et al., Science 239:487 (1988); i Recombinant DNA Methodology, Wu et al., red., Academic Press Inc., San Diego (1989), s. 189-196; og i PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., red., Academic Press, Inc. (1990). Et eksempel på en egnet PCR-fremgangsmåte er som følger. Alle temperaturer er i grader celsius. De følgende PCR-reagenser tilsettes til et 0,5 ml Eppendorf-mikrosentrifugerør: 10 il 10X PCR-buffer (500 mM KC1, 100 mM Tris-HCl, pH 8,3 ved 25°C, 25 mM MgCl2 og 1 mg/ml gelatin) (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CN), 8 il av en 2,5 mM oppløsning inneholdende hver dNTP (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP og 2 mM dTTP), 2,5 enheter (0,5 il standard 5000 enheter/ml oppløsning) Taq-DNA-polymerase (Perkin-Elmer Cetus), 1 ng templat-DNA, 100 picomol av hver av oligonukleo-tidprimerne og vann inntil et sluttvolum på 100 il. Sluttblandingen tildekkes så med 100 il paraffinolje. PCR utføres ved å bruke et DNA-varmesyklusapparat (Ericomp, San Diego, CA). Templatet denatureres ved 94°C i 5 minutter, og' PCR utføres i 25 amplifikasjonssykluser under anvendelse av et trinnprogram (denaturering ved 94°C, 1,5 minutt; annealering ved 60°C,
1 minutt; forlengelse ved 72°C, 1 minutt).
Elektroforese av en aliquot av reaksjonsblandingen på 1% "SeaKem" agarose med lav smeltetemperatur (LMT) (FMC BioProducts, Rockland, ME) og farging med etidiumbromid synlig-gjør et enkelt DNA-fragment med den forventede størrelse som PCR-reaksjonsproduktet. Det PCR-amplifiserte DNA-fragment omfatter en kort vektorsekvens som omfatter et Asp718-restriksjonssete oppstrøms for en sekvens som koder for IL-lR-aminosyrene 1 (Asp) - 312 (Thr), etterfulgt av et enkelttrådet segment som koder for peptidlinkeren.
En andre PCR-reaksjon utføres for å isolere og amplifisere et cDNA-fragment som koder for et oppløselig TNF-R-polypeptid. Templatet var vektoren betegnet psolhuTNF-RA235/- CAVNOT i eksempel 4 som inneholder en cDNA-innføyelse som koder for TNF-R-aminosyrene -22 til 235 i sekvensidentitet nr.
1. Primerne anvendt ved reaksjonen, er:
5'-primeren (sekvensidentitet nr. 20) omfatter et peptidlinkerkodende segment som er komplementært til peptidlinkeren som koder for en del av primeren med sekvensidentitet nr. 19. Det linkerkodende segment etterfølges av kodoner for de første seks aminosyrene i den fullt ferdige TNF-R (fra og. med Leu til og med Ala).
3'-primeren (sekvensidentitet nr. 21) omfatter nukleotider som er komplementære til nukleotidene 461-478 i TNF-R med sekvensidentitet nr. 1, som koder for aminosyrene fra og med 103 (Tyr, partielt kodon) til og med 109 (Gin, partielt kodon. Denne primeren omfatter også et Espl-restriksjonssete som er naturlig til stede i denne delen av TNF-R-proteinet.
PCR-reaksjonsfremgangsmåten er som beskrevet ovenfor. DNA-fragmentet amplifisert ved hjelp av denne andre PCR-reaksjonen, omfatter det ovenfor beskrevne, linkerkodende segment etterfulgt av en sekvens som koder for aminosyrene fra og med 1 (Leu) til og med 109 (Gin, partielt kodon) i TNF-R. Dette DNA-fragmentet synliggjøres ved hjelp av elektroforese etterfulgt av etidiumbromidfarging av gelen som beskrevet ovenfor. En tredje PCR-reaksjon utføres for å isolere et amplifisert, dobbelttrådet DNA-fragment som omfatter IL-lR- og TNF-R-sekvensene atskilt ved hjelp av linkersekvensen. De følgende reagenser ble slått sammen i et 0,5 ml rør: 3 il (ca. 5-10 ng) av IL-lR-peptid-linker-DNA-fragmentet amplifisert i den første PCR-reaksjon ovenfor - en 3 il aliquot tas direkte fra LMT-agarosen ved hjelp av •mikropipette under anvendelse av UV-lys for å synliggjøre det ønskede bånd på den eti-diumbromidfargede gel 3 il (ca. 5-10 ng) av peptid-linker-TNF-R-DNA-fragmentet amplifisert i den andre PCR-reaksjon ovenfor - en 3 il aliquot mikropipetteres direkte fra området i LMT-agarosegelen som inneholder det ønskede bånd
10 il 10 x PCR-buffer {beskrevet ovenfor)
100 praol av oligonukleotidet med sekvensidentitet nr. 18 som
5'-primeren
100 pmol av oligonukleotidet med sekvensidentitet nr. 21 som
3'-primeren
4 il av en 2,5 mM oppløsning inneholdende hver av de fire
dNTP-ene
0,5 il Taq-DNA-polymerase {5 enheter/il)
vann inntil et sluttvolum på 100 il
PCR-reaksjonssyklusene utføres ved temperaturene og i de tidsrommene som er angitt ovenfor. Etter det innledende denatureringstrinn annealeres de komplementære peptidlinkerkodende segmenter av de to DNA-fragmentene. Sluttproduktet av reaksjonen er et buttendet, dobbelttrådet, amplifisert DNA-fragment som er ca. 1370 bp langt, omfattende en IL-1R-DNA-sekvens oppstrøms for en sekvens som koder for en peptid-linker, etterfulgt av en TNF-R-DNA-sekvens.
En 25 il aliquot av denne tredje PCR-reaksjonsblan-ding omsettes uten rensing med restriksjonsenzymene Asp718 og Espl. Asp718 spalter oppstrøms for IL-lR-sekvensen som omtalt ovenfor. Espl spalter innenfor TNF-R-sekvensen, som vist i figur 2A og omtalt ovenfor. Restriksjonsendonukleasen Cell II er en isoschizomer av Espl og kan erstatte Espl. Det ønskede fragment, her henvist til som fragment E, renses ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter, slik som separasjon ved hjelp av gelelektroforese, f.eks. på en 1,0% "Seaplaque" agarosegel med lav smeltetemperatur, og isolering av båndet som utgjør det ønskede fragment.
To ytterligere DNA-fragmenter betegnet F og G, isoleres og knyttes sammen med fragment E, hvorved det konstrueres en ekspresjonsvektor med en andre TNF-R-sekvens fusjonert (via en peptidlinkersekvens) nedstrøms for det ovenfor fremstilte IL-lR-linker-TNF-R-DNA-fragment. Den resulterende vektor og stillingene til fragmentene E, F og G inneholdt i den, er vist i figur 4.
DNA-fragmentet betegnet F, fremstilles ved å fordøye vektoren vist i figur 3 og konstruert i eksempel 11 med Espl. Et fragment inneholdende en 3'-del av TNF-R {som strekker seg fra og med Espl-setet vist i figur 2A til og med et kodon for aminosyre 235) etterfulgt av en sekvens som koder for en Gly4SerGly5Ser-peptidlinker som etterfølges av en andre TNF-R-sekvens som strekker seg fra kodonet for aminosyre 1 {Leu) til Espl-setet i den andre (nedstrøms) TNF-R-sekvens i vektoren ifølge figur 3, isoleres. Dette fragmentet som er ca. 739 basepar langt, betegnes her fragment F.
Fragment G som inneholder vektorsekvenser {inkludert DHFR) og en 3'-del av en TNF-R-sekvens, isoleres fra en "spleisefri" vektor på følgende måte. pCAV/DHFR/TNF-R-vektoren fremstilt i eksempel 11, inneholder en sekvens som antas å være ufordelaktig for konstruksjon av IL-lR-kodende vektorer, muligens på grunn av en kryptisk promoter innenfor denne sekvensen hvorfra uønsket protein uttrykkes i E. coli. Et derivat av pCAV/DHFR/TNF-R ble fremstilt ved å erstatte et Ndel/- Asp718-vektorfragment som inneholder den uønskede sekvens med et NdeI/Asp718-fragment fra spleisefri vektor SF-CAV (ATCC 68922, beskrevet ovenfor). Konstruksjonen er vist i figur 5.
SF-CAV fordøyes med Ndel og Asp718 {unike seter i dette plasmidet), og fragmentet på ca. 500 bp merket H i figur 5, isoleres. Fragment H mangler den uønskede sekvens som finnes i det tilsvarende fragment i pCAV/DHFR/TNF-R.
pCAV/DHFR/TNF-R-vektoren fremstilt i eksempel 11 og vist i figur 5, fordøyes med Asp718, Espl og Ndel. Et Asp718/Espl-fragment på ca. 495 bp isoleres {fragment I). Et Ndel/EspI-fragment på ca. 4647 bp isoleres også (fragment J).
De ovenfor fremstilte DNA-fragmentene H, I og J ligeres sammen, hvorved den spleisefrie vektor SF-CAV/DHFR/- TNF-R vist i figur 5, dannes. E. coli- celler transformeres med ligeringsblandingen ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter. Plasmid-DNA utvinnes fra vertscellene, og den ønskede konstruksjon bekreftes ved restriksjonsanalyse. SF-pCAV/DHFR/- TNF-R fordøyes så med Asp718 og Espl. Fragmentet betegnet G i figur 5, inneholder vektorsekvenser (inkludert DHFR) og 3'-enden av en TNF-R-sekvens (fra det indre Espl-sete gjennom kodonet for aminosyre 235 etterfulgt av et stoppkodon) og isoleres ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter.
DNA-fragmentene E, F og G fremstilt ovenfor, ligeres sammen, hvorved vektoren vist i figur 4 (og betegnet SF-CAV-
■ J u
DHFR-tri-R), dannes. E. coli-celler transformeres med ligeringsblandingen, og det ønskede plasmid utvinnes som beskrevet ovenfor. Fusjonsproteinet kodet for av denne vektor, omfatter {fra N- til C-enden) aminosyrene -20-312 i type I IL-lR (sekvensidentitet nr. 5); en Gly^SerGlysSer-peptidlinker; aminosyrene 1-235 i TNF-R {sekvensidentitet nr. 1); en Gly4SerGly5Ser-peptidlinker; og et andre TNF-R-polypeptid som omfatter aminosyrene 1-235 i sekvensidentitet nr. 1.
Pattedyrceller transfekteres med ekspresjonsvektoren ved hjelp av konvensjonelle fremgangsmåter og dyrkes, hvorved det ønskede fusjonsprotein fremstilles. Én egnet pattedyrcellelinje er DHFR" ovariecellelinje fra kinesisk hamster betegnet CHO-K1 og tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, MD, under deponeringsnr. CCL61. Cellene kan transfekteres med ekspresjonsvektoren ved hjelp av standard kalsiumfosfatutfelling, hovedsakelig som beskrevet av Graham and van der Eb, Virology 52:456 (1983). De transfekterte celler dyrkes under egnede, konvensjonelle betingelser, og tilstedeværelsen av det ønskede fusjonsprotein i dyrkningsmediet bekreftes ved hjelp av slike analyser som de som er beskrevet i eksemplene 1 og 2.
DNA-sekvensering av en ekspresjonsvektor konstruert som beskrevet ovenfor, avslørte to punktmutasjoner i de
fusjonsproteinkodende sekvenser som kan ha inntrådt under PCR. "T" i stilling 437 i sekvensidentitet nr. 5 (type I IL-lR) ble endret til en "C", og "C"-en i stilling 687 i sekvensidentitet nr. 1 (TNF-R) ble endret til en "T". Disse mutasjonene er
stille slik at aminosyresekvensen i IL-lR-peptid-linker-TNF-R-peptid-linker-TNF-R-fusjonsproteinet (heretter kalt den "trimere reseptor") er som beskrevet ovenfor.
COS-7-celler ble transfektert med ekspresjonsvektoren og dyrket for å muliggjøre ekspresjon av den trimere reseptor. 5X konsentrert supernatant (inneholdende det utskilte, trimere reseptorprotein) ble analysert med hensyn på evnen til å inhibere binding av radiojodert, murin TNFå (0,5 nM) til U937-celler (en human, monocyttlignende cellelinje som bærer endogene reseptorer for TNF). Inhiberingsbindingsanalysen ble ut-ført i henhold til konvensjonelle fremgangsmåter som er like de som er beskrevet i eksempel 2, avsnitt C. Negative kon-
J 7
trollrør (for å måle ikke-spesifikk binding) inneholdt TNFå som ikke var radioaktivt merket, U937-cellene og radiojodert TNFå. Positive kontrollrør (for å måle maksimal, ikke-inhibert binding av radiojodert TNFå til U937-cellene) inneholdt bindingsmedium, U937-celler og radiojodert TNFå. Den trimerreseptorholdige supernatant inhiberte ca. 100% av TNF-bindingen til U937-celler som ble observert for den positive kontroll.
Den 5X konsentrerte, trimerreseptorholdige supernatant ble også analysert med hensyn på evne til å inhibere binding av radiojodert, human IL-lå (0,14 nM) til EL4 6.1-celler som bærer endogene IL-l-reseptorer. EL4 6.1-cellelinjen var avledet fra en murin tyomcellelinje som beskrevet av Mac-Donald et al. (J. Immunol. 135:3944, 1985) . Negative kontroll-rør for å måle ikke-spesifikk binding) inneholdt IL-lå som ikke var merket radioaktivt, EL4 6.1-celler og radiojodert IL-lå. Positive kontrollrør (for å måle maksimal, ikke-inhibert binding av radiojodert IL-lå til EL4 6.1-celler) inneholdt bindingsmedium, EL4 6.1-celler og radiojodert IL-lå. Den trimerreseptorholdige supernatant inhiberte 47% av IL-l-bindingen til EL4 6.1-celler som ble observert for den positive kontroll. Supernatant fra C0S-7-celler som uttrykker en monomer, oppløselig type I IL-lR, analysert som en kontroll, inhiberte 52% av IL-l-bindingen til EL4 6.1-celler som ble observert for den positive kontroll.
Eksempel 13
Fusjonsprotein omfattende ett IL- lR- polypeptid og ett TNF- R-polypeptid
Fragmentene E og G fremstilt i eksempel 12, kan ligeres sammen, hvorved det dannes en vektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for et fusjonsprotein med formel IL-1R-peptid-linker-TNF-R, hvor peptidlinkeren er Gly4SerGly5Ser. IL-lR og TNF-R er oppløselige polypeptider som beskrevet i eksempel 12. Fusjonsproteinet ifølge eksempel 12 er foretrukket på grunn av den forsterkede TNF-binding som ble oppnådd når det ble anvendt to TNF-R-polypeptider i stedet for ett.
COS-7-celler ble transfektert med ekspresjonsvektoren og dyrket for å muliggjøre ekspresjon av IL-lR-peptid-linker-TNF-R-fusjonsproteinet. 5X konsentrert supernatant (innehold-
DU
ende det utskilte fusjonsprotein) ble analysert ved hensyn på evne til å inhibere binding av radiojodert, human IL-lå
(0,14 nM) til EL4 6.1-celler (en murin, tyomavledet cellelinje som bærer IL-l-reseptorer som beskrevet i eksempel 12). Inhi-■ beringsbindingsanalysefremgangsmåten var lik den som er beskrevet i eksempel 2, avsnitt C, og de positive og negative kontrollene var som beskrevet i eksempel 12. Den fusjonspro-teinholdige supernatant inhiberte 53% av IL-l-bindingen til EL4 6.1-celler som ble observert for den positive kontroll.
Ytterligere fusjonsproteiner
Peptidlinkeren kan varieres ved å syntetisere f.eks. et oligonukleotid som koder for en forskjellig peptidlinkersekvens. Videre kan det isoleres alternative fragmenter i av IL-lR- eller TNF-R-proteinene ved å anvende PCR-primere som annealerer til en annen ønsket del av de beskrevne DNA-sekvenser, og derved definere endene til det ønskede fragment. Oligonukleotider brukt til å regenerere en ende av et DNA-fragment (f.eks. oligonukleotidet anvendt i eksempel 4), kan i varieres til å plassere et stoppkodon etter en eventuelt ønsket aminosyre. Valget av ekspresjonsvektor vil videre avhenge av de påtenkte vertsceller.
Kort beskrivelse av sekvenslisten
i Sekvensidentitet nr. 1 og sekvensidentitet nr. 2 viser nukleotidsekvensen og utkodet aminosyresekvens til en human TNF-R-cDNA. Det fullt ferdige protein er definert ved aminosyrene 1-439. Signalpeptidet er definert ved aminosyrene fra og med -22 til og med -1. Transmembranområdet er definert i ved aminosyrene 236-265.
Sekvensidentitet nr. 3 og sekvensidentitet nr. 4 viser nukleotidsekvensen og utkodet aminosyresekvens til det kodende område i en human TNF-R-cDNA. Denne TNF-R er et protein som er forskjellig fra TNF-R ifølge sekvensidentitetene
i nr. 1 og 2. Det fullt ferdige protein er definert ved aminosyrene 1-415. Signalpeptidet er definert ved aminosyrene fra og med -40 til og med -1. Transmembranområdet er definert ved aminosyrene 172-192.
Sekvensidentitet nr. 5 og sekvensidentitet nr. 6
Ul
viser nukleotidsekvensen og utkodet aminosyresekvens til en human type I IL-lR-cDNA. Det fullt ferdige protein er definert ved aminosyrene 1-549. Det forutsagte signalpeptid er definert ved aminosyrene fra og med -20 til og med -1. Transmembranområdet er definert ved aminosyrene 317-336.
Sekvensidentitet nr. 7 og sekvensidentitet nr. 8 viser nukleotidsekvensen og utkodet aminosyresekvens til en human type IL-lR-cDNA. Det fullt ferdige protein er definert ved aminosyrene 1-385. Det forutsagte signalpeptid er definert ved aminosyrene fra og med -13 til og med -1. Transmembranområdet er definert ved aminosyrene 331-356.
Sekvensidentitetene nr. 9-15 og 18-21 viser oligonukleotider anvendt ved konstruksjon av forskjellige, rekombinante plasmider som beskrevet i eksempelavsnittet.
Sekvensidentitetene nr. 16 og 17 viser et oligonukleotid og aminosyresekvensen kodet ved det, som omfatter en Gly^erGlysSer-peptid-linker-sekvens. Dette oligonukleotid anvendes i vektorkonstruksjonen beskrevet i eksempel 11.

Claims (17)

1. Fusjonsprotein, karakterisert ved at det omfatter en humantumornekrosefaktorreseptor (TNF-R), omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -22-x i sekvensidentitet nr. 1, hvor x er et helt tall fra 163 til 235, eller en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -40-x i sekvensidentitet nr. 3, hvor x er et helt tall fra 161 til 171, og en humaninterleukin-1-reseptor (IL-lR), omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -20-x i sekvensidentitet nr. 5, hvor x er et helt tall fra 312-316, eller en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -13-x i sekvensidentitet nr. 7, hvor x er et helt tall fra 330-333, med formel TNF-R-linker-TNF-R, hvor linkeren er en peptidlinker.
2. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter to TNF-R-er og én IL-lR, hvor fusjonsproteinet har en formel valgt fra: TNF-R-linker-TNF-R-linker-IL-IR og IL-IR-linker-TNF-R-linker-TNF-R, hvor hver linker er en peptidlinker.
3. Fusjonsprotein ifølge krav 2, karakterisert ved at hver av peptidlinkerne omfatter fra 5 til 100 aminosyrer valgt fra gruppen bestående av glysin, asparagin, serin, treonin og alanin.
4. Fusjonsprotein ifølge krav 2, karakterisert ved at hver TNF-R er en opp-løselig TNF-R og IL-lR er en oppløselig IL-lR.
5. Fusjonsprotein ifølge krav 4, karakterisert ved at den oppløselige IL-lR omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -13-x i sekvensidentitet nr. 7, hvor x er 330-333.
6. Fusjonsprotein ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte TNF-R kodes for av en TNF-R-kodende DNA valgt fra gruppen bestående av DNA som omfatter nukleotidsekvensen vist i sekvensidentitet nr. 1 eller sekvensidentitet nr. 3, og DNA med evne til å hybridisere under middels strenge betingelser til nukleotidsekvensen ifølge sekvensidentitet nr. 1 eller sekvensidentitet nr. 3, hvor den TNF-R-kodende DNA koder for et biologisk aktivt TNF-R-polypeptid, og hvor nevnte IL-lR kodes for av en IL-lR-kodende DNA valgt fra gruppen bestående av DNA som omfatter nukleotidsekvensen vist i sekvensidentitet nr. 5 eller sekvensidentitet nr. 7, og DNA med evne til å hybridisere under middels strenge betingelser til nukleotidsekvensen ifølge sekvensidentitet nr. 5 eller sekvensidentitet nr. 7, hvor den IL-lR-kodende DNA koder for et biologisk aktivt IL-lR-polypeptid.
7. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidlinkeren omfatter fra 5 til 100 aminosyrer valgt fra gruppen bestående av glysin, asparagin, serin, treonin og alanin.
8. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at hver TNF-R er et opp-løselig TNF-R-polypeptid.
9. Fusjonsprotein ifølge krav 8, karakterisert ved at hver oppløselig TNF-R omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyrene 1-x og -22-x i sekvensidentitet nr. 1, hvor x er et helt tall fra 163 til 235.
10. Fusjonsprotein ifølge krav 1, karakterisert ved at hver TNF-R kodes for av en TNF-R-kodende DNA valgt fra gruppen bestående av DNA som omfatter nukleotidsekvensen vist i sekvensidentitet nr. 1 eller sekvensidentitet nr. 3, og DNA med evne til å hybridisere under middels strenge betingelser til nukleotidsekvensen ifølge sekvensidentitet nr. 1 eller sekvensidentitet nr. 3, hvor den TNF-R-kodende DNA koder for et biologisk aktivt TNF-R-polypeptid .
11. Isolert DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et fusjonsprotein ifølge krav 1.
12. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 11.
13. Isolert DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for et fusjonsprotein ifølge krav 2, 3 eller 4.
14. Ekspresjonsvektor, karakterisert, ved at den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 13.
15. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein med formel: TNF-R-linker-TNF-R-linker-IL-IR eller IL-IR-linker-TNF-R-linker-TNF-R karakterisert ved at en vertscelle som er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 14, dyrkes under betingelser som fremmer ekspresjon av fusjonsproteinet, og fusjonsproteinet utvinnes.
16. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein med formel TNF-R-polypeptidlinker-TNF-R, karakterisert ved at en vertscelle som er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 12, dyrkes under betingelser som fremmer ekspresjon av fusjonsproteinet, og fusjonsproteinet utvinnes.
17. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter et fusjonsprotein ifølge krav 1 eller 2 og en egnet fortynner, eksipiens eller bærer.
NO19943617A 1992-03-30 1994-09-29 Fusjonsproteiner omfattende tumornekrosefaktorreseptor, DNA som koder for dette, fremgangsmate for fremstilling av dette samt farmasoytisk preparat. NO323197B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US86071092A 1992-03-30 1992-03-30
PCT/US1993/002938 WO1993019777A1 (en) 1992-03-30 1993-03-26 Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO943617D0 NO943617D0 (no) 1994-09-29
NO943617L NO943617L (no) 1994-11-29
NO323197B1 true NO323197B1 (no) 2007-01-15

Family

ID=25333845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19943617A NO323197B1 (no) 1992-03-30 1994-09-29 Fusjonsproteiner omfattende tumornekrosefaktorreseptor, DNA som koder for dette, fremgangsmate for fremstilling av dette samt farmasoytisk preparat.

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20060275868A1 (no)
EP (2) EP1239043A3 (no)
JP (1) JPH07508639A (no)
KR (1) KR950700937A (no)
AT (1) ATE242322T1 (no)
AU (1) AU671116B2 (no)
CA (1) CA2133326C (no)
DE (1) DE69333027T2 (no)
ES (1) ES2197149T3 (no)
FI (2) FI116943B (no)
NO (1) NO323197B1 (no)
NZ (1) NZ251820A (no)
WO (1) WO1993019777A1 (no)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995006737A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Kenneth Francis Prendergast Glycophorin binding protein (gbp130) fusion compositions
US6239268B1 (en) 1994-09-09 2001-05-29 Neurocrine Biosciences, Inc. Interleukin-1 type 3 receptors
JPH10508743A (ja) * 1994-09-09 1998-09-02 ニューロクライン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド インターロイキン−１ タイプ３レセプター
US5712381A (en) 1994-10-19 1998-01-27 Genetics Institute, Inc. MADD, a TNF receptor death domain ligand protein
US5849501A (en) * 1994-10-19 1998-12-15 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death domain ligand proteins and method to identify inhibitors of ligand binding
US5847099A (en) * 1994-10-19 1998-12-08 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death domain ligand proteins
US5852173A (en) * 1994-10-19 1998-12-22 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death ligand proteins and inhibitors of ligand binding
PL187400B1 (pl) 1996-02-20 2004-06-30 Applied Research Systems Białka hybrydowe tworzące heterodimery
US6194177B1 (en) 1996-02-20 2001-02-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding a hybrid heterodimeric protein
JP4771563B2 (ja) 1996-12-06 2011-09-14 アムジエン・インコーポレーテツド Ｉｌ−１媒介疾患を処置するためにｉｌ−１インヒビターを使用する組合せ療法
US7070771B1 (en) 1996-12-09 2006-07-04 Regents Of The University Of California Methods of expressing chimeric mouse and human CD40 ligand in human CD40+ cells
US6893838B1 (en) 1998-04-07 2005-05-17 Genetics Institute Llc DADD, death activator death domain protein
WO2000002902A1 (en) * 1998-07-13 2000-01-20 Gill Parkash S Novel inhibitors of angiogenesis and tumor growth
US6927044B2 (en) 1998-09-25 2005-08-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-1 receptor based cytokine traps
US7083949B2 (en) 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6472179B2 (en) * 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
AU2000236029A1 (en) * 1999-02-23 2000-09-14 Anne Chew Receptor isogenes: polymorphisms in the tissue necrosis factor receptor
US6627199B1 (en) 1999-07-09 2003-09-30 Amgen Inc Isolation, identification and characterization of tmst2, a novel member of the TNF-receptor supergene family
AU783682B2 (en) 1999-08-04 2005-11-24 Amgen, Inc. Fhm, a novel member of the TNF ligand supergene family
WO2001010908A1 (en) 1999-08-04 2001-02-15 Amgen Inc. Ntr3, a member of the tnf-receptor supergene family
US6808902B1 (en) 1999-11-12 2004-10-26 Amgen Inc. Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules
KR100408017B1 (ko) * 2000-11-15 2003-12-06 김영상 종양괴사인자와 인터루킨-4의 융합단백질
JP4212470B2 (ja) 2001-06-26 2009-01-21 アムジェン フレモント インク． Ｏｐｇｌへの抗体
WO2003014309A2 (en) * 2001-08-07 2003-02-20 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors in the treatment of diseases
WO2003026695A1 (en) * 2001-09-21 2003-04-03 Genset S.A. Agonists and antagonists of cylixin for the treatment of metabolic disorders
US7786282B2 (en) 2001-12-06 2010-08-31 The Regents Of The University Of California Nucleic acid molecules encoding TNF-α ligand polypeptides having a CD154 domain
CN1304425C (zh) * 2002-07-01 2007-03-14 上海兰生国健药业有限公司 含可溶性肿瘤坏死因子II型受体和白介素I受体拮抗剂IL1Ra的融合蛋白及其制备方法
US7700318B2 (en) * 2004-08-25 2010-04-20 Amprotein Corporation Chimeric polypeptide and use thereof
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
US8277650B2 (en) 2009-03-13 2012-10-02 Terrasep, Llc Methods and apparatus for centrifugal liquid chromatography
TW201117824A (en) 2009-10-12 2011-06-01 Amgen Inc Use of IL-17 receptor a antigen binding proteins
US9321999B2 (en) 2009-11-19 2016-04-26 Solis Biodyne Oü Compositions for increasing polypeptide stability and activity, and related methods
SG10201604093XA (en) 2010-01-15 2016-07-28 Kirin Amgen Inc Antibody formulation and therapeutic regimens
WO2013016220A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Amgen Inc. Il-17 receptor a is required for il-17c biology
SG11201607881SA (en) 2014-03-31 2016-10-28 Kirin Amgen Inc Methods of treating nail and scalp psoriasis
AU2018338192B2 (en) 2017-09-22 2022-03-03 Kite Pharma, Inc. Chimeric polypeptides and uses thereof
CN115073607A (zh) * 2021-03-12 2022-09-20 上海康岱生物医药技术股份有限公司 Tnfr2与baff受体的融合蛋白
CN115944714B (zh) * 2022-10-20 2023-12-15 苏州大学 能够同时抗白细胞介素1和肿瘤坏死因子炎症的纳米材料及其制备方法与应用

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769326A (en) * 1980-02-29 1988-09-06 The Regents Of The University Of California Expression linkers
JPS61139317U (no) * 1985-02-19 1986-08-29
US5342921A (en) * 1985-03-28 1994-08-30 Chiron Corporation Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins
US4935233A (en) * 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US5071972A (en) * 1986-01-31 1991-12-10 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding novel thrombolytic proteins
US5098702A (en) * 1986-04-09 1992-03-24 Cetus Corporation Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor
IL80005A (en) * 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
US5258498A (en) * 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5512544A (en) * 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
US4968607A (en) * 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
EP0721983A1 (en) * 1988-01-22 1996-07-17 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing biologically active peptide dimers
US5075222A (en) * 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
DE3817955A1 (de) * 1988-05-27 1989-11-30 Hoechst Ag Tnf-inhibitor enthaltendes arzneimittel
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5225538A (en) * 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
DE3922089A1 (de) * 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
IL95031A (en) * 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
US5073627A (en) * 1989-08-22 1991-12-17 Immunex Corporation Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3
NZ235148A (en) * 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5395760A (en) * 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
US5945397A (en) * 1989-09-05 1999-08-31 Immunex Corporation Purified p75 (type II) tumor necrosis factor receptor polypeptides
US5605690A (en) * 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
DK0417563T3 (da) * 1989-09-12 2000-11-06 Hoffmann La Roche TNF-bindende proteiner
ATE128184T1 (de) * 1989-12-13 1995-10-15 Yeda Res & Dev Expression des rekombinanten tumor-nekrosisfaktor-bindungsproteins i (tbp-i).
US5136021A (en) * 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
WO1991017184A1 (en) * 1990-04-27 1991-11-14 The Upjohn Company Modified interleukin-1 inhibitors
AU651596B2 (en) * 1990-06-05 1994-07-28 Immunex Corporation Type II interleukin-1 receptors
US20030064480A1 (en) * 1990-06-28 2003-04-03 Leander Lauffer Fusion proteins with immunoglobulin portions, the preparation and use thereof
GB9022648D0 (en) * 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
DE4037837A1 (de) * 1990-11-28 1992-06-04 Behringwerke Ag Zellfreie rezeptorbindungsteste, ihre herstellung und verwendung
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
KR100232688B1 (ko) * 1992-09-15 1999-12-01 스코트 쥐. 홀퀴스트 종양 괴사 인자 길항제를 함유하는 tnf-의존성 염증 치료용 제약 조성물
WO1998023284A1 (en) * 1996-11-27 1998-06-04 Immunex Corporation Method of regulating nitric oxide production

Also Published As

Publication number Publication date
FI944516A (fi) 1994-11-22
FI120042B (fi) 2009-06-15
FI944516A0 (fi) 1994-09-29
AU3970293A (en) 1993-11-08
DE69333027T2 (de) 2004-05-06
NO943617L (no) 1994-11-29
EP0670730A4 (en) 1997-02-26
FI20051161A (fi) 2005-11-15
JPH07508639A (ja) 1995-09-28
EP0670730A1 (en) 1995-09-13
NZ251820A (en) 1996-07-26
WO1993019777A1 (en) 1993-10-14
ATE242322T1 (de) 2003-06-15
EP1239043A2 (en) 2002-09-11
EP0670730B1 (en) 2003-06-04
KR950700937A (ko) 1995-02-20
FI116943B (fi) 2006-04-13
CA2133326A1 (en) 1993-10-14
DE69333027D1 (de) 2003-07-10
ES2197149T3 (es) 2004-01-01
NO943617D0 (no) 1994-09-29
EP1239043A3 (en) 2003-01-02
US20060275868A1 (en) 2006-12-07
AU671116B2 (en) 1996-08-15
CA2133326C (en) 2005-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO323197B1 (no) Fusjonsproteiner omfattende tumornekrosefaktorreseptor, DNA som koder for dette, fremgangsmate for fremstilling av dette samt farmasoytisk preparat.
US6541610B1 (en) Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
EP0418014B1 (en) Tumor necrosis factor-alpha and -beta receptors
AU646695B2 (en) Isolated viral protein cytokine antagonists
AU630497B2 (en) Tumor necrosis factor-alpha and -beta receptors
US7057022B2 (en) Antibodies which specifically bind to TNF-R
EP0460846B1 (en) Type II interleukin-1 receptors
US5464938A (en) Isolated viral protein TNF antagonists
IE883523L (en) Interleukin-1 Receptors
EP0403114B1 (en) Interleukin-7 receptors
IE903467A1 (en) Granulocyte-colony stimulating factor receptors
EP0494260B1 (en) Granulocyte-colony stimulating factor receptors
AU625534B2 (en) Interleukin-1 receptors
NZ280051A (en) Tnf-r dimers (tumour necrosis factor - receptor), dna coding for same and vectors including the dna
IE911108A1 (en) Isolated Viral Protein Cytokine Antagonists
NO312769B1 (no) Isolert DNA-sekvens, fremgangsmåte for fremstilling av et renset pattedyr-TNF-R-protein

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees